מאמר שיטה

שיטות חלופיות לאיתור ייצור אניון סופראוקסיד בטסיות הדם

DOI:

10.3791/66647

⸱

29 במרץ 2024

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדור של אניון סופראוקסיד חיוני לגירוי טסיות הדם, ואם אינו מוסדר, קריטי למחלות טרומבוטיות. כאן, אנו מציגים שלושה פרוטוקולים לזיהוי סלקטיבי של אניונים סופראוקסידים ולחקר ויסות טסיות תלוי חיזור.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיני חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות מאוד לא יציבות המכילות חמצן. חוסר היציבות הכימית שלהם הופך אותם לתגובתיים ביותר ומעניק להם את היכולת להגיב עם מולקולות ביולוגיות חשובות כגון חלבונים, חומצות גרעין ושומנים. אניונים סופראוקסידים הם ROS חשובים הנוצרים על ידי הפחתת הפחתת חמצן מולקולרית (כלומר, רכישה של אלקטרון אחד). למרות ההשלכה הראשונית שלהם אך ורק על תהליכי הזדקנות, ניוון ופתוגנים, לאחרונה ניכרה השתתפותם בתגובות פיזיולוגיות חשובות. במערכת כלי הדם, אניונים סופראוקסידים הוכחו כמווסתים את ההתמיינות והתפקוד של תאי שריר חלק וסקולריים, את ההתרבות והנדידה של תאי אנדותל וסקולריים באנגיוגנזה, את התגובה החיסונית ואת ההפעלה של טסיות הדם בהמוסטאזיס. תפקידם של אניונים סופראוקסידים חשוב במיוחד בחוסר ויסות של טסיות הדם ובסיבוכים קרדיווסקולריים הקשורים לשפע של מצבים, כולל סרטן, זיהום, דלקת, סוכרת והשמנת יתר. לכן, זה הפך להיות רלוונטי ביותר במחקר הלב וכלי הדם כדי להיות מסוגל למדוד ביעילות את הדור של אניונים superoxide על ידי טסיות אדם, להבין את המנגנונים תלויי חמצון-חיזור המווסתים את האיזון בין hemostasis ופקקת, ובסופו של דבר, לזהות כלים פרמקולוגיים חדשים עבור אפנון של תגובות טסיות המוביל פקקת וסיבוכים קרדיווסקולריים. מחקר זה מציג שלושה פרוטוקולים ניסיוניים שאומצו בהצלחה לזיהוי אניונים סופראוקסידים בטסיות הדם ולחקר המנגנונים תלויי החיזור המווסתים המוסטזיס ופקקת: 1) זיהוי אניון סופראוקסיד מבוסס דיהידרואתידיום (DHE) באמצעות ציטומטריית זרימה; 2) הדמיה וניתוח של אניון סופראוקסיד מבוסס DHE על ידי הדמיה של טסיות יחידות; ו-3) כימות מבוסס ספין פרוב של תפוקת אניון סופראוקסיד בטסיות דם על ידי תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אניון סופראוקסיד (O2•-) הוא ה-ROS הרלוונטי ביותר מבחינה תפקודית שנוצר בטסיות1. O2•- הוא תוצר של הפחתת חמצן מולקולרי ומבשר של ROS 2 רבים ושונים. הדימוטציה של O2•- מובילה ליצירת מי חמצן (H2O2) באמצעות תגובות ספונטניות בתמיסה מימית או תגובות המזורזות על ידי דיסמוטאזות סופראוקסיד (SODs 3). למרות שהוצעו מקורות אנזימטיים שונים (למשל, קסנטין אוקסידאז4, ליפאוקסיגנאז5, ציקלואוקסיגנאז6 וחנקן חמצני סינתאז7), נשימה מיטוכונדריאלית 8,9 וניקוטין-אמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט-אוקסידאז (NOXs)10 הם המקורות הבולטים ביותר של סופראוקסיד אניון בתאים איקריוטים. נראה שזה המקרה גם בטסיות דם, שם דליפת אלקטרונים מנשימה מיטוכונדריאלית 11,12 והפעילות האנזימטית שלNOXs 13,14 תוארו כתורמים העיקריים לתפוקת האניון סופראוקסיד.

למרות שמספר מחקרים התמקדו בוויסות טסיות הדם על ידי O2•-, אין הסכמה לגבי המנגנונים המולקולריים האחראים. אפנון פעילות קולטני פני השטח באמצעות חמצון ישיר ויצירת קשר דיסולפיד הוצע עבור קולטני טסיות שונים. הוויסות החיובי של אינטגרין αIIbβ3 על ידי ROS באמצעות חמצון ישיר של שאריות ציסטאין הוצע 15,16,17. באופן דומה, מאחר שתגובות טסיות הדם לקולגן תלויות בדימריזציה תלוית דיסולפיד וכתוצאה מכך בדימריזציה של הגליקופרוטאין VI (GPVI)18, הוצעה הגברת פעילות הקולטן על ידי חמצון תלוי ROS19, אם כי לא הוכחה באופן מלא בניסוי. לבסוף, חמצון המושרה על ידי ROS של קבוצות סולפידריל של גליקופרוטאין Ib (GPIb) הוכח כמקדם הידבקות טסיות ואינטראקציה טסיות-לויקוציטים במהלך דלקת20. לעומת זאת, כתוצאה אפשרית של ירידה בחמצון קבוצת סולפידריל והפעלת קולטן, השלת האקטודומיין של GPVI ו- GPIb מצטמצמת על ידי הפחתת תנאים21.

