עכבר יילודים בידוד מח עצם והכנת מקרופאגים שמקורם במח עצם

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא אנזימטית ופשוטה לבידוד תאי מח עצם של עכבר יילודים בני 7-9 ימים ויצירת מקרופאגים ממוינים באמצעות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור לגורם מגרה מושבת גרנולוציטים (M-CSF). המקרופאגים שמקורם במח עצם נותחו עוד יותר עבור אנטיגנים פני השטח F4/80, CD206, CD11b וכשירות תפקודית.

תקציר

טכניקות שונות לבידוד מח עצם מעכברים בוגרים כבר מבוססות היטב. עם זאת, בידוד מח עצם מעכברים ילודים הוא מאתגר וגוזל זמן, אך עבור דגמים מסוימים, הוא רלוונטי והכרחי מבחינה תרגומית. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ופשוטה להכנת תאי מח עצם מגורים בני 7-9 ימים. תאים אלה יכולים להיות מבודדים עוד יותר או להתמיין לסוגי תאים ספציפיים בעלי עניין. מקרופאגים הם תאי חיסון חיוניים שממלאים תפקיד מרכזי בדלקת ובזיהום. במהלך ההתפתחות, מקרופאגים בילודים תורמים באופן משמעותי לעיצוב מחדש של רקמות. יתר על כן, הפנוטיפ והתפקודים של מקרופאגים בילודים שונים מאלה של עמיתיהם הבוגרים. פרוטוקול זה מתאר גם את ההתמיינות של מקרופאגים בילודים מתאי מח עצם מבודדים בנוכחות תווך מותנה L929. סמני פני השטח של מקרופאגים יילודים מובחנים הוערכו באמצעות אנליזה ציטומטרית של זרימה. כדי להדגים פונקציונליות, היעילות הפאגוציטית נבדקה גם באמצעות Escherichia coli מצומד לצבע הרגיש ל- pH.

מבוא

מח עצם מקיף אוכלוסיות תאי גזע המטופויטיות ומזנכימליות המתחדשות מעצמן וניתן להתמיין לשושלות תאים שונות. תאי גזע המטופויטיים במח העצם מולידים שושלות מיאלואידיות ולימפואידיות¹. תאי גזע מזנכימליים מייצרים אוסטאובלסטים (עצם), אדיפוציטים (שומן) או כונדרוציטים (סחוס)². לתאים אלה יישומים רבים בתחום הביולוגיה של התא והנדסת רקמות, כולל ריפוי גנטי ^3,4. תאי אב הנמצאים במח העצם מתמיינים לסוגי תאים ספציפיים בנוכחות גורמי גדילה ספציפיים לשושלת. Erythropoietin מקדם את התפשטות של תאי אב אריתרואידים, גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (G-CSF) מגרה את הצמיחה של מושבות נויטרופילים, ו thrombopoietin מסדיר את הייצור של טסיות כמו כמה דוגמאות של גורמי גדילה ספציפיים לשושלת⁵. אנטיגן פני השטח של התא המסומן FACS ומיון תאים המופעלים מגנטית (MACS) הן שיטות מבוססות היטב לבידוד וטיהור של סוגי תאים ספציפיים שמקורם במח עצם⁶.

למרות שמחקרי יילודים מתקדמים לקראת מציאת הגורמים למוות יילודים וטיפול בסיבוכים במהלך לידות מוקדמות, פיתוח טיפולי ישיר נותר צורך רפואי שלא נענה. סמית ודיוויס הצהירו, "ילדים חולים נשארים יתומים טיפוליים"⁷. ישנם מספר אתגרים, כגון דגימות קטנות, השפעות לכל החיים של התוצאה, ובעיות אתיות בקבלת הסכמה במחקרים קליניים של יילודים⁸. לפיכך, יש ביקוש גבוה למודלים של מחקר in vivo ו - in vitro ספציפיים ליילודים כדי להשיג רלוונטיות תרגומית. בגלל הדמיון בין רמות אנטומיות ורקמות, תקופות הריון קצרות וגודל המלטה, מכרסמים הם מערכת המודל הנחקרת ביותר של יונקים.

