הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גידול ספרואידים תלת מימדיים של סרטן הלבלב הדסמופלסטי מבית Co-Culture

2.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66625

⸱

27 בספטמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, South Dakota State University

במאמר זה

סיכום

סרטן הלבלב נותר אחד מסוגי הסרטן הקשים ביותר לטיפול. לכן, קריטי שמודלים פרה-קליניים להערכת יעילות הטיפול יהיו ניתנים לשחזור ורלוונטיים קלינית. פרוטוקול זה מתאר הליך תרבית משותפת פשוט ליצירת ספרואידים דמופלסטיים הניתנים לשחזור, רלוונטיים קלינית.

תקציר

אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) הוא אחד מסוגי הסרטן הקטלניים ביותר עם שיעור הישרדות של 5 שנים של <12%. המחסום הגדול ביותר לטיפול הוא המטריצה החוץ תאית הדסמופלסטית הצפופה (ECM) המקיפה את הגידול ומפחיתה את כלי הדם, המכונה בדרך כלל דסמופלזיה. מגוון שילובי תרופות ופורמולציות נבדקו לטיפול בסרטן, ולמרות שרבים מהם מראים הצלחה טרום קלינית, הם נכשלים קלינית. לכן, חשוב שיהיה מודל רלוונטי מבחינה קלינית זמין שיכול לחזות את התגובה של הגידול לטיפול. מודל זה אומת בעבר כנגד גידולים קליניים שנכרתו. כאן מתואר פרוטוקול פשוט לגידול ספרואידים תלת-ממדיים (3D)-קו-תרבותיים דסמופלסטיים שיכולים לייצר באופן טבעי ECM חזק ואינם דורשים מקורות מטריצה חיצוניים או פיגומים כדי לתמוך בצמיחתם.

תאי סטלט לבלב אנושיים (HPaSteC) ותאי PANC-1 משמשים להכנת תרחיף המכיל את התאים ביחס של 1:2, בהתאמה. התאים מצופים בפלטת U-well מצופה פולי-HEMA, 96 בארות בעלות חיבור נמוך. הצלחת היא צנטריפוגה כדי לאפשר לתאים ליצור גלולה ראשונית. הצלחת מאוחסנת באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2, ואת המדיה מוחלף כל 3 ימים. ניתן לצלם לוחות במרווחי זמן ייעודיים כדי למדוד נפח כדורי. לאחר 14 ימי תרבית, נוצרים ספרואידים דסמופלסטיים בוגרים (כלומר נפח ממוצע של 0.048 + 0.012 מ"מ3 (451 מיקרומטר x 462.84 מיקרומטר)) וניתן להשתמש בהם להערכת טיפול ניסיוני. רכיבי ECM בוגרים כוללים קולגן-I, חומצה היאלורונית, פיברונקטין ולמינין.

מבוא

הפרוגנוזה הגרועה של סרטן הלבלב קשורה למגוון סיבות, ביניהן היעדר סמנים ביולוגיים קלים לגילוי המובילים לגילוי מאוחר. סיבה מרכזית נוספת היא הסטרומה הסמיכה המקיפה את הרקמה, מה שמוביל לאספקת דם מופחתת. שקיעת כמויות גדולות של מטריצה חוץ-תאית (ECM), אינטראקציה בין תאים, תאי אנדותל, תאי חיסון שונים, פריציטים, אוכלוסיית מיופיברובלסטים מתרבים ופיברובלסטים, ונוכחותם של תאים לא-ניאופלסטיים (יחד מהווים את התגובה הדסמופלסטית)1, מהווים את הסטרומה העבה האחראית לעמידות הכימותרפית והרדיותרפית של PDAC2. לתאי סרטן וסטרומה יש אינטראקציה מורכבת, דינמית ודו-כיוונית. למרות שאלמנטים מסוימים מחלישים או מאיצים את התקדמות המחלה, רוב התהליכים הם אדפטיביים במהלך התפתחות הגידול1. זה מספק סביבה עשירה בגורמי גדילה, גורמים פרואנגיוגניים, פרוטאזות ומולקולות הידבקות. גורמים אלה מקדמים אנגיוגנזה, התפשטות תאים, גרורות ופלישה 3,4. יחד, הם מהווים מקלט חסין ומועדף לתרופות עבור הגידול, וכתוצאה מכך עמידות לסמים.

הדסמופלזיה היא תערובת מורכבת המורכבת מחלבוני ECM שונים, יחד עם תאי מערכת החיסון ותאי סטלט הלבלב (PSC). יחד, אלה נוטים ליצור פיגום עבור התאים לגדול. PSCs הם אחד המרכיבים הגדולים ביותר של תא סטרומה5. יכולתם לייצר אנזימים כמו מטלופרוטאזות מטריצה (MMP), מעכבי רקמות של מטלופרוטאזות מטריצה (TIMP) ופיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAF)6 מרמזים על כך שהם עשויים למלא תפקיד קריטי בהתפתחות התגובה הדסמופלסטית. ECM, פיברובלסטים הקשורים לסרטן (CAF) וכלי דם הם ההיבטים הקרדינליים של PDAC. בקרב CAFs, מיופיברובלסטים ו-CAF דלקתיים משערים שהם מעורבים בקרוס-טוק פעיל האחראי לתכונות פרו-סרטניות7. ככל שהתצורות הפיברובלסטיות על הגידול נרחבות יותר, כך הפרוגנוזה 8,9,10 גרועה יותר.

