ייצור ואימות תפקודי של תאי קולטן אנטיגן כימרי רגישים להיפוקסיה

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור ואימות פונקציונלי של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T רגישים להיפוקסיה. פרוטוקול זה מציג את הדור מבוסס הלנטיוירוס של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה ואת אפיונם, כולל אימות של ביטוי CAR תלוי היפוקסיה וציטוטוקסיות סלקטיבית.

Abstract

מחקרים מקיפים הוכיחו את ההבטחה של טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR-T) בטיפול בממאירויות המטולוגיות. עם זאת, הטיפול בגידולים מוצקים נותר מאתגר, כפי שמודגם על ידי חששות הבטיחות המתעוררים כאשר תאי CAR-T תוקפים תאים נורמליים המבטאים את אנטיגני המטרה. חוקרים בחנו גישות שונות לשיפור הסלקטיביות של הגידול בטיפול בתאי CAR-T. אסטרטגיה מייצגת אחת לאורך קו זה היא בניית תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה, אשר מתוכננים על ידי היתוך תחום פירוק תלוי חמצן למויטי CAR ומתוכננים להשיג ביטוי CAR גבוה רק בסביבה היפוקסית - מיקרו-סביבה גידולית (TME). מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת תאי CAR-T כאלה והאפיון התפקודי שלהם, כולל שיטות לניתוח השינויים בביטוי CAR וביכולת ההרג בתגובה לרמות חמצן שונות שנקבעו על ידי תא אינקובטור נייד. תאי ה-CAR-T שנבנו צפויים להדגים ביטוי CAR וציטוטוקסיות באופן רגיש לחמצן, ובכך לתמוך ביכולתם להבחין בין TME היפוקסי לבין רקמות נורמליות נורמוקסיות לצורך הפעלה סלקטיבית.

Introduction

טיפול בתאי T (CAR-T) קולטן אנטיגן כימרי היווה פריצת דרך משמעותית בטיפול בסרטן. מאז שמנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) אישר את הטיפול הראשון ב-CAR-T לטיפול בלימפומה מתקדמת/עמידה ובלוקמיה לימפובלסטית חריפה בשנת 2017, ^1,2,3, 10 טיפולי CAR-T המכוונים ל-CD19 או אנטיגן להבשלת תאי B (BCMA) קיבלו אישור ברחבי העולם⁴. עם זאת, למרות מחקר מקיף, שחזור היעילות יוצאת הדופן של טיפול CAR-T בטיפול בממאירויות המטולוגיות נותר מאתגר עבור היישום שלו על גידולים מוצקים 5,6,7,8.

מיקרו-סביבה של גידול מדכא חיסון (TME) היא התורמת העיקרית ליעילות הירודה של CAR-T בסביבת הגידול המוצק. TME מעכב את פעילותם והישרדותם של תאי CAR-T עקב מחסור בחומרים מזינים, היפוקסיה, pH חומצי והצטברות פסולת מטבולית 9,10,11,12. עוינות נוספת מגיעה מחדירת תאים מדכאי חיסון כגון תאי T רגולטוריים (Tregs), תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים (MDSCs) ומקרופאגים הקשורים לגידול (TAM), אשר, לצד תאי הגידול, מפרישים ציטוקינים מדכאי חיסון הגורמים לעיכוב נוסף של תאי CAR-T ברגע שהם נכנסים לגידול^13,14.

מלבד היעילות הטיפולית הבלתי מספקת, בעיות בטיחות הן עקב אכילס נוסף של תאי CAR-T בהתמודדות עם גידולים מוצקים^15,16. החשש הבטיחותי נובע מכך שאף אחד מהאנטיגנים הספציפיים לגידול (TSA) שזוהו עד כה אינו מוגבל אך ורק לתאי הגידול. במילים אחרות, האנטיגנים הקשורים לגידול (TAA) שנבחרו כמטרה של CAR, למרות שהם מראים ביטוי גבוה יותר בתאי הגידול, מבוטאים לעתים קרובות גם על ידי רקמות נורמליות¹⁷. לכן, השפעות מחוץ לגידול עלולות להתרחש כתוצאה מהפעלה בלתי צפויה של תאי CAR-T על זיהוי יעיל של רקמות נורמליות, מה שמוביל לתסמונת שחרור ציטוקינים (CRS), תסמונת אנצפלופתיה הקשורה ל-CAR-T (CRES)¹⁸, ותוצאות שליליות אחרות¹⁹.

אסטרטגיות רבות נחקרו כדי למנוע השפעות כאלה, כולל הפחתת הזיקה של CAR כדי לאפשר לתאי CAR-T להבחין בין תאי גידול לתאים נורמליים בהתבסס על רמות הביטוי של TAA הממוקד; צייד תאי CAR-T במתג כיבוי, כגון גן התאבדות או סמן חיסול כדי לקדם את חיסולם בעת הפעלה בלתי צפויה; חלוקת אותות CD3ζ ואותות קו-סטימולטוריים לשני תאי CAR, שהפעלתם הסימולטנית נדרשת כתוצאה מכך להפעלה יעילה של תאי CAR-T; שימוש במעגל סינתטי מבוסס Notch (synNotch) המגביל את פעילותם של תאי CAR-T לתאי מטרה המבטאים יחד שני TAA שונים; והנדסת תאי CAR-T להשגת רגישות TME על ידי יישום מנגנון לכוונון ביטוי CAR לרמזים סביבתיים משתנים 20,21,22,23,24,25,26.

