הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

איסוף דם רציף מווריד נבוי נחות ואחריו וריד פורטל להערכת מטבוליטים מיקרוביאליים במעיים בעכברים

4.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66673

⸱

21 ביוני 2024

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco and San Francisco General Hospital

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מדגים שיטה לאיסוף דם מוורידי פורטל ווריד נבוב נחות מעכברים ברצף כדי להעריך את הייצור והספיגה של מטבוליטים מיקרוביאליים במעי.

תקציר

ידוע כי תוצרי חיידקי המעי פועלים הן באופן מקומי בתוך המעי והן נספגים במחזור הדם, שם השפעתם יכולה להתרחב למערכות איברים מרוחקות רבות. חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFA) הן סוג אחד של מטבוליטים המיוצרים על-ידי חיידקי מעיים במהלך התסיסה של סיבים תזונתיים בלתי ניתנים לעיכול. כיום הם מוכרים כתורמים חשובים להשפעה של מיקרוביום המעי על מערכות איברים חוץ-מעיים דרך המעי-ריאה, המעי-מוח וצירי איברי מעיים אחרים ברחבי המאכסן. SCFAs נספגים מהמעי הגס, דרך רקמת המעי, לתוך הווריד הפורטלי (PV). לאחר מכן הם עוברים דרך הכבד, ונצרכים באיברים שונים כגון המוח, השריר, רקמת השומן והריאות. SCFAs נמדדים בקלות הרבה ביותר בחומר הצואה שגורש, עם זאת, מדידות מדויקות יותר התקבלו מתכולת צואה תוך מעי גס. כאן אנו מציעים כי דגימת PV ופלזמה מערכתית במחזור של נבדק יחיד עשויה להיות עדיפה לחקר רמות הקליטה, ההובלה והמערכת של SCFA בעכברים. אנו מציגים טכניקה חדשה לדגימת דם יעילה מה-PV והווריד הנבוב התחתון (IVC) המאפשרת איסוף כמויות גדולות יחסית של דם ממחזור הדם הפורטלי והמערכתי. זה מושג על ידי קשירת PV, ובכך מאפשר הרחבה או הגדלה של PV כפי שהוא מתמלא בחזרה מן הוורידים mesenteric המתנקזים לתוכו. באמצעות שיטה זו, הצלחנו לשפר את שיעור האיסוף המוצלח, כמו גם את כמות הדם הכוללת שנאספה (עד 0.3 מ"ל מ IVC ו 0.5 מ"ל מ PV).

מבוא

חומצות שומן קצרות שרשרת (SCFA) הן קבוצה עיקרית של מטבוליטים המיוצרים על-ידי מיקרוביוטת המעי. תפקידם הקריטי באינטראקציה בין מיקרוביום המעי לבין איברים מרוחקים אחרים1 נתמך במחקר המתאר כיצד הם מווסתים דלקת, מאותתים דרך קולטנים ייעודיים ומשמשים כמצעים במטבוליזם תאי 2,3,4,5. מחקר שנערך לאחרונה מהקבוצה שלנו הציע כי SCFAs הם מווסתי דלקת חיוניים in vivo של טונוס חיסוני הריאות in vivo דרך ציר מעי-ריאה 6,7. דיווחים נוספים תיארו את השפעתם התפקודית על חילוף החומרים דרך ציר מעי-מוח 8,9. באופן כללי, ההשפעה של SCFA על הפיזיולוגיה והפתולוגיה של המאכסן נמצאת תחת מחקר פעיל ואינטנסיבי על ידי קבוצות מחקר רבות המשתרעות על מגוון רחב של תהליכי מחלה.