תרבית תאים חד-שכבתית באמצעות קווי תאים מבוססים ממשיכה להישאר כלי שימושי לניתוח רעילות תרופות ומהווה נקודת התחלה טובה למחקרי הוכחת היתכנות וגילוי. קווי תרביות תאים מבוססים, לעומת זאת, חסרים דנ"א של קו הנבט ויחסיות קלינית11. מכיוון שהם גדלים על משטחים שטוחים, הם עוברים קריטריונים שונים לבחירת מבחנה בהשוואה למצב שבו הם חלק מהגידול, מתחלקים באופן חריג ומאבדים את הפנוטיפ המובחן שלהם12. באופן כללי, תרביות תאים בודדים מגבילות את הטרוגניות הגידול ולכן מאבדות רלוונטיות קלינית. הם אינם מסוגלים לייצג במדויק את המורכבות של המיקרו-סביבה של הגידול (למשל, ECM). תרבית תלת-ממדית יכולה לשכפל בצורה קרובה יותר את המיקרו-סביבה המורכבת של הגידול.

תרבית תלת-ממדית הוצגה בשנות ה-70 של המאה ה-20 עבור תאים בריאים ומקביליהם הניאופלסטיים13. מספר טכניקות שימשו לחקר המורפולוגיה והארכיטקטורה של רקמות ממאירות באמצעות ספרואידים14. תרביות משותפות עם תאי סטרומה יכולות למדל אותות TME. עלייה בוויסות של סמני EMT נצפתה כאשר תאים עברו תרבית משותפת עם תאי סטלט15. ספרואידים PDAC ואת האינטראקציה שלהם עם stroma ניתן למדל על ידי תרבית משותפת עם רכיבי ECM. תרבית משותפת במיוחד עם PSCs דווחה כמייצרת נתוני ציטוטוקסיות של תרופות רלוונטיות מבחינה קלינית 16,17,18. PSCs גם מסייעים לעמידות לתרופות על ידי התחמקות מאפופטוזיס וגירוי התפשטות של תאים סרטניים באמצעות גורמים פרקריניים שונים19 ועל ידי גרימת מעבר EMT. לכן, זה הופך להיות קריטי לכלול את PSCs משלב מוקדם בקריטריונים המשמשים להערכת ההצלחה של מערכת אספקת תרופות או תרופות. היכולת של PSC להגביר את ההתרבות ולתמוך בצמיחה מהירה יותר בשילוב, בהשוואה לתאי סרטן הלבלב בלבד, נצפתה גם היא in vivo כאשר זריקות תת-עוריות של שני קווי התאים הוערכו בעכברים מדוכאי חיסון20.

היכולת של סוג תא לקיים אינטראקציה עם רכיבי ECM היא גם קריטית שיש לקחת בחשבון בעת גידול ספרואידים בתרבית משותפת. דווח כי ל-BxPC-3 ול-PANC-1 יש זיקות שוות בקישור לקולגן. שני קווי התאים גם נקשרים באופן שווה ללמינין, אם כי היו דיווחים כי BxPC-3 נקשר טוב יותר 21,22,23,24,25. במונחים של הגירה, Stahle et al.26 הדגימו תנועתיות מהירה פי 5 עבור תאי PANC-1 בהשוואה ל- BxPC-3. דווח גם כי תאי PANC-1 נודדים בעיקר כתאים בודדים, בעוד שתאי BxPC-3 נודדים כיריעה צפופה היטב. בחירת התאים משפיעה גם על גודל הגידול25. גידולי BxPC-3 הוכחו כגדולים יותרב-27,28 מאלו שהתקבלו מ-PANC-1, בעוד שמחקר אחד הראה את המקרה ההפוךמ-29. למרות ההבדלים בגודל ובתנועתיות שלהם, דווח כי שני התאים זקוקים לתקופות ארוכות של חביון כדי ליצור גידולים בעכברים. משך זמן זה יכול להיות ארוך במיוחד עבור BxPC-3 החל 4 שבועות עד 4 חודשים25. עם זאת, יש גם ספרות שבה BxPC-328 או BxPC-3 תאי גזע סרטניים30 יצרו גידולים גלויים מהר יותר, מה שמרמז על כך שיכולה להיות שונות במשכי צמיחת הגידול. משכי הזמן האמורים כאן צריכים, אם כן, לשמש רק כקו מנחה ראשוני לקצב צמיחת הגידול.

תאי BxPC-3 יוצרים ספרואידים עם תאים רופפים על פני השטח וליבות צפופות, בעוד שתאי PANC-1 דווחו כיוצרים הן ספרואידים נקבוביים אך חזקים31 והן ספרואידים קומפקטיים. תאי PANC-1 דווחו גם כפחות ממוינים ויותר אגרסיביים32. תוך שמירה על האופי התוקפני32 בחזית, בשילוב עם התנועתיות הגבוהה יותר של תאי PANC-1, היכולת ליצור ספרואידים קומפקטיים והיכולת לתקשר עם רכיבי ECM, נבחרו תאי PANC-1 למחקרי ספרואידים.

בשנים האחרונות, תרבית ספרואידים ראתה הצלחה רבה בהפגנת יתרון ברלוונטיות הקלינית שלה בהשוואה לתרביות דו-ממדיות (2D). הרלוונטיות שלה מונפה בשימוש בטכניקה זו כתחליף למחקרים בבעלי חיים ולהבנה טובה יותר של הביולוגיה של הגידולים. הרלוונטיות הקלינית של ספרואידים, במיוחד כאשר הם משולבים עם PSC אפשרה את השימוש בהם כדי לחקור פונקציות שונות של הספרואיד כגון נוקשות33, ביטוי של TGF-β 34,35,36,37,38, E-cadherin, F-actin 18,34,36,37, α-SMA 34,35,37,38, לקטט דהידרוגנאז (LDHA)32, HIF-1α35,39, עמידות לתרופות 16,37,40, נדידת תאים41, פלישת תאים37, פיברוזיס35, עמידות לקרינה42, שינויים פנוטיפיים18, הטרוגניות36, רמות תאים של אינטראקציות39 והדגמת רכיבי ECM37,38,39. רבים מהפרוטוקולים ששימשו להשגת הנתונים המתוארים מסתמכים על Matrigel, שיטת הטיפה התלויה, תבניות מודפסות או פיגומים אחרים כדי לסייע בתמיכה בצמיחת ספרואידים ו- ECM. המחקרים כוללים גם בדרך כלל שימוש בתאים פיברובלסטיים שאינם אנושיים או בתאי סטלט טריים שבודדו מחולים. בעוד ששימוש בתאי סטלט הוא קריטי עבור הגידולים כדי להידמות לתנאי in-vivo, השונות הבין-מטופלת הקשורה למיצויים טריים מקשה על שכפול מחקרים אלה.

