מאמר שיטה

עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

DOI:

10.3791/66613

⸱

24 במאי 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא אנזימטית ופשוטה לבידוד תאי מח עצם של עכבר יילודים בני 7-9 ימים ויצירת מקרופאגים ממוינים באמצעות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור לגורם מגרה מושבת גרנולוציטים (M-CSF). המקרופאגים שמקורם במח עצם נותחו עוד יותר עבור אנטיגנים פני השטח F4/80, CD206, CD11b וכשירות תפקודית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות שונות לבידוד מח עצם מעכברים בוגרים כבר מבוססות היטב. עם זאת, בידוד מח עצם מעכברים ילודים הוא מאתגר וגוזל זמן, אך עבור דגמים מסוימים, הוא רלוונטי והכרחי מבחינה תרגומית. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ופשוטה להכנת תאי מח עצם מגורים בני 7-9 ימים. תאים אלה יכולים להיות מבודדים עוד יותר או להתמיין לסוגי תאים ספציפיים בעלי עניין. מקרופאגים הם תאי חיסון חיוניים שממלאים תפקיד מרכזי בדלקת ובזיהום. במהלך ההתפתחות, מקרופאגים בילודים תורמים באופן משמעותי לעיצוב מחדש של רקמות. יתר על כן, הפנוטיפ והתפקודים של מקרופאגים בילודים שונים מאלה של עמיתיהם הבוגרים. פרוטוקול זה מתאר גם את ההתמיינות של מקרופאגים בילודים מתאי מח עצם מבודדים בנוכחות תווך מותנה L929. סמני פני השטח של מקרופאגים יילודים מובחנים הוערכו באמצעות אנליזה ציטומטרית של זרימה. כדי להדגים פונקציונליות, היעילות הפאגוציטית נבדקה גם באמצעות Escherichia coli מצומד לצבע הרגיש ל- pH.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מח עצם מקיף אוכלוסיות תאי גזע המטופויטיות ומזנכימליות המתחדשות מעצמן וניתן להתמיין לשושלות תאים שונות. תאי גזע המטופויטיים במח העצם מולידים שושלות מיאלואידיות ולימפואידיות1. תאי גזע מזנכימליים מייצרים אוסטאובלסטים (עצם), אדיפוציטים (שומן) או כונדרוציטים (סחוס)2. לתאים אלה יישומים רבים בתחום הביולוגיה של התא והנדסת רקמות, כולל ריפוי גנטי 3,4. תאי אב הנמצאים במח העצם מתמיינים לסוגי תאים ספציפיים בנוכחות גורמי גדילה ספציפיים לשושלת. Erythropoietin מקדם את התפשטות של תאי אב אריתרואידים, גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (G-CSF) מגרה את הצמיחה של מושבות נויטרופילים, ו thrombopoietin מסדיר את הייצור של טסיות כמו כמה דוגמאות של גורמי גדילה ספציפיים לשושלת5. אנטיגן פני השטח של התא המסומן FACS ומיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) הן שיטות מבוססות היטב לבידוד וטיהור של סוגי תאים ספציפיים שמקורם במח עצם6.

למרות שמחקרי יילודים מתקדמים לקראת מציאת הגורמים למוות יילודים וטיפול בסיבוכים במהלך לידות מוקדמות, פיתוח טיפולי ישיר נותר צורך רפואי שלא נענה. סמית ודיוויס הצהירו, "ילדים חולים נשארים יתומים טיפוליים"7. ישנם מספר אתגרים, כגון דגימות קטנות, השפעות לכל החיים של התוצאה, ובעיות אתיות בקבלת הסכמה במחקרים קליניים של יילודים8. לפיכך, יש ביקוש גבוה למודלים של מחקר in vivo ו - in vitro ספציפיים ליילודים כדי להשיג רלוונטיות תרגומית. בגלל הדמיון בין רמות אנטומיות ורקמות, תקופות הריון קצרות וגודל המלטה, מכרסמים הם מערכת המודל הנחקרת ביותר של יונקים.

