Method Article

כימות פעילות מערכת ההפרשה של Yersinia pseudotuberculosis Type III לאחר רעב לברזל וצמיחה אנאירובית

DOI:

10.3791/66642

⸱

May 31st, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Environmental Toxicology, University of California, Santa Cruz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חיידקים מאכלסים רקמות מארחות המשתנות בזמינות הביולוגית של חמצן וברזל, אך רוב הגישות לחקר חיידקים משתמשות במדיה מאווררת ועשירה. פרוטוקול זה מתאר תרבית של הפתוגן האנושי Yersinia pseudotuberculosis תחת ריכוזי ברזל ומתח חמצן משתנים, וכימות הפעילות של מערכת ההפרשה של Yersinia Type III, שהיא גורם אלימות חשוב.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מנגנון אלימות מרכזי עבור פתוגנים גראם-שליליים רבים הוא מערכת ההפרשה מסוג III (T3SS), נספח דמוי מחט המעביר חלבוני אפקטור ציטוטוקסיים או אימונומודולטוריים לתאים מארחים. ה-T3SS הוא יעד לקמפיינים לגילוי אנטי-מיקרוביאלי מכיוון שהוא נגיש מחוץ לתאית ונעדר במידה רבה מחיידקים לא פתוגניים. מחקרים אחרונים הראו כי T3SS של ירסיניה וסלמונלה מווסתים על ידי גורמים המגיבים לברזל וחמצן, שהם אותות חשובים ספציפיים לנישה שנתקלים בהם במהלך זיהום ביונקים. מתוארת כאן שיטה להרעבת ברזל של Yersinia pseudotuberculosis, עם תוספת אופציונלית לאחר מכן של ברזל אנאורגני. כדי להעריך את ההשפעה של זמינות החמצן, תהליך הרעבת ברזל זה מודגם בתנאים אירוביים ואנאירוביים כאחד. לבסוף, דגירה של התרביות בטמפרטורת מארח היונקים של 37 מעלות צלזיוס גורמת לביטוי T3SS ומאפשרת כימות של פעילות Yersinia T3SS על ידי הדמיה של חלבוני אפקטור המשתחררים לתוך הסופרנטנט. הצעדים המפורטים כאן מציעים יתרון על פני השימוש בכלאטורים של ברזל בהיעדר רעב ברזל, שאינו מספיק כדי לגרום לרעב חזק של ברזל, ככל הנראה בשל מערכות יעילות של קליטת ברזל וניקוי נבלות של ירסיניה . כמו כן, כלי זכוכית מעבדתיים לשטיפת חומצה מפורטים כדי להבטיח הסרת שאריות ברזל, החיוניות לגרימת רעב חזק בברזל. בנוסף, מתואר שימוש בחומר כלאט להסרת שאריות ברזל מהמדיה, ותרבית החיידקים במשך מספר דורות בהיעדר ברזל כדי לרוקן את מאגרי הברזל החיידקי. על ידי שילוב פרוטוקולים סטנדרטיים של משקעי חלבון המושרים על ידי חומצה טריכלורואצטית, SDS-PAGE וצביעת כסף, הליך זה מדגים דרכים נגישות למדידת פעילות T3SS. בעוד שהליך זה מותאם ל-Y. pseudotuberculosis, הוא מציע מסגרת למחקרים בפתוגנים עם מערכות ספיגת ברזל חזקות דומות. בעידן העמידות לאנטיביוטיקה, ניתן להרחיב את השיטות הללו כדי להעריך את היעילות של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות המכוונות ל-T3SS בתנאים רלוונטיים למארח.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פתוגנים גראם-שליליים רלוונטיים רבים מבחינה קלינית כמו Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas ו-Shigella מקודדים את מערכת ההפרשה מסוג III (T3SS) כדי להזריק חלבוני אפקטור לתאי המארח1. במיני חיידקים רבים, ה-T3SS נמצא תחת פיקוח רגולטורי קפדני2. לדוגמה, טרנסלוקציה של חלבוני אפקטור Yersinia T3SS לתאי מארח מטרה היא קריטית כדי לחתור תחת מנגנוני ההגנה של המארח ולאפשר התיישבות חיידקים של רקמות המארח. עם זאת, פעילות Yersinia T3SS מכבידה מבחינה מטבולית ויכולה לעורר זיהוי על ידי קולטנים חיסוניים מארחים3. בהתאם לכך, רגולטורים החשים רמזים סביבתיים ספציפיים שולטים בביטוי הגנים T3SS במיני חיידקים רבים. מכיוון שפתוגנים כמו Yersinia חווים שינויים סביבתיים במהלך מחזור ההדבקה שלהם המשפיעים על הביטוי של גורמי אלימות קריטיים, חשוב לפתח תנאי מעבדה המחקים מאפיינים בולטים של נישות מארח שנכבשו על ידי פתוגנים חיידקיים. באופן ספציפי, מתח החמצן וזמינות הברזל נבדלים בין אתרי רקמות שונים באופן מרחבי-זמני ומשפיעים על ביטוי גנים אלימים כגון T3SS 4,5,6. לכן, מטרת שיטה זו היא להעריך כיצד חמצן וברזל משפיעים על ביטוי Yersinia T3SS. זה יספק תובנה לגבי הדינמיקה של האינטראקציה בין המארח-פתוגן.