כמו כן הוצעו דרכי פעולה שאינן תלויות בחמצון ישיר של קולטני טסיות הדם. ROS, כולל O2•-, הוכחו כמווסתים באופן חיובי את קולטן הקולגן GPVI על ידי החלשת הפעילות של החלבון טירוזין פוספטאז 2 (SHP-2) המכיל הומולוגיה Src, אשר מווסת באופן שלילי את מפל האיתות של קולטן זה22. יתר על כן, O2•- יכול לייצר ONOO- (peroxynitrite) על ידי תגובה מהירה עם תחמוצת החנקן (NO), אשר בדרך כלל מעכב טסיות דרך ציקלאז גואניל לא רגיש (NO-GC) ואת הדור של וסת טסיות שלילי GMP מחזורי (cGMP) 23,24. הירידה ברמות NO כתוצאה מכך יכולה להוביל להגברת טסיות הדם. לחלופין, הדור של O2•- על ידי NOX2 הוצע לתרום חמצון שומנים והיווצרות isoprostane, אשר חיוני עבור הפעלת טסיות והדבקה25. לבסוף, חלבון קינאז חוץ-תאי המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) קינאז מווסת אות חוץ-תאי 5 (ERK5), חלבון קינאז המוצע כחיישן עקת חמצון-חיזור בטסיות26, מופעל על ידי O2•- ומשרה פנוטיפ מעודד קרישה בטסיות הדם (כפי שמוערך על ידי מדידה מבוססת ציטומטריה של זרימה של החצנת פוספטידיל-סרין)27.

חוסר הוויסות של O2•- ודור ROS אחר בטסיות הדם נקשר לתגובה המוסטטית מוגזמת המובילה לסיבוכים קרדיווסקולריים טרומבוטיים הקשורים לטרשת עורקים, סוכרת, יתר לחץ דם, השמנת יתר וסרטן28,29. בהגדרות פתולוגיות אלה, תפוקת ה- ROS על ידי טסיות הדם מוגברת, מה שמוביל להגברה של תגובות הדבק והצבירה שלהם. בנוסף להשפעה על תגובות טסיות הדם, לתפוקת הרדיקלים החופשיים של טסיות הדם עשויות להיות השלכות על תאי דם אחרים ומבנים וסקולריים, שהוא תחום שאינו מובן היטב ולא נחקר מספיק של בריאות הלב וכלי הדם30. למרות ההבנה המוגבלת שלנו של המנגנונים המולקולריים המקשרים בין עקה חמצונית לתנאים טרומבוטיים, הרלוונטיות הקלינית של נוגדי חמצון להגנה מפני מחלות לב וכלי דם זכתה לתשומת לב רבה. רמות נוגדות חמצון בפלזמה הוכחו בקורלציה הפוכה עם הסיכון לפתח מחלות לב וכלי דם, וצריכת נוגדי חמצון תזונתיים הוכחה כמגנה מפני מחלת עורקים כליליים31,32. כתוצאה מכך, השימוש בנוגדי חמצון תזונתיים נתמך כגישה מבטיחה למניעת מחלות לב וכלי דם 33,34,35. בין ההשפעות של יצירת ROS בטסיות הדם, לעלייה באפופטוזיס יכולות להיות השפעות פתופיזיולוגיות חשובות36,37. בסך הכל, פרוטוקולים אמינים לזיהוי וכימות פלט O2•- על ידי טסיות רלוונטיים יותר ויותר במחקר הלב וכלי הדם.

כיום, לטכניקות הזמינות לזיהוי ROS יש מגבלות חשובות של ספציפיות (כלומר, האופי הכימי של מולקולות החמצון שזוהו אינו ידוע) ואמינות (כלומר, האינטראקציה הבלתי רצויה עם מולקולות ביולוגיות וריאגנטים ניסיוניים מובילה לתוצאות לא פיזיולוגיות מוטות)38,39. הגישה הנפוצה ביותר לזיהוי ROS בטסיות מבוססת על שימוש בדיכלורודיהידרופלואורסצאין דיאצטט (DCFDA), המומר לדיכלורודיהידרופלואורסצאין (DCFH) על ידי אסטראזות תוך-תאיות וכתוצאה מכך לדיכלורופלואורסצאין פלואורסצאין (DCF) על ידי מחמצנים תאיים, כולל רדיקלים הידרוקסילים ומתווכים פרוקסידאז-H2O2 40,41. למרות השימוש הרחב בה, הועלו שאלות רציניות לגבי אמינותה של גישה זו למדידת ROS38 תוך תאי. החמצון של DCFH ל-DCF יכול להיגרם, למעשה, על ידי יוני מתכת מעבר (למשל, Fe2+) או אנזימים המכילים הם (למשל, ציטוכרומים) במקום ROS42. יתר על כן, DCFDA מומר על ידי peroxidases התא לצורת רדיקלים חופשיים semiquinone שלה (DCF•-), אשר בתורו מחומצן DCF על ידי תגובה עם חמצן מולקולרי (O2) עם שחרור של O2•-, מה שמוביל להגברה מלאכותית של תגובות חמצון 41,43,44 . לכן, זיהוי ROS תוך-תאי על ידי DCFDA שימושי להשגת תובנות ראשוניות אך דורש שיקול זהיר ובקרות ניסוי נרחבות38,39.

מחקר זה מציג שלוש טכניקות חלופיות לזיהוי ומדידה של הרגולטור העיקרי של תפקוד טסיות הדם O2•-1. הטכניקה הראשונה היא זיהוי באמצעות DHE וציטומטריית זרימה, המציעה יתרונות של אמינות וספציפיות על פני DCFDA. הטכניקה השנייה המוצעת כאן משתמשת גם היא ב- DHE, אך שיטת הזיהוי היא הדמיה פלואורסצנטית של טסיות חיה, המאפשרת לחקור את הדור של O2•- על איתות טסיות עם קינטיקה מהירה ורזולוציה של תא בודד. לבסוף, פרוטוקול המבוסס על השימוש בגשושית ספין הידרוקסילאמין 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH) בניסויי תהודה EPR מציע את האפשרות לכמת את קצב יצירת O2•- על ידי טסיות והשוואתו בתנאים שונים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איסוף דם היקפי ממתנדבים בהסכמה מאושר על ידי ועדת האתיקה המקומית והרשות הלאומית לחקר הבריאות (סימוכין לשירותי בריאות: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. שיטה 1: זיהוי אניון סופראוקסיד באמצעות DHE על ידי ציטומטריית זרימה