במאמר זה אנו מתארים הליך מפורט, אפשרי ביותר וניתן לשחזור לבידוד מח עצם מגורי עכברים בני 7-9 ימים ויכולתם להתמיין למקרופאגים. עם זאת, ניתן להשיג מגוון של שושלות תאים באמצעות שימוש באותות התמיינות ברורים. אנו גם מדגימים נוכחות של סמנים על פני השטח של התא ואת הנוכחות של פעילות פגוציטית במבחנה הצפויה עבור מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM).

פרוטוקול

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים במערב וירג'יניה ובוצעו בעקבות המלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה על ידי מועצת המחקר הלאומית. גורי עכברים C57BL/6J שימשו במחקר זה. הפרטים של כל הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מדיה

1. הכינו 3 מ"ל של חומר תרבית MEM בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ גלוטמין, 25 מ"מ HEPES ופניצילין (100 U/mL)/סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) בצינור צנטריפוגה של 5 מ"ל, ושמרו אותו על קרח.
2. במידת הצורך לאחסון אבות מח עצם בחנקן נוזלי, הכינו מדיית הקפאה המכילה 10% DMEM, 80% FBS ו-10% DMSO.
3. עבור DMEM מלא, להכין DMEM בתוספת 10% FBS, 2 mM גלוטמין, 25 mM HEPES, ופניצילין (100 U / mL) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל).
4. להתמיינות מקרופאגים, הכינו DMEM בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ גלוטמין, פניצילין (100 U/mL)/סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל), ו-10% סופרנאטנט^תאי L929 ^9,10,11.

2. הכנת סופרנאטנט תאי L929

1. להפשיר תאי L929 המאוחסנים בחנקן נוזלי ולהעביר לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל DMEM מלא. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
2. להשהות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של מדיה DMEM מלאה ולזרוע אותם לתוך בקבוק תרבית רקמה T25 בצפיפות של 2×10⁵ תאים. ספור את התאים עם מונה תאים אוטומטי באמצעות 0.4% טריפאן כחול. לדגור ב 37 ° C עם 5% CO₂ עד שהם מגיעים 70% מפגש.
3. כדי לנתק את התאים, תחילה לשטוף אותם עם 5 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט (PBS). שאפו את PBS והחליפו אותו ב-2.5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA.
4. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 5 דקות ולהוסיף 5 מ"ל של DMEM מלא.
5. לאסוף את התאים ואת הצנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
6. להשעות מחדש את גלולת התא ב 15 מ"ל של מדיה DMEM מלאה ולהעביר אותו צלוחיות T75.
7. לדגור ב 37 ° C עם 5% CO₂ עד התאים להגיע 90% מפגש, ולאחר מכן לאסוף את התווך ואת הצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. סנן את המדיה המכילה M-CSF דרך מסנן 0.45 מיקרומטר והקפיא ב -80 ° C ב 5 מ"ל aliquots.

3. הכנת בעלי חיים

1. מתחת לארון בטיחות ביולוגית, הפרידו בזהירות את גורי העכבר C57BL/6J בני 7-9 ימים (המלטה של 6 גורים) מהסכר והניחו אותם בכלוב נפרד.
2. השרו כדור צמר גפן ב-2 מ"ל איזופלורן ברמה וטרינרית בצנצנת פעמון או בתא הכלה אחר.
3. מניחים גור בתא וסוגרים את המכסה. נטרו את היילוד במשך כ-90 שניות כדי לוודא שהוא הופך לחסר תנועה ומחוסר הכרה.
4. הוציאו במהירות את ראשו של הגור וערפו את ראשו במספריים חדים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הממסד) לפני שהגור יוכל לחזור להכרתו.
   הערה: יילודים אינם נושמים עמוק מספיק להמתת חסד על ידי שאיפת איזופלורן בלבד.
5. הקפידו לסגור את מכסה המיכל לאחר הסרת כל גור. אותו כדור צמר גפן יכול לשמש 5-7 גורים.