השיטה המתוארת כאן מפרטת כיצד לתרבית Yersinia pseudotuberculosis באופן אירובי ואנאירובי, כמו גם כיצד לרוקן את מאגרי הברזל של Yersinia במהלך צמיחה אירובית או אנאירובית. ישנם כמה שיקולים חשובים שהודגשו כאן לגבי גידול מוצלח של חיידקים בתנאים משתנים אלה. ראשית, תרבית אנאירובית דורשת תוספת גלוקוז נוספת, שינוי שמצוין במתכון התקשורת. שנית, מאחר ש-Y. pseudotuberculosis משתמש בסידרופורים ובמערכות ספיגת ברזל אחרות שיכולות לסלק ברזל מהסביבה, תשומת לב מיוחדת מוקדשת להבטיח שאמצעי התרבות וכלי הזכוכית במעבדה יהיו נקיים ככלהאפשר מברזל. מחקרים קודמים השתמשו בכלאטורים של ברזל כגון דיפירידיל כדי לדלל ברזל מתרביות חיידקים במדיה עשירה כדי לחקות רעב לברזל 8,9. עם זאת, דלדול מאגרי הברזל של Yersinia כדי לגרום לרעב ברזל דורש הסרת שאריות ברזל בכלי זכוכית ומדיה, כמו גם צמיחה ממושכת בהיעדר ברזל. פרוטוקול זה מפרט כיצד לשטוף בחומצה כלי זכוכית ואמצעי כלאט כדי להסיר שאריות ברזל, בנוסף לתרבית החיידקים במשך מספר דורות כדי להבטיח רעב יסודי של ברזל. ניתן להבטיח רעב ברזל על ידי מדידת רמות תעתיק יחסיות של גנים המגיבים לברזל המאופיינים היטב על פני תנאים, כפי שמודגם כאן עם yfeA ו-bfd.

שיאו של פרוטוקול זה מדגים כיצד לזרז חלבוני אפקטור T3SS המופרשים מכל אחד מהמצבים הללו על ידי טיפול בתרבית עם חומצה טריכלורואצטית (TCA) והדמיה של חלבונים המופרשים באמצעות SDS-PAGE. לבסוף, פעילות T3SS יחסית מוערכת על ידי הדמיה של חלבונים המופרשים באמצעות צביעת כסף וכימות רמות יחסיות של חלבוני אפקטור T3SS, המכונים חלבונים חיצוניים של Yersinia (Yops)10.

מבחני פעילות T3SS משתמשים בדרך כלל בנוגדנים ספציפיים כדי לזהות רמות חלבון אפקטור T3SS בתרבית. עם זאת, נוגדנים מערביים לחלבוני אפקטור T3SS לרוב אינם זמינים מסחרית. לכן, תשומת לב מיוחדת הוקדשה כדי להבטיח שההדמיה הסופית של פעילות T3SS בשיטה זו אינה דורשת נוגדנים ספציפיים, ובמקום זאת יכולה למנף צביעת כסף, המאפשרת הדמיה של כל החלבונים המופרשים. בעוד ששיטה זו מותאמת ומותאמת במיוחד ל-Y. pseudotuberculosis, ניתן להתאים אותה למיני חיידקים אחרים, אם כי תנאי המדיה המדויקים וזמני הדגירה ישתנו.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרטי הריאגנטים, הרכב המדיה, רצפי הפריימר והציוד מפורטים בטבלת החומרים. איור 1 ממחיש את זרימת העבודה הניסיונית הכוללת.

1. הכנת כלי זכוכית שטופים בחומצה ומדיה M9 כלאטית

הערה: לפני שמתחילים, עיין בסעיף החומר לקבלת הריאגנטים והמתכונים המדויקים שבהם ישמשו. מדיית M9 שימשה לראשונה עבור מבחני Yersinia T3SS ב-Cheng et al.11.