במאמר זה אנו מתארים הליך מפורט, אפשרי ביותר וניתן לשחזור לבידוד מח עצם מגורי עכברים בני 7-9 ימים ויכולתם להתמיין למקרופאגים. עם זאת, ניתן להשיג מגוון של שושלות תאים באמצעות שימוש באותות התמיינות ברורים. אנו גם מדגימים נוכחות של סמנים על פני השטח של התא ואת הנוכחות של פעילות פגוציטית במבחנה הצפויה עבור מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במערב וירג'יניה ובוצעו בעקבות המלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה על ידי מועצת המחקר הלאומית. גורי עכברים C57BL/6J שימשו במחקר זה. הפרטים של כל הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיה

  1. הכינו 3 מ"ל של חומר תרבית MEM בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ גלוטמין, 25 מ"מ HEPES ופניצילין (100 U/mL)/סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) בצינור צנטריפוגה של 5 מ"ל, ושמרו אותו על קרח.
  2. במידת הצורך לאחסון אבות מח עצם בחנקן נוזלי, הכינו מדיית הקפאה המכילה 10% DMEM, 80% FBS ו-10% DMSO.
  3. עבור DMEM מלא, להכין DMEM בתוספת 10% FBS, 2 mM גלוטמין, 25 mM HEPES, ופניצילין (100 U / mL) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל).
  4. להתמיינות מקרופאגים, הכינו DMEM בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ גלוטמין, פניצילין (100 U/mL)/סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל), ו-10% סופרנאטנטתאי L929 9,10,11.

2. הכנת סופרנאטנט תאי L929

  1. להפשיר תאי L929 המאוחסנים בחנקן נוזלי ולהעביר לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל DMEM מלא. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. להשהות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של מדיה DMEM מלאה ולזרוע אותם לתוך בקבוק תרבית רקמה T25 בצפיפות של 2×105 תאים. ספור את התאים עם מונה תאים אוטומטי באמצעות 0.4% טריפאן כחול. לדגור ב 37 ° C עם 5% CO2 עד שהם מגיעים 70% מפגש.
  3. כדי לנתק את התאים, תחילה לשטוף אותם עם 5 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS). שאפו את PBS והחליפו אותו ב-2.5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA.
  4. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 5 דקות ולהוסיף 5 מ"ל של DMEM מלא.
  5. לאסוף את התאים ואת הצנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  6. להשעות מחדש את גלולת התא ב 15 מ"ל של מדיה DMEM מלאה ולהעביר אותו צלוחיות T75.
  7. לדגור ב 37 ° C עם 5% CO2 עד התאים להגיע 90% מפגש, ולאחר מכן לאסוף את התווך ואת הצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. סנן את המדיה המכילה M-CSF דרך מסנן 0.45 מיקרומטר והקפיא ב -80 ° C ב 5 מ"ל aliquots.

3. הכנת בעלי חיים

  1. מתחת לארון בטיחות ביולוגית, הפרידו בזהירות את גורי העכבר C57BL/6J בני 7-9 ימים (המלטה של 6 גורים) מהסכר והניחו אותם בכלוב נפרד.
  2. השרו כדור צמר גפן ב-2 מ"ל איזופלורן ברמה וטרינרית בצנצנת פעמון או בתא הכלה אחר.
  3. מניחים גור בתא וסוגרים את המכסה. נטרו את היילוד במשך כ-90 שניות כדי לוודא שהוא הופך לחסר תנועה ומחוסר הכרה.
  4. הוציאו במהירות את ראשו של הגור וערפו את ראשו במספריים חדים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הממסד) לפני שהגור יוכל לחזור להכרתו.
    הערה: יילודים אינם נושמים עמוק מספיק להמתת חסד על ידי שאיפת איזופלורן בלבד.
  5. הקפידו לסגור את מכסה המיכל לאחר הסרת כל גור. אותו כדור צמר גפן יכול לשמש 5-7 גורים.

