מודל כאב דלקתי שונה כדי ללמוד את אפקט משכך כאבים בעכברים

סיכום

כאן, אנו מציגים מודל כאב דלקתי שונה עם הזרקת קרגינן שתי כפות אחוריות כדי להעריך את אפקט משכך הכאבים.

תקציר

בדיקת צלחת חמה נמצאת בשימוש נרחב כדי להעריך השפעות משככי כאבים על כאב דלקתי בעכברים. מודל נפוץ של כאב דלקתי נגרם על ידי הזרקה intraplantar של carrageenan בכפה אחורית אחת. עם זאת, הממצאים מהמעבדה שלנו הראו כי עכברים עם הזרקת קרגינן בכפה אחורית אחת הרימו את כפותיהם כדי למנוע רעש תרמי במהלך בדיקת הפלטה החשמלית. בגלל תגובה זו, שיטת ההזרקה הקודמת אינה יכולה לשקף במדויק את סף הכאב התרמי. לכן, חקרנו שיטה חדשה כדי למנוע בעיה זו. במחקר הנוכחי, שינינו את השיטה הקודמת על ידי הזרקת קרגינן לשתי הכפות האחוריות כדי לבסס את המודל של כאב דלקתי. התוצאות הראו כי הזרקת שתי כפות אחוריות עם קרגינן הייתה רגישה ושיטה טובה יותר לגרום לכאב דלקתי בעת שימוש במבחן פלטה חמה מאשר הזרקת כף אחורית יחידה. על בסיס ממצאים אלה, תכננו ניסויים נוספים שבהם עכברים עם הזרקת קרגינן של שתי כפות אחוריות או כפות אחוריות בודדות של קרגינן טופלו באופן תוך-גסטרי בסלקוקסיב (30 מ"ג/ק"ג). תוצאות בדיקת הפלטה החמה הראו כי סלקוקסיב הגדיל את סף הכאב התרמי בעכברים עם הזרקת קרגינן בשתי כפות הרגליים האחוריות, אך לא בעכברים עם הזרקת קרגינן בכפה אחורית אחת. לסיכום, פיתחנו שיטה מעולה להשראת מודל של כאב דלקתי להערכת אפקט משכך כאבים.

מבוא

כאב הוא בעיה של בריאות הציבור ברחבי העולם. הוא מופעל על ידי גירוי תרמי, מכני או כימי מזיק. קשה לבצע מחקרי כאב בבני אדם בגלל חששות אתיים. לכן, שימוש במודלים של כאב בבעלי חיים הוא גישה מרכזית להבנת מנגנוני כאב וטיפולים מחקריים¹. בדיקת צלחת חמה כבר בשימוש נרחב להערכה של nociception תרמי hyperalgesia². נכון לעכשיו, המודל של כאב דלקתי המשמש לבדיקת צלחת חמה מושרה עם הזרקה intraplantar של carrageenan בכפה אחורית אחת. לדוגמה, כדי לחקור את ההשפעה האנטינוסיצפטיבית של מיקרוספרות עמוסות רוטיגוטין, מודל חייתי של כאב דלקתי הוכן על ידי הזרקת כף אחורית אחת³. כדי להעריך את ההשפעות של מעכבי catechol-o-methyl-transferase על nociception תרמי בעכברים, carrageenan ניתן לאזור plantar של הכף האחורית הימנית⁴. כדי לחקור את התפקיד משכך כאבים של תמצית Posidonia oceanica (L.) Delile, מודל כאב דלקתי הוכן בעכברים על ידי הזרקה intraplantar של carrageenan בכף האחורית הימנית⁵. עם זאת, הממצאים מהמעבדה שלנו הראו כי עכבר עם הזרקת כף אחורית אחת של קרגינן ירים את כפו כדי למנוע רעש תרמי, אשר מרחיב באופן לא מדויק את תגובת החיה לגירוי תרמי במבחן הפלטה החשמלית. לפיכך, שיערנו כי מודל הכאב הדלקתי עם הזרקת קרגינן בכפה אחורית אחת לא יכול היה לשקף במדויק את סף הכאב התרמי. לכן, ביצענו אופטימיזציה של השיטה על ידי הזרקת קרגינן לשתי הכפות האחוריות כדי לבסס מודל כאב דלקתי שונה.

