כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור ואימות פונקציונלי של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T רגישים להיפוקסיה. פרוטוקול זה מציג את הדור מבוסס הלנטיוירוס של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה ואת אפיונם, כולל אימות של ביטוי CAR תלוי היפוקסיה וציטוטוקסיות סלקטיבית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ייצור ואימות תפקודי של תאי קולטן אנטיגן כימרי רגישים להיפוקסיה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחקרים מקיפים הוכיחו את ההבטחה של טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR-T) בטיפול בממאירויות המטולוגיות. עם זאת, הטיפול בגידולים מוצקים נותר מאתגר, כפי שמודגם על ידי חששות הבטיחות המתעוררים כאשר תאי CAR-T תוקפים תאים נורמליים המבטאים את אנטיגני המטרה. חוקרים בחנו גישות שונות לשיפור הסלקטיביות של הגידול בטיפול בתאי CAR-T. אסטרטגיה מייצגת אחת לאורך קו זה היא בניית תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה, אשר מתוכננים על ידי היתוך תחום פירוק תלוי חמצן למויטי CAR ומתוכננים להשיג ביטוי CAR גבוה רק בסביבה היפוקסית - מיקרו-סביבה גידולית (TME). מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת תאי CAR-T כאלה והאפיון התפקודי שלהם, כולל שיטות לניתוח השינויים בביטוי CAR וביכולת ההרג בתגובה לרמות חמצן שונות שנקבעו על ידי תא אינקובטור נייד. תאי ה-CAR-T שנבנו צפויים להדגים ביטוי CAR וציטוטוקסיות באופן רגיש לחמצן, ובכך לתמוך ביכולתם להבחין בין TME היפוקסי לבין רקמות נורמליות נורמוקסיות לצורך הפעלה סלקטיבית.
מבוא
טיפול בתאי T (CAR-T) קולטן אנטיגן כימרי היווה פריצת דרך משמעותית בטיפול בסרטן. מאז שמנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) אישר את הטיפול הראשון ב-CAR-T לטיפול בלימפומה מתקדמת/עמידה ובלוקמיה לימפובלסטית חריפה בשנת 2017, 1,2,3, 10 טיפולי CAR-T המכוונים ל-CD19 או אנטיגן להבשלת תאי B (BCMA) קיבלו אישור ברחבי העולם4. עם זאת, למרות מחקר מקיף, שחזור היעילות יוצאת הדופן של טיפול CAR-T בטיפול בממאירויות המטולוגיות נותר מאתגר עבור היישום שלו על גידולים מוצקים 5,6,7,8.
מיקרו-סביבה של גידול מדכא חיסון (TME) היא התורמת העיקרית ליעילות הירודה של CAR-T בסביבת הגידול המוצק. TME מעכב את פעילותם והישרדותם של תאי CAR-T עקב מחסור בחומרים מזינים, היפוקסיה, pH חומצי והצטברות פסולת מטבולית 9,10,11,12. עוינות נוספת מגיעה מחדירת תאים מדכאי חיסון כגון תאי T רגולטוריים (Tregs), תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים (MDSCs) ומקרופאגים הקשורים לגידול (TAM), אשר, לצד תאי הגידול, מפרישים ציטוקינים מדכאי חיסון הגורמים לעיכוב נוסף של תאי CAR-T ברגע שהם נכנסים לגידול13,14.
מלבד היעילות הטיפולית הבלתי מספקת, בעיות בטיחות הן עקב אכילס נוסף של תאי CAR-T בהתמודדות עם גידולים מוצקים15,16. החשש הבטיחותי נובע מכך שאף אחד מהאנטיגנים הספציפיים לגידול (TSA) שזוהו עד כה אינו מוגבל אך ורק לתאי הגידול. במילים אחרות, האנטיגנים הקשורים לגידול (TAA) שנבחרו כמטרה של CAR, למרות שהם מראים ביטוי גבוה יותר בתאי הגידול, מבוטאים לעתים קרובות גם על ידי רקמות נורמליות17. לכן, השפעות מחוץ לגידול עלולות להתרחש כתוצאה מהפעלה בלתי צפויה של תאי CAR-T על זיהוי יעיל של רקמות נורמליות, מה שמוביל לתסמונת שחרור ציטוקינים (CRS), תסמונת אנצפלופתיה הקשורה ל-CAR-T (CRES)18, ותוצאות שליליות אחרות19.