  1. תמיסת נתרן ציטראט טרום חמה (37°C) (4% w/v) ולהשתמש בה כנוגד קרישה על ידי הוספתה ישירות לדם בזמן הניקור ביחס של 1:7 (0.5% w/v סופי).
  2. לשאוב דם אנושי היקפי ממתנדבים בריאים על ידי ניקוב ורידים קוביטליים מדיאניים.
  3. קבל פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) מדם שלם על ידי צעד צנטריפוגה ראשוני ב 200 x גרם במשך 20 דקות.
  4. צנטריפוגה PRP ב 500 x גרם במשך 10 דקות עם מעכבי טסיות הפיך indomethacin (10 μM) ו PGE1 (40 ng / mL).
  5. השהה מחדש את גלולת הטסיות המתקבלת במאגר של Tyrode שונה (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid (HEPES), 1 mM MgCl2, 5 mM גלוקוז, pH 7.3) (37 ° C) בצפיפות של 2 x 108 טסיות / מ"ל.
  6. לאחר הבידוד, יש לנוח טסיות במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
  7. הכן DHE בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בריכוז מלאי של 5 mM.
  8. הוסף DHE לתרחיף טסיות הדם בריכוז סופי של 5 מיקרומטר (דלל את תמיסת הציר 1 עד 1,000, עם ריכוז DMSO סופי 0.1% v/v) ודגר במשך 15 דקות ב 37 ° C.
  9. טפלו בטסיות הדם עם חומרים פרמקולוגיים ו/או אוכלי נבלות ROS במשך 15 דקות לפני הגירוי עם הגירויים והריכוזים הפיזיולוגיים הרצויים (למשל, 0.1 יחידה/מ"ל טרומבין או 3 מק"ג/מ"ל קולגן).
  10. לאחר הגירוי, יש לדלל את מתלי טסיות הדם 1 עד 10 במאגר HEPES מותאם קר כקרח.
  11. עבור ציטומטריית הזרימה, קבע רווח של פיזור צידי (SSC) ופיזור קדימה (FSC) ב- 40 mV ו- 220 mV, בהתאמה, והשתמש בתרשימי פיזור בקנה מידה לוגריתמי כדי להמחיש את אוכלוסיית החלקיקים בתרחיף (לדוגמה באיור 1A).
  12. (אופציונלי) Immunostain aliquot אחד של תרחיף טסיות באמצעות נוגדן anti-CD41 כדי לזהות את אוכלוסיית האירועים המתאימים טסיות (לדוגמה באיור 1B).
  13. נתח דגימות לפי ציטומטריית זרימה באמצעות עירור ב-405 ננומטר (לייזר סגול) ופליטה באורך גל של 580 ננומטר, אשר מזהה באופן סלקטיבי את המוצר הספציפי לאניון סופראוקסיד 2-הידרוקסי-אתידיום (2OH-Et+) (איור 2).
    הערה: קיבוע עם paraformaldehyde ואחסון דגימה לטווח ארוך אינם מומלצים.

2. שיטה 2: זיהוי אניון סופראוקסיד באמצעות DHE על ידי הדמיה פלואורסצנטית של טסיות יחיד

  1. צפו מגלשה μ של 8 בארות ביום הניסוי עם 0.1 מ"ג/מ"ל קולגן פיברילרי I מגידי סוסים (קולגן הורם), פיברינוגן 0.2 מ"ג/מ"ל או 1 מ"ג/מ"ל פולי-ל-ליזין (PLL) בחיץ שונה של טירוד למשך שעתיים ב-37°C.
  2. שטפו פעמיים עם חיץ שונה של Tyrode (10 דקות כל אחד).
  3. יש להרוות הדבקה לא ספציפית על ידי דגירה במאגר של Tyrode שעבר שינוי בתוספת אלבומין בסרום בקר (BSA) של 5 מ"ג/מ"ל למשך 30 דקות לפחות (או עד הניסוי).
  4. תמיסת נתרן ציטראט טרום חמה (37°C) (4% w/v) ולהשתמש בה כנוגד קרישה על ידי הוספתה ישירות לדם בזמן הניקור ביחס של 1:7 (0.5% w/v סופי).
  5. לשאוב דם אנושי היקפי ממתנדבים בריאים על ידי ניקוב ורידים קוביטליים מדיאניים.
  6. קבל פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) מדם שלם על ידי צעד צנטריפוגה ראשוני ב 200 x גרם במשך 20 דקות.
  7. צנטריפוגה PRP ב 500 x גרם במשך 10 דקות עם מעכבי טסיות הפיך indomethacin (10 μM) ו PGE1 (40 ng / mL).
  8. השהה מחדש את גלולת הטסיות המתקבלת במאגר של Tyrode שונה (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM גלוקוז, pH 7.3) (37 ° C) בצפיפות של 4 x 107 טסיות / מ"ל.
  9. לאחר הבידוד, יש לנוח טסיות במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
  10. הכן DHE בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בריכוז מלאי של 10 mM.
  11. הוסף DHE בריכוז סופי של 10 מיקרומטר לתרחיף הטסיות (דלל את תמיסת הציר 1 עד 1,000, עם ריכוז DMSO סופי 0.1% v/v) ודגרה למשך דקה אחת (37 מעלות צלזיוס).
  12. לאחר דקה אחת של דגירה עם DHE, להסיר את הפתרון חוסם מן הבארות שנבחרו, למקם את μ שקופיות על שלב המיקרוסקופ מוכן להדמיה, בעדינות לפזר טסיות.
  13. נטר את המרת DHE ל- 2OH-Et+ על ידי הדמיה קונפוקלית הפוכה למשך 10 דקות (405/580 ננומטר ex/em), עם תמונות שנאספו כל 10 שניות עם עדשת טבילת שמן 40x.
  14. (אופציונלי) עבור בארות מצופות PLL, עקוב אחר ייצור אניון סופראוקסיד בתגובה לאגוניסט מסיס (למשל, תרומבין 0.1 יחידה/מ"ל או 3 מיקרוגרם/מ"ל קולגן) על ידי הוספת האגוניסט 10 דקות לאחר ניפוק טסיות הדם ואיסוף תמונות פלואורסצנטיות למשך 10 דקות נוספות, כמתואר בשלב 2.13.
  15. (אופציונלי) במידת הצורך, הוסיפו נבלות אניון סופראוקסיד או מעכבים סלקטיביים (למשל, מעכבי NOX) על ידי ניפוק עדין לצד הבאר במהלך מהלך הזמן ואספו תמונות פלואורסצנטיות כמתואר ב-2.13 למשך 10 דקות נוספות.
  16. כמת ניתוח פלואורסצנטי של תא בודד על-ידי בחירת אזור העניין (ROI) המכיל טסיות בודדות מייצגות וניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות במסגרות שונות באמצעות כלי המדידה של חבילת ההדמיה ImageJ 1.53t.

