מאמר שיטה

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

DOI:

10.3791/66610

⸱

1 במרץ 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Tibetan Medicine, University of Tibetan Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy / Academy for Interdiscipline, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקירת אינטראקציות בין מולקולות שונות היא היבט מכריע בהבנת פתוגנזה של מחלות וסינון מטרות תרופות. Umbelliferone, מרכיב פעיל ברפואה הטיבטית Vicatia thibetica, מציג אפקט אימונומודולטורי עם מנגנון לא ידוע. חלבון CD40 הוא מטרה מרכזית בתגובה החיסונית. לכן, מחקר זה משתמש בעיקרון של סריקה דיפרנציאלית טכנולוגיית פלואורסצנטיות כדי לנתח את האינטראקציות בין חלבון CD40 לבין umbelliferone באמצעות סמנים אנזימים פלואורסצנטיים. בתחילה, יציבות הצבע הכתום הפלואורסצנטי של החלבון אומתה בניסוי, ונקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500. לאחר מכן, נצפתה כי ערך המסת הטמפרטורה (Tm) של חלבון CD40 נטה לרדת עם עלייה בריכוז. באופן מעניין, האינטראקציה בין חלבון CD40 לבין umbelliferone נמצאה כמשפרת את היציבות התרמית של חלבון CD40. מחקר זה מייצג את הניסיון הראשון לזהות את פוטנציאל הקישור של תרכובות מולקולות קטנות וחלבונים באמצעות מיקרו-צלחות פלואורסצנטיות וצבעים פלואורסצנטיים. הטכניקה מאופיינת ברגישות ודיוק גבוהים, ומבטיחה התקדמות בתחומי יציבות החלבון, מבנה החלבונים ואינטראקציות חלבון-ליגנד, ובכך מאפשרת מחקר וחקירה נוספים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vicatia thibetica H. Boissieu, צמח ממשפחת האומבליפיים, נפוץ ברפואה הטיבטית ומייצג את אחד המרכיבים החיוניים של חמשת המרכיבים הבסיסיים (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., ו - Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. מופץ בעיקר בדרום מערב סין, כגון צפון מערב יונאן, מערב סצ'ואן, טיבט ואזורים נוספים, השורש המיובש שלו משמש תחליף מקומי לאנג'ליקה1. השורש, הידוע בניחוחו, משמש לעתים קרובות כתיבול תבשיל, והעלים, המכונים סלרי טיבטי, תורמים למאכלים טעימים. לפיכך, Vicatia thibetica הוא בעל משמעות לא רק כצמח מרפא ייחודי אלא גם כמקור מזון בטיבט.

מחקרים מקומיים ובינלאומיים מצביעים על כך ש- Vicatia thibetica היא בעלת תכונות ממריצות דם וצ'י (כוח או אנרגיה), המועילות להסדרת הווסת. הוא משמש לטיפול בסימפטומים של דיסמנוריאה וסתית לא סדירה הנגרמת על ידי דפיקות לב ומחסור בדם, ומציג השפעות פרמקולוגיות כגון ויסות נוגד חמצון של חסינות הגוף2. תמצית האלכוהול של Vicatia thibetica הדגימה את היכולת לשחזר את מסת הגוף ואת אינדקס האיברים בעכברים מדוכאי חיסון המושרים על ידי cyclophosphamide. בנוסף, הוא מגביר את הפעילות של סופראוקסיד דיסמוטאז בסרום ומפחית את התוכן של malondialdehyde, מה שמרמז על שיפור ביכולת נוגדת חמצון והשפעה מאזנת על חמצון שומנים 2,3. במקביל, הוא משפר את מספר תאי הדם וההמוגלובין, אשר לא רק משקף באופן אובייקטיבי את התפקוד ההמטופויטי של הגוף, אלא גם ממלא תפקיד מכריע במערכת החיסון 2,3.

