Method Article

ייצור ואימות תפקודי של תאי קולטן אנטיגן כימרי רגישים להיפוקסיה

DOI:

10.3791/66697

⸱

June 14th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Clinical Center of Biotherapy at Zhongshan Hospital, Fudan University, 3Department of Oncology and Bio-therapeutic Center, Shenzhen Third People's Hospital, Southern University of Science and Technology, 4Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור ואימות פונקציונלי של תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T רגישים להיפוקסיה. פרוטוקול זה מציג את הדור מבוסס הלנטיוירוס של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה ואת אפיונם, כולל אימות של ביטוי CAR תלוי היפוקסיה וציטוטוקסיות סלקטיבית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים מקיפים הוכיחו את ההבטחה של טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR-T) בטיפול בממאירויות המטולוגיות. עם זאת, הטיפול בגידולים מוצקים נותר מאתגר, כפי שמודגם על ידי חששות הבטיחות המתעוררים כאשר תאי CAR-T תוקפים תאים נורמליים המבטאים את אנטיגני המטרה. חוקרים בחנו גישות שונות לשיפור הסלקטיביות של הגידול בטיפול בתאי CAR-T. אסטרטגיה מייצגת אחת לאורך קו זה היא בניית תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה, אשר מתוכננים על ידי היתוך תחום פירוק תלוי חמצן למויטי CAR ומתוכננים להשיג ביטוי CAR גבוה רק בסביבה היפוקסית - מיקרו-סביבה גידולית (TME). מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת תאי CAR-T כאלה והאפיון התפקודי שלהם, כולל שיטות לניתוח השינויים בביטוי CAR וביכולת ההרג בתגובה לרמות חמצן שונות שנקבעו על ידי תא אינקובטור נייד. תאי ה-CAR-T שנבנו צפויים להדגים ביטוי CAR וציטוטוקסיות באופן רגיש לחמצן, ובכך לתמוך ביכולתם להבחין בין TME היפוקסי לבין רקמות נורמליות נורמוקסיות לצורך הפעלה סלקטיבית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בתאי T (CAR-T) קולטן אנטיגן כימרי היווה פריצת דרך משמעותית בטיפול בסרטן. מאז שמנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) אישר את הטיפול הראשון ב-CAR-T לטיפול בלימפומה מתקדמת/עמידה ובלוקמיה לימפובלסטית חריפה בשנת 2017, 1,2,3, 10 טיפולי CAR-T המכוונים ל-CD19 או אנטיגן להבשלת תאי B (BCMA) קיבלו אישור ברחבי העולם4. עם זאת, למרות מחקר מקיף, שחזור היעילות יוצאת הדופן של טיפול CAR-T בטיפול בממאירויות המטולוגיות נותר מאתגר עבור היישום שלו על גידולים מוצקים 5,6,7,8.

מיקרו-סביבה של גידול מדכא חיסון (TME) היא התורמת העיקרית ליעילות הירודה של CAR-T בסביבת הגידול המוצק. TME מעכב את פעילותם והישרדותם של תאי CAR-T עקב מחסור בחומרים מזינים, היפוקסיה, pH חומצי והצטברות פסולת מטבולית 9,10,11,12. עוינות נוספת מגיעה מחדירת תאים מדכאי חיסון כגון תאי T רגולטוריים (Tregs), תאים מדכאים שמקורם במיאלואידים (MDSCs) ומקרופאגים הקשורים לגידול (TAM), אשר, לצד תאי הגידול, מפרישים ציטוקינים מדכאי חיסון הגורמים לעיכוב נוסף של תאי CAR-T ברגע שהם נכנסים לגידול13,14.

מלבד היעילות הטיפולית הבלתי מספקת, בעיות בטיחות הן עקב אכילס נוסף של תאי CAR-T בהתמודדות עם גידולים מוצקים15,16. החשש הבטיחותי נובע מכך שאף אחד מהאנטיגנים הספציפיים לגידול (TSA) שזוהו עד כה אינו מוגבל אך ורק לתאי הגידול. במילים אחרות, האנטיגנים הקשורים לגידול (TAA) שנבחרו כמטרה של CAR, למרות שהם מראים ביטוי גבוה יותר בתאי הגידול, מבוטאים לעתים קרובות גם על ידי רקמות נורמליות17. לכן, השפעות מחוץ לגידול עלולות להתרחש כתוצאה מהפעלה בלתי צפויה של תאי CAR-T על זיהוי יעיל של רקמות נורמליות, מה שמוביל לתסמונת שחרור ציטוקינים (CRS), תסמונת אנצפלופתיה הקשורה ל-CAR-T (CRES)18, ותוצאות שליליות אחרות19.

אסטרטגיות רבות נחקרו כדי למנוע השפעות כאלה, כולל הפחתת הזיקה של CAR כדי לאפשר לתאי CAR-T להבחין בין תאי גידול לתאים נורמליים בהתבסס על רמות הביטוי של TAA הממוקד; צייד תאי CAR-T במתג כיבוי, כגון גן התאבדות או סמן חיסול כדי לקדם את חיסולם בעת הפעלה בלתי צפויה; חלוקת אותות CD3ζ ואותות קו-סטימולטוריים לשני תאי CAR, שהפעלתם הסימולטנית נדרשת כתוצאה מכך להפעלה יעילה של תאי CAR-T; שימוש במעגל סינתטי מבוסס Notch (synNotch) המגביל את פעילותם של תאי CAR-T לתאי מטרה המבטאים יחד שני TAA שונים; והנדסת תאי CAR-T להשגת רגישות TME על ידי יישום מנגנון לכוונון ביטוי CAR לרמזים סביבתיים משתנים 20,21,22,23,24,25,26.