שיקול מרכזי באפשרות רגישות TME שתוארה לעיל הוא רמת החמצן הנמוכה ב- TME עקב ההתרבות המהירה של תאי הגידול. התאמתם של תאי הגידול להיפוקסיה תלויה בהפעלת גורם היפוקסיה-אינדוקציה-1 (HIF-1), גורם שעתוק הטרודימרי המורכב מתת-יחידה אינדוקטיבית, HIF-1α, ותת-יחידה המבוטאת באופן קונסטיטוטיבי, HIF-1β²⁷. בתנאים נורמוקסיים, חלבון HIF-1α עובר יוביקוויטינציה ופירוק פרוטאזומלי מהיר, תלוי בתחום הפירוק תלוי החמצן שלו (ODD)²⁸. כאשר אספקת החמצן התאית מוגבלת, HIF-1 מתייצב ומפעיל את השעתוק של גני המטרה במורד הזרם שלו על ידי קשירה לאלמנטים של תגובת היפוקסיה (HREs)²⁹. בהתחשב באופי של ODD ו- HRE כאלמנטים רגישים לחמצן, הם נחקרו כדי לממש את הביטוי המותנה של מכוניות בתוך TME³⁰ היפוקסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתמקד בשיטות לאפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה, ולפניו תיאור קצר של תכנון CAR והליכי ההכנה של תאים אלה. פרוטוקול זה מתכוון לספק קו מנחה שימושי לניצול CAR מגיב להיפוקסיה ליצירת תאי CAR-T עם רעילות מחוץ לגידול.

Protocol

במחקר זה, HER2-BBz-ODD, מכונית רגישה להיפוקסיה המכוונת ל- HER2 (מזהה גן: 2064) הושוותה למקבילתה הרגילה, HER2-BBz. השרטוטים של שתי המכוניות מודגמות באיור 1A, אשר מראה כי HER2-BBz-ODD נגזר מ-HER2-BBz על-ידי הוספת רצף ה-ODD למסוף C של CD3ξ. בניית וקטורים לנטי-ויראליים המבטאים את שני ה-CARs ויצירת הלנטיוירוס המתאים על ידי טרנספקציית תאים 293T תוארה בעבר³¹.

1. יצירת תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה על ידי זיהום לנטיויראלי

1. הפשירו תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) בהקפאה במהירות של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. העבירו את מרכזיות ההפשרה לצינור של 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום תרבית לימפוציטים ללא סרום בתוספת 400 IU של IL-2, 5 ng/mL IL-7 ו-10 ng/mL IL-15 (מדיום גידול תאי T אנושיים, המכונה TGM לאחר מכן).
2. לאחר נטילת aliquot לספירת תאים, צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות. השהה מחדש את ה- PBMCs הכדוריים עם TGM בצפיפות של 4 × 10⁶ תאים / מ"ל והעבר את המתלה לצלחת 6 בארות.
3. הכינו חרוזים חיסוניים מצופים נגד hCD3/hCD28.
   1. העבר 100 μL של חרוזים מגנטיים מסוג IgG עכבר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ושטוף אותם פעמיים באמצעות מעמד מגנטי עם PBS.
   2. השהה מחדש את החרוזים ב 100 μL של PBS והוסף 0.2 מיקרוגרם של נוגדן CD3 אנטי אנושי עכבר ו 2 מיקרוגרם של נוגדן CD28 אנטי אנושי עכבר. מערבבים בעדינות את התערובת באמצעות פיפטה וסלע למשך הלילה בחום של 4°C.
   3. שטפו את החרוזים פעמיים באמצעות מעמד מגנטי עם PBS והשהו אותם מחדש ב-100 מיקרוליטר של PBS.
4. הוסף חרוזים חיסוניים מצופים נגד hCD3 / hCD28 לצלחת בשלב 1.2 ביחס חרוז לתא של 1: 1. מניחים את הצלחת באינקובטור לח עם 5% CO₂ ב 37 ° C.
5. לאחר 48 שעות של דגירה, להעביר את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל לאחר ערבוב עדין של התאים עם פיפטה. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי למשך 3 דקות, ולאחר מכן העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לשפופרת חדשה של 15 מ"ל כדי להסיר את ה-immunobeads מה-PBMCs.
6. קח aliquot לספירת תאים, ולאחר מכן זרע את PBMCs ב 5 × 10⁵ תאים / באר ב 300 μL של TGM לתוך צלחת שטוחה 48 באר. הוסף 200 μL של מלאי lentiviral לתוך הבארות המתאימות ולהוסיף פרוטאמין סולפט לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
7. צנטריפוגו את הצלחת ב-1,000 × גרם ב-32°C למשך שעה וחצי והוציאו בזהירות 300 מיקרוליטר של סופרנאטנט מכל באר באמצעות פיפטה. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של TGM טרי באמצעות פיפטה ומניחים את הצלחת באינקובטור לח עם 5% CO₂ ב 37 ° C.
8. הוסף TGM טרי כדי להתאים את צפיפות התאים ל- 0.5-2 × 10⁶ תאים/מ"ל כל 2-3 ימים. התחל בהעברת תאים תחילה לצלחת של 12 בארות ולאחר מכן לצלחת של 6 בארות. המשך בתרבית התאים עד שהמספר הכולל מגיע ל 6 × 10⁶ בנפח 4 מ"ל.
   הערה: במקביל, בצע את התמרה CAR של תאי Jurkat T בעקבות אותם הליכים שתוארו לעיל, אלא TGM מוחלף בתווך RPMI1640 המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS).