4. בידוד מח עצם יילודים

  1. לעקר את הגוף של היילוד עם 70% אתנול.
  2. "באמצעות מלקחיים ומספריים כירורגיים עדינים, לבצע חתך בין
    בטן ורגליים אחוריות. הסר את העור על ידי משיכה לכיוון כף הרגל של הגפיים האחוריות.
  3. מגרדים את רקמת החיבור והשריר המחוברים לעצמות באמצעות מלקחיים בעלי קצוות חדים.
  4. חתכו את השוקה ואת עצם הירך, כפי שמוצג באיור 1, בעזרת מספריים כדי לנתק ולהסיר. בעזרת מלקחיים, הניחו עצמות אלה בצינור המדיה על קרח. חזור על התהליך עבור כל גור.
  5. מעבירים את העצמות בעזרת מלקחיים למסננת 40 מיקרומטר עם צינור איסוף. למחוץ את העצמות ולשחרר את המוח על ידי לחיצה עם מזרק 3 מ"ל בוכנה נגד המסננת.
  6. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  7. לשאוף את supernatant ולהשעות מחדש את התאים על ידי pipetting עדין ב 0.2% NaCl, פתרון hypotonic עבור lysis של אריתרוציטים. הוסף מיד נפח שווה של 1.6% NaCl כדי להביא את התמיסה איזוטונית.
  8. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תמיסת ליזיס.
  9. השהה מחדש ב- DMEM מלא לשימוש מיידי או בהקפאת מדיה לאחסון וספור את התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
    הערה: במחקר הנוכחי, שיטה זו הניבה 6.55 (± 1.44) ×10 6 תאי מח עצם/גור (איור 1E).
  10. אחסן את התאים בטמפרטורה של -80°C במדיה מקפיאה, או השתמש בהם באופן מיידי כמתואר להלן.
    הערה: בגלל הגיל, העצמות שקופות וברורות מספיק כדי לדמיין את המח דרכן. חשוב להיות זהירים בעת משיכת העצמות כמו הפעלת לחץ קל עליהם עשוי להיות מספיק כדי לשחרר את המוח. המח בעצמות היילוד הוא בצורת נוזל ולא חוט שלם שנמצא בעצמות בוגרות. קשה לאסוף את המח אם הוא בורח במהלך איסוף העצמות.

5. התמיינות של מקרופאגים שמקורם במח עצם בילוד

  1. זרעים 2 × 107 תאי מח עצם לכל בקבוק T75 ב-10 מ"ל DMEM מלא המכיל 10% סופרנאטנט תאי L929 (2.5 מ"ל) כמקור ל-M-CSF. לדגור את מנות התרבות ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 5 ימים. הוסף 2 מ"ל של מדיה מותנית L929 ביום השלישי של הבידול.
  2. התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ מדי יום באמצעות מיקרוסקופ הפוך ומערכת הדמיה בהגדלה של פי 20. לאחר ההתמיינות, המקרופאגים צריכים להיראות דבוקים, מוארכים והטרוגניים (איור 2).
  3. כדי לקצור את המקרופאגים לבדיקות במורד הזרם, שאפו את אמצעי הבידול.
  4. שטפו את התאים עם 5 מ"ל של PBS כדי להסיר תאים שאינם דבקים וחלבונים בסרום שיפריעו לניתוק. שאפו את PBS.
  5. קצרו את התאים על ידי הוספת 5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצלוחית. מניחים את בקבוק התרבית בטמפרטורה של 37°C עם אינקובטור CO2 של 5% למשך 5 דקות ומוסיפים 5 מ"ל DMEM.
  6. פיפטה התאים לניתוק וצנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. נתק את גלולת התא ב 1 מ"ל של DMEM מלא, ולספור ולבדוק את כדאיות התא באמצעות כחול טריפאן. BMDMs שבודדו באמצעות שיטה זו הם 7.05 (± 2.52) ×105 תאים/גור (איור 1E).
    הערה: שימו לב לנוכחות של תאים בצורת ציר שמתחילים להופיע ביום השני להתמיינות (איור 1B, חיצים אדומים). אם צבע המדיה הופך צהוב, המציין שהוא בילה, להוסיף עוד מדיה מותנית L929 ביום 4 של בידול; החלפה מלאה של מדיה אינה מומלצת.