3. שיטה 3: זיהוי אניון סופראוקסיד על ידי טסיות באמצעות תהודה פאראמגנטית אלקטרונית (EPR)

  1. תמיסת נתרן ציטראט טרום חמה (37°C) (4% w/v) ולהשתמש בה כנוגד קרישה על ידי הוספתה ישירות לדם בזמן הניקור ביחס של 1:7 (0.5% w/v סופי).
  2. לשאוב דם אנושי היקפי ממתנדבים בריאים על ידי ניקוב ורידים קוביטליים מדיאניים.
  3. קבל פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) מדם שלם על ידי צעד צנטריפוגה ראשוני ב 200 x גרם במשך 20 דקות.
  4. צנטריפוגה PRP ב 500 x גרם במשך 10 דקות עם מעכבי טסיות הפיך indomethacin (10 μM) ו PGE1 (40 ng / mL).
  5. השהה מחדש את גלולת הטסיות המתקבלת במאגר של Tyrode שונה (145 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM גלוקוז, pH 7.3) (37 ° C) בצפיפות של 2 x 108 טסיות / מ"ל.
  6. לאחר הבידוד, יש לנוח טסיות במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
  7. הוסף 5 μM diethyldithiocarbamate (DETC) ו 25 μM deferoxamine לתרחיף טסיות.
  8. ללא דגירה, להוסיף 200 μM 1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH).
  9. יש להעמיס דגימות על האגרגומטר בתוך קוביות צבירה (כולל מגנטים ערבובים מצופים טפלון).
  10. לאחר דקה, הוסיפו את הגירויים בריכוז הרצוי (למשל, יחידה אחת/מ"ל טרומבין או 3 מק"ג/מ"ל קולגן). דוגרים במשך 10 דקות.
  11. (אופציונלי) השג ייצור אניון סופראוקסיד בנקודות זמן שונות על ידי המשך לשלב 3.12 בזמן הרצוי.
  12. מעבירים את מתלה הטסיות מקובט הצבירה לצינור מיקרוצנטריפוגה ומסתובבים במהירות של 6,000 x גרם למשך 10 שניות.
  13. יש להעמיס 50 μL של הסופרנאטנט במיקרופיפטות נימיות ולאטום בשעוות איטום EPR.
  14. העבר דגימות לסורק EPR.
  15. הגדר את סורק EPR באופן הבא: שדה מרכזי 3,492.5 G, טאטוא שדה 60 G, משרעת אפנון 2 G, זמן טאטוא 10 שניות, מספר סריקות 10, תדר מיקרוגל 9.39 GHz, עוצמת מיקרוגל 20 mW, זמן המרה 327.68 ms, קבוע זמן 5242.88 ms.
  16. הערך חמצון CMH ל- CM● כשטח מתחת לעקומה (AUC) של פסגות EPR שנרשם באמצעות הפרמטרים לעיל.
  17. בנה עקומת כיול המתווה את עוצמת ה-EPR הנמדדת כמתואר בשלב 3.16 על ציר ה-y ואת ריכוזי ה-CM● הזמינים מסחרית על ציר ה-x (לדוגמה, 0, 0.3, 1, 3, 10 ו-30 מיקרומטר).
  18. מריכוז CM● בדגימות, קבל את כמות האניון סופראוקסיד שנוצר על ידי טסיות הדם בדגימות באמצעות הנוסחאות המתוארות בסעיף תוצאות מייצגות.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור זיהוי ציטומטריית זרימה של פלואורסצנטיות DHE, אנו מראים תוצאות מייצגות עבור טסיות דם במנוחה (איור 3A) או מגורות עם תרומבין של 0.1 יחידה/מ"ל (איור 3B). תפוקת O2•- כומתה כעוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת של טסיות (MFI), כפי שמוצג עבור גירוי עם תרומבין של 0.1 יחידה/מ"ל (איור 3C) או פפטיד הקשור לקולגן (CRP) של 3 מיקרוגרם/מ"ל (איור 3D). נצפתה עלייה של פי שניים / שלושה בצביעת DHE כתוצאה מגירוי טסיות. כדי לוודא ש-O2•- נמדד, אנו מציעים להשתמש ב-O2•- scavenger pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD, 100 יחידות/מ"ל), ואילו כדי לזהות את המקור של O2•- השתמשנו במעכב NOX VAS2870 (10 מיקרומטר). הן עבור קולגן והן עבור טרומבין, PEG-SOD ו-VAS2870 ביטלו את העלייה בפלואורסצנטיות DHE הנגרמת על ידי הפעלת טסיות, ואישרו כי המדידה ספציפית עבור O2•- וכי מקורותיהם בתנאים אלה הם אנזימי NOX.

