הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל חולדה של חסימה/עירוי מחדש של עורק המוח האמצעי מבלי לפגוע במבנה האנטומי של כלי המוח

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66635

⸱

17 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The Third Hospital of Hebei Medical University, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation, Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל חולדה של חסימה/רפרפוזיה של עורק המוח האמצעי המשמר את המבנה האנטומי של כלי המוח מבלי לגרום נזק.

תקציר

שבץ איסכמי הוא הגורם העיקרי לנכות ותמותה ארוכת טווח בקרב מבוגרים ברחבי העולם. מודלים של בעלי חיים של שבץ איסכמי תרמו באופן משמעותי להבנת המנגנונים הפתולוגיים שלו ולפיתוח טיפולים פוטנציאליים. נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות נפוצות הכוללות טכניקות נימה (תפר אנדווסקולרי) כדי לגרום למודלים של בעלי חיים של איסכמיה מוחית. עם זאת, לשיטות אלו יש מגבלות מובנות, כגון זלוף דם מופחת למוח, נזק למערכת עורק הצוואר החיצונית, פגיעה בצריכת מזון ו/או מים ותפקוד לקוי של הפנים. מאמר זה מציג שיטה חדשה להשראת מודל שבץ איסכמי של חולדה מבלי לפגוע באנטומיה של כלי הדם במוח. במחקר זה נחשף עורק הצוואר המשותף (CCA) של חולדות Sprague-Dawley, ובוצע חתך. לאחר מכן הוכנס חוט דרך החתך לעורק הצוואר הפנימי כדי לחסום את עורק המוח האמצעי. לאחר שעה וחצי של איסכמיה מושרית, החוט החוסם הוסר במלואו הן מעורק הצוואר הפנימי והן מה-CCA. החתך ב-CCA נתפר לאחר מכן באמצעות תפרים מיקרו-כירורגיים 11-0 תחת מיקרוסקופ (הגדלה פי 4). באמצעות שימוש בטכניקות מיקרו-כירורגיות לתיקון CCA, מחקר זה פיתח בהצלחה שיטה ייחודית לגרימת מודל שבץ איסכמי בחולדות תוך שמירה על השלמות האנטומית של כלי הדם במוח.

מבוא

שבץ מוחי, הגורם המוביל למוות ולתפקוד נוירולוגי ארוך טווח בקרב מבוגרים ברחבי העולם, מקיף סוגים שונים, כאשר שבץ איסכמי מהווה כ-81.9% מהמקרים, בעוד שדימום מוחי ודימום תת-עכבישי מהווים 14.9% ו-3.1%, בהתאמה1. שבץ איסכמי נובע לעתים קרובות מטרשת עורקים או חסימה של עורק המוח האמצעי (MCA), מה שמוביל להפחתת זרימת הדם המקומית במוח ולנזק מוחי לאחר מכן. הפחתה זו באספקת החומרים המזינים לתאים איסכמיים גורמת לדלדול אנרגיה, וגורמת לאובדן שלמות הממברנה, נפיחות תאים ובסופו של דבר ליזה. נוסף על כך, גורמים כמו עלייה בסידן תוך-תאי, שחרור חומצות אמינו מעוררות, ייצור מוגבר של רדיקלים חופשיים והפעלת תאים דלקתיים תורמים לפגיעה ברקמת המוח לאחר שבץ מוחי2.

מטרות הטיפול בשבץ איסכמי הן רב-פנים: הפחתת נזק נוירולוגי מתמשך והפחתת תמותה ונכות ארוכת טווח; מניעת סיבוכים הנובעים מחוסר תנועה ותפקוד נוירולוגי לקוי; ומזעור הסיכון להישנות שבץ מוחי. בהתחשב במורכבות הפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי, מודל שבץ חזק חיוני למחקר ופיתוח של טיפולים המכוונים לשבץ איסכמי.

נכון לעכשיו, חסימת עורק המוח האמצעי (MCAo) היא מודל נפוץ של שבץ איסכמי3. MCAo מבוצע בדרך כלל על ידי החדרת מונופילמנט עם קצה סיליקון או קהה להבה דרך כלי צוואר הרחם עד שהוא מגיע למקור עורק המוח האמצעי (MCA). בשנת 1986, קואיזומי ועמיתיו פיתחו טכניקה הכוללת החדרת מונופילמנט בעל קצה סיליקון דרך חתך בעורק הצוואר המשותף (CCA), המאפשר לו להגיע לכניסה ל-MCA ולחסום את זרימת הדם שלו4. בשנת 1989, קבוצתו של לונגה דיווחה על שיטת MCAo נוספת שכללה החדרת מונופילמנט דרך חתך בעורק הצוואר החיצוני (ECA). לאחר מכן, המונופילמנט חוצה את ההתפצלות של עורק הצוואר הפנימי (ICA) ו-ECA לפני שהוא מגיע לנקודת ההתחלה של MCA5.