2. הערכת ביטוי CAR תלוי חמצן בתאי CAR-T באמצעות ציטומטריית זרימה

1. לוחית את תאי T המומרים על ידי CAR משלב 1.8 לשני לוחות 12 בארות בצפיפות של 2.5 × 10⁶ תאים / באר ב 2 מ"ל של TGM. מניחים צלחת אחת ישירות באינקובטור לח עם 5% CO₂ ב 37 ° C (מצב נורמוקסי, כמו המצב הסטנדרטי עבור תאים תרבית יש 21% O₂) ומניחים את הצלחת השנייה בתא אינקובטור נייד CO₂ / O₂ / N₂ עם רמת O₂ קבועה מראש ב 1% (מצב היפוקסי) ולאחר מכן לשמור את החדר לח, 5% CO₂/94% N₂ אינקובטור ב 37 ° C.
2. כל 24 שעות, לאסוף 5 × 10⁵ תאים מן הצלחות בתנאים היפוקסיים או נורמוקסי לתוך 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינורות ב 500 × גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, בעדינות resuspend את התאים ב 1 מ"ל של PBS על ידי pipetting. חזור על שטיפת PBS פעם נוספת.
3. השהה מחדש את התאים הכדוריים ב-50 μL של חיץ FACS (PBS בתוספת 2% FBS) בכל צינור. הוסף 50 μL של דילול 1:100 של נוגדן אנטי-פלאג מצומד PE (0.2 מיקרוגרם / מ"ל) וערבב היטב על ידי pipetting. דוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
4. בסוף הדגירה, הוסף 1 מ"ל של חיץ FACS לכל צינור. מערבבים היטב על ידי pipetting, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות.
5. מוציאים בזהירות ומשליכים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה וחוזרים על שלב 2.4 פעם נוספת.
6. מוציאים בזהירות ומשליכים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה. להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של מאגר FACS, ולאחר מכן להעביר את תרחיף התא שנוצר לתוך צינורות זרימה 5 מ"ל.
7. בצע ציטומטריית זרימה על מתלה התא בשלב 2.6 כדי לקבוע את ביטוי CAR פני השטח. כלול תאי T שאינם נגועים כבקרה שלילית.
   1. השתמש בשערי FSC/SSC ו- FSC-A/FSC-H כדי לסנן תאים בודדים חיים. אסוף 1 × 10⁴ אירועים בודדים חיים עבור כל דגימה. שער התאים חיוביים עבור EGFP (סמן מכונן הנישא בווקטור הלנטי-ויראלי כאינדיקטור לתאי T שהותמרו בהצלחה) ולאחר מכן, התאים חיוביים עבור פיקואריתרין (PE) (תאים המבטאים CAR) כדי למדוד את חיוביות PE ואת עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI).

3. ניתוח תלות בחמצן של ביטוי CAR בתאי Jurkat T מהונדסים על ידי כתם מערבי

1. לוחית את תאי Jurkat T המומרים על ידי CAR מקטע 1 בשני לוחות 48 בארות בצפיפות של 5 × 10⁵ תאים לכל באר (נפח תרבית 500 μL) בתווך RPMI1640 עם 10% FBS.
2. עבור צלחת אחת, הוסף CoCl₂ לבארות הניסוי לריכוז סופי של 0 μM, 50 μM, או 200 μM. לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C (מצב נורמוקסי). עבור הצלחת השנייה, אין להוסיף CoCl₂ ולמקם אותו בתא אינקובטור נייד CO₂/O₂/N₂ עם רמת O₂ מוגדרת מראש של 1% (מצב היפוקסי) לפני העברתו לאותו אינקובטור.
3. לאחר 24 שעות של דגירה, להעביר את מתלי התא לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את הצינורות ב 500 × גרם במשך 5 דקות. הסר לחלוטין והשלך את הסופרנאטנטים תחילה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, לאחר מכן פיפטה של 100 מיקרוליטר, והשהה מחדש את כדורי התא ב -50 מיקרוליטר של מאגר דגימה 1x SDS-PAGE.
4. מחממים את הדגימות באמבט מים רותחים למשך 10 דקות. הניחו מיד את הצינור על קרח למשך 30 שניות, ואז צנטריפוגה בעוצמה של 16,000 × גרם למשך 30 שניות.
5. טען 30 μL של הדגימות שנוקו לתוך כל חריץ של ג'ל 10-well, 10% SDS PAGE בעובי של 1.5 מ"מ. הפעל את הג'ל ב 80 V במשך 30 דקות, ולאחר מכן להגדיל את המתח ל 100 V ולרוץ 1.5 שעות.
6. בסוף האלקטרופורזה, מעבירים חלבונים מהג'ל לקרום PVDF בשיטת העברה רטובה סטנדרטית, כאשר הזרם ומשך הזמן נקבעים על 400 mA ו 1 שעות, בהתאמה.
7. חסום את הממברנה בחיץ חוסם (5% חלב (w/v) ב-PBST (PBS+0.05% Tween-20)) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חתכו את החתיכה בין 30 kD ל 40 kD לזיהוי בקרת הטעינה GAPDH ואת החתיכה בין 50 kD ל 70k D לזיהוי מולקולות CAR.
8. דגרו על חתיכות 30-40 kD ו- 50-70 kD עם נוגדן עכבר נגד GAPDH (דילול 1:2,000) ונוגדן נגד דגל עכבר (דילול 1:2,000), בהתאמה, ב- 3 מ"ל של חיץ חוסם בטמפרטורת החדר למשך שעתיים או ב- 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
9. שטפו את הממברנות עם PBST בטמפרטורת החדר על נדנדת פלטפורמה במשך 3X5 דקות.
10. לדגור על הממברנות עם נוגדן נגד עכבר עז מצומד HRP (דילול 1:5,000) ב-3 מ"ל של חיץ חוסם בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת; לאחר מכן לשטוף את הממברנה עם PBST במשך 5 x 10 דקות.
11. פתח את הממברנות באמצעות דגירה שלהן עם מצע HRP, ולאחר מכן דמיין את רצועות החלבונים שזוהו באמצעות מנתח תמונה זוהר.