לצורך זיהוי פלואורסצנטי של DHE, אנו מציגים נתונים מניסויים שהעריכו את הייצור של O2•- ברגע ההיצמדות לקולגן או פיברינוגן (וב-10 הדקות הבאות) (איור 4A) או מניסויים שמטרתם להעריך את דור O2•- מטסיות שקודם לכן הודבקו ל-PLL לאחר גירוי עם טרומבין (איור 4B). כצפוי, היצמדות ל-PLL אינה גורמת לייצור חזק של O2•-. ככל הנראה משום שצורה זו של היצמדות תלויה באינטראקציה אלקטרוסטטית ללא התחלת תגובת איתות45, מה שהופך גישה זו למתאימה למדידת פלט O2•- בתגובה לתוספת של אגוניסטים מסיסים. כדי לוודא שפרוטוקול זה מאפשר זיהוי של O2•-, ניתן להשתמש בנבלות או במעכבים סלקטיביים. הראינו במחקרים קודמים כי N-אצטיל-ציסטאין (NAC) יכול לסלק O2•- ולבטל פלואורסצנטיות טסיות בניסויים אלה46. כאן אנו מראים שמעכב NOX סלקטיבי VAS2870 מפחית באופן יעיל ומיידי פלואורסצנטיות בטסיות דם שנצמדות לקולגן או לפיברינוגן (איור 4A) או מגיבות לתרומבין (איור 4B). זה מצביע על כך ש-NOXs הם המקור של O2•- בתנאי ניסוי אלה. סרטים מייצגים עבור פלואורסצנטיות DHE (עירור 405 ננומטר) בתגובה להידבקות לקולגן או פיברינוגן או גירוי על ידי טרומבין של טסיות הנצמדות ל- PLL כלולים כקובץ משלים 1, קובץ משלים 2 וקובץ משלים 3, בהתאמה. יש לציין כי PEG-SOD, אשר שימש בהצלחה במערכי ניסוי אחרים כ-O2•- נבלות, אינו יעיל בניסוי מסוג זה. אין לנו הסבר ברור לכך כרגע. אנו יכולים לשער כי PEG-SOD מגיע לתאים שבהם O2•- גורם לפלואורסצנטיות מוגברת בבדיקות מבוססות הדימות עם יעילות ירודה או קינטיקה איטית. ייתכן שיידרשו חקירות ממוקדות נוספות כדי להבהיר נקודה זו.

יישמנו את המדידה של O2•- על ידי EPR בטסיות במחקרים שונים שפורסמו בעבר 1,13,47,48,49,50. שלב מכריע בטכניקה זו הוא הכנת עקומת כיול באמצעות CM● זמין מסחרית (כלומר, תוצר התגובה בין גשושית הספין CMH ו- O2•- והמינים המהדהדים שנמדדו על ידי EPR). התגובה של CMH ו-O2•- מוצגת באיור 5A, ודוגמאות מייצגות של אות EPR המושרה על-ידי ריכוזים שונים של CM● מוצגות באיור 5B. הנתונים מריכוזי CM● שונים שימשו לבניית עקומת כיול המתארת את המתאם הליניארי בין כמות CMH מחומצנת לבין עוצמת אות EPR בדגימות (איור 5C). המשוואה שלהלן מתארת את המתאם בין ריכוז CM● לבין עוצמת אות EPR והיא נקודת המוצא לחישוב עקומת הכיול עבור הניסויים במחקר זה (משוואה 1):

figure-results-1

מכיוון שגם ריכוזי CM● וגם עוצמת ה- EPR המתאימה להם התקבלו בניסוי, ניתן לחשב את השיפוע ואת יירוט ציר Y של עקומת הכיול. בדוגמה המוצגת באיור 5C, שיפוע = 1,002,169 ויירוט = 596,383. לכן, ניתן לכתוב מחדש את המשוואה עבור עקומת הכיול כך:

figure-results-2

על ידי סידור מחדש של המשוואה לעיל, ניתן לחשב ריכוז CM● עבור דגימות שונות בהתבסס על ערכי עוצמת EPR שלהן (משוואה 2):

figure-results-3

לאחר שריכוז CM● בדגימות ידוע, ניתן לחשב את קצב הייצור שלו לטסיות וליחידת זמן בעזרת המשוואה הבאה (משוואה 3):

figure-results-4

באמצעות משוואה 2, ניתן לכתוב מחדש את משוואה 3 כ- (משוואה 4):

figure-results-5

אשר בדוגמה המוצגת באיור 5C ניתן לכתוב מחדש כך:

figure-results-6

קצב חמצון CMH יתבטא כאטומולים של CM● הנוצרים לכל טסיות לדקה. ניתן להשתמש בערך זה כדי להשוות את קצב יצירת O2•- בין ניסויים לתורמים, דבר שאינו אפשרי עם גשושיות פלואורסצנטיות כמו DHE (או DCFDA). גשושיות פלואורסצנטיות מאפשרות בדרך כלל רק להעריך את ההשפעה של תנאים שונים על יצירת O2•- כשינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות באותו ניסוי. באשר לכל הטכניקות המתוארות במאמר זה, הספציפיות של הזיהוי אושרה עם נבלות ROS (למשל, PEG-SOD, NAC) או מעכבים סלקטיביים של אנזימים המייצרים אניון סופראוקסיד (למשל, VAS2870 לעכב NOXs). כאן אנו מציגים נתונים עבור גירוי טסיות (איור 6) באמצעות תרומבין (איור 6A,C,E) או קולגן (איור 6B,D,F). עבור שני האגוניסטים, נעשה שימוש ב-PEG-SOD כדי לאשר ש-O2•- מזוהה, בעוד שחוסר ההשפעה של pegylated-catalase (PEG-Cat.) מצביע על כך שמי חמצן אינם מזוהים על-ידי שיטה זו (איור 6C,D, בהתאמה). VAS2870 מבטל את אותות ה-EPR המושרים על-ידי תרומבין (איור 6E) וקולגן (איור 6F), מה שמרמז על כך ש-NOXs הם המקור העיקרי לטסיות O2•- בתגובה לשני האגוניסטים האלה.