אצטט (C2), פרופיונט (C3) ובוטיראט (C4) הם ה-SCFA העיקריים, והם נוצרים על-ידי מיקרוביוטה של המעי באמצעות תסיסה של סיבים תזונתיים הניתנים לבליעה בצקום ובמעי הגס. כל שלושת SCFAs ניתן גם לקבל ישירות מן הדיאטה, ורק אצטט יכול להיות מיוצר גם על ידי תאים יונקים. SCFAs נספגים במעי הגס ומנוצלים חלקית על ידי תאי אפיתל של המעי (כמקור אנרגיה, לאפנון מקומי של מערכת החיסון של הרקמה ולתמיכה בתחזוקת מחסום המעי). הם מועברים גם לתוך וריד הפורטל דרך מערכת ורידי mesenteric10. בוטיראט נצרך בעיקר על ידי אפיתל מעיים, פרופיונט על ידי הכבד11,12, ואצטט דווח לפעול על רקמות שריר ושומן לאחר הכניסה למחזור ההיקפי 13,14.

הערכה מקיפה של ייצור, ספיגה ופעילות תפקודית של SCFA דורשת ידע על רמות SCFA בלומן המעי הגס, במחזור הדם הפורטלי ובדם ההיקפי. ניתן להשיג זאת על ידי איסוף דם מווריד הפורטל (PV) ומחזור הדם המערכתי בו זמנית או ברצף באותה חיה. מאחר ש-SCFA הם נדיפים15, מדידת הרמות שלהם בכדורי צואה מגורשים עשויה שלא לשקף במדויק את הרמות בתוך המעי הגס. יתר על כן, בהשוואה למדידות מתכולת המעי הגס, רמת SCFA הקיימת ב- PV עשויה לשקף בצורה מדויקת יותר את הסכום נטו של רמות המצב היציב הנספגות על ידי המארח לעומת הרמות הלא אחידות המיוצרות על ידי מיקרוביום המעי לאורך המעי הגס11. רמות PV SCFA אלה עשויות אפוא להיות רלוונטיות ומתאימות יותר לחקר ההשפעות של SCFA על הפיזיולוגיה והפתולוגיה של המאכסן מעבר להשפעות המקומיות בתוך המעי.

כדי לבצע איסוף מתואם וכמעט סימולטני של PV ודם מערכתי במחזור, הסרעפת צריכה להישאר שלמה כדי לשמור על זרימת דם תקינה ולתמוך בנשימה ספונטנית. לכן, הווריד הנבוב התחתון (IVC) מציג אתר אידיאלי להשגת דם במחזור הדם המערכתי תוך איסוף דם PV. דם IVC זה יכול לשמש גם למטרות אחרות, כגון מדידת ציטוקינים במחזור הדם כדי להעריך דלקת מערכתית.

נכון לעכשיו, רק שיטות מעטות לאיסוף דם הן ממחזור הדם המערכתי והן מ- PV דווחו במכרסמים גדוליםיותר 16,17. שיטות קונבנציונליות, הדורשות קנולציה של כלי שיט בחולדות, קשות מבחינה טכנית לביצוע בעכברים. בנוסף, כמות הדם המקסימלית שנאספה בשיטות אלה היא בדרך כלל לא יותר מ 0.3 מ"ל18.

במאמר זה אנו מציגים שיטה חדשנית המפשטת את תהליך איסוף הדם הכפול מעכבר IVC ואחריו PV באותה חיה. המאפיין הייחודי של השיטה הוא קשירת PV ליד הילום הכבד ממש לפני דגימת דם PV. גישה זו יכולה להרחיב את הממדים של PV, ובכך לשפר באופן משמעותי את שיעור ההצלחה, כמו גם להגדיל את נפח הדם הקולקטיבי המרבי עד 0.5 מ"ל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השלבים בהליך אי-הישרדותי זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו. מין העכבר והזן שבו השתמשו היו עכברי C57BL/6J זכרים (במשקל 25-35 גרם ובגילאי 12-15 שבועות). ניתן להשתמש גם בזני עכבר נקביים ו/או סטנדרטיים אחרים.

1. הרדמה

  1. נגב את החצי התחתון של בטן העכבר עם מקלוני אתנול 70%. ניהול הרדמה על ידי מתן זריקה intraperitoneal של tribromoethanol (250-400 מ"ג / ק"ג). ניתן להשתמש גם בקטמין/קסילזין או בהרדמה איזופלורנית. החל משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע נזק הקרנית.
  2. להזריק buprenorphine (0.05-0.1 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally עבור שיכוך כאבים.
    הערה: Buprenorphine נדרש בגלל הכאב הקשור הליך laparotomy.

