יישומים של ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית במחקר מוצרים טבעיים: אלקלואידים טרופאן כמקרה בוחן

אף על פי שמולקולות סינתטיות לחלוטין הפכו לבולטות יותר בגילוי תרופות בעשורים האחרונים, כמעט שני שלישים מכל התרופות שאושרו ב-39 השנים האחרונות הן מוצרים טבעיים או בהשראת מוצרים ^{טבעיים,1,2}  מה שמדגיש את החשיבות המתמשכת של מחקר מוצרים טבעיים. אלקלואידים, מוצרים טבעיים מסוימים המכילים חנקן, מוערכים במיוחד בזכות תכונותיהם הרפואיות. אלקלואידים טרופאן (TAs) המכילים את [3.2.1.]- מערכת דו-גלגלית המכילה חנקן, מיוצרת בעיקר על ידי צמחים ממשפחות הסולניים (סולניים), אריתרוקסילאיים (Erythroxylaceae) וקונבולוולוסיים (Convolvulaceae). דוגמאות כוללות אטרופין, סקופולמין וקוקאין; מספר טרופיות חצי סינתטיות או סינתטיות משמשות גם מבחינה קלינית³. TAs ונגזרותיהם משמשים לטיפול במצבים רבים ^3,4 וכמה מתרופות אלה מופיעות ברשימת התרופות החיוניות⁵ של ארגון הבריאות העולמי לשנת 2023. בשל פעילותם רבת העוצמה, TAs משמשים גם לשעות הפנאי (כממריצים או מדלירים) ועלולים לגרום להרעלה בבליעה של צמחים (או תכשירים) המכילים אותם ^6,7. TAs אינם רצויים במזון לבני אדם ובעלי חיים⁸ ויכולים להכתים תה, תבלינים, דגנים, דבש ותוספי צמחים ^9,10. הן בשל ההבטחה הרפואית שלהן והן בשל יכולתן להרעיל, שיטות אנליטיות שיכולות לסייע בגילוי TAs חדשים (וזיהוי של TAs ידועים) הן שימושיות.

בספקטרומטריית מסות מקבילה (MS/MS), "מסנני מסה" (למשל, קוואדרופולים, צינורות זמן טיסה) מחוברים זה לזה פיזית ("בחלל"), או שמכשיר מפעיל צעדי תגובה/הפרדה נוספים "בזמן". MS/MS בחלל משתמש במצבים שונים כדי לבחור ולפרק יונים שונים במסנני המסה השונים (למשל, הקוואדרופולים של מכשיר משולש-מרובע או מכשיר QQQ). ניתן להשתמש במצבים שונים אלה כדי לקבוע אילו מקטעים ספציפיים מיוצרים על ידי יון נתון (סריקת יוני מוצר), אילו יונים בדגימה מניבים מקטעים מסוימים (סריקת יונים מקדימים או PrIS) או עוברים אובדן של מסה אופיינית (סריקת אובדן נייטרלי או NLS), או אילו תרכובות ספציפיות מכילות אילו מקטעים ספציפיים (ניטור תגובה מרובה). MS/MS, אם כן, מספק מקטעים שימושיים להצעת מבנים לתרכובות חדשות או לאישור נוכחותה של תרכובת קיימת. MS/MS נמצא בשימוש הולך וגובר בגילוי תרופות, כימיה של מוצרים טבעיים ושדות מטבולומיים ^11,12, ושימש לפרופיל מינים המכילים אלקלואידים (לאפיון פיטוכימי או ניתוח כימוטקסונומי) ולזיהוי וכימות אלקלואידים ספציפיים במזון או בצמחי מרפא 10,13,14,15,16.