6. תיוג חיסוני וניתוח ציטומטרי זרימה

  1. חסום תיוג נוגדנים לא ספציפי של BMDMs (2x105/label) על ידי טיפול עם 10 μL/107 תאים של מגיב חוסם FcR על פי המלצות היצרן בנפח של 100 μL / חיץ ציטומטריה זרימת תווית (PBS בתוספת 2 mM EDTA ו 0.5% אלבומין בסרום בקר). שומרים על קרח למשך 10 דקות.
    הערה: ניתן לחסום את התאים בכמויות גדולות או בבארות או צינורות בודדים. כל השלבים הבאים מציינים כמויות ונפחים לכל תווית סמן תא בודד בנפח סופי של 100 μL.
  2. שטפו את התאים על ידי הוספת 200 μL של חיץ ציטומטריית זרימה וצנטריפוגה ב 525 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. מוציאים את הסופרנאטנט וזורעים את התאים בצלחת באר U-bottom 96 בצפיפות של 5 × 105 תאים לכל באר. צביעת תאים על ידי הוספת צבע FVS780-Live/Dead לספירת תאים מדולל פי 3,000 ו-0.625 μL של BV786-CD11b, PE-F4/80 ו-AlexaFluor488-CD206 ב-100 μL של חיץ ציטומטריית זרימה בנפרד או בשילוב 12,13,14,15. דוגרים על התאים במשך 45 דקות על קרח מכוסה בנייר כסף.
  4. הוסף 100 μL של חיץ ציטומטריית זרימה ולשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 525 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. שאפו את הסופרנאטנט וסובבו את גלולת התא בעדינות. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 0.4% פרפורמלדהיד לכל באר ודגרו למשך הלילה ב-4°C.
  6. שטפו את התאים על ידי הוספת 100 μL של חיץ ציטומטריית זרימה וגלולה על ידי צנטריפוגה ב 525 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. להשהות מחדש את התאים ב 400 μL של מאגר ציטומטריית זרימה ולנתח באמצעות ציטומטר זרימה.

7. בדיקת מבחנה להערכת היעילות הפאגוציטית של מקרופאגים שמקורם במח עצם בילוד

  1. השהה מחדש את BMDMs ב- DMEM מלא ללא פנול אדום או אנטיביוטיקה וזרע אותם בצפיפות של 2 × 105/ רביע בצלחת מרובעת 35 מ"מ בנפח של 500 μL.
  2. כדי להכין את החיסון החיידקי בריבוי זיהומים (MOI) של 25 או MOI רצוי אחר, הסר מלאי מחושב מראש של Escherichia coli O1:K1:H7 המאוחסן ב -80 ° C.
  3. Aliquot את נפח החיידקים הרצוי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל. לשטוף את החיידקים על ידי הוספת PBS לנפח כולל של 1 מ"ל. משחררים את החיידקים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 2,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזרו על שלב הכביסה.
  4. יש להשהות מחדש את כדורית החיידקים ב-50 מיקרוליטר PBS ולהוסיף צבע ירוק רגיש ל-pH פלואורסצנטי לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. זהו צבע רגיש ל- pH ללא אות פלואורסצנטי ב- pH ניטרלי ופלואורסצנטי בהיר בסביבות חומציות, כגון פגוזומים חומציים, במהלך תהליך הפאגוציטוזה.
  5. דוגרים על תאי החיידק במשך 20 דקות בחושך לצורך צימוד צבע.
  6. לשטוף את החיידקים ארבע פעמים עם 1 מ"ל של PBS על ידי צנטריפוגה ב 1000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. להשהות מחדש את החיידקים ב 500 μL של DMEM מלא ללא פנול אדום ולהוסיף תרביות BMDM.
  8. יש לדגור על BMDMs בטמפרטורה של 37°C באינקובטור CO2 של 5% למשך 4 שעות, ולאחר מכן להוסיף 200 ננוגרם של צבע פלואורסצנטי אדום חדיר לתאים שמכתים את הליזוזומים.
    הערה: ניתן להמחיש חיידקים פגוציטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות השיטה המתוארת במחקר זה, ניתן לבודד בהצלחה 25 עד 37 מיליון תאי מח עצם מגודל המלטה של חמישה גורי עכברים C57BL/6. שיטה זו אומתה עם גדלי המלטה הנעים בין 5 ל -7 גורים. גיל הבידוד המינימלי בניסויים שלנו היה 7 ימים. בהתאם לגודל ההמלטה ומספר התאים הדרושים לניסוי שהוא פחות ממיליון, החוקרים יכולים לנסות פרוטוקול זה עבור עכברים מתחת לגיל 7 ימים. בנוכחות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור ל-M-CSF, תאי מח עצם התמינו למקרופאגים תוך 5 ימים (איור 2). היווצרות של תאים בצורת ציר נצפתה ביום השני להתמיינות (איור 2B), כמעט מחצית מהתאים הראו צורת ציר ביום השלישי (איור 2C), ורוב התאים נצמדו ויצרו צורות ציר מוארכות ביום החמישי להתמיינות (איור 2D). התפוקה של מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) בשיטה זו הייתה 2.5-5 מיליון תאים מ-5 גורים בני 7 ימים.