  1. יוצקים 100 מ"ל של 6 N HCl לבקבוק זכוכית של 250 מ"ל.
    זהירות: HCl מסוכן ביותר; ודא שננקטים אמצעי זהירות מתאימים בעת הטיפול בחומר זה.
  2. אטמו את פי מיכל הזכוכית עם פקק זכוכית וסובבו בזהירות את הבקבוק למשך דקה אחת כדי לפזר את ה-HCl ביסודיות, תוך שינוי כיוון מדי פעם.
  3. השלך את ה-6 N HCl כראוי.
  4. שטפו את מיכל הזכוכית על ידי הוספת 100 מ"ל של H2O נטול יונים, איטום הפה, ניעור במשך 20 שניות ולאחר מכן השלכת המים.
  5. חזור על שלב השטיפה בסך הכל 3 פעמים.
  6. תן לאוויר להתייבש. חיטוי לעיקור.
  7. כדי לקלוט מדיה, מערבבים רכיבי M9 יחד עם מגיב הקלאט ומערבבים עם מוט ערבוב מגנטי בטמפרטורת החדר למשך ~18 שעות. יש לסנן ולהוסיף את MgSO4 לריכוז סופי של 1 מ"מ.

2. גידול Y. pseudotuberculosis תחת רמות ברזל ומתח חמצן משתנים

  1. פס Y. pseudotuberculosis (זן IP2666pIB1 משמש במחקר זה) על צלחות אגר מרק ליזוגני (LB) ודגירה בטמפרטורת החדר.
    הערה: דגירה של Yersinia ב-37 מעלות צלזיוס, במיוחד במדיום דל סידן, מובילה לפעילות T3SS, עצירת גדילה, ובסופו של דבר בוחרת לאובדן הפלסמיד עבור Yersinia virulence (pYV) המקודד את ה-T3SS12. לכן, פרוטוקול זה משתמש בדגירה של 26 מעלות צלזיוס של Yersinia עד שצריך למדוד את פעילות T3SS.
  2. לאחר 48 שעות, ברגע שנוצרות מושבות נראות לעין, יש לחסן 4 מ"ל של חומר M9 המכיל 0.2% גלוקוז, 1 מ"ג/ליטר FeSO4.7H 2O, ובתוספת חומצות קסאמינו (המכונות כאן M9 media) ממושבה בודדת ותרבית למשך הלילה ב-26 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-250 סל"ד למשך כ-18 שעות.
    הערה: השתמש בכלי זכוכית שטופים בחומצה החל מהשלב הבא והמשך הלאה.
  3. תת-תרבות למדיה M9 כלאטית לפי השלבים הבאים.
    הערה: עבור כל השלבים הבאים, נעשה שימוש במדיית M9 עם 0.9% גלוקוז במקום ב-0.2% גלוקוז סטנדרטי.
    1. בעזרת ספקטרופוטומטר, מדוד את הצפיפות האופטית (OD600) של תרבית הלילה.
    2. יש לדלל את תרבית הלילה לערך OD600 של 0.1 בסך הכל 14 מ"ל של מדיה M9 סטרילית בצורת כלאט המכילה 0.9% גלוקוז וללא FeSO 4.7H 2O בבקבוק שטוף חומצה של 250 מ"ל ללא תוספת ברזל.
    3. דגירה למשך 8 שעות ב-26 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-250 סל"ד.
  4. תת-תרבות לתרבויות אירוביות ואנאירוביות במקביל.
    1. מדוד אתה-OD 600 של תרבויות הגידול.
    2. להמשך הדגירה האירובית, תת-תרבית את תרביות הגידול לערך OD600 של 0.1 ב-14 מ"ל של מדיה M9 סטרילית המכילה 0.9% גלוקוז וללא FeSO4.7H 2O בבקבוק שטוף חומצה של 250 מ"ל ותרבית עם אוורור ב-26 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות ללא תוספת ברזל.
    3. לתרבות אנאירובית, תת-תרבית לערך OD600 של 0.1 ב-14 מ"ל של מדיה M9 סטרילית בצורת כלאט לשני צינורות זכוכית שטופים בחומצה. לתוך הצינור הראשון, הוסף FeSO4.7H 2O מעוקר מסנן (באמצעות קרום פוליאתרסולפון 0.22 מיקרומטר) לריכוז סופי של 1 מ"ג/ליטר (המכונה "ברזל גבוה"). בשפופרת השנייה, הוסף FeSO 4.7H2O לריכוז סופי של 0.01 מ"ג/ליטר (המכונה "ברזל נמוך"). ניתן לעשות זאת על ידי שימוש בתמיסת מלאי FeSO10 מ"ג/מ"ל 4.7H2O. דגרו את שני הצינורות בצורה אנאירובית בתא אנאירובי בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.
      הערה: 1 מ"ג/ליטר FeSO4.7H 2O מספק תנאים מלאים בברזל לצמיחה חזקה של ירסיניה . לעומת זאת, הוספת 0.01 מ"ג/ליטר FeSO4.7H 2O בלבד לתרביות אנאירוביות מבטיחה צמיחה מספקת בתנאים אנאירוביים אך עדיין מאפשרת תגובות רעב לברזל, בעוד שתרביות אירוביות גדלות במשך 12 שעות בהיעדר תוספת ברזל כדי לעורר תגובות רעב לברזל לפני גירוי פעילות T3SS.
  5. לגרום לפעילות מערכת הפרשה מסוג III.
    1. העבירו את התרביות האנאירוביות ל-37 מעלות צלזיוס והמשיכו בדגירה אנאירובית למשך 4 שעות כדי לגרום ל-T3SS.
    2. מדוד את ה-OD600 של תרבות הגידול האירובי.
    3. לתוך שתי צלוחיות שטופות בחומצה, תת-תרביות הגידול האירובי לערך OD600 של 0.2 ב-14 מ"ל של מדיה M9 סטרילית בכלאט. לתוך הבקבוק הראשון, הוסף FeSO4.7H 2O מעוקר מסנן לריכוז סופי של 1 מ"ג/ליטר. לתוך הבקבוק השני, הוסף FeSO4.7H 2O לריכוז סופי של 0.01 מ"ג/ליטר. דגירה על שתי הצלוחיות עם אוורור ב-26 מעלות צלזיוס ב-250 סל"ד למשך שעתיים.
    4. לאחר שעתיים, העבירו את התרביות האירוביות ל-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-250 סל"ד ודגרו למשך 4 שעות כדי לגרום ל-T3SS.