אסטרטגיות רבות נחקרו כדי למנוע השפעות כאלה, כולל הפחתת הזיקה של CAR כדי לאפשר לתאי CAR-T להבחין בין תאי גידול לתאים נורמליים בהתבסס על רמות הביטוי של TAA הממוקד; צייד תאי CAR-T במתג כיבוי, כגון גן התאבדות או סמן חיסול כדי לקדם את חיסולם בעת הפעלה בלתי צפויה; חלוקת אותות CD3ζ ואותות קו-סטימולטוריים לשני תאי CAR, שהפעלתם הסימולטנית נדרשת כתוצאה מכך להפעלה יעילה של תאי CAR-T; שימוש במעגל סינתטי מבוסס Notch (synNotch) המגביל את פעילותם של תאי CAR-T לתאי מטרה המבטאים יחד שני TAA שונים; והנדסת תאי CAR-T להשגת רגישות TME על ידי יישום מנגנון לכוונון ביטוי CAR לרמזים סביבתיים משתנים 20,21,22,23,24,25,26.
שיקול מרכזי באפשרות רגישות TME שתוארה לעיל הוא רמת החמצן הנמוכה ב- TME עקב ההתרבות המהירה של תאי הגידול. התאמתם של תאי הגידול להיפוקסיה תלויה בהפעלת גורם היפוקסיה-אינדוקציה-1 (HIF-1), גורם שעתוק הטרודימרי המורכב מתת-יחידה אינדוקטיבית, HIF-1α, ותת-יחידה המבוטאת באופן קונסטיטוטיבי, HIF-1β27. בתנאים נורמוקסיים, חלבון HIF-1α עובר יוביקוויטינציה ופירוק פרוטאזומלי מהיר, תלוי בתחום הפירוק תלוי החמצן שלו (ODD)28. כאשר אספקת החמצן התאית מוגבלת, HIF-1 מתייצב ומפעיל את השעתוק של גני המטרה במורד הזרם שלו על ידי קשירה לאלמנטים של תגובת היפוקסיה (HREs)29. בהתחשב באופי של ODD ו- HRE כאלמנטים רגישים לחמצן, הם נחקרו כדי לממש את הביטוי המותנה של מכוניות בתוך TME30 היפוקסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתמקד בשיטות לאפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה, ולפניו תיאור קצר של תכנון CAR והליכי ההכנה של תאים אלה. פרוטוקול זה מתכוון לספק קו מנחה שימושי לניצול CAR מגיב להיפוקסיה ליצירת תאי CAR-T עם רעילות מחוץ לגידול.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
במחקר זה, HER2-BBz-ODD, מכונית רגישה להיפוקסיה המכוונת ל- HER2 (מזהה גן: 2064) הושוותה למקבילתה הרגילה, HER2-BBz. השרטוטים של שתי המכוניות מודגמות באיור 1A, אשר מראה כי HER2-BBz-ODD נגזר מ-HER2-BBz על-ידי הוספת רצף ה-ODD למסוף C של CD3ξ. בניית וקטורים לנטי-ויראליים המבטאים את שני ה-CARs ויצירת הלנטיוירוס המתאים על ידי טרנספקציית תאים 293T תוארה בעבר31.
1. יצירת תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה על ידי זיהום לנטיויראלי
- הפשירו תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) בהקפאה במהירות של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. העבירו את מרכזיות ההפשרה לצינור של 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום תרבית לימפוציטים ללא סרום בתוספת 400 IU של IL-2, 5 ng/mL IL-7 ו-10 ng/mL IL-15 (מדיום גידול תאי T אנושיים, המכונה TGM לאחר מכן).
- לאחר נטילת aliquot לספירת תאים, צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות. השהה מחדש את ה- PBMCs הכדוריים עם TGM בצפיפות של 4 × 106 תאים / מ"ל והעבר את המתלה לצלחת 6 בארות.
- הכינו חרוזים חיסוניים מצופים נגד hCD3/hCD28.
