מאמר שיטה

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

4.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66679

⸱

7 ביוני 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 4Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך אינטגראז phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול אופטימלי למיקרו-הזרקה עוברית, צעד מכריע ליצירת זבובים טרנסגניים.

תקציר

טרנסגנזה בדרוזופילה היא גישה חיונית לחקר תפקוד גנים ברמת האורגניזם. מיקרו-הזרקה של עוברים היא צעד מכריע לבניית זבובים טרנסגניים. מיקרו-הזרקה דורשת סוגים מסוימים של ציוד, כולל מיקרו-מזרק, מיקרומניפולטור, מיקרוסקופ הפוך ומיקרוסקופ סטריאו. פלסמידים מבודדים עם ערכת מיני הכנה פלסמיד מוסמכים למיקרו-הזרקה. עוברים בשלב הפרה-בלסטודרם או הבלסטודרם הסינסיטיאלי, שבו גרעינים חולקים ציטופלסמה משותפת, נתונים למיקרו-הזרקה. מסננת תאים מקלה על תהליך הדה-כוריוניזציה של עוברים. הזמן האופטימלי לדכוריונציה וייבוש של עוברים צריך להיקבע באופן ניסיוני. כדי להגביר את היעילות של מיקרו-הזרקה עוברית, מחטים שהוכנו על ידי מושך צריכות להיות משופעות על ידי מטחנת מחט. בתהליך השחזת מחטים, אנו משתמשים במשאבת אוויר לרגל עם מד לחץ כדי למנוע את ההשפעה הנימית של קצה המחט. אנו מזריקים באופן שגרתי 120-140 עוברים לכל פלסמיד ומשיגים לפחות קו מהונדס אחד עבור כ-85% מהפלסמידים. מאמר זה לוקח את הטרנסגנזה בתיווך integrase phiC31 בדרוזופילה כדוגמה ומציג פרוטוקול מפורט למיקרו-הזרקה של עוברים לטרנסגנזה בדרוזופילה.

מבוא

זבוב הפירות Drosophila melanogaster מקובל מאוד על מניפולציה גנטית וניתוח גנטי. זבובי פירות טרנסגניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביולוגי. מאז שפותחה בתחילת שנות השמונים, טרנסגנזה בתיווך טרנספוזון של אלמנט P הייתה הכרחית למחקר דרוזופילה 1. בתרחישים מסוימים, טרנספוזונים אחרים, כגון piggyBac ומינוס שימשו לטרנסגנזה גם בדרוזופילה 2. טרנסגנים באמצעות טרנספוזון מוחדרים באופן אקראי לגנום דרוזופילה, ורמות הביטוי של טרנסגנים באתרים גנומיים שונים עשויות להשתנות בהתאם להשפעות המיקום ולכן לאניתן להשוות 2. חסרונות אלה התגברו על ידי טרנסגנזה ספציפית לאתרבתיווך phiC31 3. הגן phiC31 של הבקטריופאג' מקודד אינטגראז המתווך רקומבינציה ספציפית לרצף בין אתרי attB ו-attP בדרוזופילה3. אתרי עגינה רבים של attP אופיינו וזמינים במרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה 3,4,5,6,7,8,9.

מערכת הטרנסגנזה phiC31 עבור דרוזופילה נמצאת בשימוש נרחב על ידי קהילת הזבובים. מבין אתרי העגינה של attP, attP18 בכרומוזום X, attP40 בכרומוזום השני ו-attP2 בכרומוזום השלישי הם בדרך כלל האתרים המועדפים לשילוב טרנסגנים בכל כרומוזום מכיוון שטרנסגנים בשלושת האתרים מראים רמות גבוהות של ביטוי אינדוקטיבי בעוד רמות נמוכות של ביטוי בסיסי5. עם זאת, לאחרונה, ואן דר גראף ועמיתיו מצאו כי אתר attP40, קרוב למוקד הגן Msp300, וטרנסגנים המשולבים ב- attP40 גורמים להתקבצות גרעינית של שרירי הזחל בדרוזופילה10. במחקר אחר שנערך לאחרונה, דואן ועמיתיו מצאו כי כרומוזום attP40 הומוזיגוטי משבש את הארגון הגלומרולרי הנורמלי של קבוצת נוירוני קולטן הריח Or47b בדרוזופילה11. ממצאים אלה מצביעים על כך שיש לכלול בקרות קפדניות בעת תכנון ניסויים ופירוש נתונים.