3. משקעים של חומצה טריכלורואצטית (TCA) של חלבוני אפקטור T3SS

  1. לאחר השלמת הדגירה האנאירובית, מדוד את ה-OD600 של התרביות.
  2. נרמל את כל הדגימות האנאירוביות כדי להשיג מסת תא שווה (עיין בדוגמה המופיעה בטבלה 1). עבור תרבית אנאירובית, בדרך כלל צפו לערך OD600 של ~0.5 בתרביות רעבות לברזל ו~1 עבור תרביות מלאות ברזל. במקרה זה, השתמש ב-6 מ"ל של התרביות הרעבות לברזל ו-3 מ"ל של התרביות מלאות הברזל.
    הערה: ניתן להשתמש בתרבית הנותרת למטרות אחרות, כגון קצירת RNA כולל ושימוש ב-PCR כמותי למדידת רמות מצב יציב של mRNA מטרה (לא מתואר כאן).
  3. העבירו את הנפחים המנורמלים של כל תרבות לצינורות של 15 מ"ל.
  4. כדי לשלוט ביעילות משקעי החלבון המופרשים, הוסף 4 מיקרוליטר של 0.5 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר (BSA) לכל שפופרת.
  5. תרביות גלולה ב-3200 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. חבר מסנן PVDF של 0.22 מיקרומטר למזרק של 10 מ"ל, וסנן את הסופרנטנט של כל תרבית גלולה לצינור טרי של 15 מ"ל.
    הערה: שלב סינון זה ממזער את הסיכוי להעברת תאי חיידקים שלמים, מה שיגרום לחלבונים ציטופלזמיים לא רצויים בדגימה.
  7. הוסף 10% מנפח הסופרנטנט של 6.1 N TCA לכל דגימה.
  8. מערבולת נמרצת במשך דקה אחת. דגרו צינורות על קרח בחדר קר של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: ניתן לייעל את משך הדגירה בהתאם לצורך. דגירה של שעה אחת בלבד יכולה לעבוד בתנאים או בזנים שבהם ההפרשה חזקה.
  9. חזור על שלבי איסוף הגלולות ומשקעי TCA עם התרביות האירוביות לאחר השלמת הדגירה של 4 שעות.
    הערה: נרמל את התרבויות האירוביות על ידי גלולות נפחים עם מסת תא שוות ערך.
  10. הוסף 2 מ"ל מכל דגימה לצינור טרי של 2 מ"ל וצנטריפוגה ב-21,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  11. שאפו סופרנטנט באמצעות אביזר ואקום, והקפידו לא לגעת בתחתית או בדפנות הצינור.
    הערה: הכדור יכול להיות קשה להדמיה ועשוי להופיע כאובך לאורך הצינור.
  12. חזור על שלבים 3.10 ו-3.11 עד שכל התוכן מכל תגובת משקעים יוזרם לצינור יחיד של 2 מ"ל. זה עשוי לקחת שלושה או ארבעה שלבי צנטריפוגה עוקבים אך מאפשר ריכוז של כל החלבונים המופרשים מכל דגימה לתוך צינור של 2 מ"ל.
  13. כדי לשטוף את הכדורים, הוסף בעדינות 1 מ"ל של 100% אצטון קר כקרח לכל צינור. כדי למנוע אובדן דגימה, אל תשעה ואל תיגע בצידי הצינור.
  14. צנטריפוגה את הדגימות ב-21,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  15. שאפו את הסופרנטנט והקפידו לא לגעת בתחתית או בצדדים של הצינור.
  16. חזור על שלבי שטיפת אצטון קרים כקרח 3.13 ו -3.14.
  17. לאחר שאיבת הסופרנטנט בפעם האחרונה, פתח את הצינורות ואפשר לגלולה להתייבש לחלוטין על הספסל למשך כשעה.
  18. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת FSB: DTT לכל דגימה מיובשת. כדי למנוע אובדן חלבון, אין להשעות מחדש.
  19. מערבל היטב כל דגימה למשך דקה אחת, וודא שתמיסת FSB: DTT מצפה את דפנות הצינור כולו. ניתן לייעל זאת על ידי שימוש בחיבור מערבולת המסוגל להחזיק מספר צינורות בו זמנית.
  20. מרתיחים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  21. צנטריפוגה את הדגימות לזמן קצר למשך 30 שניות במהירות המרבית בטמפרטורת החדר.
  22. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש עתידי.

