אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר
במאמר זה
סיכום
תקציר
אנו מציגים שיטה לשלב בשלפוחיות רשתות חלבונים מורכבות, המערבות חלבוני ממברנה אינטגרליים, אנזימים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות, תוך שימוש ברכיבים מטוהרים. שיטה זו רלוונטית לתכנון ובנייה של ביוריאקטורים ולחקר רשתות תגובה מטבולית מורכבות מחוץ לשיווי משקל. אנו מתחילים בבנייה מחדש של חלבוני ממברנה (מרובים) לשלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUVs) על פי פרוטוקול שפותח בעבר. לאחר מכן אנו עוטפים תערובת של אנזימים מטוהרים, מטבוליטים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות (חלבונים פלואורסצנטיים או צבעים) באמצעות הקפאה-הפשרה-אקסטרוזיה ומסירים רכיבים שאינם משולבים באמצעות צנטריפוגה ו/או כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ביצועי הרשתות המטבוליות נמדדים בזמן אמת על ידי ניטור יחס ATP/ADP, ריכוז מטבוליטים, pH פנימי או פרמטרים אחרים על ידי קריאת פלואורסצנטיות. ניתן להמיר את השלפוחיות המכילות חלבון ממברנה בקוטר 100-400 ננומטר לשלפוחיות ענקיות (GUV), באמצעות הליכים קיימים אך מותאמים. הגישה מאפשרת הכללת רכיבים מסיסים (אנזימים, מטבוליטים, חיישנים) בשלפוחיות בגודל מיקרומטרי, ובכך להגדיל את נפח הביוריאקטורים בסדרי גודל. הרשת המטבולית המכילה GUV לכודים בהתקנים מיקרופלואידים לניתוח במיקרוסקופ אופטי.
מבוא
תחום הביולוגיה הסינתטית מלמטה למעלה מתמקד בבניית תאים (מינימליים) 1,2 וביוריאקטורים מטבוליים למטרות ביוטכנולוגיות 3,4 או ביו-רפואיות 5,6,7,8. בניית תאים סינתטיים מספקת פלטפורמה ייחודית המאפשרת לחוקרים לחקור חלבונים (ממברנה) בתנאים מוגדרים היטב המחקים את אלה של סביבות טבעיות, ומאפשרת גילוי תכונות מתפתחות ופונקציות ביוכימיות נסתרות של חלבונים ורשתות תגובה9. כצעד ביניים לקראת תא סינתטי המתפקד באו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנה כללית
- כימיקלים
- יש להמיס שומנים (בצורת אבקה) ל-25 מ"ג/מ"ל ב-CHCl3 להכנת ליפוזומים מוכנים.
הערה: עדיף להכין מלאי שומנים טריים, אך ניתן לאחסן את תמיסות המלאי גם ב -20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות. עבודה עם שומנים בצורת אבקה מדויקת יותר מאשר שימוש בליפידים שכבר מסיסים ב-CHCl3. CHCl3 צריך להיות מטופל באמצעות פיפטות זכוכית ו / או מזרקים ולאחסן במיכלי זכוכית כמו CHCl3 ממיס פלסטיק. - המסת מולקולות קטנות (נוקלאוטידים, חומצות אמינו, בדיקות פלואורסצנטיות) עבור הליך האנקפסולציה ב- 50 mM KPi (חיץ A, ראה טבלה 1) והתאמת ה- pH ל- 7.00 ±- 0.01. יש להמיס את MgCl2
- יש להמיס שומנים (בצורת אבקה) ל-25 מ"ג/מ"ל ב-CHCl3 להכנת ליפוזומים מוכנים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה מסיסים בליפוזומים דורשת ערעור היציבות של שלפוחיות מוכנות. תוספת של כמויות נמוכות של Triton X-100 גורמת בתחילה לעלייה בספיגה של 540 ננומטר (A540) עקב עלייה בפיזור האור על-ידי נפיחות השלפוחיות (איור 4). הערך המרבי A540 הוא הנקודה שבה הליפוזומים רוויים בחומר ניקוי (Rsat), ולאחר מכן כל תוספת נוספת של טריטון X-100 תגרום למסיסות חלקית של השלפוחיות. ב-Rsol, הליפוזומים מסיסים לחלוטין (איור .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של חלבון (ממברנה) המכיל שלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטרי (proteoLUVs), והמרה של proteoLUVs לשלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות (proteoGUVs). הפרוטוקול צריך להיות ישים להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה אחרים 13,19,30,40 ולאנקפסולציה של רשתות מטבוליות אחרות מלבד מסלולי פירוק L-ארגינין וסינתזה של גליצרול 3-פוספט המוצגים כאן.
ההרכבה מחדש של חלבוני הממברנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.