- העבר 100 μL של חרוזים מגנטיים מסוג IgG עכבר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ושטוף אותם פעמיים באמצעות מעמד מגנטי עם PBS.
- השהה מחדש את החרוזים ב 100 μL של PBS והוסף 0.2 מיקרוגרם של נוגדן CD3 אנטי אנושי עכבר ו 2 מיקרוגרם של נוגדן CD28 אנטי אנושי עכבר. מערבבים בעדינות את התערובת באמצעות פיפטה וסלע למשך הלילה בחום של 4°C.
- שטפו את החרוזים פעמיים באמצעות מעמד מגנטי עם PBS והשהו אותם מחדש ב-100 מיקרוליטר של PBS.
- הוסף חרוזים חיסוניים מצופים נגד hCD3 / hCD28 לצלחת בשלב 1.2 ביחס חרוז לתא של 1: 1. מניחים את הצלחת באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C.
- לאחר 48 שעות של דגירה, להעביר את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל לאחר ערבוב עדין של התאים עם פיפטה. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי למשך 3 דקות, ולאחר מכן העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לשפופרת חדשה של 15 מ"ל כדי להסיר את ה-immunobeads מה-PBMCs.
- קח aliquot לספירת תאים, ולאחר מכן זרע את PBMCs ב 5 × 105 תאים / באר ב 300 μL של TGM לתוך צלחת שטוחה 48 באר. הוסף 200 μL של מלאי lentiviral לתוך הבארות המתאימות ולהוסיף פרוטאמין סולפט לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
- צנטריפוגו את הצלחת ב-1,000 × גרם ב-32°C למשך שעה וחצי והוציאו בזהירות 300 מיקרוליטר של סופרנאטנט מכל באר באמצעות פיפטה. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של TGM טרי באמצעות פיפטה ומניחים את הצלחת באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C.
- הוסף TGM טרי כדי להתאים את צפיפות התאים ל- 0.5-2 × 106 תאים/מ"ל כל 2-3 ימים. התחל בהעברת תאים תחילה לצלחת של 12 בארות ולאחר מכן לצלחת של 6 בארות. המשך בתרבית התאים עד שהמספר הכולל מגיע ל 6 × 106 בנפח 4 מ"ל.
הערה: במקביל, בצע את התמרה CAR של תאי Jurkat T בעקבות אותם הליכים שתוארו לעיל, אלא TGM מוחלף בתווך RPMI1640 המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS).
2. הערכת ביטוי CAR תלוי חמצן בתאי CAR-T באמצעות ציטומטריית זרימה
- לוחית את תאי T המומרים על ידי CAR משלב 1.8 לשני לוחות 12 בארות בצפיפות של 2.5 × 106 תאים / באר ב 2 מ"ל של TGM. מניחים צלחת אחת ישירות באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C (מצב נורמוקסי, כמו המצב הסטנדרטי עבור תאים תרבית יש 21% O2) ומניחים את הצלחת השנייה בתא אינקובטור נייד CO2 / O2 / N2 עם רמת O2 קבועה מראש ב 1% (מצב היפוקסי) ולאחר מכן לשמור את החדר לח, 5% CO2/94% N2 אינקובטור ב 37 ° C.
- כל 24 שעות, לאסוף 5 × 105 תאים מן הצלחות בתנאים היפוקסיים או נורמוקסי לתוך 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינורות ב 500 × גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, בעדינות resuspend את התאים ב 1 מ"ל של PBS על ידי pipetting. חזור על שטיפת PBS פעם נוספת.
- השהה מחדש את התאים הכדוריים ב-50 μL של חיץ FACS (PBS בתוספת 2% FBS) בכל צינור. הוסף 50 μL של דילול 1:100 של נוגדן אנטי-פלאג מצומד PE (0.2 מיקרוגרם / מ"ל) וערבב היטב על ידי pipetting. דוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
- בסוף הדגירה, הוסף 1 מ"ל של חיץ FACS לכל צינור. מערבבים היטב על ידי pipetting, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות.
- מוציאים בזהירות ומשליכים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה וחוזרים על שלב 2.4 פעם נוספת.