שיקול מרכזי באפשרות רגישות TME שתוארה לעיל הוא רמת החמצן הנמוכה ב- TME עקב ההתרבות המהירה של תאי הגידול. התאמתם של תאי הגידול להיפוקסיה תלויה בהפעלת גורם היפוקסיה-אינדוקציה-1 (HIF-1), גורם שעתוק הטרודימרי המורכב מתת-יחידה אינדוקטיבית, HIF-1α, ותת-יחידה המבוטאת באופן קונסטיטוטיבי, HIF-1β27. בתנאים נורמוקסיים, חלבון HIF-1α עובר יוביקוויטינציה ופירוק פרוטאזומלי מהיר, תלוי בתחום הפירוק תלוי החמצן שלו (ODD)28. כאשר אספקת החמצן התאית מוגבלת, HIF-1 מתייצב ומפעיל את השעתוק של גני המטרה במורד הזרם שלו על ידי קשירה לאלמנטים של תגובת היפוקסיה (HREs)29. בהתחשב באופי של ODD ו- HRE כאלמנטים רגישים לחמצן, הם נחקרו כדי לממש את הביטוי המותנה של מכוניות בתוך TME30 היפוקסי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתמקד בשיטות לאפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה, ולפניו תיאור קצר של תכנון CAR והליכי ההכנה של תאים אלה. פרוטוקול זה מתכוון לספק קו מנחה שימושי לניצול CAR מגיב להיפוקסיה ליצירת תאי CAR-T עם רעילות מחוץ לגידול.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, HER2-BBz-ODD, מכונית רגישה להיפוקסיה המכוונת ל- HER2 (מזהה גן: 2064) הושוותה למקבילתה הרגילה, HER2-BBz. השרטוטים של שתי המכוניות מודגמות באיור 1A, אשר מראה כי HER2-BBz-ODD נגזר מ-HER2-BBz על-ידי הוספת רצף ה-ODD למסוף C של CD3ξ. בניית וקטורים לנטי-ויראליים המבטאים את שני ה-CARs ויצירת הלנטיוירוס המתאים על ידי טרנספקציית תאים 293T תוארה בעבר31.

1. יצירת תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה על ידי זיהום לנטיויראלי

  1. הפשירו תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) בהקפאה במהירות של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. העבירו את מרכזיות ההפשרה לצינור של 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום תרבית לימפוציטים ללא סרום בתוספת 400 IU של IL-2, 5 ng/mL IL-7 ו-10 ng/mL IL-15 (מדיום גידול תאי T אנושיים, המכונה TGM לאחר מכן).
  2. לאחר נטילת aliquot לספירת תאים, צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות. השהה מחדש את ה- PBMCs הכדוריים עם TGM בצפיפות של 4 × 106 תאים / מ"ל והעבר את המתלה לצלחת 6 בארות.
  3. הכינו חרוזים חיסוניים מצופים נגד hCD3/hCD28.
    1. העבר 100 μL של חרוזים מגנטיים מסוג IgG עכבר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ושטוף אותם פעמיים באמצעות מעמד מגנטי עם PBS.
    2. השהה מחדש את החרוזים ב 100 μL של PBS והוסף 0.2 מיקרוגרם של נוגדן CD3 אנטי אנושי עכבר ו 2 מיקרוגרם של נוגדן CD28 אנטי אנושי עכבר. מערבבים בעדינות את התערובת באמצעות פיפטה וסלע למשך הלילה בחום של 4°C.
    3. שטפו את החרוזים פעמיים באמצעות מעמד מגנטי עם PBS והשהו אותם מחדש ב-100 מיקרוליטר של PBS.
  4. הוסף חרוזים חיסוניים מצופים נגד hCD3 / hCD28 לצלחת בשלב 1.2 ביחס חרוז לתא של 1: 1. מניחים את הצלחת באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C.
  5. לאחר 48 שעות של דגירה, להעביר את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל לאחר ערבוב עדין של התאים עם פיפטה. הניחו את הצינור על מעמד מגנטי למשך 3 דקות, ולאחר מכן העבירו בזהירות את הסופרנאטנט לשפופרת חדשה של 15 מ"ל כדי להסיר את ה-immunobeads מה-PBMCs.
  6. קח aliquot לספירת תאים, ולאחר מכן זרע את PBMCs ב 5 × 105 תאים / באר ב 300 μL של TGM לתוך צלחת שטוחה 48 באר. הוסף 200 μL של מלאי lentiviral לתוך הבארות המתאימות ולהוסיף פרוטאמין סולפט לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל.
  7. צנטריפוגו את הצלחת ב-1,000 × גרם ב-32°C למשך שעה וחצי והוציאו בזהירות 300 מיקרוליטר של סופרנאטנט מכל באר באמצעות פיפטה. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של TGM טרי באמצעות פיפטה ומניחים את הצלחת באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C.
  8. הוסף TGM טרי כדי להתאים את צפיפות התאים ל- 0.5-2 × 106 תאים/מ"ל כל 2-3 ימים. התחל בהעברת תאים תחילה לצלחת של 12 בארות ולאחר מכן לצלחת של 6 בארות. המשך בתרבית התאים עד שהמספר הכולל מגיע ל 6 × 106 בנפח 4 מ"ל.
    הערה: במקביל, בצע את התמרה CAR של תאי Jurkat T בעקבות אותם הליכים שתוארו לעיל, אלא TGM מוחלף בתווך RPMI1640 המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS).