4. הערכה חוץ גופית של התלות בחמצן של ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה

1. ביום 0, זרע 1 × 10⁴ תאי מטרה (תאי SKOV3-Luc) לכל באר ניסיונית ב 200 μL של DMEM המכיל 10% FBS בשני לוחות תרבית רקמה שחורים שטוחים 96 באר.
2. ביום הראשון, הסירו בזהירות 100 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מהחלק העליון של כל באר. הוסף תאי CAR-T או תאי T לא מותמרים ביחסי אפקט למטרה של 1:1, 2:1 ו- 4:1 ב- 100 μL של תווך DMEM המכיל 10% FBS.
3. הניחו צלחת אחת באטמוספירה של 21% O₂ ואת השנייה באטמוספירה של 1% O₂ באמצעות תא אינקובטור נייד CO₂/O₂/N₂ , כמתואר בשלב 2.1.
   הערה: אם תא אינקובטור נייד CO₂/O₂/N₂ אינו זמין, ניתן להשתמש בהוספת CoCl₂ למדיום התרבית כדי לחקות מצב היפוקסי.
4. ביום השני, לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, העבירו בזהירות את כל הסופרנאטנט (בערך 150-200 מיקרוליטר) לצלחת U חדשה בעלת 96 בארות באמצעות פיפטה. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C לזיהוי ציטוקינים מאוחר יותר, בהתאם להליכים המתוארים בסעיף 5.
5. הוסף 60 μL של חיץ ליזה פסיבי 1x לכל באר ניסיונית של לוחות 96 בארות שחורות שטוחות מדרגה 4.4. לאחר מכן, הניחו את הצלחות על שייקר ונערו במשך 30 דקות כדי להבטיח ליזה תאית יעילה.
6. הוסף 60 μL של מצע לוציפראז גחלילית לכל באר ניסוי, ולמדוד את פעילות לוציפראז באופן מיידי באמצעות קורא microplate.
7. חישוב ציטוטוקסיות מנורמלת (%) באמצעות משוואה (1):
   ציטוטוקסיות מנורמלת (%) = 100 - ×100 (1)

5. איתור הפרשת IL-2 ו-IFN-γ על ידי תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה

1. ביום 0, הכינו דילול של 1:250 של נוגדנים IL-2 או IFN-γ במאגר הציפוי. הוסף 100 μL של נוגדן מדולל לכל באר של צלחת ELISA 96 באר לדגור את הצלחת ב 4 ° C במשך הלילה.
   הערה: חיץ הציפוי מיוצר על ידי המסת 7.13 גרם של NaHCO₃ ו-1.59 גרם של Na₂CO₃ ב-1 ליטר מים מזוקקים והתאמת ה-pH ל-9.5.
2. ביום הראשון, הסר את נוגדן הלכידה שלא נספג על ידי היפוך נמרץ של הצלחת, ולאחר מכן שטוף את הבארות 3x עם 200 μL של Wash Buffer (PBS המכיל 0.05% Tween 20).
3. מוסיפים 200 μL של מדלל Assay (PBS המכיל 10% FBS) לכל באר ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
4. השליכו את התמיסה על ידי היפוך נמרץ של הצלחת; לאחר מכן, לשטוף את הבארות 3x עם 200 μL של Wash Buffer.
5. הפשירו את הדגימות/צלחת הסופרנאטנט הקפואה משלב 4.4 בטמפרטורת החדר. לאחר הפשרה מלאה, לדלל את הדגימות ואת התקנים עם Assay Diluent. הוסף 100 μL של דגימות מדוללות או תקנים לכל באר של צלחת ELISA המצופה ודגר בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.
   הערה: עבור זיהוי IL-2, מומלץ דילול פי 10, ואילו עבור זיהוי IFN-γ, עדיף דילול פי 50.
6. הסר את הדגימות ואת התקנים על ידי הפיכת הצלחת נמרצת הפוך, ולאחר מכן לשטוף את הבארות 5x עם 200 μL של חיץ כביסה לכל באר.
7. הכן פתרון זיהוי עובד על-ידי דילול נוגדן הזיהוי IL-2 או נוגדן זיהוי IFN-γ/Streptavidin-HRP (SAv-HRP) ביחס של 1:250 במדלל בדיקה. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת גילוי העבודה לכל באר ודגרו על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם ניעור עדין.
8. השליכו את התמיסה ושטפו את הבארות 7x עם 200 μL של Wash Buffer.
9. מוסיפים 100 μL של מגיב מצע לכל באר ודגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
10. הוסף 50 μL של תמיסת עצירה (1 M H₂SO₄) לכל באר. קרא מיד את הספיגה ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplate.