4. בידוד מח עצם יילודים

1. לעקר את הגוף של היילוד עם 70% אתנול.
2. "באמצעות מלקחיים ומספריים כירורגיים עדינים, לבצע חתך בין
   בטן ורגליים אחוריות. הסר את העור על ידי משיכה לכיוון כף הרגל של הגפיים האחוריות.
3. מגרדים את רקמת החיבור והשריר המחוברים לעצמות באמצעות מלקחיים בעלי קצוות חדים.
4. חתכו את השוקה ואת עצם הירך, כפי שמוצג באיור 1, בעזרת מספריים כדי לנתק ולהסיר. בעזרת מלקחיים, הניחו עצמות אלה בצינור המדיה על קרח. חזור על התהליך עבור כל גור.
5. מעבירים את העצמות בעזרת מלקחיים למסננת 40 מיקרומטר עם צינור איסוף. למחוץ את העצמות ולשחרר את המוח על ידי לחיצה עם מזרק 3 מ"ל בוכנה נגד המסננת.
6. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
7. לשאוף את supernatant ולהשעות מחדש את התאים על ידי pipetting עדין ב 0.2% NaCl, פתרון hypotonic עבור lysis של אריתרוציטים. הוסף מיד נפח שווה של 1.6% NaCl כדי להביא את התמיסה איזוטונית.
8. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תמיסת ליזיס.
9. השהה מחדש ב- DMEM מלא לשימוש מיידי או בהקפאת מדיה לאחסון וספור את התאים באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
   הערה: במחקר הנוכחי, שיטה זו הניבה 6.55 (± 1.44) ×^{10 6} תאי מח עצם/גור (איור 1E).
10. אחסן את התאים בטמפרטורה של -80°C במדיה מקפיאה, או השתמש בהם באופן מיידי כמתואר להלן.
    הערה: בגלל הגיל, העצמות שקופות וברורות מספיק כדי לדמיין את המח דרכן. חשוב להיות זהירים בעת משיכת העצמות כמו הפעלת לחץ קל עליהם עשוי להיות מספיק כדי לשחרר את המוח. המח בעצמות היילוד הוא בצורת נוזל ולא חוט שלם שנמצא בעצמות בוגרות. קשה לאסוף את המח אם הוא בורח במהלך איסוף העצמות.

5. התמיינות של מקרופאגים שמקורם במח עצם בילוד

1. זרעים 2 × 10⁷ תאי מח עצם לכל בקבוק T75 ב-10 מ"ל DMEM מלא המכיל 10% סופרנאטנט תאי L929 (2.5 מ"ל) כמקור ל-M-CSF. לדגור את מנות התרבות ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 5 ימים. הוסף 2 מ"ל של מדיה מותנית L929 ביום השלישי של הבידול.
2. התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ מדי יום באמצעות מיקרוסקופ הפוך ומערכת הדמיה בהגדלה של פי 20. לאחר ההתמיינות, המקרופאגים צריכים להיראות דבוקים, מוארכים והטרוגניים (איור 2).
3. כדי לקצור את המקרופאגים לבדיקות במורד הזרם, שאפו את אמצעי הבידול.
4. שטפו את התאים עם 5 מ"ל של PBS כדי להסיר תאים שאינם דבקים וחלבונים בסרום שיפריעו לניתוק. שאפו את PBS.
5. קצרו את התאים על ידי הוספת 5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצלוחית. מניחים את בקבוק התרבית בטמפרטורה של 37°C עם אינקובטור CO₂ של 5% למשך 5 דקות ומוסיפים 5 מ"ל DMEM.
6. פיפטה התאים לניתוק וצנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. נתק את גלולת התא ב 1 מ"ל של DMEM מלא, ולספור ולבדוק את כדאיות התא באמצעות כחול טריפאן. BMDMs שבודדו באמצעות שיטה זו הם 7.05 (± 2.52) ×10⁵ תאים/גור (איור 1E).
   הערה: שימו לב לנוכחות של תאים בצורת ציר שמתחילים להופיע ביום השני להתמיינות (איור 1B, חיצים אדומים). אם צבע המדיה הופך צהוב, המציין שהוא בילה, להוסיף עוד מדיה מותנית L929 ביום 4 של בידול; החלפה מלאה של מדיה אינה מומלצת.