דרוזופילה היא אורגניזם מודל אידיאלי לחקירה in vivo של תפקוד גנים בשל מחזור החיים הקצר שלה, עלות נמוכה ותחזוקה קלה. סריקה גנטית כלל-גנומית מסתמכת על בניית ספריות טרנסגניות כלל-גנומיות בדרוזופילה 12,13,14,15. יצרנו בעבר 5551 מבני UAS-cDNA/ORF המבוססים על מערכת רצף ההפעלה הבינארי GAL4/upstream (GAL4/UAS), המכסים 83% מהגנים של דרוזופילה השמורים בבני אדם באוסף הזהב של מרכז המשאבים לגנומיקה דרוזופילה (DGRC)16. פלסמידים UAS-cDNA/ORF יכולים לשמש ליצירת ספריית UAS-cDNA/ORF טרנסגנית בדרוזופילה. טכנולוגיית מיקרו-הזרקה יעילה של עוברים יכולה להאיץ את יצירתן של ספריות זבובים טרנסגניות.

עבור מיקרו-הזרקה עוברית, קצה המחט נשבר בדרך כלל כנגד כיסוי17. לכן, מחטים לעיתים קרובות נסתמות או גורמות לדליפה של כמויות גדולות של ציטופלסמה, וכאשר בעיות אלה מתעוררות, יש להשתמש במחטים חדשות. למרות שמחטים משופעות יכולות לשפר את יעילות המיקרו-הזרקה, תמיסת השחזה נכנסת לקצה המשופע במהלך תהליך השחזה. תמיסת השחזה בקצה המשופע אינה מתאדה במהירות באופן טבעי; לכן, מחטים לא ניתן להשתמש עבור microinjection מיד לאחר שיקוע. גורמים אלה מפחיתים את היעילות של הליכי מיקרו-הזרקה עובריים. כאן, תוך שימוש בטרנסגנזה ספציפית לאתר בתיווך phiC31 בדרוזופילה כדוגמה, אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה. כדי למנוע מתמיסת השחזה להיכנס למחט, אנו משתמשים במשאבת אוויר כדי להפעיל לחץ אוויר בתוך המחט, ובכך למנוע מתמיסת השחזה להיכנס לקצה המשופע. מחטים משופעות מוכנות להעמסת דגימות ולמיקרו-הזרקה מיד לאחר השיקוע.

פרוטוקול

1. הכנת פלסמידים

  1. בודדו פלסמידים מתרביות חיידקים של 4 מ"ל למשך הלילה באמצעות ערכת הכנת פלסמיד. Elute עם 40 μL של חיץ elution.
    הערה: בידוד פלסמידים באמצעות ערכת הכנת פלסמיד מידי אינו הכרחי. ערכת מיני הכנה פלסמיד יכולה לעמוד באופן מלא בדרישות הניסוי למיקרו-הזרקה עוברית. בפרוטוקול זה, פלסמידים מוכנים של UAS-cDNA/ORF מכילים עשרה עותקים של כטב"ם, מקדם מינימלי Hsp70, אתר attB, גן מיני לבן וגן מעניין.
  2. לקבוע את ריכוז ה- DNA פלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר ולאחסן אותו במקפיא -80 ° C.
    הערה: ריכוז פלסמיד אינו קריטי למיקרו-הזרקה מוצלחת של עוברים, מכיוון שריכוזי פלסמיד הנעים בין 20 ננוגרם/מיקרוליטר ל-1683 ננוגרם/מיקרוליטר פועלים היטב עבור טרנסגנזה בדרוזופילה (טבלה משלימה 1).
  3. ממש לפני מיקרו-הזרקה, הפשירו פלסמידים וצנטריפוגות ב 13000 x גרם במשך 5 דקות.
  4. מעבירים 10 μL מכל פלסמיד מהשכבה העליונה של הנוזל לצינור חדש של 1.5 מ"ל.