- מוציאים בזהירות ומשליכים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה. להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של מאגר FACS, ולאחר מכן להעביר את תרחיף התא שנוצר לתוך צינורות זרימה 5 מ"ל.
- בצע ציטומטריית זרימה על מתלה התא בשלב 2.6 כדי לקבוע את ביטוי CAR פני השטח. כלול תאי T שאינם נגועים כבקרה שלילית.
- השתמש בשערי FSC/SSC ו- FSC-A/FSC-H כדי לסנן תאים בודדים חיים. אסוף 1 × 104 אירועים בודדים חיים עבור כל דגימה. שער התאים חיוביים עבור EGFP (סמן מכונן הנישא בווקטור הלנטי-ויראלי כאינדיקטור לתאי T שהותמרו בהצלחה) ולאחר מכן, התאים חיוביים עבור פיקואריתרין (PE) (תאים המבטאים CAR) כדי למדוד את חיוביות PE ואת עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI).
3. ניתוח תלות בחמצן של ביטוי CAR בתאי Jurkat T מהונדסים על ידי כתם מערבי
- לוחית את תאי Jurkat T המומרים על ידי CAR מקטע 1 בשני לוחות 48 בארות בצפיפות של 5 × 105 תאים לכל באר (נפח תרבית 500 μL) בתווך RPMI1640 עם 10% FBS.
- עבור צלחת אחת, הוסף CoCl2 לבארות הניסוי לריכוז סופי של 0 μM, 50 μM, או 200 μM. לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C (מצב נורמוקסי). עבור הצלחת השנייה, אין להוסיף CoCl2 ולמקם אותו בתא אינקובטור נייד CO2/O2/N2 עם רמת O2 מוגדרת מראש של 1% (מצב היפוקסי) לפני העברתו לאותו אינקובטור.
- לאחר 24 שעות של דגירה, להעביר את מתלי התא לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את הצינורות ב 500 × גרם במשך 5 דקות. הסר לחלוטין והשלך את הסופרנאטנטים תחילה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, לאחר מכן פיפטה של 100 מיקרוליטר, והשהה מחדש את כדורי התא ב -50 מיקרוליטר של מאגר דגימה 1x SDS-PAGE.
- מחממים את הדגימות באמבט מים רותחים למשך 10 דקות. הניחו מיד את הצינור על קרח למשך 30 שניות, ואז צנטריפוגה בעוצמה של 16,000 × גרם למשך 30 שניות.
- טען 30 μL של הדגימות שנוקו לתוך כל חריץ של ג'ל 10-well, 10% SDS PAGE בעובי של 1.5 מ"מ. הפעל את הג'ל ב 80 V במשך 30 דקות, ולאחר מכן להגדיל את המתח ל 100 V ולרוץ 1.5 שעות.
- בסוף האלקטרופורזה, מעבירים חלבונים מהג'ל לקרום PVDF בשיטת העברה רטובה סטנדרטית, כאשר הזרם ומשך הזמן נקבעים על 400 mA ו 1 שעות, בהתאמה.
- חסום את הממברנה בחיץ חוסם (5% חלב (w/v) ב-PBST (PBS+0.05% Tween-20)) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חתכו את החתיכה בין 30 kD ל 40 kD לזיהוי בקרת הטעינה GAPDH ואת החתיכה בין 50 kD ל 70k D לזיהוי מולקולות CAR.
- דגרו על חתיכות 30-40 kD ו- 50-70 kD עם נוגדן עכבר נגד GAPDH (דילול 1:2,000) ונוגדן נגד דגל עכבר (דילול 1:2,000), בהתאמה, ב- 3 מ"ל של חיץ חוסם בטמפרטורת החדר למשך שעתיים או ב- 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- שטפו את הממברנות עם PBST בטמפרטורת החדר על נדנדת פלטפורמה במשך 3X5 דקות.
- לדגור על הממברנות עם נוגדן נגד עכבר עז מצומד HRP (דילול 1:5,000) ב-3 מ"ל של חיץ חוסם בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת; לאחר מכן לשטוף את הממברנה עם PBST במשך 5 x 10 דקות.