פרוטוקול זה נועד להדגים מודל קל לפיתוח, ניתן לשחזור, רלוונטי קלינית וללא פיגומים, ובכך להסתמך אך ורק על יכולות התרביות המשותפות ליצור באופן טבעי את ה- ECM. לשם כך נבחרה שיטת תרבית משותפת פשוטה הכוללת תערובת של תאי PANC-1 (בשל נטייתם הטבעית לנדוד כתאים בודדים) יחד עם תאי סטלט לבלב אנושיים (HPaSteC), בשל יכולתם להתנהג כמו תאי גזע ולהיות עמידים מאוד לתרופות. תוך שימוש במחקרים של Durymanov et al.38כנקודת בסיס, הפרוטוקול המפורט להלן נקבע לאחר אופטימיזציה נוספת של פרמטרים כגון יחסי תאים ומשכי זמן בין שינויי מדיה. הספרואידים הנובעים מפרוטוקול זה יכולים לשמש כמערכת מודל להערכת מועמדים חדשיםלתרופה 40.

בנוסף, עבור משתמשים שאינם מכירים את התרבות הספרואידית, העבודה Peirsman et al.43הדנה בפיתוח בסיס הידע של MISpheroID עשויה להיות מועילה. הוא קובע כמה הנחיות מידע מינימליות שיכולות לסייע בהתמודדות עם הטרוגניות בין פרוטוקולי מעבדה. למרות מגבלות מסוימות, העבודה הראתה כי הבחירה של מדיה תרבית, קווי תאים, שיטת היווצרות ספרואידים, ואת גודל הספרואיד הסופי הם קריטיים בקביעת התכונות הפנוטיפיות של spheroids.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית תאים דו-ממדית

  1. לגדל תאי PANC-1 בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM), בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) בתנאים סטריליים. יש לגדול עד 70%-80% מפגש לפני המעברים, ואין להשתמש מעבר לקטעה-20 . עיין בתהליך המתואר בשלב 4.2.1.
    הערה: כנקודת התייחסות, 1 x 106 תאים ב 20 מ"ל של מדיה צריך בערך 2-3 ימים כדי להגיע 70-80% מפגש.
  2. גדל תאי HPaSteC במצע תאי Stellate בתוספת 2% FBS, 1% PenStrep ו-1% תוסף צמיחת תאי Stellate (SteCGS) באמצעות הערכה שסופקה על ידי היצרן בתנאים סטריליים. גדל בהתאם להוראות היצרן (עם כמה שינויים) כפי שמוצג בשלב 4.2.2 בצלוחית מצופה פולי-L-ליזין.
    1. דלג על שלב נטרול FBS במהלך טריפסיניזציה מפרוטוקול היצרן מכיוון שנעשה שימוש בתמיסת נטרול טריפסין (TNS). נטרל את תרחיף התא עם נפח כולל של 10 מ"ל TNS כמתואר בשלב 4.2.2.2.
      הערה: כנקודת התייחסות, 0.5 x 106 תאים ו- 1 x 106 תאים ב- 20 מ"ל של מדיה זקוקים ל- 3 ימים ויומיים, בהתאמה, כדי להשיג מפגש של 90%.
    2. קציר תאים במפגש של 90%. אין להשתמש בתאים מעבר למעבר 7.
  3. לשמור על תאים בטמפרטורה של 37°C, עם 5%CO2, באינקובטורים סטריליים עם לחות יחסית של 90%-95%. בצע את כל מחקרי תרבית התאים בצלוחית T-75.

2. ציפוי תמיסת פולי(2 -הידרוקסיאתיל מתקרילט (poly-HEMA) לצלחת באר 96

  1. הכינו תמיסת פולי-HEMA במינון של 5 מ"ג/מ"ל תוך שימוש באתנול 95% על ידי ערבוב למשך הלילה באמצעות מערבל מחומם בטמפרטורה של 37°C. (למשל, 500 מ"ל של תמיסה זקוקים ל-2.5 גרם פולי-HEMA)
    1. סמן את מיקום עוצמת הקול ההתחלתית לפני הוספת המערבל. השתמש 95% אתנול כדי לפצות על כל אובדן בתמיסה למחרת.
  2. סננו את התמיסה הסופית בקולט אדים סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ואחסנו אותה במקרר בטמפרטורה של 4°C.
    הערה: Poly-HEMA משמש להגברת ההידרופוביות של משטח, המשמש כגורם מרתיע לתאים להיקשר. מכיוון שמחקר זה דורש מהתאים לא להיצמד לבארות ולגדול כחד-שכבתיים, פולי-HEMA משמש כגורם מרתיע נוסף לתכונת החיבור הנמוכה הטבעית של הלוחות, ובכך הופך אותם ללוחות חיבור נמוכים במיוחד.
  3. הוסף 50 μL של תמיסה קרה לכל באר של צלחת microwell תחתית פוליסטירן עגול 96 באר בתוך מכסה מנוע תרבית תאים כדי לצפות את הצלחת.
  4. השאירו את הבארות עם המכסה דולק בתנור אוויר חם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים כדי להבטיח את הצלחות יבשות לחלוטין.
  5. UV לעקר את הצלחות במשך 30 דקות במכסה המנוע של תרבית התא לפני זריעת התא. יש לאחסן במנעול רוכסן סגור היטב לאחסון לטווח ארוך ולעקר לפני השימוש.