2. משיכת מחטים

  1. הפעל מושך מחטים עם הגדרות נבחרות (חום: 500, משיכה: 50, Vel: 60, עיכוב: 90, לחץ: 200, מבחן רמפה: 510).
  2. הכנס נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.75 מ"מ, אורך 10 ס"מ) למושך המחט וסגור את המכסה.
  3. לחץ על לחצן משיכה . כל נימי זכוכית מייצרים שתי מחטים.

3. טחינת מחטים (איור 1)

  1. השתמש במטחנת מחטים המורכבת עם פלטת שחיקה מתאימה (עבור גדלים של 0.7-2.0 מיקרומטר קצה) של מטחנת מחט.
  2. להרטיב את הבד (חוט ייחוס) עם תמיסת השחזה (100 מ"ל של מים מזוקקים עם 0.9 גרם של NaCl, 1 מ"ל של חומר הרטבה) ולתקן את המטלית.
  3. הפעל את מטחנת המחטים ושמור על צלחת השחזה מסתובבת.
  4. חבר מחט למשאבת אוויר ברגל עם מד לחץ באמצעות צינור סיליקון נימי, ולאחר מכן הרכיב את המחט על מחזיק מחט של מטחנת המחט. התאימו את זווית המחט ביחס לצלחת השחזה ל-35° (איור 1A, B).
  5. התאימו את מיקום קצה המחט ממש מעל משטח צלחת השחזה באמצעות ידית בקרה גסה מתחת למיקרוסקופ (איור 1C).
    הערה: המחטים שנמשכו במקטע 2 הן בעלות חידוד של 6-8 מ"מ וקצה של פחות ממיקרומטר אחד (איור 1D), כפי שמתואר במדריך למשתמש של המושך.
  6. שמור על הלחץ הפנימי של המחט על 40 psi באמצעות משאבת האוויר ברגל. התאימו את מיקום קצה המחט באמצעות ידית בקרה עדינה מתחת למיקרוסקופ, וגרמו לקצה המחט לגעת בצלחת השחזה.
  7. טוחנים במשך 3-5 שניות. כאשר בועות אוויר זעירות יוצאות מקצה המחט, פרקו את המחט (איור 1E).
    הערה: בתהליך השחזה, שימוש במשאבת אוויר מונע את ניפוי תמיסת הטחינה.
  8. הכניסו את מחטי הקרקע למארז אחסון.
    הערה: השתמש במחטים טחונות טריות ככל האפשר, אם כי ניתן לשמור את המחטים הטחונות במארז אחסון לפחות מספר שבועות לפני המיקרו-הזרקה.

4. הכנת פיפטות להעמסת פלסמידים

  1. מחממים פיפטה של 200 μL עם הלהבה החיצונית של מבער אלכוהול.
  2. ברגע שהוא מתחיל להמיס, למתוח את פיפטה.
  3. חותכים את הקצה האטום של פיפטה מתוחה עם מספריים, ואת פיפטה מתוח אז מוכן לטעון DNA לתוך מחט הקרקע.
    הערה: לחלופין, טיפים ארוכים ועדינים במיוחד למילוי מחטים טחונות זמינים מסחרית.
  4. מניחים פיפטות אלה בקופסת פלסטיק autoclaved.