- פתח את הממברנות באמצעות דגירה שלהן עם מצע HRP, ולאחר מכן דמיין את רצועות החלבונים שזוהו באמצעות מנתח תמונה זוהר.
4. הערכה חוץ גופית של התלות בחמצן של ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה
- ביום 0, זרע 1 × 104 תאי מטרה (תאי SKOV3-Luc) לכל באר ניסיונית ב 200 μL של DMEM המכיל 10% FBS בשני לוחות תרבית רקמה שחורים שטוחים 96 באר.
- ביום הראשון, הסירו בזהירות 100 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מהחלק העליון של כל באר. הוסף תאי CAR-T או תאי T לא מותמרים ביחסי אפקט למטרה של 1:1, 2:1 ו- 4:1 ב- 100 μL של תווך DMEM המכיל 10% FBS.
- הניחו צלחת אחת באטמוספירה של 21% O2 ואת השנייה באטמוספירה של 1% O2 באמצעות תא אינקובטור נייד CO2/O2/N2 , כמתואר בשלב 2.1.
הערה: אם תא אינקובטור נייד CO2/O2/N2 אינו זמין, ניתן להשתמש בהוספת CoCl2 למדיום התרבית כדי לחקות מצב היפוקסי. - ביום השני, לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, העבירו בזהירות את כל הסופרנאטנט (בערך 150-200 מיקרוליטר) לצלחת U חדשה בעלת 96 בארות באמצעות פיפטה. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C לזיהוי ציטוקינים מאוחר יותר, בהתאם להליכים המתוארים בסעיף 5.
- הוסף 60 μL של חיץ ליזה פסיבי 1x לכל באר ניסיונית של לוחות 96 בארות שחורות שטוחות מדרגה 4.4. לאחר מכן, הניחו את הצלחות על שייקר ונערו במשך 30 דקות כדי להבטיח ליזה תאית יעילה.
- הוסף 60 μL של מצע לוציפראז גחלילית לכל באר ניסוי, ולמדוד את פעילות לוציפראז באופן מיידי באמצעות קורא microplate.
- חישוב ציטוטוקסיות מנורמלת (%) באמצעות משוואה (1):
ציטוטוקסיות מנורמלת (%) = 100 -
×100 (1)
5. איתור הפרשת IL-2 ו-IFN-γ על ידי תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה
- ביום 0, הכינו דילול של 1:250 של נוגדנים IL-2 או IFN-γ במאגר הציפוי. הוסף 100 μL של נוגדן מדולל לכל באר של צלחת ELISA 96 באר לדגור את הצלחת ב 4 ° C במשך הלילה.
הערה: חיץ הציפוי מיוצר על ידי המסת 7.13 גרם של NaHCO3 ו-1.59 גרם של Na2CO3 ב-1 ליטר מים מזוקקים והתאמת ה-pH ל-9.5. - ביום הראשון, הסר את נוגדן הלכידה שלא נספג על ידי היפוך נמרץ של הצלחת, ולאחר מכן שטוף את הבארות 3x עם 200 μL של Wash Buffer (PBS המכיל 0.05% Tween 20).
- מוסיפים 200 μL של מדלל Assay (PBS המכיל 10% FBS) לכל באר ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
- השליכו את התמיסה על ידי היפוך נמרץ של הצלחת; לאחר מכן, לשטוף את הבארות 3x עם 200 μL של Wash Buffer.
- הפשירו את הדגימות/צלחת הסופרנאטנט הקפואה משלב 4.4 בטמפרטורת החדר. לאחר הפשרה מלאה, לדלל את הדגימות ואת התקנים עם Assay Diluent. הוסף 100 μL של דגימות מדוללות או תקנים לכל באר של צלחת ELISA המצופה ודגר בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.
הערה: עבור זיהוי IL-2, מומלץ דילול פי 10, ואילו עבור זיהוי IFN-γ, עדיף דילול פי 50. - הסר את הדגימות ואת התקנים על ידי הפיכת הצלחת נמרצת הפוך, ולאחר מכן לשטוף את הבארות 5x עם 200 μL של חיץ כביסה לכל באר.