למרות טכניקות ספקטרומטריית המסות הרבות הזמינות, ישנם אתגרים במציאת אלקלואידים חדשים. בנוסף למציאת אורגניזם מועמד לסינון, אישור מבני מלא של אלקלואיד הוא תהליך מפרך שעשוי לכלול טכניקות אנליטיות רבות ושונות. בנוסף, החוקרים יוכלו לבודד תרכובת שכבר ידועה, תוך בזבוז עבודה, זמן ומשאבים. הדבר קשה במיוחד עבור ת"א, שם מדווחים על מאות, אם לא אלפי ת"א, שרבים מהם איזומריים זה עם זה. התהליך של "זיהוי הידועים והבדילתם מן הנעלמים" מכונה שכפול. מאגרי מידע של זמני השמירה (r.t.s) ושברי מסה של TAs שונים ותרכובות אחרות מתפרסמים כדי לסייע בתהליך זה^17,18. אף על פי כן, השכפול מייגע; רק ביאור (כלומר, הקצאת מבנים משוערים) לאלקלואידים בכל כרומטוגרמה LC-MS/MS של הדגימה גוזל זמן. לאחרונה, הן רשת מולקולרית^{1 9,20} והן שכפול ידני 18,21,22 שימשו עבור אלקלואידים של בנזיליסוקינולין, אינדול מונוטרפן וטרופאן, ו-PrISs שימשו ל"סינון מבני" של ספקטרום לזיהוי אלקלואידים מסוג פירוליזידין וסולנין ^23,24. עם זאת, אין שיטות או זרימות עבודה ספציפיות זמינות לשכפול מהיר מבוסס LC-MS/MS של דגימות המכילות TA, אף על פי שלדגימות TA יש מקטעים נפוצים וקלים לזיהוי (איור 1). השיטה המתוארת כאן משתמשת בשילוב של סריקות יוני תוצר תלויי נתונים (DD), PrISs ו-NLSs כדי לבאר ולסווג מבני TA בצמחים בהתבסס הן על תבניות הפיצול הנפרדות של טרופאנים מונו, די ותלת-תחליפים (איור 1A) והן על ההפסדים של קבוצות אסטר נפוצות שנמצאו בלקלואידים האלה (איור 1B). יצורי המחקר הם כמה מינים בסוג הסולת Datura. מקור עשיר של TAs מגוונים, Datura שימש לאורך ההיסטוריה של העולם למטרות רפואיות ותרבותיות¹⁷ - והוא מטריצה מאתגרת לשכפול בגלל TAs רבים, דומים מבחינה מבנית, המספקים לנו דוגמאות מושכות שעליהן ניתן לבחון את השיטה שלנו.

התראה: עיין בכל גיליונות נתוני בטיחות החומרים הרלוונטיים (MSDS) לפני השימוש בכימיקלים הרשומים.

1. הכנת מדגם

אזהרה: חנקן נוזלי עלול לגרום לכוויות קריוגן. יש להשתמש בכפפות קריוגן והגנה על העיניים באזור מאוורר היטב. דגימות צמחים המכילות אלקלואידים יכולות להיות מעצבנות את העור; תמיד לטפל בהם עם כפפות. מתנול הוא רעיל ודליק ויש לטפל בו במכסה אדים הרחק ממקורות הצתה פוטנציאליים.

הערה: בתיאוריה, ניתן להשתמש ברקמת צמח מתורבת או פראית (מיובשת או טחונה טרייה); ההליך שלהלן הוא בדיוק זה שנעשה בו שימוש במהלך פיתוח השיטה.

1. אם רקמת הצמח המעניינת טרייה, הקפיאו אותה על ידי הכנסתה לצינור חרוטי פוליפרופילן וטבילתה בחנקן נוזלי למשך 2-3 דקות.
2. מניחים את רקמת הצמח הקפואה במכתש מצונן מראש (בצידנית פוליסטירן עם חנקן נוזלי), ובעזרת חומר מצונן מראש, טוחנים את הרקמה לאבקה אחידה.
3. יש לשקול במהירות את כמות הרקמה הרצויה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה מפוליפרופילן באמצעות מרית מקוררת מראש, ולהוסיף מיד 20% מתנול (בטמפרטורת החדר [RT]) בריכוז של 1 מ"ל לכל 100 מ"ג רקמה.
   הערה: מתנול (20%) משמש בדרך כלל למיצוי TAs²⁵. מדי פעם, 0.1% חומצה פורמית מתווספת, אם כי לא נצפה הבדל ביעילות המיצוי במהלך הפיתוח של שיטה זו ואחרים.
4. הניחו את הצינורות הסגורים על שייקר נדנדה (מהירות בינונית) למשך 3 שעות לפחות ב-RT.
5. צנטריפוגה את הצינורות ב 9464 x גרם במשך 10 דקות. פיפטה מהסופרנאטנט לתוך בקבוקון דוגמית אוטומטית LC-MS, או, אם עדיין מעונן, לסנן תחילה דרך מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, אם כי יש לאחסן דגימות ותמציות צמחים טריים מעובדים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לפני הניתוח כדי למנוע פירוק אלקלואיד פוטנציאלי.

2. תצורת מכשיר LC-MS ואיסוף נתונים

זהירות: אצטוניטריל רעיל ודליק; יש להרחיק ממקורות הצתה ולשלוט באדים באמצעות מכסה אדים. חומצה פורמית היא קורוזיבית; יש להימנע ממגע עור ועין ולבשו ציוד מגן אישי מתאים.