5. איסוף עוברים

  1. אספו זבובים (vas-phiC31; +; attP2) המבטאים אינטגראז phiC31 ונושאים את אתר העגינה attP2 3 ימים לאחר בקיעתם מ-50 בקבוקונים והעבירו אותם לכלוב (φ 90 מ"מ x 150 מ"מ). מוסיפים מעט ממרח שמרים טריים למרכז כל צלחת אגר ענבים18.
  2. הכינו 2-4 כלובים של זבובים. שמור את הכלובים והצלחות ב 25 ° C ולשנות את הצלחות כל יום במשך 2-4 ימים.
    הערה: מחקר זה שילב את הטרנסגן vas-phiC31 (סטוק # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) על הכרומוזום הראשון ואת טרנסגן attP2 (סטוק # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) על הכרומוזום השלישי. המלאי המתקבל (vas-phiC31; + ; attP2) משמש בפרוטוקול זה. יש להכין משחת שמרים מדי יום, ויש להאכיל את משחת השמרים הטריים לזבובים. יש לנקות ולייבש את הכלובים המוחלפים כדי להיפטר מהעוברים הנותרים בכלובים.
  3. ביום המיקרו-הזרקה, החליפו את הכלובים והצלחות בבוקר. לאחר מכן, החליפו את הצלחות כל 30 דקות ואספו עוברים מצלחות אלה. החליפו את כל הכלובים והצלחות בטמפרטורת החדר (RT) ולאחר מכן שמרו על הכלובים והצלחות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
    הערה: פרוטוקולים מסוימים מעדיפים לדגור על הכלובים והצלחות בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס להטלת ביצים. זה תלוי במספר העוברים שצריך למיקרו-הזרקה.

6. עוברים dechorionating

  1. מכינים 30% אקונומיקה על ידי ערבוב 60 מ"ל אקונומיקה (המכילה תכולת כלור פעילה של 34-46 גרם/ליטר) ו-140 מ"ל מים מזוקקים כפול.
  2. מוציאים את הזבובים הנותרים על צלחות אגר מיץ ענבים עם מברשת או מלקחיים, ושוטפים עוברים לתוך מסננת תאים עם מים מזוקקים כפול.
  3. יבש את מסננת התאים המכילה את העוברים עם נייר טישו.
  4. מניחים אותו בכלי פטרי המכיל 30% אקונומיקה, ומערבלים את מסננת התא ביד או בשייקר אופקי למשך דקה וחצי ב-60 סל"ד.
    הערה: שטיפה היא שלב קריטי. אם זמן השטיפה אינו ארוך מספיק, הקליפה של עובר לא תרד לחלוטין. אם זמן השטיפה ארוך מדי, זה יגרום לעובר להיות רך ולהישבר בקלות. מסננת התאים צריכה להיות שקועה לחלוטין באקונומיקה של 30%. לבשו זוג כפפות גומי ומעיל מעבדה כדי למנוע פציעות הנגרמות מאקונומיקה.
  5. יש לשטוף עוברים במשך 2 דקות במים מזוקקים כפולים המאוחסנים בבקבוק שטיפה מפלסטיק במעבדה כדי להסיר את שאריות האקונומיקה. בחר את העוברים הצפים להרכב.

7. סידור עוברים בשורה

  1. חותכים את אגר מיץ הענבים המוצקים לרצועות ארוכות בעזרת להב.
    הערה: השתמשו במיץ ענבים סגול כדי להקל על סידור עוברים לבנים.
  2. מעבירים את העוברים לרצועה ארוכה בעזרת מברשת.
  3. סדרו כ-60 עוברים בשורה עם מחט חותכת לאורך קצה רצועה ארוכה כאשר אחוריהם פונים לחלק החיצוני של הרצועה. העמידו בשורה כ-60 עוברים תוך 5 דקות.
    הערה: המיקרופייל הוא בליטה בצורת חרוט בקוטב הקדמי של העובר, שדרכה הזרע נכנס כדי להפרות את הביצית (איור 2A). לכן, בהתבסס על בליטה בצורת חרוט בקוטב הקדמי של העובר, קל לקבוע את החלק האחורי של העובר dechorionated.
  4. הניחו סרט דו-צדדי בקוטר 18 מ"מ לאורכו לאורך קצה הכיסוי (18 מ"מ x 18 מ"מ) והסר את גב הנייר. לחץ בעדינות על המכסה על העוברים המיושרים. ודא שהעוברים מודבקים למרכז סרט הדבק.