כדי לאפיין את BMDMs ממוינים באופן פנוטיפי, תאים מתרביות 5 ימים היו מסומנים חיסון עבור CD11b, CD206, ו F4/80. ניתן לראות סכמות פיזור קדימה/צד וסמן יחיד באיור משלים 1. התוצאות מניתוח ציטומטריית הזרימה הראו כי 76.4% מה-BMDM חיוביים הן עבור CD11b והן עבור F4/80 (איור 3A). אוכלוסיית F480-CD11b+ עקבית עם המספר המשוער של תאים חיוביים עבור CD206 (איור 3B). האחרון נחשב בדרך כלל לסמן העקבי עם מקרופאגים דמויי M2, ובעוד ששפע התיוג של CD206 יכול לנוע עד פי שניים יותר, שיעור גבוה יותר של תיוג F4/80 עקבי עם היכולת של M-CSF לקדם התמיינות לפנוטיפ דמוי M116,17 (איור 3).

הערכנו עוד יותר את היכולת של BMDMs יילודים ממוינים לחיידקי פגוציטוז ולהעביר אותם לתאים חומציים כמדד פונקציונלי. החיידקים המסומנים בצבע רגיש ל-pH צריכים להיות ירוקים רק כאשר הם עוברים פאגוציטוזה ומועברים לתאים חומציים. חיידקים פלואורסצנטיים ירוקים רבים שעברו פאגוציטוזה בתוך ה-BMDM זוהו לאחר זיהום (איור 4A). הפלואורסצנטיות הירוקה מתמקמת עוד יותר עם פלואורסצנטיות אדומה המעידה על ליזוזומים חומציים (איור 4B,C). פגוציטוזה והופעה של BMDM ילודים חיוביים לצבע עם pH ירוק נצפו גם הם במהלך הזיהום במשך 4 שעות (איור 4D ווידאו משלים). הפעילות התפקודית המוצגת כאן עקבית עם פעילות מקרופאגים דלקתיים דמויי M1.

figure-results-1
איור 1: בידוד של גורי עכבר C57BL/6J בני 7 ימים ממח עצם. (A) עצמות גפיים אחוריות של גורים בני 7 ימים בכלי בקוטר 100 מ"מ. (ב) איבר אחורי של גור בן 7 ימים לאחר הסרת העור והרקמה התת עורית; קווים מנוקדים שחורים מציינים את המקום לחתוך עבור מיצוי מח העצם. (C) הגפה האחורית של היילוד עיבדה עצמות עם מח לפני הריסוק. (D) הגפה האחורית של היילוד עיבדה עצמות לאחר ריסוק באמצעות בוכנה מזרק במסננת. (E) המספר הממוצע ± טעות התקן של תאי מקרופאגים ממח עצם (BM) וממח עצם שהתקבלו משלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: התמיינות של BMDMs מתאי מח עצם יילודים בני 7 ימים. תאי מח עצם ביום 1 (A), יום 2 (B), יום 3 (C) ויום 5 להתמיינות (D). חיצים אדומים בלוח B מציינים תאים דבוקים בצורת ציר ביום השני להתמיינות. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: זיהוי סמני מקרופאגים מורינים באמצעות אנליזה ציטומטרית של זרימה. מקרופאגים מובחנים שמקורם במח עצם בילודים המראים את הביטוי של אנטיגנים פני השטח F4/80 ו- CD11b (A) או CD206 ו- CD11b (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: פגוציטוזה של E. coli הרגיש ל-pH המסומן כ-E. coli על-ידי BMDM בילודים. (A) מקרופאגים שמקורם במח עצם המראים E . coli הרגיש ל-pH הרגיש ל-pH (ירוק) לאחר 4 שעות של זיהום. (B) BMDMs המסומנים בכתם עבור ליזוזומים חומציים (אדום). (C) תמונה ממוזגת של חלוניות (A) ו-(B). פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (D) שכבה של חיידקים פלואורסצנטיים ירוקים על מקרופאגים המוצגים בניגודיות פאזה. ההגדלה ב-(D) זהה להגדלה ב-(A). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