figure-results-7
איור 1: ניתוח ציטומטריית זרימה של מתלי טסיות. (A) הצגה אופיינית של חלקות פיזור קדימה (FSC) וצד (SSC) עבור טסיות מבודדות. (B) הצביעה החיסונית של תרחיף הטסיות עם נוגדן נגד CD41 מאשרת >98% מהחלקיקים בתכשיר כטסיות דם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8
איור 2: תגובה כימית של DHE עם אניון סופראוקסיד ותכונות ROS אחרות ותכונות ספקטרליות של מוצריו. מבנה ותכונות ספקטרליות של DHE ושני תוצרי החמצון שלו 2-הידרוקסי-אתידיום (2OH-Et+), שנוצר על ידי תגובה עם אניונים סופראוקסידים, ואתידיום (Et+), שנוצר על ידי תגובה עם סוגים אחרים של ROS (למשל, רדיקל הידרוקסיל ומי חמצן). שיא העירור ב-405 ננומטר, המודגש על-ידי מלבן כחול מקווקו באיור, הוא ספציפי עבור 2OH-Et+ ולכן ניתן להשתמש בו כדי לזהות/למדוד O2•-. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9
איור 3: ייצור אניון סופראוקסיד תלוי פקקת וקולגן שזוהה על-ידי DHE וציטומטריית זרימה. היסטוגרמות מייצגות לצביעת DHE של (A) במנוחה ו-(B) טסיות דם מגורות טרומבין. הסרגל מציין ערכי צביעת DHE מתחת ל-500, שהם 70.7% ו-16.1% עבור טסיות דם במנוחה וטרומבין, בהתאמה. טכניקה זו שימשה להערכת ייצור אניון סופראוקסיד ב (C) 0.1 יחידה / מ"ל תרומבין ו (D) 3 מיקרוגרם / מ"ל טסיות מגורה קולגן. PEG-SOD (100 יחידה/מ"ל) שימש כדי לאשר שאניונים סופראוקסידים נמדדים בניסוי זה, בעוד 10 מיקרומטר VAS2870 שימשו לזיהוי אנזימי NOX כמקור לאניונים סופראוקסיד. כל נקודת נתונים חושבה כעוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת (MFI) מ-50,000 טסיות, וכל ניסוי חזר על עצמו חמש פעמים בלתי תלויות (n = 5), כאשר ממוצע ± SEM מוצג בגרפים. המובהקות הסטטיסטית הוערכה על ידי ANOVA חד-כיווני עם מבחן Tukey לאחר השוואות זוגיות (** = p < 0.01, *** = p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10
איור 4: ייצור אניון סופראוקסיד תלוי קולגן, פיברינוגן ותרומבין שזוהה על-ידי הדמיית פלואורסצנטיות של DHE. (A) קינטיקה של ייצור אניון סופראוקסיד הוערכה עבור טסיות הנצמדות לקולגן או לפיברינוגן. טסיות הדם חולקו על שקופיות μ מצופות דקה אחת לאחר תחילת ההדמיה, ואילו 10 מיקרומטר VAS2870 נוסף 5 דקות מתחילת אוסף התמונות. (B) קינטיקה של ייצור אניון סופראוקסיד לטסיות דם בעת גירוי עם טרומבין. טסיות הדם הורשו להיצמד לשקופיות μ מצופות PLL במשך 10 דקות לפני תחילת אוסף התמונות. לאחר 2 דקות נוסף תרומבין 0.1 יחידה/מ"ל, ולאחר 5 דקות נוספות נוסף 10 מיקרומטר VAS2870 (כלומר, 7 דקות מתחילת ההדמיה). ערכת הניסוי מוצגת בחלק העליון של הלוחות, בעוד תמונות מייצגות מ 0 דקות, 1 דקה, 3 דקות, 6 דקות ו 9 דקות מוצגות באמצע הלוחות. כימות פלואורסצנטי DHE חד-טסיות מוצג בתחתית הלוחות והתקבל על ידי ניתוח עוצמת פלואורסצנטיות באמצעות ImageJ. הנתונים הם ממוצע ± SEM מ 8-12 טסיות לכל מצב ב 4 ניסויים עצמאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-11
איור 5: חישובי עקומת כיול וקצב חמצון CMH. (A) מבנה כימי ותכונות EPR של CMH ו-CM●. (B) דוגמאות מייצגות של נתוני EPR עבור ריכוזים שונים של CM● (100 ננומטר עד 10 מיקרומטר). (C) עקומת כיול של עוצמת EPR לעומת ריכוז CM● . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-12
איור 6: זיהוי של ייצור אניון סופראוקסיד על-ידי טסיות דם לאחר גירוי טרומבין או קולגן. תפוקת האניון הסופראוקסיד נמדדה על ידי EPR עם בדיקת הספין CMH בטסיות הדם שעוררו עם (A) 0.1 יחידה/מ"ל תרומבין או (B) 3 מיקרוגרם/מ"ל קולגן. (ג, ד) ריכוז של 100 יחידות / מ"ל של מסלק אניון סופראוקסיד PEG-SOD או 100 יחידות / מ"ל של מי חמצן scavenger pegylated catalase (PEG-Cat.) נכלל בתנאים שנבדקו עבור שני האגוניסטים. המקור של אניון סופראוקסיד נחקר על ידי דגירה משותפת עם מעכב NOX VAS2870 (10 מיקרומטר). גם תרומבין (E) וגם קולגן (F) תלויים בפעילות NOX לייצור אניון סופראוקסיד. לאורך כל האיור, קצב התגובה של אניון CMH/סופראוקסיד חושב מתוך עקבות EPR, כמתואר בכתב היד (משוואה 4). הנתונים הם ממוצעים ± SEM מ 5 (C,D) ו 4 ניסויים עצמאיים (E,F). המובהקות הסטטיסטית הוערכה על ידי ANOVA חד-כיווני עם מבחן Tukey לאחר השוואות זוגיות (** = p < 0.01, *** = p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: סרט מייצג לפלואורסצנטיות DHE (עירור 405 ננומטר) בתגובה להידבקות בקולגן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: סרט מייצג עבור פלואורסצנטיות DHE (עירור 405 ננומטר) בתגובה להידבקות פיברינוגן. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: סרט מייצג עבור פלואורסצנטיות DHE (עירור 405 ננומטר) בתגובה לגירוי על ידי טרומבין של טסיות הנצמדות ל- PLL. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בכתב יד זה אנו מציגים שלוש טכניקות שונות בעלות פוטנציאל לקדם את היכולת לחקור את הוויסות תלוי החיזור של תפקוד טסיות הדם באמצעות זיהוי סלקטיבי של O2•-. שתי השיטות הראשונות הן שיפור של טכניקות קיימות בגלל בדיקת חמצון-חיזור בשימוש (DHE במקום DCFDA נפוץ יותר אבל פחות אמין). טכניקות אלה, אם כן, נגישות בקלות, ורוב המעבדות יכולות לאמץ אותן ביעילות ללא ציוד מסוים או עלויות הכשרה. הטכניקה השלישית מבוססת על שימוש בציוד מיוחד לניתוח חמצון של בדיקת הספין CMH על ידי EPR. טכניקה זו דורשת רכישת ציוד וריאגנטים מיוחדים והכשרה ייעודית של המשתמש במעבדה. כתוצאה מכך, הוא נראה מתאים למעבדות המתמקדות במיוחד בחקר אירועים תלויי חמצון-חיזור בטסיות (או בתאים אחרים).