8. ייבוש עוברים

  1. הניחו את תלוש הכיסוי עם העוברים המרופדים בקופסה המכילה חומר ייבוש. זמן הייבוש משתנה בהתאם לטמפרטורה וללחות.
    הערה: זמן הייבוש הוא קריטי עבור מיקרו-הזרקה ויש לקבוע אותו באופן ניסיוני. זמן הייבוש הוא בדרך כלל 9-10 דקות בקיץ ו 17-18 דקות בחורף.
  2. מכסים את העוברים בשמן הלוקרבון.
    הערה: אין להפיל יותר מדי שמן על העוברים, שכן השמן הנוסף עלול לעלות על גדותיו של הדבק. יחס הנפח של שמן halocarbon 700 ושמן halocarbon 27 הוא 1: 3.

9. מיקרוהזרקת עוברים

  1. טען 2 μL של DNA לתוך המחט באמצעות פיפטה מתוחה. ודא שאין בועות במחט. הכנס את המחט למחזיק המחט של המיקרומניפולטור.
  2. הניחו את העוברים המיושרים מכוסים בשמן הלוקרבון תחת מיקרוסקופ הפוך. ודא כי הקצוות האחוריים של העוברים פונים אל המחט.
  3. השתמש במיקרומניפולטור כדי לקרב את המחט לעוברים. נקה את המחט. ודא כי טיפת נוזל יוצא מהמחט גלוי. החל מלחץ הזרקה של 300 hPa ולחץ שיווי משקל של 20 hPa, התאם את לחץ ההזרקה ולחץ שיווי המשקל כדי להבטיח את הגודל האופטימלי של טיפת הנוזל.
  4. השתמשו במיקרומניפולטור כדי להחדיר את המחט לקצוות האחוריים של העוברים, והשתמשו בבקרת כף הרגל שמחוברת למיקרו-מזרק כדי להזריק את הדנ"א (איור 2). אם נראית הילה קטנה, הדנ"א מוזרק בהצלחה לעובר.
    הערה: בחר את העוברים הרב-גרעיניים להזרקה והרוג את העוברים המבוגרים יותר באמצעות כפתור "נקי". אם כמות גדולה של ציטופלסמה דולפת לאחר ההזרקה, העוברים מיובשים בחסר. אם רק כמות קטנה של ציטופלסמה דולפת או ללא כמות דולפת לאחר ההזרקה, זריקות נחשבות מוצלחות. אם יותר משליש מהעוברים דולפים ציטופלסמה לאחר ההזרקה, האריכו את זמן הייבוש ב-1-2 דקות. אם יותר משליש מהעוברים מיובשים יתר על המידה, קצרו את זמן הייבוש ב-1-2 דקות.
  5. הסר את המחט מהעובר. הזיזו את המחט לקצה האחורי של העובר הבא. חזור על השלבים לעיל.
  6. הכניסו את העוברים המוזרקים לצלחת אגר. מניחים את הצלחת בחדר ב 18-20 מעלות צלזיוס. למחרת, להעביר את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוסולחות של 50%-60%, ולדגור במשך יום אחד.
    הערה: לאחר ההזרקה, לשמור על עוברים בטמפרטורה של 18-20 מעלות צלזיוס כדי להאט את התפתחותם, להקל על שילוב DNA פלסמיד לתוך גנום דרוזופילה , ולהגדיל את שיעור ההישרדות של העוברים המוזרקים.

10. איסוף זחלים

  1. השתמש במחט ניתוח כדי לגרד ולשחרר את המזון בבקבוקון. ספקו למזון כמה טיפות מים מזוקקים.
    הערה: יש לאפשר למים המזוקקים להיספג לתוך המזון כדי למנוע מהזחלים לטבוע.
  2. מוציאים את הצלחות מהאינקובטור.
  3. אספו את הזחלים שבקעו בעזרת מברשת צבע תחת מיקרוסקופ סטריאו והעבירו אותם לבקבוקון.
  4. הכניסו את הבקבוקון לאינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוסולחות של50%-60%.