3. תכנון תרבית תאים דו-ממדית

  1. תזמן את הניסוי כך שתאי PANC-1 יהיו זמינים במפגש של 70%-80% באותו יום שבו תאי HPaSteC יגיעו ל-90%.
    הערה: בקבוקונים המכילים כמיליון תאים של PANC-1 או HPaSteC, כאשר הם מועלים מחנקן נוזלי באותו יום, עם שונות מסוימת, דורשים 8 ימים של תרבית PANC-1 ו-6-7 ימים של תרבית HPaSteC כדי ששני קווי התאים יהיו מוכנים באותו יום.

צמיחת תרבות 4. 3D

  1. עיין בסקירה הכללית של התהליך כולו באיור 1 לפני תחילת התהליך.
    התראה: הן PANC-1 והן HPaSteC מקורם ביולוגי. טפל ב-PANC-1 (קו תאים סרטניים) בזהירות.
  2. טריפסינזינג וספירת תאים
    1. טריפסינזה וספירה של תאי PANC-1:
      1. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את תאי PANC-1 עם 9 מ"ל HBSS (3 מ"ל בכל פעם). יש להשליך ריאגנטים משומשים במכסה המנוע בתמיסת אקונומיקה V/V של 20-25% כדי להבטיח מוות מוחלט של חומר חי/בר קיימא.
      2. טריפסיניזציה של התאים עם 2 מ"ל של טריפסין. לאחר כמעט 10 דקות (ייתכן שיהיה צורך יותר זמן), כאשר כל התאים מנותקים, לנטרל את ההשעיה עם 10 מ"ל של DMEM + 10% FBS. יש להתחיל עם 3 מ"ל ולאחר מכן לבצע את שלבי השטיפה הבאים, תוך שימוש ב-1 מ"ל לכל שטיפה (נותרו 7 שטיפות) כדי להבטיח איסוף מרבי של תאים שעברו טריפסינה.
      3. יש לערבב כל אליקוט מנוטרל לתוך אותו צינור של 15 מ"ל. הנפח הסופי בצינור יהיה קרוב ל 12 מ"ל (~ 2 מ"ל טריפסין שנוטרל עם מדיה 10 מ"ל).
      4. צנטריפוגה את מתלה התא המנוטרל ב 700 x גרם במשך 2 דקות ו 30 שניות. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה המתקבלת ב 1 מ"ל של DMEM +10% FBS. קח aliquot מזה עבור ספירת תאים ותייג את הערך המתקבל מסעיף זה כ- "ספירה A".
    2. טריפסינזה וספירת תאי HPaSteC.
      1. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את תאי HPaSteC עם 9 מ"ל HBSS (3 מ"ל בכל פעם).
      2. טריפסיניזציה של התאים עם 2 מ"ל של טריפסין. לאחר כמעט 10 דקות, כאשר כל התאים מנותקים, נטרלו את התרחיף עם 10 מ"ל של תמיסת נטרול טריפסין. יש להתחיל עם 3 מ"ל ולאחר מכן לבצע את שלבי השטיפה הבאים, תוך שימוש ב-1 מ"ל לכל שטיפה (נותרו 7 שטיפות) כדי להבטיח איסוף מרבי של תאים שעברו טריפסינה.
      3. יש לערבב כל אליקוט מנוטרל לתוך אותו צינור של 15 מ"ל. הנפח הסופי בצינור יהיה קרוב ל-12 מ"ל (~2 מ"ל טריפסין שנוטרל עם 10 מ"ל תמיסת נטרול).
      4. צנטריפוגה את מתלה התא המנוטרל ב 700 x גרם במשך 2 דקות ו 30 שניות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה המתקבלת ב-1 מ"ל של מצע תא הסטלט המושלם. קח aliquot מזה עבור ספירת תאים ותייג את הערך המתקבל מסעיף זה כ- "ספירה B".
  3. דילול מתלי תאים ראשוניים
    1. השהה בשלב זה במידת הצורך (לא מעל 0.5 שעות) לזמן קצר לאחר קבלת שתי הספירות A ו- B או לאחר טריפסינציה ונטרול הן PANC-1 והן HPaSteC. יש לשמור על אמצעי תרבית שאינם בשימוש בטמפרטורה של 37°C ועל מתלי תאים בטמפרטורת החדר (RT; 25 ± 2°C).
    2. השתמש בספירה A ובספירה B שהושגו קודם לכן, כדי לקחת aliquots ולבצע דילולים בהתאמה (בצינורות נפרדים) כך שהנפח הסופי הוא 1 מ"ל (דילול: DMEM + 10% FBS עבור שני הבקבוקונים) והספירה הסופית היא בין 110,000-140,000 תאים עבור כל סוג תא. לאחר ביצוע דילול זה, ודא את ספירת התאים עבור כל דילול כדי לתת ספירה C (PANC-1) וספירה D (HPaSteC).
    3. השהה בשלב זה במידת הצורך (לא מעל 15-30 דקות) לאחר קבלת ספירה C וספירה D. אל תפסיק ברגע שהדילולים הסופיים נעשים בשלב 4.3.3.2; ניסוי כדי למנוע התיישבות תאים. שמור על מדיית תרבית שאינה בשימוש ב- 37 ° C ומתלי תאים ב- RT (25 ± 2 ° C).
      1. שמור על מספר התאים הסופי הדרוש לכל באר ב- HPaSteC: PANC-1: 60:120. השתמש 110 בארות עבור החישוב כדי להסביר עודף. חשב עם ערך בסיס של 100 μL של תרחיף תאים לכל באר (נפח ההשעיה הכולל הוא 11 מ"ל עבור 110 בארות עם HPaSteC: PANC-1: 60:120). הפוך את המתלה הזה בצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל לערבוב קל.
      2. השתמש בספירה C ובספירה D, והקפץ מספיק תרחיף תאים לתמיסת DMEM + 10% FBS כדי לקבל HPaSteC: PANC-1: 60:120 בנפח סופי של 11 מ"ל (6,600 תאי HPaSteC ו- 13,200 תאי PANC-1 ב- 11 מ"ל). מערבבים היטב את התמיסה באמצעות פיפטה 1 מ"ל על ידי ערבוב ו pipeting למעלה ולמטה. הימנעו מהיווצרות קצף.
  4. זריעה
    1. השתמש פיפטה 200 μL או 100 μL כדי לערבב את המתלה הסופי (ערבוב על ידי הזזת קצה פיפטה סביב בשילוב עם pipetting למעלה ולמטה) בכל שלב לפני הוספת 100 μL של המתלה לכל באר. מוסיפים את 100 μL בעדינות לאורך פינת הבאר.
      1. השתמש שוב באותו קצה עבור בארות מרובות, אלא אם כן הוא נופל. מערבבים קדימה ואחורה וסופרים עד 10 או 15 (לא שניות) בין התוספות לכל באר עבור המחצית הראשונה (בערך 43 הבארות הראשונות) של הצלחת. הנמיכו את מספר הערבוב ל-5-10 בין כל באר למחצית השנייה (43 הבארות הנותרות) מכיוון שנפח ההשעיה קטן יותר ודורש פחות משך ערבוב.
      2. אין להשתמש בפיפטטור חוזר מכיוון שציפוי פולי-HEMA הידרופובי יגרום למתלה לקפוץ מהצלחת, מה שיוביל לפיזור לא אחיד.