1. השתמש במכשיר LC-MS עם מקור יינון אלקטרוספריי (ESI) ועמוד HPLC בפאזה הפוכה (C18, 4.6 x 100 מ"מ).
2. עבור HPLC, השתמש ב-0.1% חומצה פורמית ב-H₂O כממס A וב-0.1% חומצה פורמית באצטוניטריל כממס B; אזנו את העמודה עם 99% A ו-1% B. הגדירו שיפוע של 30 דקות של 1%-50% B במשך 26 דקות, חזרו ל-1% B ב-26.01 דקות והחזיקו ב-1% B למשך 4 דקות. יש להשתמש בטמפרטורת תנור עמודים של 45°C ובקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה.
3. בשיטת LC-MS, השתמש בפרמטרי ההפעלה הבאים עבור ספקטרומטר המסות: מתח ממשק: 4.0 קילו-וולט, זרימת גז ערפילית: 3 ליטר/דקה, זרימת גז חימום: 10 ליטר/דקה, טמפרטורת DL: 250 °C, טמפרטורת בלוק חום: 400 °C, טמפרטורת ממשק: 300 °C, זרימת גז ייבוש: 10 ליטר/דקה, ולחץ גז דיסוציאציה (CID) (ארגון) המושרה על ידי התנגשות של 17 kPa.
4. בנה שיטת MS במצב חיובי ESI הכוללת הן סריקת Q3 והן סריקת Q1 (100-1000 Da) המתפקדת כאירוע סקר (מוגדר לאורך שיטת LC), עם אי הכללת איזוטופים אוטומטית מופעלת. כלול סריקת יוני מוצר כאירוע תלוי של סריקת Q1 (ניתוח DD), עם חלון מסה של 50-1000 Da, אנרגיית תא התנגשות של -20 V, וזמן אירוע של <0.2 שניות.
   הערה: סף הספירה להפעלת סריקת יונים של מוצר DD של Q1 יכול להיות משתנה, אך בדרך כלל, נעשה שימוש ברמה של 7,000-10,000 ספירות. במכשירים מסוימים, כגון זה ששימש לפיתוח השיטה, סריקת Q3 מספקת דיוק מסה ורגישות גדולים יותר מאשר Q1 ונכללת כדי לאשר יונים שנצפו בסריקת Q1, אם כי ניתן להשמיט אותה משלב 2.4 ללא בעיה.
5. לשיטת MS לעיל, הוסף PrISs במצב חיובי השווה לאורך שיטת LC עם אנרגיות תא התנגשות של -20 V וזמני אירוע של 0.75 שניות. ודא שבכל המקרים, פונקציות Automatic Isotope Exclude או De-isotoping מופעלות. ודא שערכי m/z המעניינים מקטעי TA (ב- Da, ראה איור 1A) הם 124.1 (עבור TAs חד-תחליפים, חלון מסה של 125-1000 Da), 122.1 ו- 140.1 (עבור TAs מוחלפים, חלונות מסה המתחילים ב- 123 ו- 141 Da, בהתאמה), ו- 156.1 ו- 138.1 (עבור TAs תלת-תחליפים, חלונות מסה המתחילים ב- 157 ו- 139 Da, בהתאמה).
   הערה: במהלך פיתוח השיטה, ה- PrIS פוצלו לשתי שיטות שונות, אחת עבור TAs מונו ו- disubstituted ואחת עבור TAs תלת-תחליפים, אם כי ניתן לפצל או לשלב אותם בכל דרך.
6. בנה שיטת MS שנייה הכוללת את הפרמטרים בשלב 2.4.
   1. לשיטת MS/MS זו, הוסף NLS במצב חיובי השווה לאורך שיטת LC, עם אנרגיות תא התנגשות של -20 V וזמני אירוע של 0.75 שניות. ודא שבכל המקרים, פונקציות Automatic Isotope Exclude או De-isotoping מופעלות.
   2. ודא שמסות ההפסד הניטרליות של עניין עבור אסטרים על TAs (ב- Da, ראה איור 1B) הן 100.05 (עבור אסטרים שמקורם בחומצה טיגלית, חלון מסה של 110-1000 Da), 60.03 (עבור קבוצות אצטילי, חלון מסה של 100-1000 Da), ו- 166.06 (אסטרים של חומצה פנילקטית או טרופית, חלון מסה של 170-1000 Da).
7. הורד את שיטת LC-MS וצור קבצי נתונים עבור דוגמאות של עניין. לאחר שעמודת HPLC מאוזנת ב- 45 °C, הפעל את הדגימות המעניינות באצווה או בקובץ פרויקט עם ריקים ממס מיצוי מתאימים בין מינים או סוגי רקמות שונים. נפח הזרקה טיפוסי הוא 10-20 μL.
   הערה: בנפחים גבוהים במיוחד, גלאי ספקטרומטר המסות עשוי להיות רווי. אם אתם מריצים דגימות מרוכזות מאוד, ודאו שמקור ה-ESI מנוקה ושהמכשיר מכוון באופן קבוע. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן לאחר איסוף כל הנתונים.