11. השגת זבובים טרנסגניים

  1. לאסוף את הזבובים בקעו לאחר בקבוקון הוא דגירה ב 25 ° Cבמשך 10 ימים.
  2. חצו זבוב זכר יחיד לשלוש נקבות זבובים בתוליות של מאזני TM2/TM6C Sb1 Tb1 , וחצו זבוב נקבה אחת לשלושה זבובים זכרים של מאזני TM2/TM6C Sb1 Tb1 .
  3. מניחים את הצלבים באינקובטור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ולחות של 50%-60%.
  4. סנן את הצאצאים לזבובים עם עיניים כתומות. אלה הם הזבובים הטרנסגניים (איור 3A-C).
    הערה: לזבובים הנושאים עותק של טרנסגן באתר העגינה attP2 יש עיניים כתומות.
  5. חצו זבוב זכר כתום עיניים יחיד לשלוש נקבות זבובים בתוליות של מאזני TM2/TM6C Sb1 Tb1 כדי לבסס מלאי.
    הערה: יש להגדיר יותר מדור אחד של צלבים על מנת לחצות את טרנסגן phiC31 על הכרומוזום הראשון.

תוצאות

קצה של מחט הזרקה משופע על-ידי מטחנת מחטים (איור 1). אפשר לשקוע 50-60 מחטים בשעה אחת. דנ"א מוזרק במיקרו לחלק האחורי של עובר בשלב הקדם-בלסטודרם או הבלסטודרם הסינסיטיאלי, שבו גרעינים חולקים ציטופלסמה משותפת (איור 2A). החלק האחורי של עובר יכול להיות ממוקם בקלות בהתבסס על מיקרופייל בחלק הקדמי של העובר (איור 2A). עוברים בשלבי הבלסטודרם התאי והגסטרולציה אינם יכולים לשמש להזרקה, מאחר שכל גרעין מוקף בקרום התא בשלבים אלה, ולכן הסיכוי לקבל זבובים טרנסגניים הוא כמעט אפסי (איור 2B). עוברים מיובשים יתר על המידה מעוותים כאשר הם מנוקבים, ולא ניתן להשתמש בהם למיקרו-הזרקה (איור 2C). עוברים מיובשים מספיק יכולים לחלץ כמות גדולה של ציטופלסמה כאשר הם נדקרים עם המחט (איור 2D), מה שמוביל לשיעור הישרדות נמוך יותר של עוברים. עוברים שיובשו כראוי עשויים לדלוף החוצה כמות קטנה של ציטופלסמה כאשר הם מוזרקים (איור 2E).

לקו הדרוזופילה המבטא אינטגראז phiC31 ונושא את אתר העגינה attP2 המשמש למיקרו-הזרקה של עוברים בפרוטוקול זה יש עיניים לבנות (איור 3A), ולזבובים המזדקנים של הגנוטיפ הזה יש עיניים ורודות הנובעות מהצטברות חלבון פלואורסצנטי אדום המתבטא באופן ספציפי בעין (איור 3B). אנו משתמשים בגן המיני-לבן כסמן סלקטיבי לטרנסגנזה בדרוזופילה, וזבובים טרנסגניים מזוהים על ידי צבע עיניים הנע בין צהוב בהיר לאדום. לזבובים טרנסגניים הנושאים טרנסגן באתר העגינה attP2 יש עיניים כתומות (איור 3C), שניתן להבחין בהן בקלות מזבובים שאינם נושאים טרנסגנים.