    2. השליכו את כל המתלים העודפים לאחר מילוי כל הבארות.
  5. צנטריפוגה
    1. צנטריפוגה את הצלחת הסופית המכילה את תרחיף התא כדי לאחד את כל התאים יחד כגלולה. בזהירות לעטוף את הצלחת עם parafilm סביב הגבול של הצלחת כדי למנוע זיהום במהלך שלב זה. לאחר העטיפה, צנטריפוגו את הצלחת עם איזון נגדי ב 1000 x גרם במשך 2 דקות.
    2. החזירו את הצלחת למכסה המנוע של תרבית התאים (השתמשו בכפפות המרוססות באתנול כדי לטפל), הסירו את הפרפילם ואחסנו את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, עם 5% CO2. אין לרסס את הצלחת בתערובת אתנול-מים בשום שלב.
  6. תחזוקת תרבות
    1. צפו בתאים המתאחדים ליצירת ספרואידים תחת מיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 4-5 עד היום השלישי. פעל בהתאם לפרוטוקול תחזוקת התרבית כמתואר להלן.
      1. ביום השלישי, למדוד 5-6 מ"ל של DMEM + 10% FBS ולהוסיף 50 μL ממנו לכל באר לאורך הצד של הבאר.
        1. אין לערבב או להתסיס את המדיה בכל דרך שהיא במהלך התוספת, מכיוון שהדבר יפגע בכדוריד או יוביל להסרת ספרואידים בשוגג. הנפח הסופי לכל באר יהיה ~ 150 μL.
      2. מעבר ליום 3, עיינו באיור 2 כדי להכיר את מבנה הבאר ואת מיקום השתקפות האור (בין החלק הגלילי לחלק המעוגל של הבאר) שנראה על המדיה המכונה הילה. בצע פעולות קרוב להילה בזהירות כדי להבטיח שהספרואידים לא ייפגעו.
      3. ביום 6, למדוד 10-11 מ"ל של DMEM + 10% FBS. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לשלוף מדיה בכמויות גדולות מבארות מרובות על ידי משיכת מדיה החוצה עד הילה. עשו זאת עבור הצלחת כולה, ולאחר מכן החליפו את המדיה. לאסוף supernatant בכמויות גדולות ולהשליך, או להשליך אותו כפי שהוא נשלף החוצה.
      4. החלף את המדיה שהושלכה במדיה טרייה על ידי הוספת 100 μL של מדיה לאורך הצד של כל באר. הנפח הסופי בבאר יהיה קרוב ל -200 μL.
        1. אין למשוך מדיה מעבר להילה, מכיוון שהיא מגדילה את הסיכון לשליפת הספרואיד בטעות.
      5. ביום 10/11, למדוד 10-11 מ"ל של DMEM + 10% FBS. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לשלוף מדיה בכמויות גדולות מבארות מרובות על ידי משיכת מדיה החוצה עד הילה. עשו זאת עבור הצלחת כולה, ולאחר מכן החליפו את המדיה. לאסוף supernatant בכמויות גדולות ולהשליך, או להשליך אותו כפי שהוא נשלף החוצה.
      6. החלף את המדיה שהושלכה במדיה טרייה על ידי הוספת 100 μL של מדיה לאורך הצד של כל באר. הנפח הסופי בבאר יהיה קרוב ל -200 μL.
  7. הערכת יום אחרון
    1. בצע טיפול תרופתי על הספרואידים ביום ה -14. דמיינו את הספרואידים לפני השימוש באמצעות מיקרוסקופ הפוך בעל שדה בהיר תחת מטרה 4x כדי לקבוע את נפח ההתחלה של הספרואידים. חשב את אמצעי האחסון (V) באמצעות הנוסחה הבאה:
      V = 0.5 × L × W2
    2. עקוב אחר המשוואה כדי לחשב נפחים ספרואידים המתוארים לעיל. כאן L הוא אורך הציר הראשי, ו- W הוא הרוחב (הקו הארוך ביותר בניצב לציר הראשי). המר את כל היחידות המקוריות ממיקרומטרים למילימטרים כדי לקבל נפח במילימטר מעוקב.
    3. נפח ההתחלה בכל באר ביום ה -14 הוא בין 150-200 מיקרוליטר עקב אידוי. לטיפולים תרופתיים, הסירו את המדיה עד שההילה מגיעה מכל באר והחליפו אותה ב-100 מיקרוליטר של תמיסת התרופה בחוזק של פי 2, יחד עם ערבוב עדין (ערבבו את המדיה בעדינות קדימה ואחורה תוך כדי ספירה עד 2 בין כל באר).
      1. השתמש בתמיסות חוזק פי 2 כדי לאפשר לתמיסת התרופה הסופית להיות ב 1x ולהימנע לחלוטין מהסרה מוחלטת של מדיה ישנה מהבארות, כישלון אשר הספרואידים עלולים להיות מופרעים. השתמש בכדורידים תוך 3 ימים ממסגרת זמן זו.
  8. אוסף ספרואידים
    1. מדוד נפחים ספרואידים לפני האיסוף, כמתואר בשלב 4.7.2.
    2. אספו את הספרואידים ביום ה-14 או ה-17, בהתאם לצרכי הניסוי, על ידי הסרת מדיה מכל באר עד להגעה להילה.
    3. השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי להסיר מדיה ולאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל מבארות מרובות.
    4. ברגע שלכל הבארות יש מדיה ברמת ההילה, הפחיתו את ההגדרה על פיפטה של 1 מ"ל ל בין 200-300 מיקרוליטר.
    5. ישר את הצלחת על רקע מכסה המנוע או רקע כהה (למשל, מתלה צינורות) כדי לראות את הספרואידים מתיישבים בתחתית.
    6. הכניסו בעדינות את הקצה ליד הספרואיד (רדו מתחת להילה) ופיפטה כמות קטנה של מדיה (למשל, הערכה חזותית של קרוב ל-50 מיקרוליטר) קדימה ואחורה כדי להפריע לספרואיד. אל תניח את הקצה ישירות על הספרואידים, מכיוון שזה יכול לפגוע במבנה שלו.
      1. אל תוציא את כל התקשורת מהבאר בשלב זה. שלוט בתנועת האגודל בחוזקה על הבוכנה של הפיפטה.
    7. הזיזו את המדיה עד שהכדורית כבר לא נשארת במרכז וניתן לראות אותה נעה על הרקע. משכו מספיק מדיה כדי למצוץ את הספרואיד והעבירו אותו למיקום הרצוי (למשל, אגרו אותו עם ספרואידים אחרים בבאר שהיא חלק מאותה ערכת טיפול).
  9. השלכת פסולת
    1. יש להשליך את כל דגימות הנוזלים לאחר נטרולן עם אקונומיקה בהתאם לפרוטוקולים של מחלקת בטיחות הסביבה והבריאות של המעבדות המתאימות. Autoclave ולהשליך את כל פיפטות בשימוש צלוחיות עם פסולת מסוכנת ביולוגית.