תודות
המחברים מודים לאדיטיה אייר על שיבוט הגן pBAD-PercevalHR ולגיאה שורמן-וולטרס על הסיוע בייצור וטיהור חלבונים. המחקר מומן על ידי תוכנית הכבידה של NWO "בניית תא סינתטי" (BaSyC).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma Aldrich | A9414-25g | |
| Amicon מסנן חיתוך | Sigma Aldrich | Milipore יחידות סינון צנטריפוגלי Amicon Ultra | |
| BioBeads | BioRad | 152-3920 | |
| CHCl3 | Macron כימיקלים עדינים | MFCD00000826 | |
| D(+)-גלוקוז | למדיום-D | ||
| (+)-סוכרוז | למדיום-DDM | ||
| גליקון | D97002 -C | ||
| דיאתיל אתר | Biosolve | 52805 | |
| DMSO | סיגמא-אולדריץ' | 276855-100 מ"ל | |
| DOPC | Avanti | 850375P-1g | |
| DOPE | Avanti | 850725P-1g | |
| DOPG | Avanti | 840475P-1g | |
| DTT | Formedium | DTT005 | |
| EtOH | J.T.Baker Avantor | MFCD00003568 | |
| Extruder | Avestin Inc | LF-1 | |
| פלואורמטר | Jasco | ספקטרופלואורומטר FP-8300 | |
| גליצרול | BOOM | 51171608 | |
| עמוד זרימת כוח הכבידה | Bio-Rad | 732-1010 | |
| מזרק המילטון 100 ומיקרו; L | המילטון | 7656-01 | |
| מזרק המילטון 1000 ומיקרו; L | Hamilton | 81320 | |
| מתקן LCP כף יד | ארט רובינס מכשירים | 620-411-00 | |
| כף יד סוניקטור | Hielscher טכנולוגיית אולטרסאונד | UP50H | |
| HCl | BOOM | x76021889.1000 | |
| Imidazole | Roth | X998.4-250g | |
| K2HPO4 | Supelco | 1.05099.1000 | |
| KCl | BOOM | 76028270.1 | |
| KH2PO4 | Supelco | 1.04873.1000 | |
| Kimwipe | Kimtech Science | 7552 | |
| צנטריפוגה צינור בז גדול | אפנדורף | 5810 R | |
| L-ארגינין | סיגמא-אולדריץ' | A5006-100G | |
| מיקרוסקופ אור | Leica | DM LS2 | |
| L-Ornithine | Roth | T204.1 | |
| LSM סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי | Zeiss | LSM 710 ConfoCor 3 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670-1KG | |
| שבב מיקרופלואידי | תוצרת בית | מבוסס PDMS | : https://doi.org/10.1039/C8LC01275J |
| Na-ADP | Sigma-Aldrich | A2754-1G | |
| NaCl | Supelco | 1.06404.1000 | |
| ספקטרומטר Nanodrop | Isogen Life Science | ND-1000 ספקטרופוטומטר NanoDrop | |
| NaOH | Supelco | 1.06498.1000 | |
| מחטים ל-GUVs | Henke-Ject | 14-14575 | 27 גרם x 3/4 אינץ' 0.4 x 20 מ"מ |
| מחטים למיקרופלואידיקה | Henke-Ject | 14-15538 | 18 G x 1 1/2 '' 1.2 x 40 מ"מ |
| Ni2+ Sepharose | Cytiva | 17526802 | |
| ניגריצין | Sigma-Aldrich | N7143-5MG | |
| Nutator | VWR | 83007-210 | |
| מד | אוסמולליותGonotec Salmenkipp | Osmomat 3000 נקודת הקפאה בסיסית אוסמומטר | |
| פלזמה | מנקה פלזמה תחריט | PE-Avenger | |
| מסנן פוליקרבונט | Cytiva Whatman | Nuclepor Track-Etch ממברנה מוצר: 10417104 | 0.4 & מיקרו; |
| m צינור אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט | בקמן קולטר | 355647 | |
| פירנין | אקרוס אורגניקס | H1529-1G | |
| קובטה קוורץ (שחור) | Hellma Analytics | 108B-10-40 | |
| Sephadex G-75 שרף | GE Healthcare | 17-0050-01 | |
| Sonicator | Sonics Sonics & חומרים INC | סוניקס תא | |
| מסנן מזרק | Sarstedt | Filtropur S פלוס 0.2 | 0.2 & מיקרו; m |
| משאבת מזרק | מכשיר הרווארד | A-42467 | |
| צנטריפוגה שולחנית | אפנדורף | 5418 | |
| מרווח טפלון | תוצרת בית | מבוסס טפלון | 45 x 26 x 1.5 או 45 x 26 x 3 או 20 x 20 x 3 מ"מ |
| Tris | PanReac AppliChem | A1086.1000 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100 מ"ל | |
| בקמן קולטר | אופטימה Max-E | ||
| מנורת UV | ספקטרולין | ENB-280C/FE | |
| UV/VIS ספקטרומטר | Jasco | V730 ספקטרופוטומטר | |
| Valinomycin | Sigma-Aldrich | V0627-10MG | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב | Zeiss | AxioObserver | |
| β-קזאין | סיגמא אולדריץ' | C5890-500g |
מקורות
- Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems. Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).
- Ivanov, I., et al. Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