המגבלות של שתי השיטות הקיימות להשראת MCAo ניכרות. השיטה של קואיזומי מחייבת חסימה קבועה של ה-CCA המקביל, מה שמוביל להפחתת זלוף MCA מכיוון שהרפרפוזיה מסתמכת אך ורק על המעגל של Willis4. לעומת זאת, השיטה של לונגה כוללת חיתוך ה-ECA, וכתוצאה מכך נזק למערכת ה-ECA וכתוצאה מכך פגיעה בתפקוד שרירי הפנים5. נזק זה יכול להשפיע על צריכת המזון והמים, כמו גם לגרום לתפקוד תחושתי לקוי של הפנים, ולהשפיע על השיקום והערכת התפקוד הנוירולוגי לאחר שבץ איסכמי6.

הפרוטוקול הנוכחי מבקש לטפל במגבלות אלה על ידי פיתוח שיטה חדשה לגרימת מודל שבץ איסכמי מבלי לפגוע במבנה האנטומי של כלי המוח. גישה חדשנית זו משתמשת בטכניקות מיקרו-כירורגיות לתיקון ה-CCA, ובכך נמנעת מהחסרונות הקשורים לשיטות קודמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הליך הניסוי קיבל אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת יאנטאי (מספר אישור: YTDX20230410) ודבק בהנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. חולדות Sprague-Dawley זכרות במשקל של בין 300-350 גרם שימשו למחקר זה. רשימה מקיפה של בעלי החיים, הריאגנטים והציוד המשמשים מסופקת בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. שכן את בעלי החיים בסביבה השומרת על מחזור אור/חושך של 12 שעות, טמפרטורה מבוקרת ולחות. להבטיח שיש להם גישה בלתי מוגבלת למזון ולמים.

2. הרדמה

  1. להרדים את החולדות באמצעות הזרקה תוך-צפקית בתערובת המכילה קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (20 מ"ג/ק"ג).
    הערה: הטה את הראש והגוף של חולדות כלפי מטה. אתר ההזרקה נמצא ברבע הימני התחתון של הבטן של החיה. משוך לאחור את הבוכנה לפני ההזרקה. נפח ההזרקה הממוצע הוא 0.4 מ"ל.
  2. אשר את השראת ההרדמה על ידי הערכת רפלקס הנסיגה של הכף האחורית ורפלקס המהבהב. אם לא מושג עומק הרדמה מתאים, יש להוסיף איזופלורן במהלך ההליך הכירורגי.

3. הליך מידול איסכמי

  1. יש לעקר את כלי הניתוח באמצעות חיטוי. חיטוי שולחנות הניתוחים והציוד הנלווה עם 70% אתנול.
  2. הכן את אתר הניתוח על ידי גילוח הפרווה סביב אתר החתך הצפוי. יש לחטא את העור באתר הניתוח שלוש פעמים עם בטדין ו -70% אתנול.
  3. בצע חתך בקו האמצע בצד הגחון, באורך של כ -1.5 ס"מ, ופתח את הפאשיה השטחית.
  4. בצע דיסקציה חדה וקהה כדי לחשוף את עורק הצוואר החיצוני (ECA), עורק הצוואר הפנימי (ICA) ועורק הצוואר המשותף (CCA) לפי השיטה7.
  5. הנח שלושה תפרי משי 4-0 סביב ה-CCA ותפר משי נוסף דרך ה-ECA ליד התפצלות ה-ICA. קשרו קשר החלקה הניתן לשחרור על ה-CCA הפרוקסימלי. הדק את התפר על ה-CCA הדיסטלי באמצעות המוסטט כדי לחסום את זרימת הדם. קשרו באופן רופף קשר החלקה נוסף סביב ה-CCA במהלך התפירה כדי להבטיח שהכלי אינו חסום.
    הערה: ודא שקשר ההחלקה אינו הדוק מדי, מספיק רק כדי לחסום את זרימת הדם, מכיוון שיהיה צורך לשחרר אותו במהלך תפירת כלי הדם.
  6. בצע חתך של 0.5 מ"מ בין תפר המשי הפרוקסימלי לתפר האמצעי ב-CCA באמצעות מספריים.
    הערה: ודא שהחתך מאפשר לחוט (קצה מצופה סיליקון) להיכנס ל-CCA.
  7. הכניסו ל-CCA אורך 3 ס"מ של נימה 4-0 (קצה מצופה סיליקון). הדק את תפרי המשי סביב ה-CCA כדי לאבטח את החוט התוך-לומינלי ולמנוע דימום; לאחר מכן, הסר את התפר מה-CCA הדיסטלי.
  8. המשך להכניס את החוט ללומן של ה-MCA, תוך שליטה על התפרים סביב ה-ECA כדי להבטיח שהחוט לא ייכנס ל-ECA. אורך ההכנסה הוא בדרך כלל 18 מ"מ עד 20 מ"מ.
  9. הפעל טיימר ורשום את השעה שבה מתחילה החסימה. תפרו את חתך הצוואר עם 3-0 תפרי משי והניחו בזהירות את החיה בכלוב התאוששות. יש לתת 0.5 מ"ל של מי מלח רגילים תוך צפק.