Results

מיזוג תחום ה-ODD של HIF-1α ל-CAR moiety מייצג אסטרטגיה ראשונית ליצירת CAR רגיש להיפוקסיה. המכונית הממוקדת ב-HER2 הרגישה להיפוקסיה שנותחה במחקר זה, בשם HER2-BBz-ODD, נבנתה באמצעות אסטרטגיה זו על-ידי שילוב רצף ה-ODD ב-HER2-BBz הקונבנציונלי שלה (איור 1A). במחקר זה השתמשנו בהתמרה לנטיויראלית כדי לבטא HER2-BBz-ODD CAR או HER2-BBz CAR, ולאחר מכן בחנו את רגישותם לחמצן בשני סוגי תאים: PBMCs אנושיים ותאי Jurkat T.

הבדיקה הראשונה היא ביטוי של CAR בתנאים היפוקסיים לעומת תנאים נורמוקסיים, שבוצעה הן בתאי T שמקורם ב-PBMC על ידי ציטומטריית זרימה והן בתאי Jurkat T מותמרים על ידי כתם מערבי. בהגדרה של תאי T שמקורם ב-PBMC שעבר התמרת CAR, ראינו של-HER2-BBz-ODD CAR היה ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי מתחת ל-1% O₂ מאשר מתחת ל-21% O₂ הן מבחינת אחוז התאים החיוביים ל-CAR והן מבחינת עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) (איור 1B). ניתוח immunoblotting של תאי Jurkat T מומרים CAR גם אישר את השראת תלוי היפוקסיה של HER2-BBz-ODD.

ראוי לציין כי בהקשר זה, ניתן לחקות בנוחות את המצב ההיפוקסי על ידי הוספת CoCl₂, גורם כימי להיפוקסיה, למדיום התרבית. כפי שמודגם באיור 1C, תוצאות האימונובלוטציה שלנו הראו כי חשיפה ל-50 או 200 מיקרומטר CoCl₂ שחזרה את השפעת החשיפה ל-1% O₂, מה שגרם באופן משמעותי לביטוי של מכונית HER2-BBz-ODD אך לא של מכונית HER2-BBz. האפיון הפונקציונלי של CAR רגיש להיפוקסיה בוצע עם תאי CAR-T שמקורם ב-PBMC. במחקר, קו תאי SKOV-3 הנושא גחלילית לוציפראז שימש כקו תאי המטרה. מערך זה אפשר לנו למדוד את פעילות הלוציפראז הקשורה לתאי המטרה כפרוקסי להערכת ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי CAR-T בתרבית משותפת.

כפי שניתן לראות באיור 1D, המדידות הצביעו על כך שתאי CAR-T מסוג HER2-BBz הורגים ביעילות תאי מטרה, ללא קשר לשאלה אם האטמוספירה הייתה נורמוקסית או היפוקסית. לעומת זאת, תאי CAR-T מסוג HER2-BBz-ODD הציגו ציטוטוקסיות חלשה משמעותית בתנאים נורמוקסיים עבור כל שלושת יחסי ה-E:T שנבדקו. עם זאת, ציטוטוקסיות שלהם השתפרה באופן משמעותי כאשר נחשפו לתנאים היפוקסיים. רמות העל-נאטנט של IL-2 ו-IFN-γ נמדדו גם הן על ידי ELISA לאחר תרבית משותפת של תאי CAR-T עם תאי מטרה במשך 24 שעות. עבור שני הציטוקינים, הפרשה גבוהה יותר מתחת ל-1% O₂ בהשוואה ל-21% O₂ נצפתה עבור תאי CAR-T מסוג HER2-BBz-ODD, אשר עולה בקנה אחד עם נתוני ציטוטוקסיות. לעומת זאת, תאי CAR-T מסוג HER2-BBz הראו הפרשה נמוכה יותר של שני הציטוקינים מתחת ל-1% O₂ בהשוואה ל-21% O₂, מה שמצביע על השפעה שלילית של היפוקסיה על הפעילות התאית (איור 1E). יחד, תוצאות אלה אישרו באופן משכנע את האופי הרגיש להיפוקסיה של מכונית HER2-BBz-ODD.