סרטון משלים. סרטון וידאו בן 4 שעות של הדמיה חיה של חיידקי פלורסנט ירוקים על-ידי BMDM בילודים כמו באיור 4 בלוח A. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

איור משלים 1: ניתוח ציטומטריית זרימה של BMDM. (A) BMDMs גודרו תחילה על FSC ו- SSC כדי להסיר פסולת וכפילים. צביעה יחידה של F4/80 (B), CD11b (C) ו-CD206 (D) מוצגת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר המערב מודלים של עכברי יילודים יכול להציב מספר אתגרים. ליילודים יש מערכת חיסונית מתפתחת שהיא ייחודית בהשוואה למבוגרים8. לפיכך, אין להניח שנתונים שנוצרו ממודלים של בעלי חיים בוגרים חלים על תינוקות, וכמה עבודות שפורסמו ביטאו רעיון זה היטב18,19. לכן, מודלים ספציפיים ליילודים ומקורות של תאים נחוצים כדי לחקור את המורכבות של התגובה החיסונית בתחילת החיים. עם זאת, בשל גודלם, רגישותם ואופיים העדין של עכברי היילודים, כמות הדגימות הביולוגיות יכולה להיות מוגבלת, ותהליך האיסוף יכול לקחת זמן. פרוטוקול זה קובע הליך פשוט וחסכוני בזמן לחילוץ מח עצם מעכברים ילודים.

עצמות עכבר בוגר גדולות מספיק כדי להחדיר מחט ולשטוף בקלות את המח. לעומת זאת, הגישה למח עצם בילוד באמצעות מחט מאתגרת בשל גודלה ושבריריותה. מחקרים מסוימים השתמשו בעיכול אנזימטי עם collagenase סוג II ו dispase20. כאן, בשל האופי הרך והזעיר של עצמות היילוד, אימצנו שיטת ריסוק לשחרור מח העצם. לאחר הטיהור, בהתאם ליישום המחקר המעניין, תאים אלה יכולים להיות ממוינים לסוגי תאים ספציפיים.

יילודים מציגים אוכלוסיות מקרופאגים פנוטיפיות מובהקות21. מחקר זה הבהיר את ההתמיינות של BMDMs מתאי מח עצם של גורים בגילאי 7-9 ללא שימוש באנזימים. צעדים קריטיים המעורבים במתודולוגיה כוללים את האופי העדין הכולל של גורי עכברים בילודים, איסוף העצמות הקטנות באופן שאינו מאפשר שחרור מח עצם, ואיתור המקום הנכון בשוקה ובעצם הירך לביצוע חתכי מספריים. ראינו כי BMDMs בילודים רגישים יותר מאשר BMDMs בוגרים בתרבית, ומשך זמן ארוך יותר של בידוד מח עצם מיילודים אסר על יכולת ההתמיינות שלהם. לפיכך, מיצוי מיותר מ -7 גורים בכל פעם אינו מוצע. בנוסף, התוספת של מדיית הבידול BMDM ביום השני של הבידול הביאה גם לתוצאות גרועות כגון בידול גרוע וכדאיות נמוכה יותר.