2. הערכת ביטוי CAR תלוי חמצן בתאי CAR-T באמצעות ציטומטריית זרימה

  1. לוחית את תאי T המומרים על ידי CAR משלב 1.8 לשני לוחות 12 בארות בצפיפות של 2.5 × 106 תאים / באר ב 2 מ"ל של TGM. מניחים צלחת אחת ישירות באינקובטור לח עם 5% CO2 ב 37 ° C (מצב נורמוקסי, כמו המצב הסטנדרטי עבור תאים תרבית יש 21% O2) ומניחים את הצלחת השנייה בתא אינקובטור נייד CO2 / O2 / N2 עם רמת O2 קבועה מראש ב 1% (מצב היפוקסי) ולאחר מכן לשמור את החדר לח, 5% CO2/94% N2 אינקובטור ב 37 ° C.
  2. כל 24 שעות, לאסוף 5 × 105 תאים מן הצלחות בתנאים היפוקסיים או נורמוקסי לתוך 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינורות ב 500 × גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, בעדינות resuspend את התאים ב 1 מ"ל של PBS על ידי pipetting. חזור על שטיפת PBS פעם נוספת.
  3. השהה מחדש את התאים הכדוריים ב-50 μL של חיץ FACS (PBS בתוספת 2% FBS) בכל צינור. הוסף 50 μL של דילול 1:100 של נוגדן אנטי-פלאג מצומד PE (0.2 מיקרוגרם / מ"ל) וערבב היטב על ידי pipetting. דוגרים בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  4. בסוף הדגירה, הוסף 1 מ"ל של חיץ FACS לכל צינור. מערבבים היטב על ידי pipetting, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות.
  5. מוציאים בזהירות ומשליכים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה וחוזרים על שלב 2.4 פעם נוספת.
  6. מוציאים בזהירות ומשליכים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה. להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של מאגר FACS, ולאחר מכן להעביר את תרחיף התא שנוצר לתוך צינורות זרימה 5 מ"ל.
  7. בצע ציטומטריית זרימה על מתלה התא בשלב 2.6 כדי לקבוע את ביטוי CAR פני השטח. כלול תאי T שאינם נגועים כבקרה שלילית.
    1. השתמש בשערי FSC/SSC ו- FSC-A/FSC-H כדי לסנן תאים בודדים חיים. אסוף 1 × 104 אירועים בודדים חיים עבור כל דגימה. שער התאים חיוביים עבור EGFP (סמן מכונן הנישא בווקטור הלנטי-ויראלי כאינדיקטור לתאי T שהותמרו בהצלחה) ולאחר מכן, התאים חיוביים עבור פיקואריתרין (PE) (תאים המבטאים CAR) כדי למדוד את חיוביות PE ואת עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI).

3. ניתוח תלות בחמצן של ביטוי CAR בתאי Jurkat T מהונדסים על ידי כתם מערבי

  1. לוחית את תאי Jurkat T המומרים על ידי CAR מקטע 1 בשני לוחות 48 בארות בצפיפות של 5 × 105 תאים לכל באר (נפח תרבית 500 μL) בתווך RPMI1640 עם 10% FBS.
  2. עבור צלחת אחת, הוסף CoCl2 לבארות הניסוי לריכוז סופי של 0 μM, 50 μM, או 200 μM. לאחר מכן, מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 5% CO2 בטמפרטורה של 37°C (מצב נורמוקסי). עבור הצלחת השנייה, אין להוסיף CoCl2 ולמקם אותו בתא אינקובטור נייד CO2/O2/N2 עם רמת O2 מוגדרת מראש של 1% (מצב היפוקסי) לפני העברתו לאותו אינקובטור.
  3. לאחר 24 שעות של דגירה, להעביר את מתלי התא לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. צנטריפוגה את הצינורות ב 500 × גרם במשך 5 דקות. הסר לחלוטין והשלך את הסופרנאטנטים תחילה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, לאחר מכן פיפטה של 100 מיקרוליטר, והשהה מחדש את כדורי התא ב -50 מיקרוליטר של מאגר דגימה 1x SDS-PAGE.
  4. מחממים את הדגימות באמבט מים רותחים למשך 10 דקות. הניחו מיד את הצינור על קרח למשך 30 שניות, ואז צנטריפוגה בעוצמה של 16,000 × גרם למשך 30 שניות.
  5. טען 30 μL של הדגימות שנוקו לתוך כל חריץ של ג'ל 10-well, 10% SDS PAGE בעובי של 1.5 מ"מ. הפעל את הג'ל ב 80 V במשך 30 דקות, ולאחר מכן להגדיל את המתח ל 100 V ולרוץ 1.5 שעות.
  6. בסוף האלקטרופורזה, מעבירים חלבונים מהג'ל לקרום PVDF בשיטת העברה רטובה סטנדרטית, כאשר הזרם ומשך הזמן נקבעים על 400 mA ו 1 שעות, בהתאמה.
  7. חסום את הממברנה בחיץ חוסם (5% חלב (w/v) ב-PBST (PBS+0.05% Tween-20)) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חתכו את החתיכה בין 30 kD ל 40 kD לזיהוי בקרת הטעינה GAPDH ואת החתיכה בין 50 kD ל 70k D לזיהוי מולקולות CAR.
  8. דגרו על חתיכות 30-40 kD ו- 50-70 kD עם נוגדן עכבר נגד GAPDH (דילול 1:2,000) ונוגדן נגד דגל עכבר (דילול 1:2,000), בהתאמה, ב- 3 מ"ל של חיץ חוסם בטמפרטורת החדר למשך שעתיים או ב- 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  9. שטפו את הממברנות עם PBST בטמפרטורת החדר על נדנדת פלטפורמה במשך 3X5 דקות.
  10. לדגור על הממברנות עם נוגדן נגד עכבר עז מצומד HRP (דילול 1:5,000) ב-3 מ"ל של חיץ חוסם בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת; לאחר מכן לשטוף את הממברנה עם PBST במשך 5 x 10 דקות.
  11. פתח את הממברנות באמצעות דגירה שלהן עם מצע HRP, ולאחר מכן דמיין את רצועות החלבונים שזוהו באמצעות מנתח תמונה זוהר.