לעכברים שקיבלו זריקת קרגינן בשתי כפות הרגליים האחוריות לא הייתה דרך להימנע מהגירוי התרמי של שתי הכפות האחוריות בו זמנית. סף הכאב הוגדר כזמן מהנחת העכבר על הפלטה החמה ועד לליקוק העכבר באחת מכפותיו האחוריות. התוצאות אישרו כי מודל הכאב הדלקתי המותאם מתאים יותר להערכת סף הטמפרטורה הנוסיספטיבית. זה עשוי לשפר את היעילות של בדיקת פלטה חמה למחקר ופיתוח של תרופות משככי כאבים.

פרוטוקול

פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת יאנטאי (No. YTDX20220425). הנהלים פעלו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לשימוש בחיות מעבדה.

1. בעלי חיים

1. השתמשו בנקבות עכברי ICR במשקל 20-25 גרם לצורך הניסויים.
2. אפשרו לבעלי החיים להתאקלם בסביבת חדר הניסויים במשך 3 ימים לפני תחילת הניסויים.
3. שמרו על חדר הניסויים עם מחזור אור-חושך של 12 שעות, וספקו לעכברים גישה חופשית למים ולצ'או.

2. הכנת תמיסת קרגינן

1. שוקלים 0.1 גרם של carrageenan. הוסף 10 מ"ל של מלוחים רגילים מעוקרים לצינור.
2. מוסיפים 0.1 גרם קרגינן לצינור ומערבלים את הצינור למשך 30 שניות.
3. אספו את תמיסת הקרגינן המעוקר 1%.
4. הכינו את תמיסת הקרגינן לפני הניסויים.

3. הזרקה intraplantar של carrageenan

1. השתמש מזרק (0.05 מ"ל, 29G x 1/2 אינץ ', 0.33 מ"מ × 12.7 מ"מ) כדי להזריק את תמיסת קרגינן 1%.
2. נערו את תמיסת הקרגינן לפני שתמשכו אותה לתוך המזרק. ודא שאין בועה במזרק.
3. יש לחטא את אזור ההזרקה (כף אחורית) ב-75% אלכוהול.
4. יש להזריק 30 μL ^6,7 של 1% תמיסת קרגינן תת עורית לתוך פני השטח הפלנטריים של הכף האחורית. עבור עכברי קבוצת הביקורת, יש להזריק 30 מיקרוליטר של מי מלח רגילים.
   1. הכנס את המחט באלכסון כלפי מעלה לתוך כרית כף הרגל האחורית. לשמור על יציבות המזרק.
   2. לאחר ההזרקה, משוך את המזרק באיטיות ולחץ על אתר ההזרקה במשך 2 שניות כדי למנוע דליפה.

4. בדיקת פלטה חמה

1. בצע את בדיקת צלחת חמה 3 שעות לאחר הזרקת intraplantar.
2. נקו וחיטאו את פני השטח של הפלטה החמה.
3. הפעל את מנגנון הפלטה החמה. לחץ על הלחצן מצב טמפרטורה . לחץ על CONSTANT כדי לכוון את הטמפרטורה ל- 55 ±- 0.2 °C.
4. לחץ על לחצן התחל ניסוי ולחץ על תפוצה. קחו עכבר ממיכל האירוח. אחזו בעדינות בתא המטען שלו. הניחו את העכבר במרכז הפלטה החשמלית. לחץ על התחל.
5. שימו לב ותיעדו את הזמן ללקק את הכף האחורית השמאלית (לעכברים עם הזרקת כף אחורית יחידה) או את הכף האחורית (לעכברים עם הזרקת שתי כפות אחוריות) בתגובה לגירוי החום. לחץ על הדוושה של הפלטה החמה כדי לראות את השעה במסך הפלטה החשמלית. הגדר סף כאב כזמן מהנחת העכבר על הפלטה החמה ועד ליקוק הכף האחורית.
6. הגדר מגבלה של 60 שניות לבדיקת פלטה חמה ^4,8,9. רשום סף כאב של 60 שניות אם מגיעים למגבלה.
   הערה: נקה את מכשיר הפלטה החמה עם 75% אלכוהול לפני הנחת העכבר הבא כדי למנוע הטיה אפשרית עקב ריח שיורי מהעכבר הקודם.