פרוטוקול זה השתמש בסופרנאטנט תאי L929 כמקור של M-CSF להתמיינות תאי מח עצם למקרופאגים. תאי L929 הם פיברובלסטים מורינים הידועים כמייצרים כמויות גבוהות של M-CSF10. המקרופאגים צפויים להיחשף לחומרים אחרים המופרשים בסופרנטנט L929, יחד עם M-CSF. M-CSF מטוהר מסחרי יכול לשמש גם להבדיל מקרופאגים; עם זאת, לא השווינו אותו ישירות לשימוש בסופרנטנט תרבות L929. חשוב גם לציין כי L de Brito Monteiro et al. הבחינו בפרופילים מטבוליים מובהקים בין מקרופאגים שנוצרו באמצעות L929 ו- M-CSF22 מסחרי.

שיטה זו ביססה גישה חסכונית וחוסכת זמן ללא שימוש באנזימי עיכול כלשהם. הטכניקה הניבה בידוד אמין של מח עצם בילוד שהביא להתמיינות ברורה של BMDMs בילוד. BMDMs ילודים מבודדים יכולים לשמש גם לחקר דינמיקה של מקרופאגים בילוד במהלך זיהומים שונים וויסות דלקת על ידי תאים אלה. מגבלות השיטה כוללות עקומת למידה להתבססות ראשונית והתאמה לתהליך משיכת העצמות הקטנות, אשר בסופו של דבר משתפרת עם הניסיון וממזערת את משך התהליך עם כדאיות מוגברת של התאים. גודל ההמלטה של הגורים הוא שיקול נוסף למספר המקרופאגים שניתן להבדיל ביניהם בהתאם לצורך הניסויי.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכותבים אין ניגודי עניינים הרלוונטיים למאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [R01 AI163333] ל- CMR. אנו מכירים בתמיכת מימון נוספת הניתנת ל- West Virginia University Flow Cytometry and Single Cell Core Facility על ידי המענקים הבאים: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 ומענק NIH OD016165.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
40 ומיקרו; m מסננתGreiner542040תרבית תאים
96 צלחת תחתונה עגולה היטב (U)Thermo Scientific12-565-65תרבית תאים
נגד עכבר CD11b-BV786BD Biosciences740861ניתוח FACS
נגד עכבר CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709ניתוח FACS
נגד עכבר F4/80-PEBD Biosciences565410ניתוח FACS
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACCמונה תאים אוטומטי
DMEMHycloneSH30022.01תרבית תאים
DMSOVWRWN182תרבית תאים
DPBS, 1xCorning21-031-CVתרבית תאים
Escherichia coli זיהום O1:K1:H7ATCC11775
EVOS FL Invitrogen12-563-649מערכת הדמיית תאים 
FBSאוונטור 76419-584תרבית תאים
FluoroBright BMDMThermo fisher ScientificA1896701מדיה לתרבית ללא צבע
גלוטמיןCytivaSH30034.01תרבית תאים
HEPESCytivaSH30237.01תרבית תאים
L-929ATCCDifferentiation
LSROrtessaBecton DickinsonFlowcytometer
Lysotracker אדום DND 99InvitrogenL7528צבע פלואורסצנטי
MEMCorning15-010-CVתרבית תאים
פניצילין / סטרפטומיצין HycloneSV30010תרבית תאים
pHrodo ירוק STP אסטר InvitrogenP35369צבע פלואורסצנטי
T75 בקבוקCell Star658170תרבית תאים
Trypsin-EDTAGibco25300120תרבית תאים
Zeiss 710 צייסP20GM103434קונפוקלי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
  2. Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
  3. Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
  4. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  5. Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
  6. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
  7. Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
  8. Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
  9. Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957(2021).
  10. Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, pub prot5080 (2008).
  11. Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566(2023).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
  14. Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
  15. Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654(2012).
  16. Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792(2019).
  17. Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931(2022).
  18. Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077(2018).
  19. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  20. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358(2022).
  21. Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
  22. de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Neonatal Bone MarrowBone Marrow IsolationBone Marrow Derived MacrophagesMacrophage DifferentiationFlow CytometryPhagocytosis AssayL929 Conditioned MediumHypotonic SolutionEscherichia Coli InfectionCell Counter

מאמרים קשורים