איור 1: בנייה ואפיון של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה. (A) ייצוג סכמטי של עיצובים של מכונית רגישה להיפוקסיה, HER2-BBz-ODD, ומקבילתה הקונבנציונלית, HER2-BBz. שתי המכוניות מורכבות מפפטיד אות CD8α N-terminal, תג FLAG, scFv ממוקד HER2 אנושי, ציר CD8 ותחום טרנסממברנה, וחלק תוך תאי המורכב מתחום קוסטימולטורי מ-4-1BB, תחום איתות CD3ξ, IRES ו-EGFP. HER2-BBz-ODD שונה מ- HER2-BBz בהיתוך של תחום ODD למסוף C של תחום האיתות CD3ξ, ומאפשר ביטוי תלוי היפוקסי שלו על ידי קידום השפלה תלוית יוביקוויטין בתנאים נורמוקסיים. (ב,ג) הערכות של ביטוי תלוי חמצן של מכונית HER2-BBz-ODD. (B) הערכה אחת בוצעה עם תאי CAR-T אנושיים שמקורם ב-PBMC לאחר תרבית מתחת ל-1% או 21% O₂ במשך 24, 48 או 72 שעות באמצעות ציטומטריית זרימה. (C) ההערכה השנייה הייתה עם תאי Jurkat T מותמרים של CAR, שבהם ליזטים של תאים נקצרו 24 שעות לאחר תרבית מתחת ל-21% O₂, 50 או 200 μM CoCl₂, או 1% O₂ ונותחו עבור ביטוי CAR באמצעות כתם מערבי, כאשר תאים מומרים HER2-BBz CAR נכללו כבקרה. (ד,ה) ציטוטוקסיות במבחנה והפרשת ציטוקינים של תאי CAR-T בתנאי חמצן שונים. (D) תאי CAR-T גודלו בתרבית משותפת עם תאי SKOV3 המבטאים גחליליות לוציפראז ביחס E:T מצוין מתחת ל-1% או 21% O₂. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, יעילות הריגת תאי המטרה נקבעה על ידי מדידת השינוי בפעילות לוציפראז של גחליליות הקשורות לתאים ביחס לזו של תאי T שאינם מותמרים. (E) הסופרנאטנטים נאספו לגילוי IL-2 ו-IFN-γ מופרשים. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM (n = 3 תורמים בריאים) (****p < 0.0001). קיצורים: scFv = משתנה מקטע שרשרת יחיד; CAR = קולטן אנטיגן כימרי. לוחות C ו-D לקוחים מ-Liao et ^al.31. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

חששות בטיחות הם נושאים משמעותיים שיש לטפל בהם כדי שכל טיפול בתאי CAR-T יתקדם לשימוש קליני. ניצול התכונות הייחודיות של תאי הגידול או TME הפך לכיוון מחקר עיקרי המתמקד בפיתוח תאי CAR-T המכוונים לרקמות הגידול באופן סלקטיבי. תכנון CAR-T רגיש להיפוקסיה הוא אסטרטגיה אטרקטיבית בכיוון זה, עם מספר גישות שנבחנות, כולל זו שהוצגה במחקר זה - מיזוג ה- CAR moiety עם תחום חלבון ה- ODD המתרחש באופן טבעי עם חישת היפוקסיה. גישה חלופית כוללת החלפת מקדם מכונן המשמש בדרך כלל להנעת ביטוי CAR באלמנט תגובת היפוקסיה (HRE), אשר הראה הבטחה במחקרים קודמים. הוא האמין כי שילוב אלמנטים HRE ו ODD (סוג פראי או גרסאות הנדסיות המציעות שליטה הדוקה יותר של ביטוי) מייצג עיצוב אופטימלי עבור מכונית המושרה היפוקסיה.

פרוטוקול זה מתאר הליכים ניסיוניים ליצירה ואימות של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה. יישום פרוטוקול זה כרוך במספר שיקולים מרכזיים. שיקול עיקרי הוא יצירת תנאים היפוקסיים. בין שתי הגישות, התוספת של CoCl₂ למדיום התרבית הייתה נפוצה במחקרים קודמים הקשורים להיפוקסיה, בעיקר הודות לנוחות שלה^32,33. עם זאת, אי אפשר למדוד את מידת ההיפוקסיה המחקה על ידי גישה זו. לעומת זאת, שימוש בתא דגירה נייד CO₂/O₂/N₂ הוא יתרון בכך שניתן להגדיר במדויק את רמות O₂ ולכן מתאים לניתוח עדין של רגישות להיפוקסיה של תאי CAR-T. מבחינה זו, רמת ההיפוקסיה בתוך גידולים משתנה בין סוגים שונים של גידולים מוצקים ותקופות שונות של התקדמות הגידול³⁴, כאשר רק 1% O₂ מודגם בפרוטוקול. זהו תרגול אופטימלי עבור החוקרים להתאים את רמת החמצן בהתאם לביקוש בפועל. אם שיטת CoCl₂ היא הגישה היחידה הזמינה, אנו ממליצים לכלול טווח של ריכוזי CoCl₂ בבדיקה כדי לדמות רמות חמצן שונות.