4. SDS-PAGE וצביעה מכסף כדי להמחיש חלבוני אפקטור T3SS

  1. טען 15 מיקרוליטר מכל דגימה אנאירובית ו-10 מיקרוליטר מכל דגימה אירובית לתוך ג'ל SDS-PAGE של 12.5%, יחד עם 3 מיקרוליטר של תקן לא מוכתם זמין מסחרית כסולם.
  2. הפעל את הג'ל כ- 90 דקות ב 100 וולט. הגדרות אלה עשויות להשתנות בהתאם למכשיר בו נעשה שימוש.
  3. עקוב אחר פרוטוקול צביעת הכסף בהתאם להוראות היצרן, וכתוצאה מכך ג'ל, כפי שמוצג באיור 2.

5. כימות פעילות T3SS יחסית

  1. מקם את הג'ל במערכת ההדמיה, וודא שכל הרצועות המיועדות לכימות נמצאות במסגרת התמונה.
    הערה: המשקל המולקולרי של BSA הוא ~66 kDa, בעוד שהמשקל המולקולרי של חלבון האפקטור T3SS YopE הוא ~23 kDa.
  2. בתוכנה, בחר את כל רצועות ה-YopE בכל הבארות.
  3. הגדר את רצועת ה-YopE ההתייחסות לדגימה המתאימה.
  4. ייצא את ערכי הכימות היחסיים המחושבים על ידי התוכנה עבור כל רצועות ה-YopE.
  5. אם נחזור לתוכנה, בחר את כל רצועות ה-BSA בכל הבארות.
  6. הגדר את רצועת ה-BSA של ההתייחסות כדי לוודא שהיא מאותה דגימה כמו רצועת ה-YopE ההתייחסות.
  7. ייצא את ערכי הכימות היחסיים המחושבים על-ידי התוכנה עבור כל רצועות ה- BSA.
  8. כדי לחשב רמות ביטוי YopE יחסיות, חלקו את ערך הכמות היחסית של YopE בערך הכמות היחסית של BSA עבור כל דגימה.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו מאפשרת השוואה יחסית של יופים מופרשים על פני תנאים שונים ביחס למצב ייחוס מעניין. זרימת העבודה הניסיונית הכוללת מתוארת באיור 1. טבלה 1 מתארת ייצוג של האופן שבו נורמליזציה של תרבית תאים תתרחש בדרך כלל במקרה של כל מצב תרבית ונפח ה-TCA שיתווסף לכל סופרנטנט. כאן, תוצאות מייצגות מוצגות באמצעות Wildtype (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1 וכן שני מוטציות קונגניות, ΔyscNU ו-ΔyopE. המוטציה ΔyopE משמשת כבקרה חסרת YopE, בעוד שהמוטנט ΔyscNU משמש כבקרה שלילית מלאה של T3SS מכיוון שהוא אינו מסוגל להרכיב T3SSפונקציונלי 13,14. תמונה מייצגת של ג'ל 12.5% SDS-PAGE מוכתם בכסף המכיל את החלבונים המופרשים מתוארת באיור 2. כפי שתואר לעיל, כל דגימה הכילה BSA מובהק כבקרה על יעילות משקעי החלבון. בניתוח הנתונים, יש להתייחס למערכי נתונים אנאירוביים ואירוביים כמערכי נתונים עצמאיים מכיוון שכל אחד מהם נורמל בנפרד. בדגימות האנאירוביות, ~פי 38 יותר YopE היה נוכח בדגימות הברזל הנמוכות ביחס לדגימות הברזל הגבוהות, בהתאם לתוצאות קודמות15,16. בדגימות האירוביות נצפתה כמות דומה של YopE מופרש בדגימות ברזל נמוכות וגבוהות, בהתאם לתוצאות קודמות16. בדרך כלל, לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים של כל מצב משמשים לקביעת מובהקות סטטיסטית.