4. הערכה חוץ גופית של התלות בחמצן של ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה

  1. ביום 0, זרע 1 × 104 תאי מטרה (תאי SKOV3-Luc) לכל באר ניסיונית ב 200 μL של DMEM המכיל 10% FBS בשני לוחות תרבית רקמה שחורים שטוחים 96 באר.
  2. ביום הראשון, הסירו בזהירות 100 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מהחלק העליון של כל באר. הוסף תאי CAR-T או תאי T לא מותמרים ביחסי אפקט למטרה של 1:1, 2:1 ו- 4:1 ב- 100 μL של תווך DMEM המכיל 10% FBS.
  3. הניחו צלחת אחת באטמוספירה של 21% O2 ואת השנייה באטמוספירה של 1% O2 באמצעות תא אינקובטור נייד CO2/O2/N2 , כמתואר בשלב 2.1.
    הערה: אם תא אינקובטור נייד CO2/O2/N2 אינו זמין, ניתן להשתמש בהוספת CoCl2 למדיום התרבית כדי לחקות מצב היפוקסי.
  4. ביום השני, לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, העבירו בזהירות את כל הסופרנאטנט (בערך 150-200 מיקרוליטר) לצלחת U חדשה בעלת 96 בארות באמצעות פיפטה. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C לזיהוי ציטוקינים מאוחר יותר, בהתאם להליכים המתוארים בסעיף 5.
  5. הוסף 60 μL של חיץ ליזה פסיבי 1x לכל באר ניסיונית של לוחות 96 בארות שחורות שטוחות מדרגה 4.4. לאחר מכן, הניחו את הצלחות על שייקר ונערו במשך 30 דקות כדי להבטיח ליזה תאית יעילה.
  6. הוסף 60 μL של מצע לוציפראז גחלילית לכל באר ניסוי, ולמדוד את פעילות לוציפראז באופן מיידי באמצעות קורא microplate.
  7. חישוב ציטוטוקסיות מנורמלת (%) באמצעות משוואה (1):
    ציטוטוקסיות מנורמלת (%) = 100 - figure-protocol-1 ×100 (1)

5. איתור הפרשת IL-2 ו-IFN-γ על ידי תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה

  1. ביום 0, הכינו דילול של 1:250 של נוגדנים IL-2 או IFN-γ במאגר הציפוי. הוסף 100 μL של נוגדן מדולל לכל באר של צלחת ELISA 96 באר לדגור את הצלחת ב 4 ° C במשך הלילה.
    הערה: חיץ הציפוי מיוצר על ידי המסת 7.13 גרם של NaHCO3 ו-1.59 גרם של Na2CO3 ב-1 ליטר מים מזוקקים והתאמת ה-pH ל-9.5.
  2. ביום הראשון, הסר את נוגדן הלכידה שלא נספג על ידי היפוך נמרץ של הצלחת, ולאחר מכן שטוף את הבארות 3x עם 200 μL של Wash Buffer (PBS המכיל 0.05% Tween 20).
  3. מוסיפים 200 μL של מדלל Assay (PBS המכיל 10% FBS) לכל באר ודגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
  4. השליכו את התמיסה על ידי היפוך נמרץ של הצלחת; לאחר מכן, לשטוף את הבארות 3x עם 200 μL של Wash Buffer.
  5. הפשירו את הדגימות/צלחת הסופרנאטנט הקפואה משלב 4.4 בטמפרטורת החדר. לאחר הפשרה מלאה, לדלל את הדגימות ואת התקנים עם Assay Diluent. הוסף 100 μL של דגימות מדוללות או תקנים לכל באר של צלחת ELISA המצופה ודגר בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות.
    הערה: עבור זיהוי IL-2, מומלץ דילול פי 10, ואילו עבור זיהוי IFN-γ, עדיף דילול פי 50.
  6. הסר את הדגימות ואת התקנים על ידי הפיכת הצלחת נמרצת הפוך, ולאחר מכן לשטוף את הבארות 5x עם 200 μL של חיץ כביסה לכל באר.
  7. הכן פתרון זיהוי עובד על-ידי דילול נוגדן הזיהוי IL-2 או נוגדן זיהוי IFN-γ/Streptavidin-HRP (SAv-HRP) ביחס של 1:250 במדלל בדיקה. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת גילוי העבודה לכל באר ודגרו על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם ניעור עדין.
  8. השליכו את התמיסה ושטפו את הבארות 7x עם 200 μL של Wash Buffer.
  9. מוסיפים 100 μL של מגיב מצע לכל באר ודגרים על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.
  10. הוסף 50 μL של תמיסת עצירה (1 M H2SO4) לכל באר. קרא מיד את הספיגה ב 450 ננומטר באמצעות קורא microplate.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיזוג תחום ה-ODD של HIF-1α ל-CAR moiety מייצג אסטרטגיה ראשונית ליצירת CAR רגיש להיפוקסיה. המכונית הממוקדת ב-HER2 הרגישה להיפוקסיה שנותחה במחקר זה, בשם HER2-BBz-ODD, נבנתה באמצעות אסטרטגיה זו על-ידי שילוב רצף ה-ODD ב-HER2-BBz הקונבנציונלי שלה (איור 1A). במחקר זה השתמשנו בהתמרה לנטיויראלית כדי לבטא HER2-BBz-ODD CAR או HER2-BBz CAR, ולאחר מכן בחנו את רגישותם לחמצן בשני סוגי תאים: PBMCs אנושיים ותאי Jurkat T.