Umbelliferone, המאופיין גבישים acicular טעם מר, בעל משקל מולקולרי קטן, הוא נדיף, והוא יכול להיות מזוקק עם אדים. הוא עובר סובלימציה בקלות, בעל מסיסות נמוכה במים ומסיסות גבוהה בחומר אורגני. כאחד המרכיבים הכימיים העיקריים של Vicatia thibetica, umbelliferone מציג השפעות אימונומודולטוריות על חסינות תאית, חסינות הומורלית וחסינות לא ספציפית במודלים של עכברי דיכוי חיסוניהמושרה על ידי הידרוקורטיזון 4,5.

מולקולת פני התא CD40, חברה במשפחת קולטני גורם נמק הגידול, מתבטאת באופן נרחב בתאי מערכת החיסון6. הליגנד ההומולוגי שלו, CD154, הידוע גם בשם CD40L, הוא חלבון טרנסממברנה מסוג II המתבטא על ידי לימפוציטים פעילים מסוג T. להפעלת CD40 יש את היכולת לווסת את הביטוי של מולקולות קו-סטימולטוריות על פני השטח של תאים דנדריטיים (DC) ומונוציטים. תהליך זה מקדם את פונקציית הצגת האנטיגן של מולקולות מורכבות היסטותאימות עיקריות (MHC) ומפעיל עוד יותר תאי CD8+ T7.

מקרופאגים ממלאים תפקיד מכריע בהיווצרות ובוויסות של מיקרו-סביבת הגידול, והפעלת CD40 יכולה לשפר את העיצוב מחדש של מיקרו-סביבת הגידול על ידי מקרופאגים8. הפעלת אות CD40 משפיעה באופן משמעותי על התרבות והפעלה של תאי B. תאי B, כאשר מופעלים על ידי CD40, יכולים לתפקד כתאים מציגי אנטיגן יעילים. הם מציגים אנטיגנים, מייצרים פעילות תאי T משפיעים, ובכך תורמים להשפעות אנטי-סרטניות9. יתר על כן, הפעלת CD40 בתאי הגידול יכולה לגרום לאפופטוזיס ולעכב את צמיחת הגידול10. CD40 בעיקר מתמיר אותות על ידי שליטה בפעילות של קינאזות חלבון טירוזין שאינן קולטנות, כולל לין, פין, סייק ואחרים. בנוסף, יש לו את היכולת לעורר חלבונים Bcl-xL, Cdk4 ו- Cdk6, להפעיל גורמי שעתוק Rel/NF-kB, ופוספורילט CG-2 ו- PI3K10.

שיטת פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית (DSF) נמצאת בשימוש נרחב כדי להעריך את ההשפעה של תנאים סביבתיים שונים, כגון הרכב חיץ, טמפרטורה וליגנדות של מולקולות קטנות, על היציבות התרמית של מבני חלבונים. הצבע הנפוץ עבור DSF הוא צבע כתום, רגיש לסביבה, הידרופובי. בתנאים רגילים, מבנה החלבון מקופל, ומסתיר את המקטע ההידרופובי שלו מבפנים. ככל שהטמפרטורה עולה, האזור ההידרופובי של החלבון נחשף יותר, וכתוצאה מכך מתפרק בהדרגה מבנה החלבון הטבעי. הצבע נקשר באופן סלקטיבי לחלק חלבוני חשוף זה, ומגביר את הפלואורסצנטיות שלו. ערכי Tm מחושבים לאחר מכן על ידי ניטור שינויים בזיהוי אות פלואורסצנטי11. במידה מסוימת, שינויים בערכי המדיטציה הטרנסנדנטלית יכולים לאמוד שינויים ביציבות החלבונים עקב מוטציות, שינויים במאגרים או קשירת ליגנדים. יתר על כן, הוא יכול להצביע על שינויים מבניים בתהליך קיפול החלבונים12. גישה זו מציעה נתונים מדויקים, טווח טמפרטורות רחב, רגישות גבוהה ואובדן דגימת חלבון מינימלי13.