4. תפירה מיקרוכירורגית של ה-CCA

  1. להרדים מחדש את החולדה 1.5 שעות לאחר איסכמיה. יש לחטא את מקום החתך שלוש פעמים עם אתנול 70% ולפתוח מחדש את החתך.
  2. משוך בעדינות את החוט החוסם עד שהקצה הלבן נראה בבירור ליד חתך ה-CCA. הנח מיקרו clamp אופקית קרוב לקשר התפר התוך-לומינלי המאובטח ליד התפצלות CCA.
    הערה: הימנע מה-clampקצה החוט הלבן כדי למנוע ניתוק סיליקון ופקקת שלאחר מכן.
  3. שחרר את קשר התפר התוך-לומינלי המאובטח והסר לחלוטין את החוטים.
  4. הנח מיקרו מהדק נוסף ליד צד קצה הלב של קשר ה-CCA הפרוקסימלי. לאחר מכן, הסר את קשר התפר סביב ה-CCA הפרוקסימלי.
    הערה: מיקום נכון של clamps הוא חיוני להרמת כלים קבועים בשלבים מאוחרים יותר כדי להקל על תפירה מיקרו-וסקולרית. הנח clamps אופקית על השרירים שמסביב כדי למנוע החלקה.
  5. שטפו את מקום החתך במי מלח רגילים וייבשו את האזור בעזרת צמר גפן סטרילי כדי להסיר את הדם ולהשיג שדה כירורגי נקי.
  6. תחת מיקרוסקופ (הגדלה פי 4), תפר את חתך ה-CCA באמצעות תפרים מיקרו-כירורגיים 11-0 בתבנית קטועה, בדרך כלל דורש שני תפרים בהתאם לגודל החתך.
  7. לאחר התפירה, הסר את מהדקי המיקרו משני קצוות ה-CCA כדי להחזיר את זרימת הדם.
  8. הפעל לחץ עם צמר גפן סטרילי על מקום התפר CCA למשך 30 שניות. התבונן ב-CCA למשך 2 דקות כדי לוודא שלא יתרחש דימום. יש לתפור את החתך בצוואר החולדה ולהניח את בעל החיים בקופסת טיפול בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס להתאוששות מהרדמה לפני החזרתו לכלוב.
    הערה: יש לתת תוך צפקי עם מלוקסיקם במינון של 2 מ"ג/ק"ג לשיכוך כאבים לאחר הניתוח.

5. צביעה עם 2,3,5-טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC)

  1. שלושה ימים לאחר האיסכמיה-רפרפוזיה, המתת חסד של בעלי החיים בהרדמה עמוקה עם איזופלורן 4% ופריקת צוואר הרחם.
  2. הסר את המוחות וחתוך אותם לחלקים קורונליים בעובי 2 מ"מ באמצעות להב אזמל8.
  3. דגרו על חלקי המוח עם 2% TTC למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
  4. שטפו את חלקי המוח פעמיים עם 10% פורמלין, ואז תקנו אותם עם 10% פורמלין למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. צלם תמונות דיגיטליות של פרוסות עוקבות ומדוד כמותית את אזורי האוטם באמצעות תוכנת Image J.

6. בדיקת תפקוד נוירולוגי

הערה: התפקוד הנוירולוגי הוערך באמצעות מבחן גרסיה, בעקבות דוח קודם9.