3. ניתוח נתונים

1. בחן את כרומטוגרמת היונים הכוללת של סריקות Q1 ו- Q3 (וסריקת יונים של מוצר DD), ושים לב למסת האב של כל יונים שופעים בעלי תכונות דמויות TA: א) מסה <500 da עבור יון [m+h]⁺ , בדרך כלל מסה זוגית, ב) r.t.s טיפוסי בין 2-22 דקות בשיטת LC לעיל, ו- c) מקטעים מהרשימה הבאה: m/z 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 או 128 Da.
2. בדוק את הכרומטוגרמה/ערוץ PrIS עבור m/z 124, ושים לב אילו פסגות/יונים הם שבהם r.t.s (שנרשם בשלב 3.1) מייצר קטע זה. לחץ סריקה אחר סריקה דרך הכרומטוגרמה וכן בחן את ספקטרום MS/MS המלא המתקבל בסריקת יוני המוצר DD, במיוחד עבור מינים בעלי שפע נמוך יותר.
   הערה: מין אמיתי המכיל מקטע זה יתקיים עבור סריקות מרובות ויופיע הן בסריקות Q1 והן בסריקות Q3 (אם נעשה שימוש באחרון). גיליון אלקטרוני מצורף במידע התומך (קובץ משלים 1) כדי לסייע בביאורים.
3. חזור על שלב 3.2 עם הכרומטוגרמות האחרות של PrIS. מכיוון שגם m/z 122 וגם m/z 122 מעידים על TAs שהוחלפו וגם m/z 138 וגם 156 מעידים על TAs משולשים, בחנו כרומטוגרמות/תעלות אלה יחד.
4. בחן את הכרומטוגרמה/ערוצים של NLS עבור m/z 100, 60 ו-166, ושים לב אילו פסגות/יונים שבהם r.t.s (שנרשם בשלב 3.1) מייצרים הפסדים ניטרליים אלה. כמו עם PrIS, לחץ סריקה אחר סריקה דרך הכרומטוגרמה והשווה עם הפיצול המתקבל בסריקת יונים של מוצר DD, במיוחד עבור מינים בעלי שפע נמוך יותר.
5. באמצעות השילוב של נתוני PrIS ו-NLS, הנתמכים על ידי תוצאות סריקת היונים של מכפלת DD, ערוך ביאורים משוערים של האלקלואידים שנצפו על-ידי הוספת מסת הטרופאן הקטנה ביותר (למשל, 124, 122 או 138) וההפסד הניטרלי ולאחר מכן התחשבות במסה הנותרת שנותרה.
   הערה: קבוצות אופייניות שמחליפות TAs (והמסות שלהם ב-Da) הן הידרוקסיל (18), אצטיל (60), פרופיוניל (74), איזובוטיריל (88), טיגלואיל (100), טיגלואיל/2-מתילבוטיריל רווי (102), או פנילקטט/חומצה טרופית (166).
6. השווה ביאורים לאלקלואידים לאלה המדווחים בספרות¹⁷ ובמאגרי מידע (למשל, MoNA)²⁶ כדי לקבוע אילו דפוסי תחליפי ת"א מדווחים (ואילו הם עשויים להיות חדשניים). בנוסף, השתמש בתקנים של כמה אלקלואידים טרופאן נפוצים (למשל, אטרופין, littorine, scopolamine) הזמינים מסחרית לאישור.
7. למידע מבני נוסף עבור דגימות בשפע נמוך (PrIS ו-NLS עשויים לאסוף יונים מתחת לסף האירוע התלוי), אספו סריקת יוני מוצר ספציפית (תוך ניצול מסת העניין כיון מקדים) על דגימה מרוכזת יותר.
   הערה: שיטה זו פותחה במכשיר QQQ ברזולוציה נמוכה. עבור כל התרכובות החדשות המשוערות, יש להשתמש במכשיר MS ברזולוציה גבוהה כדי להשיג ספקטרום מסה מדויק.