במחקר זה, קביעת פלואורסצנטיות בוצעה באמצעות קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי במקום מנגנון תגובת שרשרת פולימראז כמותי פלואורסצנטי (PCR). שינוי זה מאפשר זיהוי DSF במעבדות ללא מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי, מה שהופך את השיטה לפחות מורכבת ומפחית את השלבים הנדרשים להתקנת המכשיר, ובכך מפשט את תהליך הניסוי. עם זאת, ישנם חסרונות מסוימים לגישה זו. בעוד המורכבות מצטמצמת, ההליך הופך מסורבל יותר. יש צורך בזיהוי פלואורסצנטי ידני בטמפרטורות שונות, ולא ניתן להשיג איסוף אוטומטי ורציף של פלואורסצנטיות מהמערכת. לפיכך, מחקר זה השתמש בטכניקת DSF כדי לחקור את האינטראקציה בין חלבון CD40 לבין umbelliferone, ומספק תובנות חדשות על המנגנונים המולקולריים של הרפואה הטיבטית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמיסת התרכובת, תמיסת החלבונים והצבע הוכנסו לתמיסת PBS. לאחר מכן, הדגימות עברו חימום הדרגתי באמצעות חימום דיגיטלי המנער אמבטיה יבשה, והיציבות התרמית של החלבונים הוערכה על ידי מדידת השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות במערכת המורכבת. השלבים המפורטים מתוארים להלן, ואיור 1 ממחיש סקירה כללית של הפרוטוקול.

1. הכנת פתרון

  1. הכינו תמיסת אומבליפרון בנפח 1 מ"מ על ידי הוספת 0.1 מ"ג אומבליפרון ל-616.75 מיקרוליטר תמיסת DMSO (ראו טבלת חומרים).
  2. הכינו תמיסת חלבון CD40 של 200 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הוספת 0.1 מ"ג CD40 עד 500 מיקרוליטר של תמיסת ddH2O (ראו טבלת חומרים).
  3. הכינו תמיסת צבע כתום 500x על ידי הוספת 1 μL של צבע כתום 5000x ל-9 μL של מלח חוצץ פוספט (PBS) (ראה טבלת חומרים).
    הערה: בצע את הפעולות לעיל על קרח, ומכיוון פיפטה יש טווח מינימלי של 0.1 μL, בתחילה לדלל את צבע חלבון כתום על ידי גורם של 10 כדי להקל על השימוש הבא.