- הכן פתרון זיהוי עובד על-ידי דילול נוגדן הזיהוי IL-2 או נוגדן זיהוי IFN-γ/Streptavidin-HRP (SAv-HRP) ביחס של 1:250 במדלל בדיקה. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת גילוי העבודה לכל באר ודגרו על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם ניעור עדין.
- השליכו את התמיסה ושטפו את הבארות 7x עם 200 μL של Wash Buffer.
- מוסיפים 100 μL של מגיב מצע לכל באר ודגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
- הוסף 50 μL של תמיסת עצירה (1 M H2SO4) לכל באר. קרא מיד את הספיגה ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplate.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מיזוג תחום ה-ODD של HIF-1α ל-CAR moiety מייצג אסטרטגיה ראשונית ליצירת CAR רגיש להיפוקסיה. המכונית הממוקדת ב-HER2 הרגישה להיפוקסיה שנותחה במחקר זה, בשם HER2-BBz-ODD, נבנתה באמצעות אסטרטגיה זו על-ידי שילוב רצף ה-ODD ב-HER2-BBz הקונבנציונלי שלה (איור 1A). במחקר זה השתמשנו בהתמרה לנטיויראלית כדי לבטא HER2-BBz-ODD CAR או HER2-BBz CAR, ולאחר מכן בחנו את רגישותם לחמצן בשני סוגי תאים: PBMCs אנושיים ותאי Jurkat T.
הבדיקה הראשונה היא ביטוי של CAR בתנאים היפוקסיים לעומת תנאי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חששות בטיחות הם נושאים משמעותיים שיש לטפל בהם כדי שכל טיפול בתאי CAR-T יתקדם לשימוש קליני. ניצול התכונות הייחודיות של תאי הגידול או TME הפך לכיוון מחקר עיקרי המתמקד בפיתוח תאי CAR-T המכוונים לרקמות הגידול באופן סלקטיבי. תכנון CAR-T רגיש להיפוקסיה הוא אסטרטגיה אטרקטיבית בכיוון זה, עם מספר גישות שנבחנות, כולל זו שהוצגה במחקר זה - מיזוג ה- CAR moiety עם תחום חלבון ה- ODD המתרחש באופן טבעי עם חישת היפוקסיה. גישה חלופית כוללת החלפת מקדם מכונן המשמש בדרך כלל להנעת ביטוי CAR באלמנט תגובת היפוקס...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2016YFC1303402), המגה-פרויקט הלאומי על מחלות זיהומיות מרכזיות (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007), והתוכנית הכללית של ועדת הבריאות העירונית של שנחאי (201740194).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל | QSP | 509-GRD-Q | Supernatants ותאים cellection פרוטוקול שלב 2,3,4 |
| 10% ExpressCast PAGE | NCM biotech | P2012 | Immunoblotting פרוטוקול שלב 3 |
| 10x PBS | NCM ביוטק | 20220812 | תרבית תאים פרוטוקול שלב 4 |
| 10 מ"ל פיפטה | Yueyibio | YB-25H | צנרת פרוטוקול שלב 1 |
| 10xTRIS-Glycine-SDS מאגר אלקטרופורזה | אפיזים | 3673020 | פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 |
| צינור צנטריפוגה 15 מ"ל | Thermo Scientific | 339650 | Supernatants and cells cellection פרוטוקול שלב 1 |
| 25 ס"מ2 פרוטוקול EasYFlask | Thermo Scientific | 156367 | תרבית תאים שלב 3,4 |
| 4x חלבון SDS PAGE טעינת מאגר | Takara | 9173 | פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 |
| צלחות תרבית רקמות עם תחתית שטוחה 6 בארות | Thermo Scientific | 140675 | T Culture פרוטוקול שלב 1 |
| 96 בארות צלחות תרבית רקמה שחורות עם תחתית שטוחה | Greiner | 655090 | בדיקת ציטוטוקסיות פרוטוקול שלב 4 |
| צלחות ELISA 96 בארות | קורנינג | 3590 | פרוטוקול ELISA שלב 5 |
| שייקר צלחות 96 בארות | QILINBEIER | MH-2 | Shake פרוטוקול שלב 4 |
| 96 בארות צלחות תרבית רקמות תחתונות U | Thermo Scientific | 268200 | Supernatants cellection פרוטוקול שלב 4,5 |
| נוגדן נגד FLAG | Sigma | F1804-50UG | פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 |
| קרבינול | פרוטוקול Sinopharm | 10010061 | Immunoblotting שלב 3 |
| חממת פחמן דו חמצני | Thermo Scientific | 360 | תרבית תאים פרוטוקול שלב 1,2,3,4 |
| צלחת ספירת תאים | Hausser scientific | 1492 | פרוטוקול ספירת תאים שלב 1,3,4 |
| ערכת IgG של עכבר CELLection Pan Mouse Thermo | Scientific | 11531D | עכבר IgG חרוזים מגנטיים פרוטוקול שלב 1 |
| צנטריפוגה | תרמו מדעית | 75002432 | תרבית תאים פרוטוקול שלב 1,3,4 |
| מערכת הדמיית ג'ל כימילומינסנציה | BIO-RAD | 12003154 | Immunoblotting פרוטוקול שלב 3 |
| תמיסת קובלט כלוריד (0.5 M) | bioleaper | BR4000203 | מצב היפוקסי פרוטוקול שלב 2,3,4 |
| DMEM | Corning | 10-103- | CV פרוטוקול תרבית תאים שלב 4 |