  1. להעריך פעילות ספונטנית, סימטריה בתנועה של כל ארבע הגפיים, מתיחת כף היד הקדמית, טיפוס, פרופריוספציה של הגוף ותגובה למגע ויבריסה. הקצה ציונים על סמך קריטריוני מבחן גרסיה, עם ציון מקסימלי של 18 נקודות המעיד על תפקוד נוירולוגי תקין.

7. ניתוח סטטיסטי

  1. השתמש ב-GraphPad Prism כדי לבצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן ה-t של הסטודנט. בטא את הנתונים כממוצע ± סטיית תקן. שקול את ההבדלים בין הממוצעים המובהקים סטטיסטית אם P < 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תהליך התפירה המיקרוסקופית
החוט נסוג סמוך לחתך ב-CCA עד שקצה החוט הלבן היה גלוי (איור 1A). לאחר מכן הוצבו תפסני מיקרו על ה-CCA (איור 1B). תחת מיקרוסקופ בהגדלה של 4x, נתפר החתך ב-CCA באמצעות תפרי מיקרו-כירורגיה בתבנית של תפרים נפרדים (איור 1C). לאחר מכן, הוסרו תפסני המיקרו מה-CCA, ובכך הוחזרו המבנה האנטומי וזרימת הדם (איור 1D).

צביעת TTC ושיעור התמו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

MCAo היא שיטה בשימוש נרחב ליצירת מודלים של שבץ מוחי בבעלי חיים, המשחזרת ביעילות את תהליך השבץ שנצפה בחולים על ידי שחזור זרימת הדם לאחר איסכמיה 10,11,12. המעבדה שלנו פיתחה מודל שבץ איסכמי המאפשר רפרפוזיה מה-CCA מבלי לגרום נזק ל-ECA. לאחר השראת איסכמיה, מבוצע תיקון מיקרו-כירורגי של ה-CCA. למרות שלא נערכה מדידה ישירה של זרימת הדם CCA, הנסיינים הבחינו בפעימות כלי הדם ב-CCA לפני שהמשיכו בעירוי מחדש. טכניקה זו שומרת על השלמות האנטומית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים מנוגדים פוטנציאליים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט הצגת מודיעין זר במחוז הביי בשנת 2023. אנו מודים ל-Lisa Kreiner, PhD, מ-Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), על עריכת הטקסט האנגלי של טיוטה של כתב היד הזה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10% פורמליןבייג'ינג Labgic טכנולוגיה ושות', בע"מBL913A
11-0 תפרים מיקרוכירורגייםNingbo תפר רפואי מחט ושות', בע"מ3/8 1 פעמים;
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)SIGMAT8877
3-0 תפר משיNingbo רפואי תפר מחט ושות', בע"מ3-0
4% איזופלורן   טיאנג'ין רינגפו ביו-טכנולוגיה ושות', בע"מ
6-0 תפר משיNingbo רפואי תפר מחט ושות', בע"מ6-0
70% אתנולשאנדונג לירקאנג טכנולוגיה רפואית ושות', בע"מ
20230408נימה Xinong טכנולוגיות בע"מ2838-A5
קטמין   ג'יאנגסו Hengrui פרמצבטיקה ושות', בע"מ230613BL
זכר Sprague Dawley חולדותג'ינאן Pengyue גידול בעלי חיים ניסיוני ושות', בע"מSCXK (Lu) 20190003
MicroclipsShanghai Jinzhong Medical Device FactoryW40150
מיקרוסקופZEISSS100 OPMI pico
תיבת הנקהבייג'ינג Fuyi מכשירי חשמל ושות', בע"מFYL-YS-100L
PHR3263קסילזיןSIGMA
520221102

מקורות

  1. Tu, W. J., et al. China stroke surveillance report 2021. Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).
  2. Wu, L., et al. Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury. Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).
  3. Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
  4. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  5. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  6. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
  7. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice. J Vis Exp. (51), e2879(2011).
  8. Yu, Z., et al. Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway. Mol Med. 28 (1), 142(2022).
  9. Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).
  10. Bracko, O., et al. 3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).
  11. Goldmacher, G. V., et al. Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model. PLoS One. 8 (3), e60049(2013).
  12. Lee, H. J., et al. The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).
  13. Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
  14. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  15. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  16. Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מודל של שבץ איסכמימודל שבץ בחולדהשלמות כלי דם מוחייםאיסכמיה המושרית על ידי פילמנטטכניקות מיקרו-כירורגיותהעורק הקרוטידי המשותףפגיעה מחזרת דםצביעת TTCמדידת נפח השבץ
מודל חולדה של חסימה/עירוי מחדש של עורק המוח האמצעי מבלי לפגוע במבנה האנטומי של כלי המוח
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.