עבור טכניקות המשתמשות ב- DHE, בחירת אורך הגל עבור העירור חיונית להשגת הזיהוי הספציפי של O2•-. 2-הידרוקסי-אתידיום (2OH-Et+) שנוצר על-ידי התגובה של DHE עם O2•- מעורר ב-405 ננומטר, בעוד שלאתידיום (Et+) שנוצר על-ידי התגובה הכללית של DHE עם ROS (למשל, רדיקל הידרוקסיל ומי חמצן) יש שיא עירור סביב 520 ננומטר, אך אין עירור ב-405 ננומטר (איור 1)51. שימוש ב-DHE במקום DCFDA מגן מפני הממצאים הנגרמים על ידי התגובה הישירה של בדיקה זו עם רכיבים תאיים כגון פרוקסידאזים, אנזימים אחרים המכילים הם וחומרים מחזרי יוני מתכת 42,43,44. DHE הוצע ככלי בטוח יותר למחקרי חמצון-חיזור תאי38,39. כאן, אנו מציעים את השימוש ב- DHE בשתי טכניקות קריאה שונות: 1) ציטומטריית זרימה ו -2) הדמיה פלואורסצנטית.

ציטומטריית זרימה היא בדרך כלל טכניקה המאפשרת טיפול בו זמנית במספר דגימות עם תפוקה נמוכה עד בינונית52. למרבה הצער, הגישה בה נעשה שימוש במחקר זה אינה מאפשרת קיבוע דגימה. למרות שדילול הדגימות עם חיץ טיירוד שעבר שינוי קר כקרח מייצב את הפלואורסצנטיות בדגימות למשך עד 30 דקות, ניתוח כל הדגימות צריך להתבצע במסגרת זמן זו. זה מגביל באופן משמעותי את מספר הדגימות לכל ניסוי. מספר ריצות ניסוי מבוקרות פנימיות באותו יום ושימוש באותה הכנת טסיות אפשריות, אם כי התוצאות צריכות להיות מנורמלות לבקרות ולא להיחשב כניסויים עצמאיים. טכניקה זו שימשה את מחברי כתב היד הזה כדי להדגיש את התפקיד של אפנון טסיות תלוי חיזור בתגובות לאגוניסטים ומודולטורים שונים46,50. ניתן לשנות שיטה זו על ידי אימוץ השימוש בגרסה מהונדסת כימית של DHE המאפשרת מיקוד של מיטוכונדריה (כלומר, מיטוסוקס)53, אשר שימשה למחקרי טסיות המתמקדים ב- NOX254. זוהי הזדמנות מעניינת שעדיין לא ניצלה על ידי המעבדות שלנו.

לטכניקת ההדמיה הפלואורסצנטית המשתמשת ב-DHE המוצעת כאן יש יתרון בקביעת מסלול הזמן של יצירת O2•- בטסיות דם עם הידבקות (אגוניסטים הנקלטים על פני באר ההדמיה) או גירוי (אגוניסטים בתרחיף). זה מאפשר פרשנות של יחסי הגומלין בין שלבים שונים של תהליך הפעלת טסיות הדם והערכת תרומתם של מקורות O2•- שונים (למשל, אנזימים שונים המייצרים ROS, למשל, NOXs). אין טכניקה קיימת המאפשרת חקירה מסוג זה. יש לכך עלות במונחים של תפוקת מבחן, כאשר כל מצב נבדק אורך 30 דקות (הכולל הגדרת μ שקופיות, מיקוד ובחירת שדה, הדמיה וחיסכון בנתונים). לכן, טכניקה זו מאפשרת בדיקה של מספר קטן של תנאים ליום עבודה (כלומר, מתחת ל -10). למרות שנעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי עבור הנתונים המוצגים כאן, אישרנו כי ניתן להשיג תוצאות טובות באותה מידה עם מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם יכולת עירור של 405 ננומטר. זה מפחית את הדרישה למערכי מיקרוסקופיה קונפוקלית יקרים והופך טכניקה זו לזולה יותר.

פרוטוקול EPR פותח על סמך מחקרים קודמים בסוגי תאים שונים55. טכניקה זו מוכרת באופן נרחב ככלי האמין ביותר לחקר יצירת ROS וחקירת אירועים תלויי חיזור בתאים38. בנוסף לאמינות מעולה בהשוואה לטכניקות אחרות בשל הספציפיות של התגובה של בדיקות ספין הידרוקסילאמין עם רדיקלים חופשיים חמצן56, EPR מאפשר לכמת את קצב הדור O2•- ואת השוואתו בין אנשים שונים וניסויים. זה לא אפשרי עם טכניקות מבוססות פלואורסצנטיות, אשר מאפשרות לנו רק להעריך את ההשפעה של תנאים נבחרים על עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך ניסוי יחיד והכנת טסיות. למרות שפרוטוקול EPR זה פותח כטכניקה לשילוב עם צבירת טסיות לניטור מקבילי של הפעלת טסיות ו- O2•- דור1, ניתן לבצע ניסויים אלה ללא ניתוח מקבילי של צבירה. גם ללא ניתוח מקביל של צבירת טסיות, אנו מציעים לבצע את הדגירה באגרגומטר כדי להבטיח גירוי טסיות יעיל, הדורש את לחץ הגזירה המסופק על ידי ערבוב מתמשך. אם יש צורך לבצע את הניסויים בצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל ללא ערבוב, רמות הייצור של O2•- נמוכות משמעותית. לכן, אם בוחרים בגישה ניסיונית זו, אנו מציעים לבצע את הדגירה של CMH על גלגל מסתובב ועם טסיות מרוכזות יותר בצפיפות (כלומר, 1 x 109/mL), מה שמוביל לאות חזק מספיק לגילוי על ידי ספקטרומטר EPR.