| איזון אלקטרוני | Sartorius | PRACTUM612-1CN | משקל פרוטוקול שלב 5 פרוטוקול |
| FBS | BI | 04-001-1ACS | תרבית תאים שלב 3,4 |
| עכבר GAPDH mAb | ABclonal | AC002 | פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 |
| מכשיר אלקטרופורזה ג'ל | BIO-RAD | 1645070 | פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 |
| קוראי מיקרופלייט GloMax | Promega | GM3000 | פרוטוקול שלב 4 פרוטוקול |
| עיזים נגד עכבר IgG (H+L) | פרוטוקול Yeasen | P1126151 | Immunoblotting שלב 3 |
| צנטריפוגה מיקרו-הקפאה במהירות גבוהה | eppendorf | 5810 | פרוטוקול תרבית תאי R שלב 1 |
| IFN-&גמא אנושי; ELISA Set | BD | 555142 | פרוטוקול ELISA שלב 5 פריטים: IFN-&gamma אנושי רקומביננטי; תקן ליופיליזציה, זיהוי נוגדנים ביוטין אנטי אנושי IFN-וגמא; לכידת נוגדנים מטוהרים אנטי אנושיים IFN-&גמא;, מגיב אנזים סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז מצומד (SAv-HRP) |
| אנושי IL-2 ELISA סט | BD | 555190 | ELISA פרוטוקול שלב 5 פריטים: תקן ליופיליזציה אנושי רקומביננטי IL-2, זיהוי נוגדנים ביוטין אנטי אנושי IL-2, לכידת נוגדנים מטוהרים אנטי-אנושיים IL-2, מגיב אנזים סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז מצומד (SAv-HRP) |
| IL-15 | מו"פ D systems | P40933 | פרוטוקול תרבית תאי T שלב 1 |
| IL-21 | נובופרוטאין | GMP-CC45 | פרוטוקול תאי T תרבית שלב 1 |
| IL-7 | מו"פ מערכות D | P13232 | תאי T תרבית פרוטוקול שלב 1 |
| מיקרוסקופ הפוך | פרוטוקול תרבית תאים אולימפוס | CKX41 | תרבית תאים פרוטוקול שלב 1,3,4 |
| פרוטוקול Jurkat | ATCC | TIB-152 | CAR-Jurkat construction שלב 3 פרוטוקול |
| LSRFortessa | LSRFortessa | Flow Cytometry שלב 2 | |
| מערכת | בדיקת לוציפראזPromega | E1501 | לוציפראז מדווח בדיקה פרוטוקול שלב 4 פריטים: מאגר ליזה פסיבי, מצע לוציפראז גחלילית |
| קורא מיקרופלייט | BioTek | HTX | ELISA פרוטוקול שלב 5 |
| נייד CO2/O2/N2 תא חממה | סין מכשיר חדשנות ושות', בע"מ. | Smartor118 | מצב היפוקסי פרוטוקול שלב 2, 3, 4 |
| עכבר אנטי-הקסה היסטידין תג | סיגמא | SAB2702218 | פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 |
| NcmBlot מאגר העברה מהירה | NCM ביוטק | WB4600 | Immunoblotting |
| NcmECL Ultra | NCM ביוטק | P10300 | פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 פריטים: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A), NcmECL מגיב מי חמצן אולטרה מיוצב (B) |
| צלחות שטוחות 48 בארות מצופות NovoNectin | Novoprotein | GMP-CH38 | תאי CAR-T בנייה פרוטוקול שלב 1 |
| סט טבליות OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) | Sigma | P9187 | מגיב מצע פרוטוקול שלב 5 פריטים: טבלית OPD (רדיד כסף), טבלית מי חמצן אוריאה (רדיד זהב) |
| מצומד PE אנטי-DYKDDDDK | Biolegend | 637310 | פרוטוקול זרימה ציטומטריה שלב 2 |
| פרוטאמין סולפט | Sigma | P3369-1OG | פרוטוקול זיהום לנטי-וירוס שלב 1 |
| סמן חלבון 10 KDA-250 KDa | Epizyme | WJ102 | פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 |
| עכבר NA/LE מטוהר אנטי-אנושי CD3 | BD | 566685 | תאי T תרבית פרוטוקול שלב 1 |
| עכבר NA/LE מטוהר אנטי-אנושי CD28 | BD | 555725 | תאי T תרבית פרוטוקול שלב 1 |
| פרוטוקול קרום PVDF | Millipore | 168627 | Immunoblotting שלב 3 פרוטוקול |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVRC | תרבית תאים שלב 3 |
| אבקת חלב רזה | Yeasen | S9129060 | פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 פרוטוקול |
| SKOV3-Luc | ATCC | HTB-77 | בדיקת ציטוטוקסיות שלב 4 פרוטוקול |
| Trypsin-EDTA | NCM biotech | C125C1 | תרבית תאים שלב 4 פרוטוקול |
| 30189328 | סינופארם | Immunoblotting שלב 3 | |
| אמבט מים | keelrein | NB014467 | פרוטוקול חימום שלב 1 |
| X-VIVO 15 | LONZA | 04-418Q | תרבית לימפוציטים ללא סרום בינוני פרוטוקול שלב 1 |
מקורות
- Boardman, A. P., Salles, G. CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma. Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).
- Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. CAR-T: What is next. Cancers. 15 (3), 663(2023).