2. בדיקת ביצועי צבע

  1. הוסף את הצבע הכתום 500x לתמיסת PBS ודלל אותו לקבלת צבע: יחסי PBS של 1:500, 1:1000, 1:2000 ו- 1:4000.
    הערה: ודא שהריכוז הסופי של DMSO אינו עולה על 2% (v/v).
  2. הפעילו את קורא המיקרו-צלחות הפלואורסצנטיות וחממו אותו מראש למשך 10 דקות.
  3. פתח את המחשב ואת תוכנת איסוף הנתונים ברצף (ראה טבלת חומרים).
  4. לחץ על מכשיר, בחר את דגם המיקרו-צלחת הפלואורסצנטי המתאים ובחר אישור בתוכנת רכישת הנתונים.
    הערה: המתן עד שהמיקרו-פלטה הפלואורסצנטית תסיים את החימום המוקדם ותציג את הטמפרטורה בלוח לפני פתיחת תוכנת איסוף הנתונים כדי להבטיח חיבור מוצלח בין המכשיר לתוכנה.
  5. לחץ על הגדרות רכישה ובחר Fluorescence בתוכנת רכישת הנתונים.
  6. ערוך את התוכנית בממשק אורכי גל : Lm1 = 470 ננומטר, 570 ננומטר ולאחר מכן בחר אישור.
    הערה: הצבע הכתום יכול להיות מעורר עם אור UV ב 300 ננומטר או אור נראה ב 470 ננומטר, ואת הפליטה ניתן למדוד ב 570 ננומטר.
  7. הוסף ריכוזים שונים של צבע כתום (1:500, 1:1000, 1:2000 ו-1:4000) ו-PBS לצלחות 96 בארות ב-100 מיקרוליטר/באר.
    הערה: יש להמיס את התמיסה ב-DMSO לפני הוספתה ל-PBS, ולערבל אותה ב-2000 x גרם ביסודיות במהלך תהליך ההכנה כדי להבטיח המסה מלאה בשל נטיית הצבע לזרז.
  8. הכניסו את צלחת 96 הקידוחים לשלב הזיהוי של המכשיר, לחצו על כפתור הקריאה בתוכנת איסוף הנתונים, ומדדו את הפלואורסצנטיות של ריכוז הצבע 13 פעמים בטמפרטורת החדר, עם מרווח של 2 דקות בכל פעם.
  9. לחץ על יצוא כפתור לאחר כל קביעה, בחר ייצוא ל- XML XLS TXT, בחר כל הצלחות, ולאחר מכן בחר צלחת בפורמט פלט, ולבסוף לחץ על אישור כדי לשמור את הנתונים בתיקיה בפורמט "XLS" לניתוח נוסף.
    הערה: שלבים אלה מסייעים לקבוע את ההשפעה של מדידה רציפה על הפלואורסצנטיות העצמית של הצבע הכתום בטמפרטורת החדר ולזהות את ריכוז הצביעה האופטימלי.
  10. הפעל את האמבטיה היבשה המטלטלת את החימום הדיגיטלי, הגדר את טמפרטורת החימום ל -35 מעלות צלזיוס ואת זמן החימום ל -2 דקות.
  11. הכינו את יחס הדילול האופטימלי של הצבע בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל והניחו אותו באמבט החימום הדיגיטלי המנער היבש למשך 2 דקות.
  12. הוסף את תמיסת PBS ואת תמיסת הצביעה, מחוממת ב 35 ° C, לצלחת 96 באר בנפח של 100 μL לכל באר.
  13. הכניסו את לוחית 96 הקידוחים לשלב הזיהוי של המכשיר, ולחצו על כפתור הקריאה בתוכנת איסוף הנתונים.
  14. כוונו את טמפרטורת החימום ל-40°C ואת זמן החימום ל-2 דקות.
  15. פיפטה את תמיסת הצבע בצלחת 96 באר בחזרה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל ומחממים אותו במכשיר במשך 2 דקות.
  16. חזור על הפעולות של שלבים 2.12-2.15 ושלב 2.9 כדי לבדוק את ספיגת תמיסת הצבע ב- 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C, 85°C, 90°C ו- 95°C, בהתאמה.
    הערה: שלבים אלה מסייעים לקבוע את יציבות האוטופלואורסצנטיות של הצבע הכתום תחת חימום מתמשך בשיפוע מ- 35 °C עד 95 °C. חיוני לעבוד במהירות כדי למנוע ירידות טמפרטורה מהירות או הוספת נוזל לא נכון, מה שעלול להוביל לטעויות ניסיוניות.