figure-results-1
איור 1: שחיקת המחטים. (A) משאבת אוויר ברגל עם מד לחץ משמשת להפעלת לחץ אוויר על המחט. (B) מחט מותקנת על מטחנת מחטים בזווית של 35° למשטח צלחת השחזה. (C) השתמש בידית כוונון גסה כדי למקם את קצה המחט ממש מעל משטח צלחת השחזה, ולאחר מכן השתמש בידית כוונון עדינה כדי להתחיל לקף את הקצה. (D) קצה מחט משוכה נמצא מתחת למיקרוסקופ. מוטות קנה מידה = 10 מיקרומטר. (E) מחט משופעת נמצאת מתחת למיקרוסקופ. הקצה המשופע של המחט מסומן על ידי חץ. פסי קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: עוברי דרוזופילה המתאימים למיקרו-הזרקה. (A) ניתן להזריק עובר דרוזופילה בשלב הפרה-בלסטודרם או הבלסטודרם הסינסיטיאלי בקוטב האחורי של העובר, המסומן באליפסה אדומה. המיקרופייל בקוטב הקדמי של העובר מסומן על ידי חץ. (B) עובר דרוזופילה בשלב הבלסטודרם התאי אינו יכול לשמש למיקרו-הזרקה. (C) עובר שעבר ייבוש יתר נראה מעוות. (D) התייבשות לא מספקת של עובר מובילה לדליפה ציטופלזמית גדולה לאחר ההזרקה. (E) עבור הזרקה מוצלחת, כמות קטנה של ציטופלסמה עלולה לדלוף. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: צבע עיניים של דרוזופילה טרנסגנית הנושאת טרנסגן באתר העגינה attP2. (A) לקו ההזרקה attP2 המבטא phiC31 integrase (vas-phiC31; +; attP2) יש עין לבנה. RFP המתבטא באופן ספציפי בעין משמש כסמן סלקטיבי עבור טרנסגן phiC31. (B) לקו ההזרקה המיושן attP2 המבטא phiC31 integrase יש עין ורודה כתוצאה מחלבון RFP שהצטבר בעין. (C) לזבובים הנושאים טרנסגן המשולב באתר העגינה attP2 יש עין כתומה. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה משלימה 1: טרנסגנזה בדרוזופילה כתוצאה ממיקרו-הזרקה של 100 פלסמידים נפרדים. בסך הכל הוזרקו לעוברים 100 פלסמידים שונים בריכוזים שונים, החל מ-20 ננוגרם/מיקרוליטר ועד 1683 ננוגרם/מיקרוליטר, וזבובים טרנסגניים התקבלו עבור 85 מתוך 100 הפלסמידים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה 2: יעילות מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה. בסך הכל הוזרקו 120 פלסמידים שונים לעוברים, וזבובים טרנסגניים התקבלו עבור 101 מתוך 120 הפלסמידים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיקרו-הזרקה של עוברים לטרנסגנזה בדרוזופילה. עבור טרנסגנזה ספציפית לאתר בתיווך phiC31, הזרקנו 120-140 עוברים לכל פלסמיד וקיבלנו לפחות קו מהונדס אחד עבור כ-85% מהפלסמידים (טבלה משלימה 2). מניסיוננו, DNA פלסמיד שבודד על ידי ערכת הכנה פלסמיד מספיק לטרנסגנזה בדרוזופילה. ריכוזי דנ"א פלסמידים הנעים בין 20 ng/μL ל-1683 ng/μL עשויים שלא להשפיע באופן נראה לעין על שיעור ההצלחה של טרנסגנזה, מכיוון שרובם יכולים לייצר זבובים טרנסגניים (טבלה משלימה 1).