- Barsan, V., et al. Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns. eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).
- Liu, Y., et al. Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy. Front Oncol. 12, 1037934(2022).
- Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response. Front Immunol. 12, 748768(2021).
- Li, N., et al. Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway. Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).
- Derenzo, C., Gottschalk, S. Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors. Front Immunol. 10, 218(2019).
- Fu, R., et al. Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors. Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).
- Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors. Cells. 11 (22), 3626(2022).
- Liu, Z., et al. Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy. Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).
- Luo, Z., et al. Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).
- Martinez, M., Moon, E. K. CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment. Front Immunol. 10, 128(2019).
- Zhang, X., et al. The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma. Front Immunol. 13, 1003651(2022).
- Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets. J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).
- Wu, Y., et al. Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety. APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).
- Al-Haideri, M., et al. cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment. Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).
- Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
- Neelapu, S. S., et al. Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities. Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).
- Mi, J., Ye, Q., Min, Y. Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors. Front Immunol. 13, 849759(2022).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
- Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity. Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).
- Dana, H., et al. CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors. Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).
- Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment. Front Oncol. 10, 1362(2020).
- Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management. Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).
- Flugel, C. L., et al. Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours. Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).
- Rababah, F., et al. Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors. Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).
- Masoud, G. N., Li, W. Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).
- Semenza, G. L. Targeting hif-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).
- Harris, A. L. Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
- Juillerat, A., et al. An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell. Sci Rep. 7, 39833(2017).
- Liao, Q., et al. Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing. Biomark Res. 8 (1), 56(2020).
- Ivan, M., et al. Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing. Science. 292 (5516), 464-468 (2001).
- Wang, G. L., Semenza, G. L. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).
- D'alonzo, R. A., et al. In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review. Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).
- He, H., et al. Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy. J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).
- Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells. Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel. Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