3. זיהוי המסת הטמפרטורה (Tm) של החלבון

  1. שלב חלבון CD40 וצבע כתום עם תמיסת PBS כדי להשיג ריכוזים סופיים של 5 מיקרוגרם / מ"ל, 10 מיקרוגרם / מ"ל, 15 מיקרוגרם / מ"ל, 20 מיקרוגרם / מ"ל ו 1:500, בהתאמה.
  2. חזור על הפעולות המתוארות בשלבים 2.2-2.6 ושלבים 2.10-2.16 כדי להעריך את ספיגת תמיסת החלבון CD40 בטמפרטורות של 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ו- 95 °C, בהתאמה.
  3. חזור על שלב 2.9 כדי לשמור ולנתח את הנתונים, ולאחר מכן חשב את ערך המדיטציה הטרנסנדנטלית באמצעות תוכנה לניתוח נתונים (ראה טבלת חומרים).
  4. הוסף חלבון CD40, אומבליפרון וצבע כתום לתמיסת PBS כדי לקבל ריכוזים סופיים של 5 מיקרוגרם/מ"ל, 10 מיקרוגרם/מ"ל, 15 מק"ג/מ"ל, 20 מק"ג/מ"ל, 10 מיקרומטר ו-1:500, בהתאמה.
    הערה: מערבולות נמרצות במהלך הכנת התמיסה חיוניות כדי להבטיח פיזור אחיד של הצבע, חלבון CD40 ואומבליפרון ב- PBS.
  5. חזור על הפעולות של שלבים 3.2-3.3 כדי למדוד את הספיגה של תמיסת מתחמי CD40-umbelliferone בטמפרטורות של 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C ו- 95 °C, בהתאמה.
    הערה: צעדים אלה נערכו כדי לקבוע את ערכי המדיטציה הטרנסנדנטלית של קומפלקסים של חלבון CD40 ו-CD40-umbelliferone, במטרה לזהות את ריכוז הקישור האופטימלי של חלבון CD40 לאומבליפרון.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצבע הכתום הפגין באופן עקבי עירור פלואורסצנטי יציב ב- Ex = 470 ננומטר ו- Em = 570 ננומטר, הן בטמפרטורת החדר והן בטמפרטורות גבוהות. נקבע יחס דילול אופטימלי של 1:500 (איור 2A,B). זיהוי ערך המדיטציה הטרנסנדנטלית היה מאתגר כאשר ריכוז חלבון CD40 היה מתחת ל-15 מק"ג/מ"ל (איור 3A,B). עם זאת, בריכוז של 15 מיקרוגרם/מ"ל, ניתן היה לזהות ערך Tm יציב של 51.82°C, אשר ירד ל-45.79°C עם עלייה בריכוז החלבון CD40 (איור 3C,D).

כפי שמתואר באיור 3, ברור כי חלבון CD40 שנקשר לאומבליפרון משפיע על ערך ה-Tm של חלבון CD40. באופן ספציפי, ערכי Tm של חלבון CD40 בריכוזים של 15 מיקרוגרם / מ"ל ו 20 מיקרוגרם / מ"ל, כמו גם 10 מיקרומטר umbelliferone, עלה ל 62.08 ° C ו 65.27 ° C, בהתאמה.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול. תרשים זרימה של תהליך רישום יכולת הקישור של חלבון CD40 לאומבליפרון בהתבסס על עקרון DSF באמצעות קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: סינון יחסי דילול צבע כתום ומבחני יציבות. (A) יציבות פלואורסצנטית של צבעים עם יחסי דילול שונים בטמפרטורת החדר. (B) יציבות פלואורסצנטית של צבעים עם יחס דילול של 1:500 ב-35-95°C. קווי השגיאה מציינים ממוצע ± SEM, n = 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תרשימי תוצאות של שימוש בקורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי כדי לרשום את יכולת הקישור של חלבון CD40 לאומבליפרון בהתאם לעקרון DSF. (A-D) פרופילי Tm של 5 מיקרוגרם/מ"ל, 10 מיקרוגרם/מ"ל, 15 מיקרוגרם/מ"ל, 20 מיקרוגרם/מ"ל חלבון CD40 ו-CD40 + 10 מיקרומטר אומבליפרון, בהתאמה. קווי השגיאה מציינים ממוצע ± SEM, n = 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DSF, הידועה גם בשם בדיקת שינוי תרמי או בדיקת פלואורסצנטיות תרמית, היא טכניקה המשמשת לזיהוי תהליך של דנטורציה תרמית של חלבונים בדגימות על ידי ניטור שינויים באות הפלואורסצנטי של דגימת הבדיקה או הצבע במהלך עליית טמפרטורה איטית ומתוכנתת. DSF, שהוקמה לראשונה על ידי פנטוליאנו14, משמשת כשיטת תפוקה גבוהה. ההליך העיקרי כולל העלאת הטמפרטורה על צלחת מחוממת הנשלטת על ידי מחשב, פליטת אור עירור באמצעות מנורה אולטרה סגולה באורך גל ארוך, ולכידת שינויים בעוצמת האות הפלואורסצנטי הנובעים מקשירה של צבעים פלואורסצנטיים לחלבונים באמצעות מצלמה ליצירת פאזה של מכשיר מצומד מטען.