figure-protocol-1
איור 1: סקירה כללית של התהליך לגידול ספרואידים תלת-ממדיים של סרטן לבלב דסמופלסטי (שנוצרו באמצעות BioRender). האיור נותן סקירה כללית של התהליכים הבסיסיים המעורבים; כלומר, טריפסינזינג תאים, שימוש בספירת התאים הראשונית כדי לבצע תרחיפים של תאים מדוללים, הכנת תרבית משותפת באמצעות מתלי התאים המדוללים, הוספת תרחיפים של תאים לכל באר, דגירה על התרביות, ביצוע תחזוקת מדיה והיווצרות ספרואידים סופית כצפוי ביום ה -14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-protocol-2
איור 2: מבנה באר תחתית U. התמונה הנכונה היא צורה מוגזמת כדי להדגים את החלק "הילה" של הבאר. מטרת האיור היא להגדיר היכן נמצא חלק ה"הילה" של הבאר, שכן עבודה מעל ההילה היא קריטית לגידול הספרואידים ולמניעת אובדן מקרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

5. הערכת רכיבי ECM ומיקרוסקופ קונפוקלי

  1. השתמש immunostaining כדי להעריך את התגובה של ECM לטיפול תרופתי על פי הפרוטוקול המתואר על ידי Durymanov et al.38.
    1. אגרו את הספרואידים יחד ושטפו פעמיים עם 100 מיקרוליטר של PBS. יש להטמיע בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) רקמה המטמיעה מדיום, להקפיא ולשמור על טמפרטורה של -80°C.
    2. חותכים את גושי הגידול הקפואים למקטעים של 10 מיקרומטר, מקבעים את החלקים בתערובת אצטון-מתנול (1:1) למשך 15 דקות, ומאפשרים להם להתייבש באוויר ב-RT.
  2. כדי לקבוע רכיבי ECM, immunostain cryosections עם נוגדנים ראשוניים אנטי פיברונקטין חד שבטי ארנבת, נוגדנים קולגן רב שבטי ארנב סוג I, נוגדנים רב-שבטיים נגד למינין, ונוגדנים לחומצה היאלורונית רב-שבטית כבשים.
  3. השתמש נגד ארנב עיזים IgG מסומן עם Alexa Fluor 488 או חמור נגד כבשים מצומד עם Alexa Fluor 568 כנוגדנים משניים.
    הערה: נוגדנים ראשוניים ומשניים דוללו ב-1:200 וב-1:300, בהתאמה.
  4. קבל תמונות של כל קטעי הספרואידים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשת 20x/0.45 אובייקטיבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שלושה מהשלבים הקריטיים ביותר שמעורבים בגידול הספרואידים הם ספירת התאים הראשונית, שלבי הערבוב בזמן זריעת הספרואידים, וביצוע שינויי מדיה בזמן כדי לאפשר לכדוריות לגדול (איור 1). נוסף על כך, היכרות עם איור 2 של שינויי המדיה לאחר היום השלישי היא קריטית כדי לאפשר שינויי מדיה אפקטיביים עקב הגידול בנפח המדיה בכל באר. כאשר כל השלבים האלה מבוצעים בהתאם להוראות שניתנו, נמצא שהספרואידים (איור 3) גדלים לנפח ממוצע של 0.048 ± 0.01...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