כדי להדגים את יעילות השיטה, תערובת סטנדרטית של TAs (10 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד מתערובת אצטילטרופין/אצטיל-פסאודוטרופין [monosubstituted], 10 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד מתערובת של שני איזומרים אניסודאמינים [disubstituted], יחד עם hyoscyamine [monosubstituted], littorine [monosubstituted] ו-scopolamine [trisubstituted]) נותחה כבקרה חיובית (איור 2). כרומטוגרמה מלאה של סריקת Q1 (מוצגת בתצוגת כרומטוגרמה של שיא בסיס) מוצגת באיור 2A, כאשר המבנים הסטנדרטיים של TA מסומנים על-ידי הפסגות התואמות שלהם. PrIS עבור m/z 124 (איור 2B) מציג שיאים בכרומטוגרמה שלו עבור TAs חד-תחליפים; ERGO, תערובת אצטילטרופין/פסאודוטרופין, היוסציאמין וליטורין מוצגים. הפסגות המקבילות לאצטילטרופין ופסאודוטרופין בכרומטוגרמה m/z 124 הן קטנות (אולי משום שהן בריכוז נמוך יותר מהתקנים האחרים ואולי משום שהן עשויות לייצר מקטע m/z 124 פחות נפוץ מאשר TAs חד-תחליפים אחרים). עם זאת, הם עדיין ניתנים לגילוי הן בכרומטוגרמה זו והן בערוץ PrIS המתאים. איור 2C ואיור 2D הם כרומטוגרמות PrIS עבור m/z 122 ו-140, בהתאמה. שניהם מזהים שברי TA מוחלפים, ומסמנים את שני האיזומרים של אניסודמין, עם אות חזק יותר הנראה בערוץ m/z 140. מכיוון שת"א שונים עשויים להיות בעלי שברים בעוצמות שונות, יש לבחון את ערוצי m/z 122 ו-140 יחד. לבסוף, ערוצי m/z 156 (איור 2E) ו-m/z 138 (איור 2F), דיאגנוסטיים עבור TAs תלת-תחליפים, מציגים שניהם שיא אחד עבור סקופולאמין (ה-TA המשולש היחיד בתמהיל הסטנדרטי).

לאחר מכן נעשה שימוש בכרומטוגרמות NLS כדי להקצות את קבוצות האסתר הנוכחיות. איור 2G מראה את כרומטוגרמת NLS עבור 60 Da (אובדן חומצה אצטית מאסטרי אצטט): שני איזומרי TA חד-תחליפיים בעלי אצטילציה נראים לעין. כרומטוגרמה NLS עבור 166 Da (איור 2I), שנועדה לזהות אסטרים פנילקטיים או טרופיים, מזהה נכונה את כל האלקלואידים שמכילים אחת מהקבוצות האלה (היוסקיאמין, ליטורין, שני איזומרים אניסודאמינים וסקופולמין). לבסוף, כצפוי, הכרומטוגרמה (איור 2H) עבור אובדן של 100 Da (אבחון של אסטרי טיגלויל) ריקה למעט טומאה קלה ב-r.t. 1.75 דקות, מאחר שאף אחד מהאלקלואידים הסטנדרטיים אינו מכיל את הקבוצה הזו.

לאחר מכן נבדקה השיטה לתוצאות חיוביות כוזבות. תמצית מים/מתנול של עלי עגבנייה (Solanum lycopersicum) שימשה כבקרה שלילית. למרות היותן שמשיות לילה, עגבניות אינן מייצרות TAs. סריקת Q1 מלאה של כרומטוגרמה בסיסית-שיא מוצגת באיור 3A. ה-PrIS עבור m/z 124 (איור 3B) הוא ברובו ריק, עם תנודות בסיסיות קטנות שהן ככל הנראה רעשי גלאי (שום אותות לא תאמו את המסות האלה בסריקות Q1 או Q3). שתי תכונות עם r.t.s של 2.6 ו-3.4 דקות אכן מניבות מקטע של 124, אך בחינה של סריקת יון המוצר DD מגלה כי תכונות אלה אינן מייצרות שברי טרופאן חד-תחליפים אחרים (m/z 93 או 142), דבר המצביע על כך שהם אינם TAs. דוגמה זו גם מדגישה את התועלת של הכללת סריקת יונים של מוצר DD בשיטה זו כדי לשלול תוצאות חיוביות שגויות. באופן דומה, ערוץ m/z 122 עבור TAs מוחלפים (איור 3C) גם הוא רק מראה רעש. כרומטוגרמות PrIS עבור m/z 140, m/z 138 ו-m/z 156, ושלושת ה-NLSs, המציעים רק תכונות שאינן TA בסריקות DD, מוצגות באיור משלים 1A-F.