הבדיקה הראשונה היא ביטוי של CAR בתנאים היפוקסיים לעומת תנאים נורמוקסיים, שבוצעה הן בתאי T שמקורם ב-PBMC על ידי ציטומטריית זרימה והן בתאי Jurkat T מותמרים על ידי כתם מערבי. בהגדרה של תאי T שמקורם ב-PBMC שעבר התמרת CAR, ראינו של-HER2-BBz-ODD CAR היה ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי מתחת ל-1% O2 מאשר מתחת ל-21% O2 הן מבחינת אחוז התאים החיוביים ל-CAR והן מבחינת עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) (איור 1B). ניתוח immunoblotting של תאי Jurkat T מומרים CAR גם אישר את השראת תלוי היפוקסיה של HER2-BBz-ODD.

ראוי לציין כי בהקשר זה, ניתן לחקות בנוחות את המצב ההיפוקסי על ידי הוספת CoCl2, גורם כימי להיפוקסיה, למדיום התרבית. כפי שמודגם באיור 1C, תוצאות האימונובלוטציה שלנו הראו כי חשיפה ל-50 או 200 מיקרומטר CoCl2 שחזרה את השפעת החשיפה ל-1% O2, מה שגרם באופן משמעותי לביטוי של מכונית HER2-BBz-ODD אך לא של מכונית HER2-BBz. האפיון הפונקציונלי של CAR רגיש להיפוקסיה בוצע עם תאי CAR-T שמקורם ב-PBMC. במחקר, קו תאי SKOV-3 הנושא גחלילית לוציפראז שימש כקו תאי המטרה. מערך זה אפשר לנו למדוד את פעילות הלוציפראז הקשורה לתאי המטרה כפרוקסי להערכת ציטוטוקסיות המתווכת על ידי תאי CAR-T בתרבית משותפת.

כפי שניתן לראות באיור 1D, המדידות הצביעו על כך שתאי CAR-T מסוג HER2-BBz הורגים ביעילות תאי מטרה, ללא קשר לשאלה אם האטמוספירה הייתה נורמוקסית או היפוקסית. לעומת זאת, תאי CAR-T מסוג HER2-BBz-ODD הציגו ציטוטוקסיות חלשה משמעותית בתנאים נורמוקסיים עבור כל שלושת יחסי ה-E:T שנבדקו. עם זאת, ציטוטוקסיות שלהם השתפרה באופן משמעותי כאשר נחשפו לתנאים היפוקסיים. רמות העל-נאטנט של IL-2 ו-IFN-γ נמדדו גם הן על ידי ELISA לאחר תרבית משותפת של תאי CAR-T עם תאי מטרה במשך 24 שעות. עבור שני הציטוקינים, הפרשה גבוהה יותר מתחת ל-1% O2 בהשוואה ל-21% O2 נצפתה עבור תאי CAR-T מסוג HER2-BBz-ODD, אשר עולה בקנה אחד עם נתוני ציטוטוקסיות. לעומת זאת, תאי CAR-T מסוג HER2-BBz הראו הפרשה נמוכה יותר של שני הציטוקינים מתחת ל-1% O2 בהשוואה ל-21% O2, מה שמצביע על השפעה שלילית של היפוקסיה על הפעילות התאית (איור 1E). יחד, תוצאות אלה אישרו באופן משכנע את האופי הרגיש להיפוקסיה של מכונית HER2-BBz-ODD.