בחירת שיטה מתאימה לבחינת ביטוי CAR תלוי היפוקסיה היא שיקול מרכזי נוסף. בעוד שניתוח אימונובלוטינג של תאי Jurkat T מומרים על ידי CAR הוא אפשרות נוחה במהלך אופטימיזציה של מבנה CAR, ניתוח ההשפעה של רמות חמצן על פני השטח ביטוי CAR ב- PBMCs אנושיים מותמרים על ידי ציטומטריית זרימה משמש כאימות האולטימטיבי. אופטימלי לבחון את הדינמיקה של ביטוי CAR בתגובה למעבר מתנאים היפוקסיים לנורמוקסיים, כפי שעשינו בעבר עם גרסה משופרת של CAR רגישה להיפוקסיה, כלומר HiTA-CAR³⁵. זה ידגים עוד יותר ביטוי CAR מוגבל היפוקסיה.

לאימות פונקציונלי של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה, בדיקת ציטוטוקסיות המתוארת בפרוטוקול כוללת שימוש בתאי מטרה נושאי לוציפראז גחליליות. בדיקה מבוססת כתב זו יכולה להיות מוחלפת בשיטות הערכת הרג אחרות, כגון שיטת CCK8 ושיטת ניתוח תאי בזמן אמת (RTCA), שבה ניתן להשתמש בתאי גידול שלא שונו. ניתוח RTCA הוא גם יתרון למדידת קינטיקה הרג בזמן אמת של תאי CAR-T. כדי למדוד את ציטוטוקסיות ספציפית הנגרמת על ידי תאי CAR-T, PBMCs שאינם מותמרים צריכים להיכלל כבקרה. יעילות העברה גבוהה של PBMCs רצויה כדי למנוע חששות כי הבדלים ציטוטוקסיות שזוהו בין קבוצות ניסוי וקבוצת ביקורת נובעים מהרג לא ספציפי בתיווך כמויות משתנות של תאי השפעה שנוספו.

קיימות מספר מגבלות בפרוטוקול זה. תנאים היפוקסיים יכולים להשפיע על הכדאיות של תאי מטרה ותאי T^36,37, מה שמציג את החשש כי מוות תאי שאינו קשור ציטוטוקסיות בתיווך תאי CAR-T עלול לבלבל את הפרשנות של תוצאות הבדיקה. יש לוודא שגם לתאי CAR-T וגם לתאי המטרה יש יכולת קיום מצוינת מיד לפני הבדיקה, כדי למנוע או למזער חששות כאלה. כמו כן יש לציין כי אימות חוץ גופי אינו מבטיח תרגום מוצלח in vivo. תמיד יש צורך בהערכות In vivo כדי לאשר אם מועמד CAR-T רגיש להיפוקסיה יכול להימנע מהתמקדות ברקמות נורמליות המבטאות את האנטיגן הממוקד