כדי להדגים את השימושים בשיטה זו בפירוק דגימה המכילה TA, נותחה תמצית של שורש D. metel var. 'fastuosa'. השורשים הם האתר העיקרי של הביוסינתזה של ת"א בגווני לילה, ורבים ומגוונים היו צפויים להיות נוכחים. הכרומטוגרמה המלאה של סריקת Q1 מוצגת באיור 4A. כצפוי, מאפיינים רבים של שפע משתנה התגלו ב-PrISs עבור m/z 124 (איור 4B), m/z 122 (איור 4C), m/z 140 (איור 4D), m/z 156 (איור 4E) ו-m/z 138 (איור 4F). רבים מה-TAs האלה היו גם אצטילטים או טיגלואילטים, או נגזרו מחומצה פנילקטית/טרופית, כפי שמראים האותות הרבים בכרומטוגרמות NLS באיור 4G-I, בהתאמה.

גיליון אלקטרוני, שסופק כקובץ .xls (גיליון ריק לשימוש הקורא הוא קובץ משלים 1, D. שורש metel נמצא בקובץ משלים 2), שימש לתיעוד ראשוני של התכונות (מסות או r.t.s) שנראו כמו TA (באמצעות קריטריונים בשלב 3.1). לאחר מכן, שברים והפסדים ניטרליים השייכים לתכונות אלה צוינו. השיטה רגישה ביותר: ערוצי PrIS אף זיהו בקלות TAs בשפע נמוך שלא הניבו פסגות נראות לעין על הכרומטוגרמות המתאימות. באמצעות השברים וההפסדים הניטרליים, ניתן להציע מבנה לאלקלואיד על ידי ביצוע שלב 3.5.

דוגמה לשימוש בנתונים ספקטרליים כדי להוסיף ביאורים לאלקלואידים מוצגת באיור 5. הכרומטוגרמה המלאה של סריקת Q1 עבור שורש D. metel נמצאת באיור 5A. נבחרה תכונה ב-14.4 דקות; ספקטרום סריקת Q1 (איור 5B) מראה מסת אב של m/z 224 עבור שיא זה. ספקטרום סריקת היונים של מכפלת DD מוצג באיור 5C. ערוץ PrIS עבור m/z 124 (איור 5D) מציין שיון 224 מייצר את המקטע הזה (נראה גם בסריקת יוני המוצר DD). ערוץ NLS עבור 100 Da (לזיהוי TAs tigloylated) מסמן גם m /z 224 (שאושר גם על ידי סריקת יונים של מוצר DD). חיבור ההפסד הנייטרלי ושבר TA בעל המסה הנמוכה ביותר (100 + 124 Da) שווה למסת האב, 224, מה שמאשר שקבוצת הטיגלואיל היא ההחלפה היחידה; מבנה סביר עבור האלקלואיד הזה מצוין באיור 5C. עבור TAs di- ו- tri-substituted, נוספו מסות אובדן ניטרליות נצפות למסת TA הנמוכה ביותר, ואז הוצעה החלפה אחרת כדי להסביר את המסה הנותרת: לדוגמה, m/z 222, עם שברי TA מוחלפים של 140 ו- 122 ואובדן נייטרלי של 100 Da, יש מסה שארית של 100 (222-122 = 100), ככל הנראה תהיה קבוצת טיגלויל שנייה. תהליך עבודה זה יכול לשמש באופן אינטואיטיבי לתהליך של אלימינציה: תכונה חסרה קטעי טרופאן (גם אם היא עלולה לאבד 60, 100 או 166 Da) לא סביר להיות TA. בדוגמה לשכפול יסודי ומהיר באמצעות תהליך עבודה זה, זוהו 71 TAs שונים בשפע ובקוטביות שונים בשורש D. metel , כולל תרכובות איזומריות מרובות (קובץ משלים 2). בחלק מתרכובות אלה היו קבוצות אסטר שלא ניתן היה להקצות בקלות, וכמה תרכובות נוספות סומנו כתרכובות פוטנציאליות של TAs, אך לא ניתן היה לבאר אותן בביטחון רב.

כמו כן נבדקה תמצית מתנול/מים של זרעי D. stramonium טחונים. הכרומטוגרמה המלאה של סריקת Q1 עבור שורש D. metel מוצגת באיור 6A. PrIS עבור m/z 124 מוצג באיור 6B ו-PrIS עבור m/z 122 מוצג באיור 6C; הכרומטוגרמות האחרות מוצגות באיור משלים 2A-F. איור 6B מצביע על אלקלואיד טרופאן חד-תחליפי בשפע רב ב-r.t. = 12.6 דקות, ככל הנראה היוסקיאמין. הגיליון האלקטרוני המציג ביאורי seed TA כלול בקובץ משלים 3. הביצועים של השיטה נראו נמוכים יותר עם המדגם הספציפי הזה: שתי תכונות שופעות מאוד עם m/z של 259 ב-r.t.s של 8.5 ו-10.2 דקות הניבו שיאים בכרומטוגרמות NLS עבור 60 ו-100 Da (איור משלים 2 D,E) עם מסה של m/z 260 (איזוטופ M+1) שצוינו בספקטרום המתאים. תרכובות אלה אינן TAs, אלא נוצרו מקטעים התואמים אלקלואידים בטא-קרבולין27. הם אינם אצטילטים או טיגלואילטים, אלא מאבדים 60 או 100 מהאיזוטופ M+1 שלהם, מה שהופך את הופעתם בשני ערוצי NLS אלה לשגויה. בנוסף, סקופולאמין (r.t. = 10.5 דקות) הניב מקטע m/z 122 מפסגת האיזוטופ m/z 305 M+1 שלו, איזוטופ של מקטע m/z 121 הצפוי של סקופולמין. אף על פי ששיטות אלה משתמשות בפונקציות דה-איזוטופינג, "זליגת" איזוטופים מסוימת אפשרית בריכוזי דגימה גבוהים אלה. אמנם זה עשוי להיות אירוע ייחודי למכשיר המשמש במחקר זה או מדגם זה, ראוי לציין.