figure-results-1
איור 1: בנייה ואפיון של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה. (A) ייצוג סכמטי של עיצובים של מכונית רגישה להיפוקסיה, HER2-BBz-ODD, ומקבילתה הקונבנציונלית, HER2-BBz. שתי המכוניות מורכבות מפפטיד אות CD8α N-terminal, תג FLAG, scFv ממוקד HER2 אנושי, ציר CD8 ותחום טרנסממברנה, וחלק תוך תאי המורכב מתחום קוסטימולטורי מ-4-1BB, תחום איתות CD3ξ, IRES ו-EGFP. HER2-BBz-ODD שונה מ- HER2-BBz בהיתוך של תחום ODD למסוף C של תחום האיתות CD3ξ, ומאפשר ביטוי תלוי היפוקסי שלו על ידי קידום השפלה תלוית יוביקוויטין בתנאים נורמוקסיים. (ב,ג) הערכות של ביטוי תלוי חמצן של מכונית HER2-BBz-ODD. (B) הערכה אחת בוצעה עם תאי CAR-T אנושיים שמקורם ב-PBMC לאחר תרבית מתחת ל-1% או 21% O2 במשך 24, 48 או 72 שעות באמצעות ציטומטריית זרימה. (C) ההערכה השנייה הייתה עם תאי Jurkat T מותמרים של CAR, שבהם ליזטים של תאים נקצרו 24 שעות לאחר תרבית מתחת ל-21% O2, 50 או 200 μM CoCl2, או 1% O2 ונותחו עבור ביטוי CAR באמצעות כתם מערבי, כאשר תאים מומרים HER2-BBz CAR נכללו כבקרה. (ד,ה) ציטוטוקסיות במבחנה והפרשת ציטוקינים של תאי CAR-T בתנאי חמצן שונים. (D) תאי CAR-T גודלו בתרבית משותפת עם תאי SKOV3 המבטאים גחליליות לוציפראז ביחס E:T מצוין מתחת ל-1% או 21% O2. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, יעילות הריגת תאי המטרה נקבעה על ידי מדידת השינוי בפעילות לוציפראז של גחליליות הקשורות לתאים ביחס לזו של תאי T שאינם מותמרים. (E) הסופרנאטנטים נאספו לגילוי IL-2 ו-IFN-γ מופרשים. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM (n = 3 תורמים בריאים) (****p < 0.0001). קיצורים: scFv = משתנה מקטע שרשרת יחיד; CAR = קולטן אנטיגן כימרי. לוחות C ו-D לקוחים מ-Liao et al.31. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חששות בטיחות הם נושאים משמעותיים שיש לטפל בהם כדי שכל טיפול בתאי CAR-T יתקדם לשימוש קליני. ניצול התכונות הייחודיות של תאי הגידול או TME הפך לכיוון מחקר עיקרי המתמקד בפיתוח תאי CAR-T המכוונים לרקמות הגידול באופן סלקטיבי. תכנון CAR-T רגיש להיפוקסיה הוא אסטרטגיה אטרקטיבית בכיוון זה, עם מספר גישות שנבחנות, כולל זו שהוצגה במחקר זה - מיזוג ה- CAR moiety עם תחום חלבון ה- ODD המתרחש באופן טבעי עם חישת היפוקסיה. גישה חלופית כוללת החלפת מקדם מכונן המשמש בדרך כלל להנעת ביטוי CAR באלמנט תגובת היפוקסיה (HRE), אשר הראה הבטחה במחקרים קודמים. הוא האמין כי שילוב אלמנטים HRE ו ODD (סוג פראי או גרסאות הנדסיות המציעות שליטה הדוקה יותר של ביטוי) מייצג עיצוב אופטימלי עבור מכונית המושרה היפוקסיה.

פרוטוקול זה מתאר הליכים ניסיוניים ליצירה ואימות של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה. יישום פרוטוקול זה כרוך במספר שיקולים מרכזיים. שיקול עיקרי הוא יצירת תנאים היפוקסיים. בין שתי הגישות, התוספת של CoCl2 למדיום התרבית הייתה נפוצה במחקרים קודמים הקשורים להיפוקסיה, בעיקר הודות לנוחות שלה32,33. עם זאת, אי אפשר למדוד את מידת ההיפוקסיה המחקה על ידי גישה זו. לעומת זאת, שימוש בתא דגירה נייד CO2/O2/N2 הוא יתרון בכך שניתן להגדיר במדויק את רמות O2 ולכן מתאים לניתוח עדין של רגישות להיפוקסיה של תאי CAR-T. מבחינה זו, רמת ההיפוקסיה בתוך גידולים משתנה בין סוגים שונים של גידולים מוצקים ותקופות שונות של התקדמות הגידול34, כאשר רק 1% O2 מודגם בפרוטוקול. זהו תרגול אופטימלי עבור החוקרים להתאים את רמת החמצן בהתאם לביקוש בפועל. אם שיטת CoCl2 היא הגישה היחידה הזמינה, אנו ממליצים לכלול טווח של ריכוזי CoCl2 בבדיקה כדי לדמות רמות חמצן שונות.

בחירת שיטה מתאימה לבחינת ביטוי CAR תלוי היפוקסיה היא שיקול מרכזי נוסף. בעוד שניתוח אימונובלוטינג של תאי Jurkat T מומרים על ידי CAR הוא אפשרות נוחה במהלך אופטימיזציה של מבנה CAR, ניתוח ההשפעה של רמות חמצן על פני השטח ביטוי CAR ב- PBMCs אנושיים מותמרים על ידי ציטומטריית זרימה משמש כאימות האולטימטיבי. אופטימלי לבחון את הדינמיקה של ביטוי CAR בתגובה למעבר מתנאים היפוקסיים לנורמוקסיים, כפי שעשינו בעבר עם גרסה משופרת של CAR רגישה להיפוקסיה, כלומר HiTA-CAR35. זה ידגים עוד יותר ביטוי CAR מוגבל היפוקסיה.

לאימות פונקציונלי של תאי CAR-T רגישים להיפוקסיה, בדיקת ציטוטוקסיות המתוארת בפרוטוקול כוללת שימוש בתאי מטרה נושאי לוציפראז גחליליות. בדיקה מבוססת כתב זו יכולה להיות מוחלפת בשיטות הערכת הרג אחרות, כגון שיטת CCK8 ושיטת ניתוח תאי בזמן אמת (RTCA), שבה ניתן להשתמש בתאי גידול שלא שונו. ניתוח RTCA הוא גם יתרון למדידת קינטיקה הרג בזמן אמת של תאי CAR-T. כדי למדוד את ציטוטוקסיות ספציפית הנגרמת על ידי תאי CAR-T, PBMCs שאינם מותמרים צריכים להיכלל כבקרה. יעילות העברה גבוהה של PBMCs רצויה כדי למנוע חששות כי הבדלים ציטוטוקסיות שזוהו בין קבוצות ניסוי וקבוצת ביקורת נובעים מהרג לא ספציפי בתיווך כמויות משתנות של תאי השפעה שנוספו.