משך הזמן ויחסי התאים שנבחרו לגידול הספרואידים התבססו על מחקרים כפי שדווחו קודם לכן38. כאשר ניסו למטב מחקרים אלה על ידי החלפת תאי NIH3T3 בתאי HPaSteC, נפחי הספרואידים ודפוסי אפופטוזיס נמצאו דומים מאוד לפרמטרים הממוטבים שדווחו (דווח עבור PANC-1: NIH3T3:: 120:12) כאשר יחסי PANC-1: HPaSteC היו 120: 60. למרות שמחקרים אלה מודדים אפופטוזיס רק עד היום ה -14, הפרוטוקול המתואר בתהליך זה ממשיך להשתמש בספרואידים עד היום ה -17, שכן לא נצפתה עלייה נראית לעין בהיווצרות פסולת בין...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

העבודה שתוארה נתמכה על ידי משרד מושלי דקוטה הדרומית לפיתוח כלכלי, תוכנית מענקי המחקר התחרותיים של מועצת העוצרים של דקוטה הדרומית (SD-BOR-CRGP) והמחלקה למדעי התרופות באוניברסיטת מדינת דקוטה הדרומית על תמיכתם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ הפוך Axio ObserverCarl Zeiss0450-354
Cellometer Auto T4Nexcelom Bioscience LLCAuto-T4
DMEM, אבקה, גלוקוז גבוהGibco12100046
חמור נגד כבשים מצומד עם Alexa Fluor 568Abcamab175712
סרום בקר עוברי CytivaSH3091003HI
עיזים נגד ארנב IgG מסומן עם Alexa Fluor 488 Abcamab150077
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) Gibco14175145
תאי כוכב לבלב אנושיים (HPaSteC)ScienCell3830
מיקרוסקופNikon NikonEclipse Ts 100
Nunc 96-Well פוליסטירן עגול תחתון Microwell צלחות ThermoScientific12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 לייזר קונפוקליאולימפוסN/Aמוצר
PANC-1ATCCCRL-1469
Poly-HEMASigmaP3932
נוגדנים אנטי-למינינים פוליקלונליים של ארנב Abcamab11575
ארנב פוליקלונלי אנטי סוג I נוגדנים לקולגן Abcamab34710
נוגדנים אנטי-חומצה היאלורונית פוליקלונליים כבשיםAbcamab53842
ערכת מדיה תאית כוכבית מלאה ScienCell5301
טריפסין MP Biomedicals, LLC153571תמיסת טריפסין שהוכנה על פי פרוטוקול היצרן ומשמשת ב-0.25% w/v 
תמיסת נטרול טריפסין (TNS)ScienCell103
שהופסק