5. הכנת תרחיף סלקוקסיב 1.5 מ"ג / מ"ל

1. יש ליטול כמוסה אחת המכילה 200 מ"ג סלקוקסיב. קבל את התוכן של הכמוסה ולטחון אותו לתוך אבקה.
2. הוסף 0.5% נתרן carboxymethyl תאית. הנפח הסופי הוא 13.3 מ"ל. זוהי השעיית החנות של celecoxib.
3. קח 1 מ"ל של השעיית החנות celecoxib. הוסף 9.0 מ"ל של 0.5% נתרן carboxymethyl cellulose כדי לקבל 1.5 מ"ג / מ"ל של תרחיף celecoxib.
4. יש לתת 0.2 מ"ל/10 גרם של השעיית celecoxib תוך גסטרית לעכברים.
   הערה: בחר מחט gavage עם אורך 4.0-4.5 ס"מ עבור עכברים במשקל 20-25 גרם.

6. הערכת מודל הכאב הדלקתי המותאם

1. חלקו באופן אקראי נקבות עכברי ICR לשלוש קבוצות: קבוצת ביקורת, מודל וקבוצת סלקוקסיב.
2. יש להזריק 30 μL של תמיסת קרגינן 1% תת עורית לתוך פני השטח הפלנטריים של הכף האחורית (כף אחורית אחת או שתי כפות אחוריות). עבור עכברי קבוצת הביקורת, יש להזריק 30 מיקרוליטר של מי מלח רגילים.
3. לאחר הזרקת קרגינן או מי מלח רגילים, בצע את הטיפול באופן מיידי. מתן תוך-גסטרי של סלקוקסיב במינון של 30 מ"ג/ק"ג לעכברים בקבוצת הסלקוקסיב. עבור עכברים בקבוצות הבקרה והמודל, תוך גזסטרית לנהל 0.5% נתרן carboxymethyl צלולוז.
4. בצע את בדיקת הפלטה החמה (סעיף 2) ב 3 שעות לאחר הזרקת carrageenan.

7. שיטות סטטיסטיות

1. הצג את תוצאות הניסוי כממוצע ± סטיית תקן. בצע בדיקת התפלגות נורמלית עם הטוב הסטטיסטי Kolmogorov-Smirnov של מבחן ההתאמה.
2. נתח את ההשוואה בין שתי הקבוצות באמצעות מבחן t לא מזווג. בצע השוואות קבוצתיות מרובות באמצעות ניתוח חד-כיווני של שונות ואחריו מבחן דנט. שקול את הערך של p < 0.05 מובהק סטטיסטית.

תוצאות

סף הכאב במודלים של כאב דלקתי
סף הכאב של מודל הכאב הדלקתי עם הזרקת קרגינן בכפה אחורית אחת היה 32.23 ±-11.11 שניות, בעוד שסף הכאב של קבוצת הביקורת היה 27.73 ±-7.08 שניות. בהשוואה לקבוצת הביקורת, סף הכאב של מודל הזרקת כף אחורית אחת לא הראה ירידה משמעותית (p > 0.05, איור 1A). סף הכאב של מודל הכאב הדלקתי עם הזרקת קרגינן בשתי כפות הרגליים האחוריות היה 21.84 ±-5.63 שניות, בעוד שסף הכאב של קבוצת הביקורת היה 28.21 ±-8.61 שניות. בהשוואה לזה של קבוצת הביקורת, סף הכאב של מודל הזרקת שתי כפות הרגליים האחוריות ירד באופן משמעותי (p < 0.05, איור 1B).