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל	QSP	509-GRD-Q	Supernatants ותאים cellection פרוטוקול שלב 2,3,4
10% ExpressCast PAGE	NCM biotech	P2012	Immunoblotting פרוטוקול שלב 3
10x PBS	NCM ביוטק	20220812	תרבית תאים פרוטוקול שלב 4
10 מ"ל פיפטה	Yueyibio	YB-25H	צנרת פרוטוקול שלב 1
10xTRIS-Glycine-SDS מאגר אלקטרופורזה	אפיזים	3673020	פרוטוקול Immunoblotting שלב 3
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	Thermo Scientific	339650	Supernatants and cells cellection פרוטוקול שלב 1
25 ס"מ2 פרוטוקול EasYFlask	Thermo Scientific	156367	תרבית תאים שלב 3,4
4x חלבון SDS PAGE טעינת מאגר	Takara	9173	פרוטוקול Immunoblotting שלב 3
צלחות תרבית רקמות עם תחתית שטוחה 6 בארות	Thermo Scientific	140675	T Culture פרוטוקול שלב 1
96 בארות צלחות תרבית רקמה שחורות עם תחתית שטוחה	Greiner	655090	בדיקת ציטוטוקסיות פרוטוקול שלב 4
צלחות ELISA 96 בארות	קורנינג	3590	פרוטוקול ELISA שלב 5
שייקר צלחות 96 בארות	QILINBEIER	MH-2	Shake פרוטוקול שלב 4
96 בארות צלחות תרבית רקמות תחתונות U	Thermo Scientific	268200	Supernatants cellection פרוטוקול שלב 4,5
נוגדן נגד FLAG	Sigma	F1804-50UG	פרוטוקול Immunoblotting שלב 3
קרבינול	פרוטוקול Sinopharm	10010061	Immunoblotting שלב 3
חממת פחמן דו חמצני	Thermo Scientific	360	תרבית תאים פרוטוקול שלב 1,2,3,4
צלחת ספירת תאים	Hausser scientific	1492	פרוטוקול ספירת תאים שלב 1,3,4
ערכת IgG של עכבר CELLection Pan Mouse Thermo	Scientific	11531D	עכבר IgG חרוזים מגנטיים פרוטוקול שלב 1
צנטריפוגה	תרמו מדעית	75002432	תרבית תאים פרוטוקול שלב 1,3,4
מערכת הדמיית ג'ל כימילומינסנציה	BIO-RAD	12003154	Immunoblotting פרוטוקול שלב 3
תמיסת קובלט כלוריד (0.5 M)	bioleaper	BR4000203	מצב היפוקסי פרוטוקול שלב 2,3,4
DMEM	Corning	10-103-	CV פרוטוקול תרבית תאים שלב 4
איזון אלקטרוני	Sartorius	PRACTUM612-1CN	משקל פרוטוקול שלב 5 פרוטוקול
FBS	BI	04-001-1ACS	תרבית תאים שלב 3,4
עכבר GAPDH mAb	ABclonal	AC002	פרוטוקול Immunoblotting שלב 3
מכשיר אלקטרופורזה ג'ל	BIO-RAD	1645070	פרוטוקול Immunoblotting שלב 3
קוראי מיקרופלייט GloMax	Promega	GM3000	פרוטוקול שלב 4 פרוטוקול
עיזים נגד עכבר IgG (H+L)	פרוטוקול Yeasen	P1126151	Immunoblotting שלב 3
צנטריפוגה מיקרו-הקפאה במהירות גבוהה	eppendorf	5810	פרוטוקול תרבית תאי R שלב 1
IFN-&גמא אנושי; ELISA Set	BD	555142	פרוטוקול ELISA שלב 5 פריטים: IFN-&gamma אנושי רקומביננטי; תקן ליופיליזציה, זיהוי נוגדנים ביוטין אנטי אנושי IFN-וגמא; לכידת נוגדנים מטוהרים אנטי אנושיים IFN-&גמא;, מגיב אנזים סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז מצומד (SAv-HRP)
אנושי IL-2 ELISA סט	BD	555190	ELISA פרוטוקול שלב 5 פריטים: תקן ליופיליזציה אנושי רקומביננטי IL-2, זיהוי נוגדנים ביוטין אנטי אנושי IL-2, לכידת נוגדנים מטוהרים אנטי-אנושיים IL-2, מגיב אנזים סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז מצומד (SAv-HRP)
IL-15	מו"פ D systems	P40933	פרוטוקול תרבית תאי T שלב 1
IL-21	נובופרוטאין	GMP-CC45	פרוטוקול תאי T תרבית שלב 1
IL-7	מו"פ מערכות D	P13232	תאי T תרבית פרוטוקול שלב 1
מיקרוסקופ הפוך	פרוטוקול תרבית תאים אולימפוס	CKX41	תרבית תאים פרוטוקול שלב 1,3,4
פרוטוקול Jurkat	ATCC	TIB-152	CAR-Jurkat construction שלב 3 פרוטוקול
LSRFortessa		LSRFortessa	Flow Cytometry שלב 2
מערכת	בדיקת לוציפראזPromega	E1501	לוציפראז מדווח בדיקה פרוטוקול שלב 4 פריטים: מאגר ליזה פסיבי, מצע לוציפראז גחלילית
קורא מיקרופלייט	BioTek	HTX	ELISA פרוטוקול שלב 5
נייד CO2/O2/N2 תא חממה	סין מכשיר חדשנות ושות', בע"מ.	Smartor118	מצב היפוקסי פרוטוקול שלב 2, 3, 4
עכבר אנטי-הקסה היסטידין תג	סיגמא	SAB2702218	פרוטוקול Immunoblotting שלב 3
NcmBlot מאגר העברה מהירה	NCM ביוטק	WB4600	Immunoblotting
NcmECL Ultra	NCM ביוטק	P10300	פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 פריטים: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A), NcmECL מגיב מי חמצן אולטרה מיוצב (B)
צלחות שטוחות 48 בארות מצופות NovoNectin	Novoprotein	GMP-CH38	תאי CAR-T בנייה פרוטוקול שלב 1
סט טבליות OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride)	Sigma	P9187	מגיב מצע פרוטוקול שלב 5 פריטים: טבלית OPD (רדיד כסף), טבלית מי חמצן אוריאה (רדיד זהב)
מצומד PE אנטי-DYKDDDDK	Biolegend	637310	פרוטוקול זרימה ציטומטריה שלב 2
פרוטאמין סולפט	Sigma	P3369-1OG	פרוטוקול זיהום לנטי-וירוס שלב 1
סמן חלבון 10 KDA-250 KDa	Epizyme	WJ102	פרוטוקול Immunoblotting שלב 3
עכבר NA/LE מטוהר אנטי-אנושי CD3	BD	566685	תאי T תרבית פרוטוקול שלב 1
עכבר NA/LE מטוהר אנטי-אנושי CD28	BD	555725	תאי T תרבית פרוטוקול שלב 1
פרוטוקול קרום PVDF	Millipore	168627	Immunoblotting שלב 3 פרוטוקול
RPMI 1640	Corning	10-040-CVRC	תרבית תאים שלב 3
אבקת חלב רזה	Yeasen	S9129060	פרוטוקול Immunoblotting שלב 3 פרוטוקול
SKOV3-Luc	ATCC	HTB-77	בדיקת ציטוטוקסיות שלב 4 פרוטוקול
Trypsin-EDTA	NCM biotech	C125C1	תרבית תאים שלב 4 פרוטוקול
30189328	סינופארם		Immunoblotting שלב 3
אמבט מים	keelrein	NB014467	פרוטוקול חימום שלב 1
X-VIVO 15	LONZA	04-418Q	תרבית לימפוציטים ללא סרום בינוני פרוטוקול שלב 1