מקורות

  1. Hingorani, S. R. Epithelial and stromal co-evolution and complicity in pancreatic cancer. Nat Rev Cancer. 23 (2), 57-77 (2023).
  2. Laklai, H., et al. Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression. Nat Med. 22 (5), 497-505 (2016).
  3. Binker, M. G., Binker-Cosen, M. J., Binker-Cosen, A. A., Cosen-Binker, L. I. Microenvironmental factors and extracellular matrix degradation in pancreatic cancer. J Pancreas. 15 (4), 280-285 (2014).
  4. Spano, D., Zollo, M. Tumor microenvironment: a main actor in the metastasis process. Clin Exp Metastasis. 29 (4), 381-395 (2012).
  5. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  6. Sunami, Y., Häußler, J., Kleeff, J. Cellular heterogeneity of pancreatic stellate cells, mesenchymal stem cells, and cancer-associated fibroblasts in pancreatic cancer. Cancers. 12 (12), 3770(2020).
  7. Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. J Exp Med. 214 (3), 579-596 (2017).
  8. Pandol, S., Edderkaoui, M., Gukovsky, I., Lugea, A., Gukovskaya, A. Desmoplasia of pancreatic ductal adenocarcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 7 (11), S44-S47 (2009).
  9. Watanabe, I., et al. Advanced pancreatic ductal cancer: fibrotic focus and β-catenin expression correlate with outcome. Pancreas. 26 (4), 326-333 (2003).
  10. Hu, G., et al. Tumor-infiltrating podoplanin+ fibroblasts predict worse outcome in solid tumors. Cell Physiol Biochem. 51 (3), 1041-1050 (2018).
  11. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  12. Monberg, M. E., et al. Occult polyclonality of preclinical pancreatic cancer models drives in vitro evolution. Nat Commun. 13 (1), 3652(2022).
  13. Emerman, J. T., Pitelka, D. R. Maintenance and induction of morphological differentiation in dissociated mammary epithelium on floating collagen membranes. In Vitro. 13 (5), 316-328 (1977).
  14. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  15. Kikuta, K., et al. Pancreatic stellate cells promote epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun. 403 (3-4), 380-384 (2010).
  16. Lee, J. -H., et al. Microfluidic co-culture of pancreatic tumor spheroids with stellate cells as a novel 3D model for investigation of stroma-mediated cell motility and drug resistance. J Exp Clin Cancer Res. 37 (1), 4(2018).
  17. Wong, C. -W., Han, H. -W., Tien, Y. -W., Hsu, S. -H. Biomaterial substrate-derived compact cellular spheroids mimicking the behavior of pancreatic cancer and microenvironment. Biomaterials. 213, 119202(2019).
  18. Liu, X., et al. 3D heterospecies spheroids of pancreatic stroma and cancer cells demonstrate key phenotypes of pancreatic ductal adenocarcinoma. Transl Oncol. 14 (7), 101107(2021).
  19. Vonlaufen, A., et al. Pancreatic stellate cells: partners in crime with pancreatic cancer cells. Cancer Res. 68 (7), 2085-2093 (2008).
  20. Bachem, M. G., et al. Pancreatic carcinoma cells induce fibrosis by stimulating proliferation and matrix synthesis of stellate cells. Gastroenterology. 128 (4), 907-921 (2005).
  21. Greco, E., et al. Pancreatic cancer cells invasiveness is mainly affected by interleukin-1β not by transforming growth factor-β1. Int J Biol Markers. 20 (4), 235-241 (2005).
  22. Arao, S., Masumoto, A., Otsuki, M. β1 integrins play an essential role in adhesion and invasion of pancreatic carcinoma cells. Pancreas. 20 (2), 129-137 (2000).
  23. Sawai, H., Yamamoto, M., Okada, Y., Sato, M., Akamo, Y., Takeyama, H., Manabe, T. Alteration of integrins by Interleukin-1alpha in human pancreatic cancer cells. Pancreas. 23 (4), 399-405 (2001).
  24. Chen, J., et al. Expression and function of the epidermal growth factor receptor in physiology and disease. Physiol Rev. 96 (3), 1025-1069 (2016).
  25. Deer, E. L., et al. Phenotype and genotype of pancreatic cancer cell lines. Pancreas. 39 (4), 425(2010).
  26. Stahle, M., et al. Mechanisms in LPA-induced tumor cell migration: critical role of phosphorylated ERK. J Cell Sci. 116, Pt 18 3835-3846 (2003).
  27. Aubert, M., et al. Decrease of human pancreatic cancer cell tumorigenicity by α1, 3galactosyltransferase gene transfer. Int J Cancer. 107 (6), 910-918 (2003).
  28. Miknyoczki, S. J., Chang, H., Klein-Szanto, A., Dionne, C. A., Ruggeri, B. A. The Trk tyrosine kinase inhibitor CEP-701 (KT-5555) exhibits significant antitumor efficacy in preclinical xenograft modelsof human pancreatic ductal adenocarcinoma. Clin Cancer Res. 5 (8), 2205-2212 (1999).
  29. Fukasawa, M., Korc, M. Vascular endothelial growth factor-trap suppresses tumorigenicity of multiple pancreatic cancer cell lines. Clin Cancer Res. 10 (10), 3327-3332 (2004).
  30. Hernández-Camarero, P., et al. Pancreatic (pro) enzymes treatment suppresses BXPC-3 pancreatic Cancer Stem Cell subpopulation and impairs tumour engrafting. Sci Rep. 9 (1), 11359(2019).
  31. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Eng Part C Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  32. Longati, P., et al. 3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing. BMC Cancer. 13, 95(2013).
  33. Kpeglo, D., et al. Modeling the mechanical stiffness of pancreatic ductal adenocarcinoma. Matrix Biol Plus. 14, 100109(2022).
  34. Jang, S. -D., et al. Anti-cancer activity profiling of chemotherapeutic agents in 3D co-cultures of pancreatic tumor spheroids with cancer-associated fibroblasts and macrophages. Cancers. 13 (23), 5955(2021).
  35. Pednekar, K. P., Heinrich, M. A., van Baarlen, J., Prakash, J. Novel 3D µtissues mimicking the fibrotic stroma in pancreatic cancer to study cellular interactions and stroma-modulating therapeutics. Cancers. 13 (19), 5006(2021).
  36. Kim, S. -K., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of cancer cell migration in a pancreatic tumor three-dimensional culture model. Cancers. 12 (5), 1305(2020).
  37. Hwang, H. J., Oh, M. -S., Lee, D. W., Kuh, H. -J. Multiplex quantitative analysis of stroma-mediated cancer cell invasion, matrix remodeling, and drug response in a 3D co-culture model of pancreatic tumor spheroids and stellate cells. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 258(2019).
  38. Durymanov, M., et al. Subcutaneous inoculation of 3D pancreatic cancer spheroids results in development of reproducible stroma-rich tumors. Transl Oncol. 12 (1), 180-189 (2019).
  39. Giustarini, G., Teng, G., Pavesi, A., Adriani, G. Characterization of 3D heterocellular spheroids of pancreatic ductal adenocarcinoma for the study of cell interactions in the tumor immune microenvironment. Front Oncol. 13, 1156769(2023).
  40. Alseud, K., et al. Synthesis and biological activity of 11-oxygenated and heterocyclic estrone analogs in pancreatic cancer monolayers and 3D spheroids. Bioorg Med Chem. , (2024).
  41. Fitzgerald, A. A., et al. Fibroblast activation protein regulates natural killer cell migration, extravasation and tumor infiltration. bioRxiv. , 429622(2021).
  42. Wishart, G., Gupta, P., Schettino, G., Nisbet, A., Velliou, E. 3D tissue models as tools for radiotherapy screening for pancreatic cancer. Br J Radiol. 94 (1120), 20201397(2021).
  43. Peirsman, A., et al. MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity. Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).
  44. Durymanov, M., Kroll, C., Permyakova, A., Reineke, J. Role of endocytosis in nanoparticle penetration of 3D pancreatic cancer spheroids. Mol Pharm. 16 (3), 1074-1082 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

ספרואידים דסמופלסטייםתרבית קו-קלטורה תלת-ממדיתמטריצה חוץ-תאיתתאי כוכב לבלבתאי PANC-1תרבית ספרואידיםציפוי Poly-HEMAמיקרו-סביבה גידוליתמחסום ECM
גידול ספרואידים תלת מימדיים של סרטן הלבלב הדסמופלסטי מבית Co-Culture
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.