2. לפרוטומיה

  1. הניחו את העכבר המרדים על משטח הניתוח (עם כרית חימום מתחת) במצב שכיבה. הדקו את כל איברי העכבר על לוח הניתוחים באמצעות קלטת. ודא כי עומק ההרדמה המתאים הושג על ידי צביטת בוהן ללא רפלקס נסיגה מדוושה.
  2. הרימו את העור ובצעו חתך אורכי עם מספריים מנתחים לאורך קו האמצע מהטבור לתהליך הקסיפואיד ובאופן קאודלי לכיוון בסיס הבטן (איבר המין החיצוני).
  3. בצע חתך דומה לתוך הצפק עם מספריים לנתח מבלי לנקב או לפגוע במעיים, בסרעפת או בכבד.
  4. הרחבת שדה הניתוח על ידי ביצוע חתך רוחבי באורך מלא (הארכת רוחב הבטן) עם מספריים משני צידי הטבור.
  5. העבר את המעי הגס והדק לצד ימין של המנתח באמצעות גזה נקייה ספוגה ב- PBS חם כדי לחשוף את IVC למטה.

3. הכנת ליגטורה ל- PV

  1. תמרן בעדינות את מקטעי המעי בתחום הכירורגי עם צמר גפן כדי לאתר את PV בשורש המזנטריה.
  2. באמצעות מיקרוסקופ מנתח כדי להמחיש את כלי הדם ומבני בטן אחרים, העבירו בזהירות תפר פרולן 7-0 מאחורי PV ליד הילום הכבד (בין וריד התריסריון לווריד הטחול)19 כך שהוא מוכן לקשירה בשלב 5 (איור 1).
    הערה: שימוש במיקרוסקופ משלב זה ואילך אינו חובה אך משפר משמעותית את אחוזי ההצלחה של ההליך הכולל.

4. איסוף דגימות דם מה- IVC

  1. הכנס את המחט 28G 1/2 אינץ 'של מזרק אינסולין 1 cc heparinized לתוך IVC. לאסוף 0.2-0.3 מ"ל של דגימת דם.
    הערה: אם יותר מדי דם מוסר בשלב זה, זה יגרום לכמויות נמוכות יותר של דם PV שנאסף בשלב 5.
  2. השאירו את המחט בתוך העירוי כדי למנוע את הדימום שיתרחש עם ההסרה.

5. איסוף דגימות דם מה- PV

  1. לקשור בעדינות את ליגטורה פרולן 7-0 סביב PV; ה- PV אמור להתרחב ולהתרחב כאשר הוא מתמלא בחזרה. הכנס את המחט 28G 1/2 אינץ 'של מזרק אינסולין 1cc אחר heparinized לתוך PV.
  2. שואפים לאט לאסוף עד 0.3-0.5 מ"ל של דם מן PV. PV עלול לקרוס אבל זה צריך בהדרגה להתרחב מחדש עם מילוי דם מן המערכת הוורידית mesenteric.

6. אחסון לדוגמה

  1. הסר את המחטים מה- IVC וה- PV לאחר איסוף הדם.
  2. העבירו את דגימות הדם ממזרקים לצינורות אפנדורף 1.5 מ"ל והניחו אותן על קרח לעיבוד מאוחר יותר לפלזמה לאחסון וניתוח לפי הצורך.
  3. יש להרדים את העכבר באמצעות מנת יתר של חומר הרדמה ואחריו פריקת צוואר הרחם (בהתאם להנחיות המאושרות על ידי UCSF IACUC).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

באמצעות השיטה שתוארה לעיל, אנו יכולים לאסוף דגימות דם מה- IVC וה- PV ברצף באותו עכבר עם שיעור הצלחה של יותר מ -95%. הכמויות הממוצעות של דגימות הדם שנאספו הן 0.25 מ"ל עבור IVC ו 0.35 מ"ל עבור PV.

באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיית גז (GC-MS), מדדנו את ריכוז SCFAs בצואה, בדם PV ובדם IVC, וכך הצלחנו לעקוב אחר הספיגה והמעבר של אצטט (C2), פרופיונט (C3) ובוטיראט (C4) מתא המעי הגס שבו הם מיוצרים על ידי חיידקי מעיים מותססים, לתוך מחזור הדם המערכתי.

באופן ספציפי, בניסו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מאמר זה מתאר שיטת in vivo חדשנית לאיסוף כמעט סימולטני של דגימות דם ברצף מ- IVC ו- PV באותו עכבר ניסיוני. שיטה זו שימושית למדידת הרמות של תוצרי מיקרוביוטה במעי, כגון SCFAs, העוברים דרך מחזור הדם בפורטל. נפח הדם המקסימלי הממוצע שניתן לאסוף במהלך הליך סופני בעכברים (במשקל 25-30 גרם) הוא כ 1 מ"ל / עכבר, אשר בתורו מייצג 50% מנפח הדם הכולל במחזורהדם 18. עם זאת, השגת מספיק דם למדידות ניסיוניות רצויות משתי מערכות ורידי אינטראקציה ושכנות יכולה להיות מאתגרת. הלחץ ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

AP ממומנת על ידי פרס R01 מה-NIH/NHLBI (1R01HL146753). DM ממומן על ידי מלגת T32 מה-NIH ועל ידי פרסי טייס מתמחה/צוות ממרכז UCSF בניוף לרפואת מיקרוביום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2,2,2 טריברומו-אתנול, 97% (אוורטין)סיגמא אולדריץ' T48402-25Gחומר הרדמה 
הזרקת בופרנורפין הידרוכלוריד 0.3 מ"ג/מ"לPAR פרמצבטיקה NDC 42023-179-05חומר משכך כאבים
חבישת מלקחייםMiltex 6-100דיסקציה 
מלקחיים GraefeRobozRS-5136דיסקציה 
הפטין נתרן 1000 יחידות USP / מ"לHikmaNDC 0641-0391-12מזרקים / צינורות דגימת דם הפריניזציה
פרולן 7-0Ethicon8696Gקשירת וריד פורטל
מספרייםFST14058-11דיסקציה 
סטודנט הלסטד-מוסקיטו המוסטטיםF.S.T 91308-12דיסקציה 
סרט כירורגי 3M Transpore1527-1קיבוע גפיים של עכבר
U-100 מזרק אינסולין 28G1/2EXEL26027איסוף דגימות דם 

מקורות

  1. vander Hee, B., Wells, J. M. Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids. Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).
  2. Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
  3. Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. Regulation of inflammation by short chain fatty acids. Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).
  4. Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets. Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).
  5. den Besten, G., et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).
  6. Tian, X., et al. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Front Microbiol. 10, 159(2019).
  7. Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).
  8. De Vadder, F., et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).
  9. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).
  10. Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).
  11. Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).
  12. Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).
  13. Neis, E. P., et al. Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man. Gut. 68 (4), 764-765 (2019).
  14. Yamashita, H., et al. Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).
  15. Ríos-Covián, D., et al. Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health. Front Microbiol. 7, 185(2016).
  16. Jaworska, K., et al. An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products. J Vis Exp. (140), e58456(2018).
  17. Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
  18. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  19. Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).
  20. Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).
  21. Hoyles, L., et al. Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier. Microbiome. 6 (1), 55(2018).
  22. Shimizu, J., et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. PLoS One. 13 (9), e0203657(2018).
  23. Wang, J., et al. Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response. Front Immunol. 8, 1108(2017).
  24. Lucas, S., et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun. 9 (1), 55(2018).
  25. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J Vis Exp. (92), e51955(2014).
  26. Sänger, C., et al. Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications. PLoS One. 10 (11), e0141798(2015).
  27. Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. Portal Vein Injuries: A Review. J Emerg Trauma. 2 (2), 4(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

חומצות שומן קצרות-שרשרתדגימה מווריד הפורטהאיסוף דם מעכבריםספיגת SCFAמיקרוביום המעידם וריד הפורטההובלת מטבוליטיםטכניקה כירורגית בעכברים
איסוף דם רציף מווריד נבוי נחות ואחריו וריד פורטל להערכת מטבוליטים מיקרוביאליים במעיים בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.