הכנת מחטי הזרקה היא קריטית למיקרו-הזרקה יעילה של עובר. מחט הזרקה נסגרת לאחר שהיא נמשכת על ידי מושך מחט. עבור טרנסגנזה שגרתית בתיווך phiC31 בדרוזופילה, קצה המחט נשבר בדרך כלל על ידי כיסוי17. עם זאת, המחטים השבורות באופן אקראי לרוב אינן מתאימות היטב למיקרו-הזרקה עוברית, מכיוון שהן עלולות להיחסם או לגרום לדליפה של כמות גדולה של ציטופלסמה ולכן יש להחליף אותן באחת חדשה במהלך ההזרקה. מחטי הזרקה שקצותיהן משופעים על ידי מטחנה אינן נחסמות בדרך כלל או מעוררות דליפה ציטופלזמית גדולה, המפחיתה את תדירות החלפת המחטים. שמנו לב שתמיסת השחזה יכולה להיכנס לקצה המשופע של מחט ברגע שהקצה פתוח במהלך השחזה. ברגע שהוא נכנס למחט, פתרון השחזה לא יתייבש במהירות באופן טבעי. כדי למנוע את ניפוי תמיסת השחזה, אנו מחברים מחט הזרקה למשאבת אוויר ברגל עם מד לחץ. בעת השחזת קצה המחט אנו משתמשים במשאבת האוויר כדי להפעיל לחץ אוויר על המחט, וכך נמנעת כניסת תמיסת השחזה לקצה המשופע, מה שמאפשר שימוש מיידי במחט המשופעת. יחד, משאבת האוויר ברגל עם מד הלחץ אמורה לעזור להאיץ טרנסגנזה בדרוזופילה, במיוחד עבור מספר גדול של פלסמידים.

זיהוי עוברים בשלב הפרה-בלסטודרם או הבלסטודרם הסינקטיאלי הוא קריטי עבור מיקרו-הזרקה19,20, שכן הזרקת עוברים בשלבים מאוחרים יותר בקושי מייצרת זבובים טרנסגניים. זבובים בני פחות מ -10 ימים משמשים להטלת ביצים מכיוון שהם נוטים להטיל יותר ביצים מאשר מבוגרים. בתהליך של דה-כוריוניזציה של עוברים, נעשה שימוש במסננת תאים כדי לפשט את הטיפול באקונומיקה ושטיפה כפולה של עוברים במים מזוקקים. לאחר שטיפת העוברים, העוברים הצפים מצביעים על כך שקליפות הביצים טופלו היטב וניתן להשתמש בהן למיקרו-הזרקה לאחר מכן. הן זמן הדכוריון והן זמן הייבוש של עוברים הם קריטיים למיקרו-הזרקה ויש לייעל אותם באופן ניסיוני, שכן זמן דכוריון או ייבוש ממושך יכול להרוג עוברים. זמני הדה-כוריון והייבוש מושפעים מהטמפרטורה והלחות המשתנים ממקום למקום ומעת לעת ויש לכוונם בהתאם בהתאם לקצב בקיעת העובר.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

העבודה נתמכה על ידי קרן המחקר המדעי לכישרונות ברמה גבוהה, אוניברסיטת דרום סין.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
100 μ m מסננת תאיםNEST258367
3M דבק דו צדדי3M415
זכוכית בורוסיליקטSUTTERB100-75-10
צלחת שוחקת יהלוםSUTTER104E
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםSUTTERP-1000
משאבת אוויר רגל עם מד לחץShenfengSF8705D
שמן הלוקרבון 27סיגמאH8773
שמן הלוקרבון 700סיגמאH8898
מיקרוסקופ הפוךניקוןECLIPSE Ts2R
משאבת מיקרו הזרקהeppendorfFemtoJet 4i
מיקרומניפולטורeppendorfTransferMan 4r
Micropipette BevelerSUTTERמשקפי כיסוי מיקרוסקופ BV-10
(18 מ"מ x 18 מ"מ)CITOLAS10211818C
שקופיות מיקרוסקופ (25 מ"מ x 75 מ"מ)CITOLAS188105W
צלחת פטרי (90 מ"מ x 15 מ"מ)LAIBOER4190152
Photo-Flo 200Kodak1026269
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Stereo מיקרוסקופניקוןSMZ745

מקורות

  1. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  2. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
  3. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  4. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  5. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
  6. Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
  7. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  8. Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), Bethesda. 1095-1102 (2012).
  9. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
  10. Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598(2022).
  11. Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), Bethesda. 022(2023).
  12. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  13. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  14. Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  15. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
  16. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  17. Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
  18. Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
  19. Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  20. Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PhiC31

מאמרים קשורים