אפקט משכך כאבים של celecoxib במודלים שונים של כאב דלקתי
במודל הכאב הדלקתי עם הזרקת קרגינן בכפה אחורית אחת, סף הכאב של קבוצת סלקוקסיב (27.01 ± 10.98 שניות) לא הראה עלייה משמעותית בהשוואה לזה של קבוצת המודל (29.77 ± 13.97 שניות, p > 0.05). בהתאם לתוצאות לעיל, סף הכאב של קבוצת המודל לא הראה ירידה משמעותית בהשוואה לזה של קבוצת הביקורת (30.94 ±-14.54 שניות), מה שהצביע על כך שהזרקת קרגינן בכפה אחורית אחת לא גרמה למודל כאב דלקתי (איור 2A). במודל הכאב הדלקתי עם הזרקת קרגינן בשתי כפות הרגליים האחוריות, סף הכאב של קבוצת המודל (15.61 ± 4.85 שניות) ירד משמעותית בהשוואה לזה של קבוצת הביקורת (23.55 ± 3.96 שניות, p < 0.05). בהשוואה לקבוצת המודל, סף הכאב של קבוצת הסלקוקסיב (20.29 ±-3.10 שניות) ירד משמעותית (איור 2B).

איור 1: ספי הכאב במודלים של כאב דלקתי. (ממוצע ± סטיית תקן, n = 15). (A) סף הכאב של מודל הכאב הדלקתי עם הזרקת קרגינן בכפה אחורית יחידה. (B) סף הכאב של מודל הכאב הדלקתי עם הזרקת קרגינן בשתי כפות הרגליים האחוריות (^#P<0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ההשפעה משככת הכאבים של סלקוקסיב במודלים שונים של כאב דלקתי (ממוצע ± סטיית תקן, n = 14). (A) ההשפעה משכך הכאבים של סלקוקסיב במודל הכאב הדלקתי עם הזרקת כף אחורית אחת של קרגינן. (B) ההשפעה משכך הכאבים של celecoxib במודל כאב דלקתי עם הזרקת שתי כפות אחוריות של carrageenan, ( ^#P<0.05, *P<0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

כאב הוא תגובת הגנה המופעלת על ידי נזק לרקמות או פציעה. עם זאת, יש לה גם השפעה שלילית על איכות החיים¹⁰. לכן, פיתוח משככי כאבים יעילים וחקר מנגנוני כאב נשארים תחומי מחקר פעילים. השיטות להערכת כאב ממלאות תפקיד מפתח בפיתוח תרופות משככי כאבים. הזרקת קרגינן בכפה אחורית אחת היא שיטה קלאסית לבדיקת פלטה חמה. המודל השונה המושרה על ידי הזרקת קרגינן בשתי כפות הרגליים האחוריות שאנו מציגים כאן מספק דרך אמינה לחקור את יעילותם של סוכנים טיפוליים פוטנציאליים להקלה על הכאב.

במחקר הנוכחי מצאנו כי עכברים עם זריקה של קרגינן בכפה אחורית אחת לא הראו ירידה בסף הכאב. עם זאת, במחקרים אחרים, שיטה זו הובילה להפחתה משמעותית בסף הכאב במבחן פלטה חמה^11,12. הפער בתוצאות בין המחקרים הקודמים למחקר זה עשוי להיות מוסבר על ידי מיני בעלי החיים השונים ששימשו בניסויים 13,14,15,16. הסבר אפשרי נוסף הוא שראינו את העכברים עם הזרקת כף אחורית אחת של קרגינן מרימים לעתים קרובות את הכף המוזרקת או דורכים קלות על הצלחת כדי להימנע מהגירוי התרמי. הערכת סף הכאב דורשת התבוננות בתגובה הנוסיספטיבית האופיינית של ליקוק או טלטול הכף המוזרקת. כך קיבלנו תוצאה שלילית, המצביעה על כך שסף הכאב של המודל עם הזרקת קרגינן בכפה אחורית אחת לא ירד משמעותית. עכברים עם הזרקת קרגינן בשתי כפות הרגליים האחוריות לא הצליחו להימנע מהגירוי התרמי על ידי הרמת הכף או דריכה קלה על הצלחת. סף הכאב נחשב לליקוק או רעד של אחת הכפות האחוריות, המשקף את התגובה הנוסיספטיבית האמיתית של העכברים.