ארבעים TAs הוסברו בזרעי D. stramonium בשיטה זו, כולל כמה שנראים כגליקוזילטים, ומאבדים מסות של 162 (hexose), 146 (deoxyhexose), או 132 Da (xylose או סוכר דומה). בעוד TAs המכילים hexose דווחו Merremia (Convolvulaceae)28, Duboisia29, ו Atropa25, זהו הדיווח הראשון של deoxyhexose או TAs המכילים xylose. לת"א אחד היה r.t. של 13.8 דקות (איור 7A) ומסה של m/z 436 (סריקת Q1 באיור 7B). תכונה זו הפיקה אות בערוץ m/z 124, המציין TA חד-תחליף (איור 7D), אך לא הפיקה אותות בערוץ PrIS או NLS אחר. סריקת יוני מכפלת DD (איור 7C) הצביעה על m/z 124 הצפוי, אובדן של 312 Da, אולי 166 + 146 Da, מיון האב. MS/MS ברזולוציה גבוהה התקבל במכשיר זמן טיסה מרובע (ספקטרום באיור 7E), אשר הצביע על מקטע m/z 290, מה שמרמז על היוציאמין או ליטורין גליקוזילציה על חלק אסטר הידרוקסיל עם רמנוז או סוכר דומה; המסה המדויקת שנמדדה הייתה גם קרובה מאוד למסה המדויקת שחושבה עבור רמנוזיל-היוסקיאמין או ליטורין (מבנה באיור 7E). בגלל המבנה והשפע חסרי התקדים שלו, אלקלואיד זה ראוי לבידוד מזרעי D. stramonium , דוגמה המדגימה את השימוש בשיטה זו בגילוי אלקלואיד חדש.