ערך ה- Tm, אינדיקטור מכריע המאפיין את המבנה ברמה גבוהה יותר של חלבונים, מייצג את הטמפרטורה המתאימה למחצית הדנטורציה של תרופת החלבון במהלך עליית טמפרטורה. ערכי Tm גבוהים יותר מצביעים על דרישת טמפרטורה גבוהה יותר עבור דנטורציה של חלבון, מה שמצביע על מבנה חלבון יציב יותר. השיטה המוכרת כיום לזיהוי ערכי Tm היא קלורימטריה סריקה דיפרנציאלית (DSC), שהחלה בשנות השישים15. DSC מודד את ההבדל בהספק המועבר לאובייקט הנבדק ולאובייקט ייחוס כפונקציה של טמפרטורה תחת בקרת טמפרטורה מתוכנתת כדי להשיג את כמות החום הנספגת והמשוחררת. זה עומד תקן הזהב לניתוח יציבות תרמית16,17.

DSF זכה לשימוש נרחב בשל שלושה יתרונות על פני DSC: (1) צריכת דגימה נמוכה יותר: DSC דורש בדרך כלל נפח דגימה של 400 μL, בעוד DSF דורש רק 20-25 μL. (2) טווח ריכוזים גדול יותר: DSC דורש בדרך כלל ריכוזי חלבון של 0.2-2 מ"ג / מ"ל כדי להשיג שיא דנטורציה משמעותי, בעוד DSF יכול לנתח דגימות בטווח של 0.005-200 מ"ג / מ"ל. (3) תפוקת דגימה גבוהה יותר: DSC יכול לנתח רק דגימה אחת בכל פעם, בעוד DSF יכול לסרוק בו זמנית עד 96 דגימות או יותר18. בשל יתרונות אלה, DSF נמצא בשימוש נרחב בחקר יציבות החלבון, מבנה וקונפורמציה של חלבונים, אינטראקציות חלבון-ליגנד, וההשפעות של מייצבי חלבון, מעכבים, קופקטורים ועוד.

בנוסף ל- DSF ו- DSC, קיימות מספר טכניקות אינטראקציה מולקולרית אחרות. תהודה פלסמונית פני השטח (SPR) היא תופעה אופטית המתרחשת בממשק של שתי מדיות ויכולה להיגרם על ידי פוטונים או אלקטרונים. מדובר בהשתקפות מוחלטת כאשר האור נפלט מתווך צפוף אופטית לתווך דליל מבחינה אופטית. הזווית שבה מתרחשת תהודה פלסמונית פני השטח ידועה בשם זווית SPR. חיישנים ביולוגיים של SPR משתמשים בשינויים בזוויות SPR כדי לנטר אינטראקציות בין-מולקולריות בזמן אמת19,20. תרמופורזה MicroScale (MST) היא טכניקה לניתוח אינטראקציות ביומולקולריות על ידי זיהוי שינויים בגודל, מטען ושכבת הידרציה של ביומולקולות הנגרמות על ידי קשירה. הוא רושם שינויים פלואורסצנטיים באזור המוקרן על ידי לייזר אינפרא אדום בתוך הדגימה לפני, במהלך ואחרי הפעלת הלייזר, ומאפשר קביעות מהירות יחסית21. אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) מודדת תגובות פני שטח של חיישנים על ידי מעקב אחר שינויי תזוזה בספקטרום האינטרפרומטריה. בניסויי BLI, מולקולה אחת משותקת על פני השטח של חיישן טבול כדי לזהות מולקולה אחרת שיכולה להיקשר אליה. אינטראקציית הקשירה גורמת לתזוזה של הפרעות, וניטור בזמן אמת של שינוי התזוזה הזה מניב את עקומת הקישור22. קלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) מכמתת אינטראקציות ביומולקולריות על ידי מדידה ישירה של החום המשתחרר או נספג במהלך הקשירה הביומולקולרית. הוא מספק מידע תרמודינמי מקיף על אינטראקציות מולקולריות23. בהשוואה לטכנולוגיות אינטראקציה מולקולרית אלה, ל- DSF יש דרישות נמוכות יותר עבור מכשירים, חומרים מתכלים וטכניקות הפעלה. הוא יכול לזהות ביעילות אינטראקציות בין תרכובות וחלבונים ברוב המעבדות.