לסיכום, כאן אנו מציגים שלוש טכניקות מתוקפות לזיהוי O2•- בטסיות. הם מציעים יתרונות שונים וניתן לבחור אותם על פי מטרות הניסוי וסדרי עדיפויות. הטכניקה הראשונה המבוססת על שימוש ב- DHE על ידי ציטומטריית זרימה היא הכי פחות מייגעת וגוזלת זמן ולכן ניתן לבחור בה כניתוח ברמת הכניסה. הטכניקה השנייה, המבוססת על שימוש ב-DHE במיקרוסקופ פלואורסצנטי, מאפשרת להעריך את הקינטיקה המהירה של דורO 2•- ולחקור כיצד מפלים שונים של איתות עשויים להשפיע על תגובת החמצון בסקאלת הזמן של השניות (בעוד שטכניקות אחרות מאפשרות רק חקירה בנקודות קצה של אירועים המתרחשים בתוך דקות מרגע הגירוי). לבסוף, EPR מאפשר לכמת את קצב דור O2•- ואת השוואתו בין ניסויים ויחידים. מסיבה זו, הטכניקה האחרונה שימושית במיוחד עבור מחקרים קליניים שמטרתם לאפיין את התגובה החמצונית בטסיות דם מאנשים שונים (למשל, השוואה בין חולים או חולים לעומת קבוצת ביקורת בריאה). בסך הכל, שלוש הטכניקות הללו מציעות יתרונות משמעותיים על פני השיטות הקיימות ומייצגות התקדמות משמעותית בכלים הניסיוניים העומדים לרשותנו לחקר אירועים תלויי חיזור בטסיות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי קרן הלב הבריטית (PG/15/40/31522), מחקר אלצהיימר בריטניה (ARUK-PG2017A-3), ומועצת המחקר האירופית (#10102507) מענקי G. Pula.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1-הידרוקסי-3-מתוקסיקרבוניל-2,2,5,5-טטרמתילפירולידין (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAזרימה ציטומטר
בקר סרום אלבומיןMerck / SigmaA7030עבור μ-ציפוי שקופיות
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH  NOX-E.11-BES ספקטרומטר EPR
קטלאז– פוליאתילן גליקול (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963נבלות מי חמצן (בקרת ספציפיות)
ChronoLog דגם 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM רדיקליNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg מגיב ל- EPR (בקרת כיול)
דפרוקסאמין Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg מגיב ל- EPR
דיאתילדיתיוקרבמט (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g מגיב ל- EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347בדיקת אניון סופראוקסיד
דימתיל סולפוקסידMerck/Sigma34869להכנת תמיסת מלאי 
צלחות שעווה איטום EPRNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMמתכלה למים בדרגת EPR
EPRNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L מגיב ל- EPR
פיברינוגן מפלזמה אנושיתMerck/SigmaF4883לציפוי μ-slide
FITC אנטי אנושי CD41 נוגדןBioLegend303704צביעה ספציפית לטסיות דם לזרימה ציטומטריה
קובטות זכוכית Labmedics/ChronologP/N 312מתכלה לדגירה באגרגומטר
הורם קולגןLabmedics/ChronologP/N 385לגירוי טסיות
דם ImageJ המכונים הלאומיים לבריאות (NIH)NAImageJ 1.53t (וויין רסבנד)
אינדומתציןMerck/SigmaI7378לבידוד טסיות
מיקרופיפטות DURAN 50µ lNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µ Lמתכלה עבור EPR
פולי-L-ליזין הידרוכלורידMerck/SigmaP2658לציפוי μ-slide
פרוסטגלנדין E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515לבידוד
טסיות דם נתרן ציטראט (תמיסה 4% w/v)Merck/SigmaS5770לבידוד טסיות
מוטות ערבוב (מצופה טפלון)Labmedics/ChronologP/N 313מתכלה לדגירה באגרגומטר Superoxide
dismutase&ndash– פוליאתילן גליקול (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549סופראוקסיד אניון נבלות (בקרת ספציפיות)
תרומבין מפלזמה אנושיתMerck/SigmaT6884לגירוי טסיות דם וציפוי μ-slide
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395מעכב NOX
Zeiss 510 LSM מיקרוסקופ קונפוקליZeissNA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
  2. Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
  3. Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
  4. Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, Pt 3 589-606 (2004).
  5. Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
  6. Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), Pt 2 H401-H403 (1988).
  7. Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, Suppl 12 S54-S56 (1992).
  8. Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
  9. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  10. Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
  11. Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044(2013).
  12. Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
  13. Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
  14. Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
  15. Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
  16. Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
  17. Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
  18. Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
  19. Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
  20. Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
  21. Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
  22. Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
  23. Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), Pt 1 C1424-C1437 (1996).
  24. Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
  25. Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
  26. Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
  27. Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
  28. Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
  29. Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866(2020).
  30. Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
  31. Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
  32. Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
  33. Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713(2023).
  34. Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
  35. Rotariu, D., et al. Oxidative stress - complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238(2022).
  36. Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
  37. Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
  38. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  39. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  40. Hempel, S. L., Buettner, G. R., O'malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
  41. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  42. Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
  43. Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2',7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
  44. Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2'-7'-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2'-7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
  45. Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
  46. Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
  47. Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497(2021).
  48. Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
  49. Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
  50. Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
  51. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
  52. Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
  53. Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
  54. Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
  55. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
  56. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Superoxide Anion DetectionPlatelet FunctionReactive Oxygen SpeciesFlow CytometryDihydroethidium ImagingElectron Paramagnetic ResonancePlatelet Rich PlasmaSpin Probe QuantificationPlatelet AdhesionNADPH Oxidases

מאמרים קשורים