כדי לאשר שפרוטוקול זה מביא לרעב הולם של ברזל, נערך ניתוח qPCR על גנים המגיבים לברזל yfeA ו-bfd בזן הבר בכל התנאים. YfeA הוא חלבון הקישור הפריפלזמי של מערכת הובלת ABC האחראית על הובלת ברזל, בעוד ש-Bfd הוא פרדוקסין הקשור לבקטריופריטין המעורב בגיוס מאגרי ברזל 17,18,19,20. RNA בודד כפי שתואר קודם לכן21, וכצפוי, yfeA ו-bfd היו מווסתים באופן משמעותי בתנאים מדוללי ברזל ביחס לתנאים מלאי ברזל, הן אירובית והן אנאירובית, כפי שמוצג באיור 3. בנוסף, כימתנו את רמות ה-mRNA של yopE במצב יציב באמצעות qPCR כדי לאשר שהתוצאות שנצפו עבור YopE יחסי ברמת החלבון היו עקביות עם רמות התעתיק של yopE (ראה איור 3).

לבסוף, מכיוון שחיידקים נוטים לליזינג בתנאי תרבות מלחיצים, היה חשוב להראות שהשלבים בפרוטוקול זה אינם גורמים לליזה חיידקית שעלולה לבלבל את התוצאות. כדי לאשר זאת, דגימות סופרנטנט שהושקעו על ידי TCA היו נתונות לכתמים מערביים ונבדקו עבור YopE ו-RpoA, תת-יחידה של RNA פולימראז וחלבון ציטופלזמי. כפי שמוצג באיור 4, בעוד שדפוס הביטוי של YopE עקב אחר זה שמוצג באיור 3, לא הייתה עדות לנוכחות RpoA בסופרנטנטים דגימיים, מה שמצביע על כך שלא הייתה ליזה נצפית שתשחרר RpoA ציטופלזמי לתוך הסופרנטנט.

figure-results-1
איור 1: זרימת עבודה ניסיונית לגידול Yersinia pseudotuberculosis תחת זמינות משתנה של ברזל וחמצן. ייצוג גרפי של שלבי הטיפוח. שימו לב שיש להשתמש בכלי זכוכית שטופים בחומצה החל מהיום הרביעי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תוצאות של ג'ל 12.5% SDS-PAGE מוכתם בכסף של חלבון משקע TCA מתרבית-על. סופרנטנטים תרבית משקעים הועמסו על ג'ל SDS-PAGE 12.5% ומוכתמים בכסף. (A) פרופיל הפרשה של זני WT, ΔyscNU ו-ΔyopE שגדלו בצורה אנאירובית. ערכים יחסיים מייצגים של YopE מנורמלים לדגימת WT אנאירובית גדושה בברזל. (B) פרופיל הפרשה של זני WT, ΔyscNU ו-ΔyopE שגדלו באופן אירובי. ערכים יחסיים מייצגים של YopE מנורמלים לדגימת הברזל האירובית WT. חיצים לבנים מציינים YopE (~23 kDa). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: רמות mRNA יחסיות של גנים המגיבים לברזל מדגימות רעב לברזל. RNA בודד מ-WT Y. pseudotuberculosis שתורבת בתנאים המתוארים באיור 1. qPCR שימש למדידת הביטוי היחסי של רמות yfeA, bfd ו-yopE מנורמלות ל-16S rRNA בתנאים אנאירוביים (A-C) ואירוביים (D-F). ****p < 0.0001 כפי שנקבע על ידי מבחן t לא מזווג. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: היעדר RpoA ציטופלזמי בדגימות סופרנטנט מדגים את היעדר ליזה של תאים בתנאי תרבית. 5 מיקרוליטר של סופרנטנטים משקעים של דגימות אנאירוביות (A) ו-(B) אירוביות מאיור 3 הופעלו על ג'ל SDS-PAGE של 12.5% יחד עם בקרת גלולה. חלבונים הועברו לקרום PVDF לצורך כתמים מערביים. הממברנה נחתכה, והחצי העליון נבדק ל-RpoA באמצעות נוגדן נגד RpoA, והחצי התחתון נבדק ל-YopE באמצעות נוגדן נגד YopE. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