קיימות מספר מגבלות בפרוטוקול זה. תנאים היפוקסיים יכולים להשפיע על הכדאיות של תאי מטרה ותאי T36,37, מה שמציג את החשש כי מוות תאי שאינו קשור ציטוטוקסיות בתיווך תאי CAR-T עלול לבלבל את הפרשנות של תוצאות הבדיקה. יש לוודא שגם לתאי CAR-T וגם לתאי המטרה יש יכולת קיום מצוינת מיד לפני הבדיקה, כדי למנוע או למזער חששות כאלה. כמו כן יש לציין כי אימות חוץ גופי אינו מבטיח תרגום מוצלח in vivo. תמיד יש צורך בהערכות In vivo כדי לאשר אם מועמד CAR-T רגיש להיפוקסיה יכול להימנע מהתמקדות ברקמות נורמליות המבטאות את האנטיגן הממוקד

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2016YFC1303402), המגה-פרויקט הלאומי על מחלות זיהומיות מרכזיות (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007), והתוכנית הכללית של ועדת הבריאות העירונית של שנחאי (201740194).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
צינור צנטריפוגה 1.5 מ"לQSP509-GRD-QSupernatants ותאים cellection
פרוטוקול שלב 2,3,4
10% ExpressCast PAGENCM biotechP2012Immunoblotting
פרוטוקול שלב 3
10x PBSNCM ביוטק20220812תרבית תאים
פרוטוקול שלב 4
10 מ"ל פיפטהYueyibioYB-25Hצנרת
פרוטוקול שלב 1
10xTRIS-Glycine-SDS מאגר אלקטרופורזהאפיזים3673020פרוטוקול Immunoblotting
שלב 3
צינור צנטריפוגה 15 מ"לThermo Scientific339650Supernatants and cells cellection
פרוטוקול שלב 1
25 ס"מ2 פרוטוקול EasYFlaskThermo Scientific156367תרבית תאים
שלב 3,4
4x חלבון SDS PAGE טעינת מאגרTakara9173פרוטוקול Immunoblotting
שלב 3
צלחות תרבית רקמות עם תחתית שטוחה 6 בארותThermo Scientific140675T Culture
פרוטוקול שלב 1
96 בארות צלחות תרבית רקמה שחורות עם תחתית שטוחהGreiner655090בדיקת ציטוטוקסיות
פרוטוקול שלב 4
צלחות ELISA 96 בארותקורנינג3590פרוטוקול ELISA
שלב 5
שייקר צלחות 96 בארותQILINBEIERMH-2Shake
פרוטוקול שלב 4
96 בארות צלחות תרבית רקמות תחתונות UThermo Scientific268200Supernatants cellection
פרוטוקול שלב 4,5
נוגדן נגד FLAGSigmaF1804-50UGפרוטוקול Immunoblotting
שלב 3
קרבינולפרוטוקול Sinopharm10010061Immunoblotting
שלב 3
חממת פחמן דו חמצניThermo Scientific360תרבית תאים
פרוטוקול שלב 1,2,3,4
צלחת ספירת תאיםHausser scientific1492פרוטוקול ספירת תאים
שלב 1,3,4
ערכת IgG של עכבר CELLection Pan Mouse ThermoScientific11531Dעכבר IgG חרוזים מגנטיים
פרוטוקול שלב 1
צנטריפוגהתרמו מדעית75002432תרבית תאים
פרוטוקול שלב 1,3,4
מערכת הדמיית ג'ל כימילומינסנציהBIO-RAD12003154Immunoblotting
פרוטוקול שלב 3
תמיסת קובלט כלוריד (0.5 M)bioleaperBR4000203מצב היפוקסי
פרוטוקול שלב 2,3,4
DMEMCorning10-103- CV פרוטוקול תרבית תאים
שלב 4
איזון אלקטרוניSartoriusPRACTUM612-1CNמשקל
פרוטוקול שלב 5 פרוטוקול
FBSBI04-001-1ACSתרבית תאים
שלב 3,4
עכבר GAPDH mAbABclonalAC002פרוטוקול Immunoblotting
שלב 3
מכשיר אלקטרופורזה ג'לBIO-RAD1645070פרוטוקול Immunoblotting
שלב 3
קוראי מיקרופלייט GloMaxPromegaGM3000
פרוטוקול שלב 4 פרוטוקול
עיזים נגד עכבר IgG (H+L)פרוטוקול YeasenP1126151Immunoblotting
שלב 3
צנטריפוגה מיקרו-הקפאה במהירות גבוההeppendorf5810  פרוטוקול תרבית תאי R
שלב 1
IFN-&גמא אנושי; ELISA SetBD555142פרוטוקול ELISA
שלב 5
פריטים: IFN-&gamma אנושי רקומביננטי; תקן ליופיליזציה, זיהוי נוגדנים ביוטין אנטי אנושי IFN-וגמא; לכידת נוגדנים מטוהרים אנטי אנושיים IFN-&גמא;, מגיב אנזים סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז מצומד (SAv-HRP)
אנושי IL-2 ELISA סטBD555190ELISA
פרוטוקול שלב 5
פריטים: תקן ליופיליזציה אנושי רקומביננטי IL-2, זיהוי נוגדנים ביוטין אנטי אנושי IL-2, לכידת נוגדנים מטוהרים אנטי-אנושיים IL-2, מגיב אנזים סטרפטווידין-חזרת פרוקסידאז מצומד (SAv-HRP)
IL-15מו"פ D systemsP40933פרוטוקול תרבית תאי T
שלב 1
IL-21נובופרוטאיןGMP-CC45פרוטוקול תאי T תרבית
שלב 1
IL-7מו"פ מערכות DP13232תאי T תרבית
פרוטוקול שלב 1
מיקרוסקופ הפוךפרוטוקול תרבית תאים אולימפוסCKX41תרבית תאים
פרוטוקול שלב 1,3,4
פרוטוקול JurkatATCCTIB-152CAR-Jurkat construction
שלב 3 פרוטוקול
LSRFortessaLSRFortessaFlow Cytometry
שלב 2
מערכתבדיקת לוציפראזPromegaE1501לוציפראז מדווח בדיקה
פרוטוקול שלב 4
פריטים: מאגר ליזה פסיבי, מצע לוציפראז גחלילית
קורא מיקרופלייטBioTekHTXELISA
פרוטוקול שלב 5
נייד CO2/O2/N2 תא חממהסין מכשיר חדשנות ושות', בע"מ.Smartor118מצב היפוקסי
פרוטוקול שלב 2, 3, 4
עכבר אנטי-הקסה היסטידין תגסיגמאSAB2702218פרוטוקול Immunoblotting
שלב 3
NcmBlot מאגר העברה מהירהNCM ביוטקWB4600Immunoblotting
NcmECL UltraNCM ביוטקP10300פרוטוקול Immunoblotting
שלב 3
פריטים: NcmECL Ultra Luminol/Enhancer Reagent (A), NcmECL מגיב מי חמצן אולטרה מיוצב (B) 
צלחות שטוחות 48 בארות מצופות NovoNectinNovoproteinGMP-CH38תאי CAR-T בנייה
פרוטוקול שלב 1
סט טבליות OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride)SigmaP9187מגיב מצע
פרוטוקול שלב 5
פריטים: טבלית OPD (רדיד כסף), טבלית מי חמצן אוריאה (רדיד זהב)
מצומד PE אנטי-DYKDDDDKBiolegend637310פרוטוקול זרימה ציטומטריה
שלב 2
פרוטאמין סולפטSigmaP3369-1OGפרוטוקול זיהום לנטי-וירוס
שלב 1
סמן חלבון 10 KDA-250 KDaEpizymeWJ102פרוטוקול Immunoblotting
שלב 3
  עכבר NA/LE מטוהר אנטי-אנושי CD3BD566685תאי T תרבית
פרוטוקול שלב 1
עכבר NA/LE מטוהר אנטי-אנושי CD28BD555725תאי T תרבית
פרוטוקול שלב 1
פרוטוקול קרום PVDFMillipore168627Immunoblotting
שלב 3 פרוטוקול
RPMI 1640Corning10-040-CVRCתרבית תאים
שלב 3
אבקת חלב רזהYeasenS9129060פרוטוקול Immunoblotting
שלב 3 פרוטוקול
SKOV3-LucATCCHTB-77בדיקת ציטוטוקסיות
שלב 4 פרוטוקול
Trypsin-EDTANCM biotechC125C1תרבית תאים
שלב 4 פרוטוקול
30189328סינופארםImmunoblotting
שלב 3
אמבט מיםkeelreinNB014467פרוטוקול חימום
שלב 1
X-VIVO 15 LONZA04-418Qתרבית לימפוציטים ללא סרום בינוני
פרוטוקול שלב 1
מדידת פעילות לוציפראז BD