6. תיוג חיסוני וניתוח ציטומטרי זרימה

1. חסום תיוג נוגדנים לא ספציפי של BMDMs (2x10⁵/label) על ידי טיפול עם 10 μL/10⁷ תאים של מגיב חוסם FcR על פי המלצות היצרן בנפח של 100 μL / חיץ ציטומטריה זרימת תווית (PBS בתוספת 2 mM EDTA ו 0.5% אלבומין בסרום בקר). שומרים על קרח למשך 10 דקות.
   הערה: ניתן לחסום את התאים בכמויות גדולות או בבארות או צינורות בודדים. כל השלבים הבאים מציינים כמויות ונפחים לכל תווית סמן תא בודד בנפח סופי של 100 μL.
2. שטפו את התאים על ידי הוספת 200 μL של חיץ ציטומטריית זרימה וצנטריפוגה ב 525 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
3. מוציאים את הסופרנאטנט וזורעים את התאים בצלחת באר U-bottom 96 בצפיפות של 5 × 10⁵ תאים לכל באר. צביעת תאים על ידי הוספת צבע FVS780-Live/Dead לספירת תאים מדולל פי 3,000 ו-0.625 μL של BV786-CD11b, PE-F4/80 ו-AlexaFluor488-CD206 ב-100 μL של חיץ ציטומטריית זרימה בנפרד או בשילוב 12,13,14,15. דוגרים על התאים במשך 45 דקות על קרח מכוסה בנייר כסף.
4. הוסף 100 μL של חיץ ציטומטריית זרימה ולשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 525 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
5. שאפו את הסופרנאטנט וסובבו את גלולת התא בעדינות. הוסיפו 100 מיקרוליטר של 0.4% פרפורמלדהיד לכל באר ודגרו למשך הלילה ב-4°C.
6. שטפו את התאים על ידי הוספת 100 μL של חיץ ציטומטריית זרימה וגלולה על ידי צנטריפוגה ב 525 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
7. להשהות מחדש את התאים ב 400 μL של מאגר ציטומטריית זרימה ולנתח באמצעות ציטומטר זרימה.

7. בדיקת מבחנה להערכת היעילות הפאגוציטית של מקרופאגים שמקורם במח עצם בילוד

1. השהה מחדש את BMDMs ב- DMEM מלא ללא פנול אדום או אנטיביוטיקה וזרע אותם בצפיפות של 2 × 10⁵/ רביע בצלחת מרובעת 35 מ"מ בנפח של 500 μL.
2. כדי להכין את החיסון החיידקי בריבוי זיהומים (MOI) של 25 או MOI רצוי אחר, הסר מלאי מחושב מראש של Escherichia coli O1:K1:H7 המאוחסן ב -80 ° C.
3. Aliquot את נפח החיידקים הרצוי לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל. לשטוף את החיידקים על ידי הוספת PBS לנפח כולל של 1 מ"ל. משחררים את החיידקים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 2,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חזרו על שלב הכביסה.
4. יש להשהות מחדש את כדורית החיידקים ב-50 מיקרוליטר PBS ולהוסיף צבע ירוק רגיש ל-pH פלואורסצנטי לריכוז סופי של 500 מיקרומטר. זהו צבע רגיש ל- pH ללא אות פלואורסצנטי ב- pH ניטרלי ופלואורסצנטי בהיר בסביבות חומציות, כגון פגוזומים חומציים, במהלך תהליך הפאגוציטוזה.
5. דוגרים על תאי החיידק במשך 20 דקות בחושך לצורך צימוד צבע.
6. לשטוף את החיידקים ארבע פעמים עם 1 מ"ל של PBS על ידי צנטריפוגה ב 1000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. להשהות מחדש את החיידקים ב 500 μL של DMEM מלא ללא פנול אדום ולהוסיף תרביות BMDM.
8. יש לדגור על BMDMs בטמפרטורה של 37°C באינקובטור CO₂ של 5% למשך 4 שעות, ולאחר מכן להוסיף 200 ננוגרם של צבע פלואורסצנטי אדום חדיר לתאים שמכתים את הליזוזומים.
   הערה: ניתן להמחיש חיידקים פגוציטיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