(א)
אנאירובית
תנאיODנפח לאיסוף (מ"ל)נפח של 6.1 N TCA נוסף לסאפ (מ"ל)
WT ברזל נמוך0.560.6
WT ברזל גבוה130.3
(ב)
אירובי
תנאיODנפח לאיסוף (מ"ל)נפח של 6.1N TCA נוסף לסאפ (מ"ל)
WT ברזל נמוך0.960.6
WT ברזל גבוה1.43.8570.386

טבלה 1: זרימת עבודה מייצגת של איסוף מדגמים. ביום החמישי, (A) לאחר השלמת הדגירה של 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עבור הדגימות האנאירוביות, נאספו 6 מ"ל מהדגימה עם ערך ה-OD600 הנמוך ביותר ושאר נפחי הדגימה נורמלו בהתאם. לאחר סינון הסופרנטנט, נוסף 6.1 N TCA. (B) לאחר השלמת הדגירה האירובית (שעתיים ב-26 מעלות צלזיוס ו-4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס), נאספו 6 מ"ל מהדגימה עם ערך ה-OD600 הנמוך ביותר, ושאר נפחי הדגימה נורמלו בהתאם. לאחר סינון הסופרנטנט, נוסף 6.1 N TCA.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ה-T3SS הוא גורם אלימות חשוב בחיידקים פתוגניים רבים; לכן, פיתוח טכניקות מעבדה לחקר הוויסות שלו חשוב להבנת פתוגנזה ולפיתוח טיפולים פוטנציאליים1. ברזל וחמצן ידועים כרמזים מארחים חשובים המורגשים על ידי פתוגנים חיידקיים לוויסות ביטוי T3SS5; לכן, שיטה זו מציגה אסטרטגיה לתרבית Y. pseudotuberculosis בתנאים אנאירוביים או אירוביים, עם רעב או מילוי ברזל, ומדגימה כיצד לכמת את הפעילות היחסית של T3SS בתנאים שונים אלה על ידי הערכת כמויות יחסיות של רמות חלבון אפקטור YopE T3SS המופרש.

בעוד שזרימת העבודה של ניסוי זה היא פשוטה יחסית, ישנן כמה נקודות שיש לקחת בחשבון מקרוב כדי לייעל את התוצאות. במהלך שלב משקעי החלבון בתיווך TCA, חשוב להימנע משאיבת גלולת החלבון, שיכולה להיות קשה לראות. נקיטת אמצעי זהירות נוספים כדי לא לאפשר לקצה השואב לגעת בקירות או בתחתית הצינור היא קריטית. בנוסף, כאשר מתמודדים עם זנים מוטנטיים עם רמה נמוכה יותר של פעילות T3SS, רצוי לאסוף דגימה גדולה יותר לעיבוד. לבסוף, אם הנתיבים נראים מרוחים לאחר עיבוד דגימה וצביעה בג'ל במקום לייצר רצועות מובהקות, זה יכול לנבוע מליזיס תאים במהלך התרבות או מהעברה של חיידקים שלמים מהגלולה לחלק העל. במקרה זה, יש לחזור על הניסוי, ולהקפיד יותר להימנע מלקיחת הגלולה בעת הסרת הסופרנטנט. חשוב לציין כי פרוטוקול זה עשוי שלא להיות רגיש מספיק כדי לזהות חלבונים המופרשים בכמויות נמוכות מאוד, ובמקרה זה ייתכן שיהיה צורך להשתמש בשיטות זיהוי אחרות. בנוסף, מכיוון שחומרי כלאט רבים יסירו קטיונים דו-ערכיים שאינם ברזל ומגנזיום מהתקשורת, ניתן להוסיף קטיונים דו-ערכיים אחרים בחזרה למדיה לאחר הקלציה כדי לקבוע את השפעתם על ההפרשה.

נקודה חשובה נוספת שיש לקחת בחשבון בניסויים אלה היא הנטייה של מלחים במדיה M9 לשקע, וכתוצאה מכך שונות בין קבוצות ניסוי. כדי להקל על בעיה זו, ניתן להוסיף MgSO4 מעוקר מסנן למדיה מיד לפני התרבית.