ההליך התפעולי של טכנולוגיית DSF הוא פשוט יחסית. בתחילה, דגימות חומר לבן, מאגרי תגובה, צבעים פלואורסצנטיים וליגנדות מועמדות משולבות למערכת תגובה. מערכת זו מועברת לאחר מכן למכשיר PCR פלואורסצנטי שבו נקבעים תנאי חימום וגילוי לקביעת פלואורסצנטיות 24,25. צבע החלבון הנפוץ ביותר עבור DSF הוא כיום צבע כתום, ומכשיר הזיהוי הוא בדרך כלל מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי26. עם זאת, מכיוון שאורך גל העירור של צבע כתום הוא 470 ננומטר ואורך גל הפליטה הוא 570 ננומטר, לא כל מכשירי ה-PCR הכמותיים הפלואורסצנטיים בשוק מתאימים באופן מושלם. לכן, מחקר זה מאמץ קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי ככלי זיהוי חדש לחקר אינטראקציות חלבון-ליגנד.

גישה זו מציעה שני יתרונות עיקריים על פני DSF באמצעות מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי. ראשית, ניתן להתאים אישית את טווח אורכי הגל של סמן האנזים הפלואורסצנטי, מה שהופך אותו לתואם יותר לטווח אורכי הגל של הצבע ומבטיח זיהוי פלואורסצנטי מדויק יותר. שנית, לא ניתן לעצור את התוכנית של מכשיר PCR כמותי פלואורסצנטי לאחר הפעלתו, מה שהופך אותו למאתגר לפתור בעיות במהלך תהליך החימום. לעומת זאת, קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי מאפשר סילוק הפרעות על ידי שינוי איטרטיבי של יחס המערכת ותנאי הזיהוי לאורך כל תהליך הזיהוי. עם זאת, השימוש בקורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי עבור DSF מגיע גם עם חסרונות מסוימים, בעיקר כמות הדגימה הגדולה יחסית הנדרשת, בדרך כלל בין 50-200 μL, בעוד DSF מסורתי בדרך כלל משתמש 20-25 μL של דגימה.

במאמר זה, האימות של DSF המבוסס על קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי נערך לזיהוי Tm באמצעות חלבון CD40 ואומבליפרון בטווח ריכוז של 5-20 מיקרוגרם/מ"ל. התוצאות הדגימו את הספציפיות והדיוק הגבוהים של השיטה, ואישרו את התאמתה לזיהוי מדיטציה טרנסנדנטלית. השוואה מאוחרת יותר של תוצאות זיהוי מדיטציה טרנסנדנטלית בריכוזי דגימה שונים חשפה מגמת ירידה בערך ה-Tm של חלבון CD40 ככל שהריכוז עלה, מה שמרמז על השפעה פוטנציאלית של הריכוז על זיהוי המדיטציה הטרנסנדנטלית (איור 3). יתר על כן, המחקר זיהה עלייה בערך ה- Tm של חלבון CD40 לאחר הוספת umbelliferone למערכת בהשוואה לפני התוספת. זה מצביע על כך שלאומבליפרון יש את היכולת להיקשר לחלבון CD40, מה שמוביל לשיפור ביציבות התרמית של חלבון CD40 בשילוב שלהם (איור 3).