כדי לאמת את עליונותו של מודל הכאב הדלקתי השונה, עכברים עם זריקות כף אחורית אחת או שתי כפות אחוריות של קרגינן טופלו עם ניהול intragastric של celecoxib. בהתאם להשערה של מחקר זה, celecoxib הפעיל אפקט משכך כאבים במודל כאב דלקתי שונה, אבל זה לא הראה שום השפעות במודל עם הזרקת כף אחורית אחת של carrageenan. ממצא זה הוכיח כי מודל הכאב הדלקתי המותאם אמין לבדיקת משככי כאבים פוטנציאליים.

יש מגבלות במחקר הזה. זנים רבים ושונים של עכברים שימשו בבדיקות פלטה חשמלית. זני עכברים שונים עשויים להציג תגובות שונות לגירויים תרמיים. הניסוי הנוכחי השתמש רק בעכברי ICR כדי לבחון את ההשערה. לכן, עדיין לא ברור אם השיטה ששונתה מזהה באופן מדויק ועקבי ספי כאב בזני עכברים אחרים בבדיקת הפלטה החשמלית. בנוסף, לא תכננו ניסוי פיילוט להערכת סף הכאב של העכברים ולכן לא שללנו בעלי חיים עם סף כאב גבוה. עם זאת, מגבלה זו עשויה להיחשב גם כיתרון של השיטה הנוכחית ששונתה. זה לא רק מפשט את התהליך של מבחן משכך כאבים, אלא גם משקף את טווח התגובות של עכברים במבחן צלחת חמה. יתר על כן, מדידת נפח הכף האחורית תסייע לאשר את השראת הדלקת ולאמת את ההשפעה משככת הכאבים של תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידיות (NSAIDs). עם זאת, הניסיון שלנו הוכיח כי לא קל למדוד את נפח כף העכברים. כף העכבר קטנה מכדי לקבל ערך מדויק. לכן, המחקר הנוכחי לא נועד לחקור את השינוי בנפח הכף לאחר דלקת.

לסיכום, בעקבות השלבים שתוארו לעיל, מודל הכאב הדלקתי עם הזרקת קרגינן בשתי כפות הרגליים האחוריות מאפשר לקבוע את הסף התרמו-נוסיצפטיבי של עכברים בצורה אמינה. יתר על כן, עם מתן משככי כאבים, זוהתה עלייה בסף הכאב באופן סטטיסטי. מודל הכאב הדלקתי המותאם שימושי להקרנת משככי כאבים פוטנציאליים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש למחקר בביולוגיה של כאב, פיתוח תרופות חדשות וטיפול קליני, כמו גם לספק רעיונות ופתרונות חדשים לניהול כאב.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AL204 איזון אלקטרוני	Yuheng סוללה ושות', בע"מ	YH-400A
קרבוקסימתיל צלולוז	טיאנג'ין כימית ושות', בע"מ
Carrageenan	Sigma, MO, ארה"ב	29H0715
Celecoxib	Pfizer Inc.
פלטה חמה	UGO בע"מ ושות', איטליה	PB-200
עכברים נקבות ICR	ג'ינאן פנגיו  ושות', בע"מ
תמיסת מלח רגילה	קלון פרמצבטיקה ושות', בע"מ