באמצעות השיטה המתוארת במחקר זה, ניתן לבודד בהצלחה 25 עד 37 מיליון תאי מח עצם מגודל המלטה של חמישה גורי עכברים C57BL/6. שיטה זו אומתה עם גדלי המלטה הנעים בין 5 ל -7 גורים. גיל הבידוד המינימלי בניסויים שלנו היה 7 ימים. בהתאם לגודל ההמלטה ומספר התאים הדרושים לניסוי שהוא פחות ממיליון, החוקרים יכולים לנסות פרוטוקול זה עבור עכברים מתחת לגיל 7 ימים. בנוכחות סופרנאטנט של תאי L929 כמקור ל-M-CSF, תאי מח עצם התמינו למקרופאגים תוך 5 ימים (איור 2). היווצרות של תאים בצורת ציר נצפתה ביום השני להתמיינות (

דיון

מחקר המערב מודלים של עכברי יילודים יכול להציב מספר אתגרים. ליילודים יש מערכת חיסונית מתפתחת שהיא ייחודית בהשוואה למבוגרים⁸. לפיכך, אין להניח שנתונים שנוצרו ממודלים של בעלי חיים בוגרים חלים על תינוקות, וכמה עבודות שפורסמו ביטאו רעיון זה היטב^18,19. לכן, מודלים ספציפיים ליילודים ומקורות של תאים נחוצים כדי לחקור את המורכבות של התגובה החיסונית בתחילת החיים. עם זאת, בשל גודלם, רגישותם ואופיים העדין של עכברי היילודים, כמות הדגימות הביולוגיות יכול...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
40 ומיקרו; m מסננת	Greiner	542040	תרבית תאים
96 צלחת תחתונה עגולה היטב (U)	Thermo Scientific	12-565-65	תרבית תאים
נגד עכבר CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	ניתוח FACS
נגד עכבר CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	ניתוח FACS
נגד עכבר F4/80-PE	BD Biosciences	565410	ניתוח FACS
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	מונה תאים אוטומטי
DMEM	Hyclone	SH30022.01	תרבית תאים
DMSO	VWR	WN182	תרבית תאים
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	תרבית תאים
Escherichia coli זיהום O1:K1:H7	ATCC	11775
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	מערכת הדמיית תאים
FBS	אוונטור	76419-584	תרבית תאים
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	מדיה לתרבית ללא צבע
גלוטמין	Cytiva	SH30034.01	תרבית תאים
HEPES	Cytiva	SH30237.01	תרבית תאים
L-929	ATCC		Differentiation
LSROrtessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker אדום DND 99	Invitrogen	L7528	צבע פלואורסצנטי
MEM	Corning	15-010-CV	תרבית תאים
פניצילין / סטרפטומיצין	Hyclone	SV30010	תרבית תאים
pHrodo ירוק STP אסטר	Invitrogen	P35369	צבע פלואורסצנטי
T75 בקבוק	Cell Star	658170	תרבית תאים
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	תרבית תאים
Zeiss 710	צייס	P20GM103434	קונפוקלי