בסך הכל, שיטות אלו מספקות מסגרת חזקה לכימות פעילות יחסית של Yersinia T3SS על ידי מדידת רמות חלבון. יחד עם גישות מקבילות שמטרתן להעריך ביטוי T3SS, השיטות המוצגות כאן מאפשרות הבנה מקיפה של דינמיקת T3SS בתגובה לרמזים סביבתיים רלוונטיים למארח. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם גם לחיידקים אחרים שניתן לגדל במצע מוגדר שבו ניתן להשמיט מקור ברזל וליישומים שבהם מדידת חלבונים מופרשים רלוונטית לשאלה המדעית.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמונות גרפיות שנוצרו באמצעות BioRender.com. מחקר זה נתמך על ידי R01AI119082 המענקים של המכונים הלאומיים לבריאות (www.NIH.gov).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מזרק קצה Luer-Lok 10 מ"לBD301029
מאגר ריצה 10x SDS תוצרת0.25 M בסיס Tris, 1.92 M גליצין, 1% SDS בנפח 1 ליטר
12.5% SDS-Page ג'לתוצרת
15 מ"ל צינורות תרביתFalcon352059ללילה ראשוני 
15 מ"ל שפופרות פלקוןFalcom352196לאיסוף סופרנטנטים
250 מ"ל בקבוק תרביתBelco251000250
500 מ"ל מערכת סינוןקורנינג431097
6 N תמיסת חומצה הידרוכלוריתפישר סיינטיפיק7732185
אצטוןפישר כימיA949-44 L
ביו ראד ChemiDoc MP הדמיה מספרדגם: מכסה מנוע אוניברסלי III
בורוסיליקט צינורות תרבית זכוכיתפישרברנד14-961-34לתרבות אנאירובית
Chelex 100 שרףביו ראד142-1253
Chelex M9 +0.9% גלוקוז מדיהתוצרת בית6 גרם/ליטר Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 גרם/ליטר NH4Cl, 1% חומצות קסאמינו, <חזק>0.9% דקסטרוז, 0.0005% תיאמין, 5 גרם/ליטר שרף Chelex 100. מערבבים מדיה במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר, מסננים באמצעות יחידת סינון קורנינג של 500 מ"ל, ואז מוסיפים MgSO4 עבור 1 מ"מ MgSO4 final
Buffer Final Sample Buffer (FSB)תוצרת0.1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% גליצרול, 0.2% של ברומופנול
כחול FSB: פתרון DTTתוצרתFSB+0.2M DTT
Image Lab SoftwareBio Radhttps://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8ZSoftware
Isotemp Heat BlockFisher Scientific88860021
LB Agar Platesתוצרת10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם NaCl, 15 גרם אגר בנפח כולל של 1 ליטר. חיטוי
M9 + 0.2% גלוקוז מדיהתוצרת6 גרם/ליטר Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 מ"מ MgSO<תת>4, 1 מ"ג/ליטר FeSO47H2O, 1% חומצות קסאמינו, <חזקות>0.2% דקסטרוז, 0.0005% תיאמין 
Millex-GP PES 0.22um מסנן מצורף למזרקMilliporeSLGPR33RSעבור FeSO47H2O
סינון Millex-GV PVDF 0.22um מסנן מצורף למזרקMilliporeSLGVR33RSלסינון supernatant
דיוק פלוס חלבון לא מוכתם סטנדרטיBio Rad1610363
SDS-PAGE ג'ל מכשירביו ראדדגם: מיני PROTEAN Tetra תא
ערכת צביעת כסף SilverXpress InvitrogenLC6100
The BellyDancer ShakerIBI ScientificBDRAA1155
תמיסת חומצה טריכלורואצטית 6.1NSigma AldrichT0699
ויניל תא אנאירוביCoy Lab מוצריםhttps://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details
qPCR רצפי פריימר 
yfeA קדימה - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T
yfeA הפוך - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A
bfd קדימה - ccagcatcagccccatacag
bfd הפוך - tggcttgtcggatgcacttc
yopE קדימה - CCATAAACCGGTGGTGAC
yopE הפוך - CTTGGCATTGAGTGATACTG
בית בית בית בית בית בית מספר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems. Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Springer International Publishing. Bacterial Type III Protein Secretion Systems. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).
  3. Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance. Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).
  4. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  5. Singhal, R., Shah, Y. M. Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine. J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).
  6. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  7. Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia. Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).
  8. Lesic, B., Carniel, E. Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis. J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).
  9. Green, E. R., et al. Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection. PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).
  10. Cornelis, G. R. The Yersinia Ysc-Yop "Type III" weaponry. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).
  11. Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).
  12. Straley, S. C. The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae. Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).
  13. Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system. PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).
  14. Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation. Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).
  15. Hooker-Romero, D., et al. Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection. PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).
  16. Balderas, D., et al. Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia. mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).
  17. Bearden, S. W., Perry, R. D. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague. Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).
  18. Zhou, D., et al. Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis. FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).
  19. Wijerathne, H., et al. a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site. Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).
  20. Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11. J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).
  21. Miller, H. K., et al. IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence. PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type III SecretionYersinia PseudotuberculosisIron StarvationAnaerobic GrowthEffector Protein SecretionSDS PAGE AnalysisSilver StainingOxygen AvailabilityProtein PrecipitationBacterial Virulence

Related Articles