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boardman, A. P., Salles, G. CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma. Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).
  2. Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. CAR-T: What is next. Cancers. 15 (3), 663(2023).
  3. Barsan, V., et al. Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns. eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).
  4. Liu, Y., et al. Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy. Front Oncol. 12, 1037934(2022).
  5. Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response. Front Immunol. 12, 748768(2021).
  6. Li, N., et al. Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway. Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).
  7. Derenzo, C., Gottschalk, S. Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors. Front Immunol. 10, 218(2019).
  8. Fu, R., et al. Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors. Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).
  9. Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors. Cells. 11 (22), 3626(2022).
  10. Liu, Z., et al. Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy. Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).
  11. Luo, Z., et al. Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).
  12. Martinez, M., Moon, E. K. CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment. Front Immunol. 10, 128(2019).
  13. Zhang, X., et al. The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma. Front Immunol. 13, 1003651(2022).
  14. Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets. J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).
  15. Wu, Y., et al. Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety. APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).
  16. Al-Haideri, M., et al. cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment. Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).
  17. Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  18. Neelapu, S. S., et al. Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities. Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).
  19. Mi, J., Ye, Q., Min, Y. Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors. Front Immunol. 13, 849759(2022).
  20. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  21. Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity. Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).
  22. Dana, H., et al. CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors. Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).
  23. Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment. Front Oncol. 10, 1362(2020).
  24. Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management. Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).
  25. Flugel, C. L., et al. Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours. Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).
  26. Rababah, F., et al. Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors. Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).
  27. Masoud, G. N., Li, W. Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).
  28. Semenza, G. L. Targeting hif-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).
  29. Harris, A. L. Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
  30. Juillerat, A., et al. An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell. Sci Rep. 7, 39833(2017).
  31. Liao, Q., et al. Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing. Biomark Res. 8 (1), 56(2020).
  32. Ivan, M., et al. Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing. Science. 292 (5516), 464-468 (2001).
  33. Wang, G. L., Semenza, G. L. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).
  34. D'alonzo, R. A., et al. In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review. Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).
  35. He, H., et al. Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy. J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).
  36. Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells. Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).
  37. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel. Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CAR T CellsHypoxia Sensitive CARTumor MicroenvironmentSolid TumorsCancer ImmunotherapyOxygen Dependent DegradationCAR ExpressionCytotoxicity AssayHypoxia ModelTumor Selectivity

Related Articles