איור 1: מקטעים והפסדים רלוונטיים שנצפו בטרשת נפוצה של TAs. (A) מקטעים אופייניים (והמסות האבחנתיות שלהם) שנוצרו מ-TAs חד-תחליפים, מוחלפים ותלת-תחליפים, כמו גם דוגמאות מייצגות של אלקלואידים בכל מחלקה. (B) הפסדים ניטרליים נפוצים שנצפו מקבוצות אסטר ב-TAs (והמסות האבחנתיות שלהם). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: יון מקדים לבקרה חיובית וסריקות אובדן ניטרלי. עבור כל הכרומטוגרמות, ציר X הוא זמן שמירה, וציר Y הוא ספירה (שפע יונים). (A) הכרומטוגרמה הכוללת של היונים, בתצוגת כרומטוגרמה של שיא בסיס, של תערובת תקן אלקלואיד. מבנים של התקנים מסומנים; הפסגות המתאימות מסומנות בחצים אדומים. (B-F) הן כרומטוגרמות PrIS עבור (B) m/z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 ו-(F) 138. (ז-י) כרומטוגרמות NLS עבור 60 Da (אצטיל, G), 100 Da (tigloyl, H) ו- 166 Da (חומצה פנילקטית/טרופית, I). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: יון מקדים לבקרה שלילית וסריקות אובדן ניטרלי. עבור כל הכרומטוגרמות, ציר X הוא זמן שמירה, וציר Y הוא ספירה (שפע יונים). (A) כרומטוגרמה של יונים כוללת, בתצוגת כרומטוגרמה של שיא בסיס, של תמצית מתנול/מים של עלה S. lycopersicum . (B) כרומטוגרמה PrIS עבור m/z 124 מראה רק שתי תכונות שאינן טרופאן ב-r.t. 2.6 ו-3.4 דקות. (C) כרומטוגרמה PrIS עבור m/z 122, ריקה למעט רעש גלאי. הקשקשים המשמשים זהים לאלה שבאיור 2; שאר הכרומטוגרמות נמצאות באיור משלים 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: יישום שיטת MS/MS על שורשי D. metel var. 'fastuosa'. עבור כל הכרומטוגרמות, ציר X הוא זמן שמירה, וציר Y הוא ספירה (שפע יונים). (A) כרומטוגרמה של יונים כוללת, בתצוגת כרומטוגרמה של שיא בסיס, של תמצית מתנול/מים של שורשי D. metel var. 'fastuosa'. (B-F) הן כרומטוגרמות PrIS עבור m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 ו-(F) 138. (G-I) הם כרומטוגרמות NLS עבור 60 Da (אצטיל, G), 100 Da (tigloyl, H) ו-166 Da (חומצה פנילקטית/טרופית, I). שימו לב לאותות השופעים בכל כרומטוגרמה המתאימים למספר רב של TAs. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: יישום של סריקת יונים משולבת של מכפלת DD, סריקת יונים מקדימה ושיטת סריקת אובדן ניטרלית להצעת המבנה עבור TA. (A) כרומטוגרמה של יונים כוללת, בתצוגת כרומטוגרמה של שיא בסיס, של תמצית מתנול/מים של שורשי D. metel var. 'fastuosa' . שיא ב- r.t. = 14.4 דקות מסומן על ידי חץ אדום. (B) Q1 (סריקת סקר), עם מסה שופעת של m/z 224 עבור שיא זה. עבור כל הספקטרה, ציר X הוא מסה, וציר Y הוא עוצמה. (C) סריקת יוני מכפלת DD, המראה את הפיצול של יון m/z 224, המציין אובדן של 100 Da ומקטע m/z 124 (חיצים אדומים). תרכובת זו מופיעה הן בערוץ (D) m/z 124 PrIS והן בערוץ (E) 100 Da NLS, דבר המציין שהיא גם חד-תחליפה וגם טיגלואילציה (מבנה בלוח C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: יישום שיטת MS/MS על זרעי D. stramonium . עבור כל הכרומטוגרמות, ציר X הוא זמן שמירה, וציר Y הוא ספירה (שפע יונים). (A) הכרומטוגרמה הכוללת של יונים, בתצוגת כרומטוגרמה של שיא בסיס, של תמצית מתנול/מים של זרעי D. stramonium. (B) כרומטוגרמה PrIS עבור m/z 124; (C) מתאר את כרומטוגרמה PrIS עבור m/z 140. שאר הכרומטוגרמות נמצאות באיור משלים 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: ביאור אלקלואיד חדש בזרעי D. stramonium . עבור כל הכרומטוגרמות, ציר X הוא זמן שמירה, וציר Y הוא ספירה (שפע יונים). (A) כרומטוגרמה של יונים כוללת, בתצוגת כרומטוגרמה של שיא בסיס, של תמצית מתנול/מים של זרעי D. stramonium. תכונה ב r.t. = 13.7 דקות מצוין. (B) Q1 (סריקת סקר) המראה מסה של m/z 436 עבור שיא זה. עבור כל הספקטרה, ציר X הוא מסה, וציר Y הוא עוצמה. (C) סריקת יונים של מכפלת DD המראה את הפיצול של יון m/z 436. (D) תרכובת TA חד-תחליפה זו מופיעה בערוץ m/z 124 PrIS. (E) ספקטרום MS/MS ברזולוציה גבוהה עבור TA חדש זה, יחד עם מבנים מוצעים ומסה מדויקת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: סריקות מקדימות בקרה שליליות נוספות וסריקות אובדן ניטרלי. (א-ג) כרומטוגרמות PrIS עבור m/z (A) 140, (B) 156 ו-(C) 138. (ד-ו) כרומטוגרמות NLS עבור 60 Da (אצטיל, D), 100 Da (tigloyl, E) ו- 166 Da (חומצה פנילקטית/טרופית, F). הסולמות שבהם משתמשים זהים לאלה שבאיור 2. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 2: יישום שיטת MS/MS על זרעי D. stramonium; כרומטוגרמות נוספות. (A-C) הן כרומטוגרמות PrIS עבור m/z (A) 140, (B) 156 ו-(C) 138. (ד-ו) כרומטוגרמות NLS עבור 60 Da (אצטיל, D), 100 Da (tigloyl, E) ו- 166 Da (חומצה פנילקטית/טרופית, F). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 1: גיליון אלקטרוני ריק המשמש לביאורים אלקלואידים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: גיליון אלקטרוני של ביאורים ומבנים אלקלואידים עבור שורשי D. metel var. 'fastuosa' . אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: גיליון אלקטרוני של ביאורים ומבנים אלקלואידים עבור זרעי D. stramonium. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.