השלבים הקריטיים בפרוטוקול זוהו כשלבים 2.7 עד 2.16, שהשלמתם המוצלחת משפיעה ישירות על הזיהוי הבא של פלואורסצנטיות חלבון. לסיכום, מחקר זה ביסס שיטת זיהוי DSF חדשנית המבוססת על עקרונות טכנולוגיית DSF, תוך שימוש בחלבון CD40 ואומבליפרון כדוגמה. השיטה ניתחה ביעילות את כוח הקישור בין חלבונים וליגנדות באמצעות קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי. יתר על כן, ניתן להרחיב טכניקה זו לניתוח יציבות חלבונים ומחקר על מבנה החלבון, העמקת היישום של טכנולוגיית DSF בחקר מסלולי איתות תאים וחקר פתוגנזה של מחלות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מביעים את הערכתנו הכנה לתמיכה הכספית שהתקבלה מפרויקט בניית הקונוטציה של תוכנית החומש ה -14 של האוניברסיטה לרפואה טיבטית (2022ZYYGH12), הנושאים הפתוחים 2022 של מעבדת המפתח של הרפואה הטיבטית וחינוך בסיסי של משרד החינוך באוניברסיטה לרפואה טיבטית (ZYYJC-22-04), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של נינגשיה (2023BEG02012), ופרויקט קידום המחקר Xinglin Scholar של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (XKTD2022013).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חלבון CD40MedChemExpressHY-P75408
DMSOBoster ביולוגי טכנולוגיה ושות', בע"מPYG0040
FlexStation 3 קורא מיקרופלטות רב תכליתישנחאי מייגו מכשירים מולקולריים ושות', בע"מFlexStation 3
OriginPro 8 תוכנהOriginLab Corporationv8.0724(B724)
מלח חוצץ פוספט ( 1x)Gibco8120485
SoftMax Pro 7.1שנחאי Meigu מכשירים מולקולריים ושות', בע"מSoftMax Pro 7.1
SSYPRO צבע כתוםSigmaS5942
Umbelliferoneשנחאי Yuanye ביוטכנולוגיה ושות'.B21854

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cairang, N. Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine "five roots". Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).
  2. Li, L., et al. Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide. Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).
  3. Lu, H., et al. Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice. J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).
  4. Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui. Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).
  5. Lu, Z., Zhang, L. Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice. Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).
  6. Vonderheide, R. H. CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).
  7. Grewal, I. S., Flavell, R. A. CD40 and CD154 in cell-mediated immunity. Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).
  8. Long, K. B., et al. IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma. Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).
  9. He, Y., et al. The roles of regulatory B cells in cancer. J Immunol Res. 2014, 215471(2014).
  10. Eliopoulos, A. G., et al. CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily. Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).
  11. Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).
  12. Rosa, N., et al. Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry. J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).
  13. Hellman, L. M., et al. Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes. J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).
  14. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).
  15. Gorny, H., et al. Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules. J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821(2023).
  16. Freire, E. Thermal denaturation methods in the study of protein folding. Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).
  17. Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites. Heliyon. 9 (11), 21238(2023).
  18. Zhou, C., Yu, M., Li, W. Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein. Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).
  19. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  20. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  21. Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases. Int J Mol Sci. 23 (14), 7672(2022).
  22. Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
  23. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
  24. Sharma, R., et al. Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD. Int J Biol Macromol. 253, 127208(2023).
  25. Grädler, U., et al. Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding. J Biol Chem. 299 (11), 105328(2023).
  26. Xu, Y., et al. Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein. Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים