מאמר שיטה

אבחון מבוסס קריספר נקודתי עם ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה

DOI:

10.3791/66703

⸱

16 באוגוסט 2024

 ,  , 
1School of Biomolecular Science and Engineering, Vidyasirimedhi Institute of Science and Technology (VISTEC)

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים את ההכנה שלב אחר שלב של הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז מעורבבת מראש, ליופילית ותגובות מבוססות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), אשר ניתן להשתמש בהן לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין של פתוגנים של מחלות זיהומיות או סמנים גנטיים אחרים בעלי עניין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבחון מולקולרי על ידי זיהוי מבוסס Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) הוא בעל דיוק אבחוני גבוה ותכונות המתאימות לשימוש בנקודות טיפול, כגון זמני אספקה מהירים לתוצאות, קריאות פשוטות נוחות וללא צורך במכשירים מסובכים. עם זאת, התגובות יכולות להיות מסורבלות לביצוע בנקודת הטיפול בשל מרכיביהן הרבים ושלבי הטיפול הידניים. בזאת, אנו מספקים פרוטוקול ממוטב שלב אחר שלב לזיהוי חזק של פתוגנים וסמנים גנטיים של מחלות עם הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז וריאגנטים מבוססי קריספר, אשר מעורבבים מראש ולאחר מכן מיובשים בהקפאה בפורמטים קלים לאחסון ומוכנים לשימוש. ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה ניתנים להתייבשות לשימוש מיידי ושומרים על יעילות הגברה וזיהוי גבוהה. אנו מספקים גם מדריך לפתרון בעיות נפוצות בעת הכנה ושימוש בריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה לאבחון מבוסס קריספר, כדי להפוך את פלטפורמת הזיהוי לנגישה יותר לקהילות האבחון/בדיקות גנטיות רחבות יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אבחון מבוסס קריספר לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין דווח לראשונה בשנת 2017 1,2,3,4, ומאז, הוכח כאבחון הדור הבא עם בדיקות שאושרו על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA), במיוחד לזיהוי RNA של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2), במספר מדינות 5,6,7,8 . מעבר למחלת הקורונה 2019 (COVID-19), הטכנולוגיות הוכחו כיעילות לאיתור וירוסים וחיידקים מגוונים 9,10,11,12,13, מוטציות ומחיקות של מחלות גנטיות, וניתן להנדס אותן לאיתור סמנים ביולוגיים של חלבונים ומולקולות קטנות 2,12. אבחון מבוסס קריספר משלב לעתים קרובות שיטות הגברה איזותרמיות - כגון הגברה של רקומבינאז פולימראז (RPA) או הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP)14,15 - עם זיהוי מבוסס קריספר באמצעות אנזימים הקשורים לקריספר מונחה RNA (Cas) עם פעילות אנדונוקלאז "בטחוני" לאחר זיהוי מטרה3. השימוש הכפול בהגברה איזותרמית וגילוי מבוסס קריספר מעניק מספר תכונות רצויות לטכנולוגיות, במיוחד דיוק אבחון גבוה המתקרב לזה של תגובת שרשרת פולימראז סטנדרטית זהב (PCR), ויכולת לריבוב וזיהוי הבדלי רצפים קטנים, כולל פולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים 1,9.

עם זאת, הגרסאות המדויקות ביותר של אבחון מבוסס קריספר מכילות רכיבים ושלבים מרובים ועשויות להיות מסובכות לביצוע עם אנשים שאינם מומחים או בנקודת הטיפול (POC). כדי להתמודד עם אתגר זה של הרחבת השימוש באבחון מדויק ביותר מבוסס קריספר להגדרות POC, פיתחנו פרוטוקולים להכנת הגברה איזותרמית מעורבבת מראש, ליופילית, מבוססת רקומבינאז ותגובות זיהוי מבוססות קריספר, קלות לשימוש ולאחסון7. פרוטוקולים אלה צריכים להשלים פרוטוקולים מצוינים קיימים על אבחון מבוסס קריספר14, המכילים מידע נוסף על ייצור רכיבים ביוכימיים הדרושים לאבחון מבוסס קריספר7, הנחיות תכנון1, ופורמולציות המשתמשות בטכניקות הגברה איזותרמיות חלופיות 2,14,15,16 ואנזימי Cas 12. בסופו של דבר, אנו מקווים שאבחון מבוסס קריספר יוכל לסייע במימוש זיהוי גרעין מהיר, זול ורגיש בסביבות שבהן נדרשים ניתוחים ניידים ונטולי מכשירים 1,9,17.

אנו משתמשים בעיקר בשילוב של זיהוי מבוסס RPA ו- Cas13 בפרוטוקולים שלנו. RPA פועל בטמפרטורות סביבה קרובות (37-42 ° C), ולכן, יש דרישות אנרגיה וציוד נמוכות. תגובות הגברה איזותרמיות אחרות דורשות טמפרטורות גבוהות יותר (LAMP, 60-65°C; הגברת תזוזת גדיל (SDA), 60°C; תגובת הגברה מעריכית (EXPAR), 55°C; והגברה תלוית מנחת מסוקים (HDA), 65°C)2. גם העיצוב של פריימרים RPA אינו מורכב, בניגוד לפריימרים LAMP, וניתן להרחיב אותו להגברה מרובבת 7,9,14. למרות שריבוב מעבר לשתי מטרות עם RPA קשה בפועל, ישנן הנחיות ברורות כיצד לתכנן פריימרים RPA מרובבים כדי למזער הפרעות18.

בעוד שזיהום נשיאה נותר בעיה גדולה בתהליך העבודה הדו-שלבי, האמפליקונים שנוצרו של RPA הם קטנים בגודלם ונוטים פחות לגרום לזיהום נשיאה בהשוואה לאמפליקונים שרשוריים גדולים מ- LAMP14. פריימרים RPA ניתן לתכנן על פי הנחיות תקן14: הם בדרך כלל 25-35 נוקלאוטיד ארוך עם טמפרטורות התכה של 54 עד 67 ° C. גודל האמפליקון צריך להיות קטן מ-200 זוגות בסיסים. ניתן להוסיף את אנזים השעתוק ההפוך (RT) ל-RPA כדי לאפשר הגברה מ-RNA, ובשעתוק לאחור-RPA (RT-RPA), אנזים נוסף ריבונוקלאז H (RNase H) מתווסף בדרך כלל בכמויות קטנות כדי לסייע בפתרון הרנ"א המתקבל: DNA היברידי ולקדם את תגובת ההגברה 5,19. כדי לאפשר שעתוק T7 לזיהוי מבוסס Cas13, ניתן למקם את מקדם T7 RNA פולימראז בקצה 5' של פריימר RPA קדמי.

לאחר שאמפליקונים נוצרים מ-RPA, ניתן לזהות אותם באמצעות אנזימי Cas מתוכנתים של crRNA. בין אנזימי Cas שונים שניתן להשתמש בהם לזיהוי אמפליקון, אנו מעדיפים גרסאות Cas13 ממוקדות RNA בשל פעילות המחשוף הגבוהה שלהם1 והעדפות מחשוף פולינוקלאוטידים מאופיינות היטב 7,9, שהאחרון שבהם יכול לשמש לזיהוי מרובה. רצף crRNA עבור Cas13 מתוכנן להיות משלים (משלים הפוך) לאתר המטרה ב-RNA המיוצר עם רצפי ספייסר וחזרה ישירה (DR). רצף crRNA ופריימרים RPA לא צריכים לחפוף, כדי למנוע זיהוי מבוסס Cas לא רצוי של מוצרי הגברה מחוץ למטרה, אשר מגביר רקע ותוצאות חיוביות שגויות14.

זיהוי מבוסס Cas מסתמך על שיטות זיהוי שונות כדי לנטר את הפיצול של מולקולות חומצות גרעין מדווח (כתבי RNA עבור תגובות מבוססות Cas13)1,2,14. שיטות גילוי שונות כוללות קולורימטריה, קריאות אלקטרוכימיות, פלואורסצנטיות, קריאות רצף ורצועות זרימה רוחביות2. אנו מתמקדים בקריאת הפלואורסצנטיות בהינתן מגוון פלואורופורים וכתבים כגון ציאנין 5 (Cy5), רודאמין X (ROX) וקרבוקסיפלואורסצאין (FAM), שניתן לעורר ביעילות באמצעות מקור אור LED כחול יחיד, והפלואורסצנטיות שלהם מנותחת על ידי קורא מיקרו-לוחות או מחזור תרמיבזמן אמת 7,14. בנוסף, קריאת פלואורסצנטיות קלה להגדרה ומאפשרת ניטור רציף, המאפשר כימות בזמן אמת. ניתן לשלב הגברה מוקדמת של RPA מרובב וזיהוי מבוסס Cas13 באמצעות אנזימי Cas עם קריאות פלואורסצנטיות צבעוניות לזיהוי סימולטני של מטרות גנטיות מרובות 2,7.

בפרוטוקולים שלנו, אנו מגבירים תחילה באופן איזותרמי רנ"א עם RT-RPA על-ידי הוספת דגימת רנ"א לצורה הליופילית של מגיב RT-RPA (איור 1). במהלך RT-RPA, מקדם T7 מתווסף למגבר הדנ"א הדו-גדילי שנוצר. לאחר מכן, מוצרי RPA מועברים לזיהוי מבוסס Cas13 ליופילי, המכיל גם T7 RNA פולימראז. תגובת זיהוי זו תמיר אמפליקונים של DNA ל-RNA (באמצעות T7 RNA פולימראז), אשר ניתן לזהות בקלות באמצעות Cas13 מתוכנת crRNA. Cas13 המופעל על ידי מטרה יבקע מולקולות כתב כדי לייצר אות פלואורסצנטי 2,7,14 הניתן לזיהוי. בעוד שהפרוטוקולים כאן מתייחסים לזיהוי על ידי Leptotrichia wadei (LwaCas13a), ניתן להרחיב אותם לזיהוי סימולטני מרובב של עד ארבע מטרות באמצעות אנזימים אורתוגונליים Cas13 ו- Cas12 7,9. תגובות זיהוי מבוססות RPA ו- Cas יכולות גם להיות משולבות לצינור יחיד, אם כי באובדן רגישות14.

figure-introduction-1
איור 1: זרימת עבודה לזיהוי מבוססת קריספר. זרימת העבודה מדגימה זיהוי של שני גני מטרה. ראשית, אזורי עניין בתוך יעד הדנ"א מוגברים באופן איזותרמי באמצעות RPA; התגובה יכולה להתבצע באמצעות שעתוק לאחור (RT-RPA) בעת זיהוי מטרות RNA. לאחר מכן, שעתוק T7 ממיר אמפליקונים dsDNA לרנ"א, אשר בתורו מזוהים על ידי קומפלקסים Cas13-crRNA המסוגלים לעורר פעילות RNase בטחונות בעת קשירת המטרה. מחשוף של כתבי פלואורסצנטיות מרווים מייצר אותות פלואורסצנטיים שניתן לנטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות, לדמיין על ידי טרנסילטור LED, או להשתמש בהם עם מחזור תרמי בזמן אמת. קיצורים: CRISPR = מקובצים במרווחים קבועים של חזרות פלינדרומיות קצרות; RT = תמלול הפוך; RPA = הגברת רקומבינאז פולימראז; Cas = חלבון הקשור לקריספר; LED = דיודה פולטת אור. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

המאפיינים העיקריים של הפרוטוקולים המוצגים כאן הם ניסוחים premixing עבור lyophilization. ערבוב מקדים מפשט את השימוש בתגובה ומשפר את יכולת השחזור, אך רכיבים רבים בזיהוי מבוסס RPA ו- Cas - במיוחד שעתוק לאחור וכמה גורמים משלימים כמו ATP אינם יציבים בתמיסה. לכן, אנו מגבשים את הפתרונות המעורבבים מראש כך שניתן יהיה לייבש אותם בהקפאה לאחסון לטווח ארוך ולשינוע ופריסה קלים 1,9,20. ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה מסייעים גם הם לשפר את רגישות הזיהוי, מכיוון שניתן להוסיף נפח דגימה גבוה יותר (ולכן, קלט DNA/RNA גבוה יותר) כדי לשחזר את התגובה10. בנוסחאות שלנו, אנו משתמשים בעיקר בטרהלוז21 כמגן קריוגני בתגובות זיהוי מבוססות RPA ליופיליות ו- Cas7. בנוסף לשימור ריאגנטים, טרהלוז גם מקדם את התגובות באמצעות הגדלת ייצוב האנזים 16,22,23,24 והפחתת טמפרטורות ההתכה של dsDNA 23. חקר מייצבים אחרים 5,7,21,25,26 מעבר לטרהלוז עשוי להניב ניסוחים אופטימליים עוד יותר לתרחישי שימוש שונים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת ריאגנטים מעורבים מראש RT-RPA lyophilized

  1. הכנת ציוד
    1. הכינו דיואר חנקן נוזלי או מגש להקפאת הבזק של תגובות. מלאו את הדיואר או המגש בחנקן נוזלי.
    2. מייבש בהקפאה
      1. בדוק מים מרוכזים בצינורות ניקוז ואת פנים החדר; מוציאים את המים במידת הצורך.
      2. נקו את פנים התא ואת מתלה המתכת צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל עם תמיסת טיהור RNase, ואחריה 70% אתנול.
      3. סגור את דלת התא ואת שסתום שחרור הוואקום.
      4. הפעילו את מייבש ההקפאה.
      5. הגדר ידנית את טמפרטורת המדף ל -30 ° C.
    3. ציוד ביולוגיה מולקולרית
      1. נקו את הדברים הבאים עם תמיסת טיהור RNase: פיפטות (פיפטה), מתלי קצה פיפטה, מערבל מערבולת, מיניצנטריפוגה מסתובבת וסמן קבוע.
      2. נקו את הפריטים הבאים במי ברז, ולאחר מכן נגבו בנייר מגבונים: מתלים מפלסטיק לצינורות מיקרוצנטריפוגות וקופסת קצף לקרח.
      3. הכינו גוש חימום (המשמש להמסת תמיסת הטריגליצין) על ידי ניקויו בתמיסת טיהור RNase ואתנול 70%. לאחר מכן, הפעל אותו והגדר את הטמפרטורה ל -60 מעלות צלזיוס.
  2. הכנת תגובות RPA מעורבות מראש
    הערה: נוסחה זו מיועדת ל-10 תגובות (באמצעות שלושה כדורי RPA).
    1. בדוק אם יש משקע בתמיסת הטריגליצין לפני השימוש. אם יש שקעים, יש להמיס אותם על ידי דגירה בטמפרטורה של 60°C וערבוב יסודי לפני השימוש. קררו את תמיסת הטריגליצין לפני הוספת ריאגנטים רגישים אחרים לחום.
      הערה: משקעים יכולים להיווצר בקלות אם הצינור נשאר בטמפרטורת החדר לתקופה ממושכת.
    2. מוציאים מהמקפיא שלושה צינורות רצועת כדורי RPA; הקש על צינורות הרצועה על ידי הטחתם בעדינות על ספסל המעבדה כדי לעקור את הכדורים הלבנים.
    3. מעבירים את כל שלושת הכדורים לצינור מיקרוצנטריפוגה A בנפח 1.5 מ"ל.
    4. פיפטה 25 μL של מים נטולי נוקלאז כדי לשטוף את כל אבקת RPA שנותרה בצינורות הרצועה ולהעביר את תמיסת השטיפה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל B.
    5. הוסף 10 μL של תמיסת טריגליצין 0.57M ו- 10 μL של תערובת פריימר (10 μM כל אחד) לצינור מאסטרמיקס B.
    6. מערבולת ערבוב צינור B; לאחר מכן סובבו מטה והניחו את הצינור על קרח.
    7. הוסף 28.4 μL של חיץ 5x RPA (מוכן מ 500 μL של 50% (w/v) PEG20000, 250 μL של 1 M Tris pH 7.4, ו 100 μL של 100 mM dithiothreitol (DTT)) לצינור מאסטרמיקס B ולערבב היטב על ידי הקשה חזקה או ניעור מספר פעמים.
      הערה: אנו מייצרים את הפתרון באופן זה כדי לעזור לדלל/להפחית את צמיגות ה-PEG בצינור המאסטרמיקס, לפני הוספת הכל לכדורי RPA מסיסים.
    8. העבר כדורים שנאספו בצינור A משלב 1.2.3 לתוך צינור Mastermix B ולאחר מכן הפוך את צינור Mastermix מספר פעמים כדי לערבב. שימו לב אם התמיסה נראית הומוגנית ומונופאזית (היא גם תיראה מעט אטומה) ולאחר מכן, הניחו את הצינור על קרח.
      הערה: אם הערבוב אינו יסודי, PEG עלול לגרום לתמיסה/מתלה להיפרד פאזה.
    9. הוסף 0.71 μL של 200 Unit/μL RT ו- 2.84 μL של 5 Unit/μL RNase H לצינור המאסטרמיקס. הקש בעדינות או הפוך את צינור Mastermix למעלה ולמטה פעמים רבות. סובבו מטה והניחו את הצינור על קרח.
      הערה: אנו מוסיפים אנזימים אלה לאחר ערבוב כבד של שלבים מוקדמים יותר מכיוון ש- RT ו- RNase H רגישים לגזירה עקב ערבוב; אין יותר מערבולות לאחר הוספת RT/RNase H.
    10. Aliquot 8.4 μL של פתרון mastermix ל 10 צינורות 1.5 מ"ל מקורר מראש ומניחים את הצינורות על קרח. לשם כך, טבלו את קצה הפיפט בתמיסת מאסטרמיקס ומשכו את תמיסת המאסטרמיקס לתוך הקצה לאט ובהתמדה כדי למנוע היווצרות בועות אוויר ולהבטיח מדידת נפח מדויקת. הוציאו את תמיסת המאסטרמיקס לצינור מקורר מראש של 1.5 מ"ל.
      הערה: עם 8.4 μL aliquoted, מניסיוננו, יישאר ~ 1-2 μL השעיה בצינור Mastermix. הנסיין יכול לכוונן מעט את עוצמת הקול כדי להבטיח מספיק ריאגנטים לכל 10 התגובות. השתמש בטכניקות פיפטינג נכונות בעת טיפול בתמיסות צמיגיות.
    11. לאחר השלמת aliquoting, מניחים את הצינורות במדף מתכת שקוע בחנקן נוזלי כדי להכין אותם לליופיליזציה. אפשר לצינורות להיות שקועים בחנקן נוזלי למשך 5 דקות.
      הערה: כמו lyophilization מסיר תמיסה עודפת, זה מאפשר לנו להוסיף יותר קלט DNA/RNA, אשר מסייע להגביר את הרגישות. תגובות RPA מיובשות מראש מיובשות בהקפאה ניתן לאחסן ב -20 ° C במשך 8 חודשים. ליופיליזציה מסייעת בשחזור אם ניסוי נתון מבוצע באמצעות תערובות RPA שהוכנו באותה אצווה, כך שביצוע אצווה גדולה יותר גם עוזר.
  3. ליופיליזציה
    1. במייבש ההקפאה, בדקו את טמפרטורת הקולט והמדף. במידת הצורך, המתן עד שטמפרטורת האספן תגיע ל -75 ± 5 מעלות צלזיוס וטמפרטורת המדף תגיע ל -30 ± 1 מעלות צלזיוס.
    2. כסו את הצינורות הפתוחים במדף המתכת ביריעת נייר ניגוב, הניחו את מדף המתכת יחד עם הצינורות הפתוחים במדף מייבש ההקפאה וסגרו את דלת המדף.
    3. בחר את התוכנית המוצגת בטבלה 1 ולחץ על התחל. לאחר 30 דקות של שלב הייבוש המשני (20 ° C, <0.1 mbar; הטמפרטורה מוחזקת עד אינסוף על ידי הגדרת זמן הצעד ל "אינסופי"), לחץ על הפסק את התוכנית.
      הערה: אנו מאפשרים לצינורות להתחמם במייבש ההקפאה כדי למנוע עיבוי מים.
    4. שחררו את הלחץ על ידי פתיחת שסתום שחרור הוואקום ולאחר מכן הסירו את המדף מהמדף. מכסים את הצינורות מיד ומאחסנים את התגובות הליופיליות ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן תגובות מעורבות מראש של RPA ו-CRISPR-Cas13a בטמפרטורה של -20°C למשך 8 חודשים.

2. הכנת ריאגנטים לזיהוי CRISPR-Cas13a מעורבבים מראש

הערה: בצע את שלב 1.1 להכנת ציוד.

  1. הכנת תגובה מעורבת מראש CRISPR-Cas13a (10 תגובות)
    1. הסר את הפריטים הבאים מהאחסון והנח אותם על קרח: 10 μL של LwaCas13a (מיוצר בבית 7,8,14) (2 מ"ג / מ"ל), מאגר אחסון Cas, 10 ng / μL (225 nM) crRNA, 25 mM rNTP, 50 יחידות / μL T7 RNA פולימראז, 2 מיקרומטר של כתב פלואורסצנטי FAM.
    2. הכן פתרון עבודה של LwaCas13a ב 126 מיקרוגרם / מ"ל (900 ננומטר) על ידי הוספת 148.8 מיקרוליטר של מאגר אחסון Cas (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.6 M NaCl, 5% גליצרול, 2 mM DTT) ל 10 μL של 2 מ"ג / מ"ל LwaCas13a.
    3. הכינו את תגובת המאסטרמיקס CRISPR-Cas13a באופן הבא: 71 μL של מים נטולי RNase, 20 μL של 400 mM Tris pH 7.4, 20 μL של 60% (w/v) trehalose, 10 μL של 10 ng/μL (225 nM) crRNA (כאן, מכוון לגנים s ו-n של SARS-CoV-2), 8 μL של תערובת rNTP של 100 mM (25 mM כל אחד), 6 μL של 50 יחידות / μL T7 RNA פולימראז, 25 μL של 2 μM FAM fluorescence reporter, ו 10 μL של 126 μg / mL (900 nM) LwaCas13a. מערבבים היטב על ידי היפוך צינור Mastermix; לאחר מכן, ספין למטה.
    4. Aliquot 17 μL של mastermix לתוך 10 צינורות 1.5 מ"ל להציב על קרח. הניחו את הצינורות במדף שקוע בחנקן נוזלי ואפשרו לצינורות להיות שקועים בחנקן נוזלי למשך 5 דקות.
  2. ליופיליזציה
    1. במייבש ההקפאה, בדקו את טמפרטורות האספן והמדף והמתינו עד שטמפרטורת הקולט תגיע ל -75 ± 5 מעלות צלזיוס וטמפרטורת המדף תגיע ל -30 ± 1 מעלות צלזיוס.
    2. הכניסו את הצינורות למייבש ההקפאה. בחר את התוכנית המוצגת בטבלה 1 ולחץ על התחל. לאחר 30 דקות של שלב הייבוש המשני (25 ° C, <0.1 mbar; הטמפרטורה מוחזקת עד אינסוף על ידי הגדרת זמן הצעד ל "אינסופי"), לעצור את התוכנית.
    3. שחרר את הלחץ על ידי פתיחת שסתום שחרור הוואקום והסר את המדף מהמדף. מכסים את הצינורות מיד ומאחסנים את התגובות הליופיליות ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לאחסן ריאגנטים מעורבבים מראש מסוג RPA ו-CRISPR-Cas13a בטמפרטורה של -20°C למשך 8 חודשים.

3. הגברת חומצת גרעין RT-RPA

הערה: כדי למנוע זיהום צולב, יש להפריד אזורים ופיפטורים במקום העבודה לצורך הגברה מראש, הוספת דגימה והגברה לאחר הגברה. אנו ממליצים להשתמש בקצוות פיפטה מסוננים.

  1. מחממים מראש אינקובטור רעד תרמי ב 42 °C (75 °F).
  2. הוסף 1 μL של תערובת תמיסת מגנזיום אצטט (Mg(OAc)2) ואשלגן אצטט (KOAc) (המורכבת מ-196 mM Mg(OAc)2 ו-1.5 M KOAc) לצד הצינור המכיל את גלולת RT-RPA שעברה ליופיליזציה מעורבבת מראש (מסעיף 1).
    הערה: טריק להוספת תערובת Mg(OAc)2 ו- KOAc: יש למקם את הטיפה סביב סימן הנפח של 1 מ"ל של הצינור. כאן, הטיפה תהיה גלויה בבירור ולא סביר שתאבד מסגירת צינור או פעולות אחרות. ההגברה תתחיל לאחר סיבוב למטה כדי לאסוף את הטיפה בתחתית הצינור. בעת עיבוד יותר מתגובה אחת בכל פעם, ניתן להפעיל את ההגברה בו זמנית.
  3. השהה מחדש את גלולת RT-RPA על ידי הוספת 12.4 μL של דגימת ה- RNA (או דגימות הבקרה).
    הערה: רצף החיבור הוא דגימה שלילית/בקרה שלילית, RNA/DNA לבדיקה, דגימה חיובית/בקרה חיובית.
  4. כדי להתחיל את תגובת RT-RPA, סובב לזמן קצר את הפתרון הנוסף משלבים 3.2 ו-3.3 באמצעות מיניצנטריפוגה של ספין-דאון בטמפרטורת החדר למשך 3 שניות.
  5. מערבבים על ידי הקשה זהירה על הצינור ולאחר מכן לעשות עוד סיבוב קצר במשך 3 שניות.
  6. יש לדגור על התגובה בטמפרטורה של 42°C למשך 60 דקות על ידי הכנסתה לבלוק חימום שחומם מראש או באינקובטור לרעידה תרמית.
  7. לאחר סיום התגובה, הוציאו את צינורות התגובה והניחו אותם על קרח לפני שתמשיכו לשלב זיהוי CRISPR-Cas (סעיף 4).
    הערה: ניתן להשתמש במוצר המוגבר ב-RPA בתגובת הזיהוי באופן מיידי או לאחסן אותו ב-4°C למשך מספר ימים או ב-20°C למשך מספר חודשים.

4. זיהוי חומצות גרעין CRISPR-Cas13

  1. הפעל קורא microplate פלואורסצנטי, להגדיר ולחמם מראש את טמפרטורת החימום ל 37 °C, ובחר את התוכנית המוצגת בטבלה 2.
  2. מניחים צלחת של 384 בארות על קרח.
  3. השהה מחדש את תגובת הזיהוי המעורבב מראש של CRISPR-Cas (מסעיף 2) על ידי הוספת 17 μL של תמיסת מגנזיום כלוריד 8 mM. מערבבים על ידי הקשה זהירה על הצינור; לאחר מכן סובבו בקצרה במשך 3 שניות והניחו את הצינור על קרח.
  4. מעבירים 18 μL של תערובת התגובה המרחפת לכל באר של צלחת 384 באר מקוררת מראש על קרח.
  5. הוסף 2 μL של מוצר RPA מוכן בסעיף 3 לכל תגובה היטב.
  6. הסר את הצלחת מהקרח, הכנס אותה במהירות לקורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי שחומם מראש ולחץ על התחל.
    הערה: צלחת 384 בארות הונחה על קרח כדי לאפשר סנכרון של התחלת התגובה כאשר צלחת 384 בארות מועברת לקורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי שחומם מראש.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדגישים את הקינטיקה של יצירת אותות פלואורסצנטיים FAM מהזיהוי המשולב של s ו-n גנים של SARS-CoV-2, וכיצד המידע שימש לקביעת תנאים אופטימליים עבור ניסוחי תגובה ליופיליים ומעורבבים מראש. בכל המקרים, כללנו דגימות עם ערכי Ct היטב בתוך מגבלת הזיהוי שנקבעה (LoD) (Ct ~ 31-33), כמו גם אלה עם Ct ב- LoD (Ct ~ 35-37)7, כדי לאפשר הבחנה של פרוטוקולים עם רגישות טובה יותר.

עבור RT-RPA שעבר ליופיליזציה, מעורבב מראש, מצאנו שההכללה של KOAc בתגובה המעורבת מראש השפיעה לרעה על רגישות התגובה (איור 2A). לכן השמטנו את KOAc מהתגובה המעורבבת מראש והוספנו אותו עם יוזם התגובה, Mg(OAc)2, לאחר הוספת דגימת הרנ"א. השתמשנו גם בבדיקות דומות כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של טרהלוז מגן קריופילי (איור 2B) ואת ההשפעות של טריגליצין7 בתגובת RT-RPA שעברה ליופיליזציה (איור 2C). לכן, תגובות RT-RPA אופטימליות ומעורבבות מראש הוכנו עם 6% טרהלוז, ללא KOAc (אך הוא נוסף מאוחר יותר לאחר דגימת הרנ"א), ובתוספת טריגליצין, כמתואר בסעיף 1 של הפרוטוקול.

figure-results-1
איור 2: אופטימיזציה של תגובות RT-RPA שעברו ליופיליזציה, מעורבבות מראש. תגובת RT-RPA הוכנה באמצעות פריימרים המכוונים לגן n של SAR-CoV-2. Mg(OAc)2 לא נכלל בכל התגובות המעורבות מראש. ההשפעות של (A) KOAc, (B) טרהלוז ו-(C) טריגליצין שנוספו לתגובות המעורבות מראש הוערכו. ניטור התגובה באמצעות פלואורסצנטיות FAM שנוצרה בוצע באמצעות מחזור תרמי בזמן אמת או קורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטיים. מוצגים נתונים בודדים ממדידות משולשות. קיצורים: RT = תמלול הפוך; RPA = הגברת רקומבינאז פולימראז; CRISPR = מקובצים במרווחים קבועים של חזרות פלינדרומיות קצרות; Cas = חלבון הקשור לקריספר; SAR-CoV-2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2; Ct = סף מחזור; FAM = carboxyfluorescein. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

עבור תגובות מבוססות Cas13a שעברו ליופיליזציה, אימתנו את החשיבות של הגנה קריואקטיבית נכונה: 6% טרהלוז או 2% סוכרוז19 עבדו היטב, בעוד שסוכרוז נמוך יותר ב-1% או 5% w/v PEG20000 לא שמר על יעילות התגובה לאחר ליופיליזציה (איור 3). MgCl2 הושמט מכל התגובות ונוסף בשלב ההתייבשות. תגובת הזיהוי האופטימלית מבוססת Cas13 הוכנה עם 6% טרהלוז כפי שמוצג בסעיף 2 של הפרוטוקול.

figure-results-2
איור 3: אופטימיזציה של תגובות זיהוי מבוססות Cas13 שעברו ליופיליזציה, מעורבבות מראש. תגובת הזיהוי בוצעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות תוצר RPA מהגן SARS-CoV-2 n. הבדיקות נעשו לפני ואחרי ליופיליזציה. MgCl2 לא נכלל בכל התגובות המעורבות מראש. היכולות של (A) טרהלוז, (B) PEG20000 ו-(C) סוכרוז בשימור יעילות התגובה לאחר ליופיליזציה הוערכו. ניטור התגובה באמצעות פלואורסצנטיות FAM שנוצרה בוצע באמצעות מחזור תרמי בזמן אמת. מוצגים נתונים בודדים ממדידות משולשות עבור התנאים "לאחר ליופיליזציה" ואחד משוכפל מתנאי "לפני ליופיליזציה". איור 3A,B נלקח מ-Patchsung et al.7. קיצורים: RPA = הגברת פולימראז רקומבינאז; SAR-CoV-2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2; FAM = carboxyfluorescein. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ריאגנטים ליופיליים, מעורבבים מראש עבור תגובות מבוססות RT-RPA ו-Cas13 יציבים בטמפרטורה של -20°C למשך 8 חודשים לפחות [איור 4].

figure-results-3
איור 4: בדיקות יציבות של ריאגנטים מסוג RPA ו-CRISPR-Cas13a שעברו ליופיליזציה, מעורבבים מראש בטמפרטורה של -20°C. בדיקת יציבות ב-(א) 30 יום, (ב) 45 ימים, (ג) 3 חודשים, (ד) 5 חודשים, (ה) 8 חודשים. מוצגים נתונים בודדים ממדידות משולשות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

LoD של תגובות מבוססות RT-RPA ו-Cas13 לזיהוי גנים s ו-n של SARS-CoV-2 מוצג באיור 5. הקינטיקה של יצירת אותות יכולה להשתפר עם זיהוי גנים כפולים בהשוואה למצב שבו רק גן אחד מזוהה.

figure-results-4
איור 5: רגישות אנליטית של זיהוי גן יחיד לעומת זיהוי של גן כפול. (A) LoD של זיהוי RT-RPA וזיהוי מבוסס Cas המכוונים לגן s של SAR-CoV-2. (B) LoD של זיהוי סינגלפלקס ליופילי RT-RPA וזיהוי מבוסס Cas המכוון לגן n של SAR-CoV-2. (C) LoD של מולטיפלקס ליופילי RT-RPA וזיהוי כפול מבוסס Cas המכוון לגנים s ו-n. ה-LoD נקבע באמצעות RNA SARS-CoV-2 בדילול סדרתי, שערכי ה-Ct שלו נקבעו באמצעות בדיקת RT-qPCR המכוונת לגן n. מוצגים נתונים בודדים מ-3-6 מדידות משוכפלות. קיצורים: LoD = גבול הזיהוי; RT = תמלול הפוך; RPA = הגברת רקומבינאז פולימראז; CRISPR = מקובצים במרווחים קבועים של חזרות פלינדרומיות קצרות; Cas = חלבון הקשור לקריספר; SAR-CoV-2 = תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2; Ct = סף מחזור; qPCR = תגובת שרשרת פולימראז כמותית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מעבר לזיהוי וירוסים, אנו מציגים אב טיפוס של כלי גנוטיפ POC המבוסס על אבחון CRISPR, כדי לסייע בזיהוי מיני נחשים ארסיים אנדמיים לתאילנד (איור 6). זיהוי מהיר ומדויק של מיני נחשים באמצעות דגימות DNA שנאספו מפצעי הכשה יכול לסייע במתן מהיר של נוגדי ארס, ולשפר את סיכויי ההישרדות של החולה. התמקדנו באזורים בתוך הגן cytochrome b מיטוכונדריאלי (cytb) של שמונה מיני נחשים, כולל Ophiophagus hannah (קוברת המלך) (איור 6A), והראינו שזיהוי של פונדקאיות דנ"א סינתטי של הגן O. hannah cytb יכול להגיע לרמת רגישות אטומולרית (איור 6B,C).

figure-results-5
איור 6: אב טיפוס לזיהוי מבוסס קריספר לזיהוי מיני נחשים מארס הכשת נחש. (A) פריימרים RPA ותכנון LwaCas13a crRNA לזיהוי גן cytb של Ophiophagus hannah. פרומוטור T7 (T7 overhang) הוצב בקצה 5' של פריימר RPA קדמי. (B) קינטיקה של יצירת אותות FAM במשך 60 דקות ו-(C) פלואורסצנטיות FAM בנקודת קצה מזיהוי בתיווך LwaCas13a של קלטי dsDNA סינתטיים המתאימים למקטעי הגן cytb מ-O. hannah. נעשה שימוש בריכוזי קלט שונים (0, 10-9, 10-12, 10-15 ו-10-18 מטר). הנתונים הם ממוצע ± s.d. ממדידות משולשות. קיצורים: RPA = הגברת פולימראז רקומבינאז; CRISPR = מקובצים במרווחים קבועים של חזרות פלינדרומיות קצרות; Cas = חלבון הקשור לקריספר; FAM = carboxyfluorescein. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ליופיליזציה של ריאגנטים לזיהוי CRISPR-Cas13a מעורבבים מראש
צעדקצב רמפהטמפ' מדףזמן (hh:mm)Vaccuum
(°C/min)(°C)(מבר)
הקפאה 13-30כבוי-
יבש 13-30כבוי0
יבש 23401:000
יבש 3320∞0

טבלה 1: הגדרות ליופיליזר של ריאגנטים לזיהוי RT-RPA ו-CRISPR-Cas13a מעורבבים מראש. קיצורים: RT = תמלול הפוך; RPA = הגברת רקומבינאז פולימראז; CRISPR = מקובצים במרווחים קבועים של חזרות פלינדרומיות קצרות; Cas = חלבון הקשור לקריספר.

פרמטרהגדרה
טמפרטורה37°C
מחזור קינטימשך זמן02:00 (מ"מ:אס)
זמן מרווח02:30 (מ"מ:אס)
רועדתמשך זמן1 שניות
מצבליניארי
משרעת1 מ"מ
עוצמת פלואורסצנטיותאורך גל עירור488 ניוטון מטר
אורך גל פליטה520 ניוטון מטר
מצבסביבון
מיקום Z24470
לקבל71
זמן אינטגרציה20 מיקרוס
מספר הבזקים25

טבלה 2: תוכנית קורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטיות לזיהוי חומצות גרעין.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנם שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. להפרדת אזורים, מומלץ להשתמש בחללים נפרדים למיצוי חומצות גרעין, הכנת מאסטרמיקס (אזור טרום הגברה), הוספת דגימה וזיהוי אמפליקון (אזור לאחר הגברה). כל אזור צריך להיות מוגדר באמצעות קבוצה נפרדת של כלים וציוד. אין להכניס כלים מאזור אחד לאזור אחר, במיוחד מאזור ההגברה שלאחר מכן לאזור שלפני ההגברה. ניקוי אזורי עבודה הוא הכרחי: יש לנקות אזורי עבודה, פיפטה, מערבולות וסמנים קבועים עם תמיסת טיהור RNase / DNase / 3% Clorox ואחריו 70% אתנול או מים deionized autoclaved. נדרשת שטיפת כלי מעבדה בסיסיים וחלקים נשלפים של מכשירים, כגון מתלי פלסטיק צינור 1.5 מ"ל ומתאם הרוטור של מיניצנטריפוגה. מים נטולי Nuclease משמשים כבקרה שלילית וכמרכיב תגובה, ולכן הם מגיב רגיש שיכול להיות מזוהם אם לא מטפלים בו בזהירות. לכן, אנו ממליצים לעשות aliquots קטן של מים לשימוש רק פעם אחת.

הפעל תמיד תגובת בקרה שלילית באמצעות פריימרים לבדיקה כדי לבדוק זיהום. בנוסף, כדי למנוע בעיות זיהום, אנו ממליצים להכין את תגובת הבקרה השלילית על ידי הוספת מים נטולי נוקלאז באזור טרום ההגברה במקום בחדר תוספת הדגימה. תערובת מגנזיום אצטט-אשלגן אצטט צריכה להיות aliquoted בכמויות קטנות (~ 20 μL / צינור) כי משמשים רק פעם אחת כדי למנוע זיהום מגיב עם מגברי נשיאה. בעת הוספת תערובת מגנזיום-אשלגן אצטט לתגובות RPA קדם-מיקס ליופיליות, אנו ממליצים לשנות את קצה פיפטה בכל פעם. עבור זרימת העבודה של ניסויים, שמור על זרימת העבודה חד-כיוונית, החל מקדם-הגברה ועד לניסויים שלאחר הגברה. עברו מסביבות עבודה "נקיות" יותר (טרום הגברה) לסביבות עבודה "מלוכלכות" יותר (לאחר הגברה).

לצורך שינויים ופתרון בעיות של השיטה למניעת זיהום שאריות של אמליקונים, אנו ממליצים להפריד מרחבית בין שלושת השלבים העיקריים של הניסוי: הכנת תגובת RPA; תוספת מדגם; ושלבי ההגברה והזיהוי. יש להכין את המאסטרמיקס באזור נטול תבניות במעבדה. בעת החלפת חדרים, גם להחליף כפפות ומעילי מעבדה. עבודה חד כיוונית מלפני לפוסט הגברה. הימנע משימוש באותה פיפטה לשלבים שונים. עדיף אם קבוצות שונות של פיפטות מסודרים עבור שלבים אלה: הכנת mastermixes; הוספת תבנית DNA/RNA; והעברת המוצר המוגבר. השתמשו בקצוות מסוננים, נסו למנוע היווצרות אירוסולים ככל האפשר, והימנעו מלגעת בחלק הפנימי של הצינור בעת פתיחתו. אם ניסויי הגברה מראים זיהום, יש לשנות את כל הריאגנטים. אם אפשר, ללכת למעבדה אחרת עם ריאגנטים טריים ולבדוק אם זיהום נמשך. מלבד ריאגנטים, אין להביא שום דבר אחר כולל פיפטה. נסה autoclaving פיפטות אם הם autoclavable.

כדי לשפר את קצב ההגברה (מיטוב מבחן), ראשית, עיין בהוראות היצרן כגון מדריך RPA של TwistDx כדי להבטיח עיצובים אופטימליים. לאחר מכן, נסה אופטימיזציות אמפיריות של התגובות כגון הוספת תוספי תגובה הידועים כמגבירים תגובות RPA ו- CRISPR7; הגדלת זמני התגובה (למשל, זמן תגובה RPA עד 60 דקות); או רצפי פריימר וריכוזים משתנים. אנו ממליצים גם להוסיף נפח מדגם רב ככל האפשר; שימוש בריאגנטים ליופיליים מאפשר להוסיף נפח דגימה גדול יותר. כדי להפחית את פלואורסצנטיות הרקע, ניתן לבצע שלב השבתת חום (75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות) לאחר סיום ה-RPA, לפני המעבר לזיהוי, או לייעל את ריכוז המדווח. יותר מדי כתב ייתן רקע גבוה יותר. בנוסף, הוספת מעכבי RNase מסייעת למנוע השפלה בלתי תלויה ב- Cas של המדווח.

מעבר לאופטימיזציה של תנאי תגובה מבוססי RPA וקריספר (RT)-RPA ונהלי הטיפול בהם, יש לוודא כי ריאגנטים בשימוש הם באיכות טובה, וכי שלב מיצוי חומצות הגרעין לפני כל התגובות הוא מוצלח. ריאגנטים ליופיליים מספקים רגישות זיהוי גבוהה, הם ניידים, מאפשרים בדיקות POC וניתן ליישם אותם על דגימות קליניות מגוונות. יתר על כן, lyophilized (RT)-RPA יכול להיות rehydrated באופן מיידי על ידי הוספת תמצית חומצת גרעין מדגימות קליניות. מחקר קודם הראה רגישות גבוהה יותר כאשר מכניסים נפח גדול יותר של קלט חומצת גרעין ללא נפח מוגבל, מה שמגדיל למעשה את הכמות הכוללת של חומצת גרעין המטרה.

אבחון מבוסס קריספר הותאם לזיהוי פתוגנים על ידי איסוף דגימות קליניות כגון מקלוני אף ולוע וגרון, שתן וסרום 7,8,11. הוא יושם גם כדי להבחין בין וריאנטים בודדים של נוקלאוטידים, לזהות גנים עמידים לאנטיביוטיקה באורגניזמים עמידים למיקרוביאלית, ולזהות מוטציות הקשורות לסרטן. התועלת של הטכנולוגיה עשויה להיות הגדולה ביותר ביישומי שדה שבהם ניתן לשלב תגובות ביוכימיות מהונדסות, להגברה איזותרמית ולזיהוי מבוסס קריספר, עם התקנים מוכנים לשטח וקריאות כגון פלואורומטר כף יד או פסי זרימה רוחביים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.P. ו- C.U. הגישו פטנט בתאילנד על פורמולציות לזיהוי מרובב של RNA SARS-CoV-2. ר.ק. מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.U. מודה במימון מהבנק המסחרי סיאם תחת VISTEC-Siriraj Frontier Research Center, ומ-Thailand Science Research and Innovation (TSRI), קרן פונדמנטלית, שנת הכספים 2024, מענק מספר FRB670026/0457. R.K. ו- M.P. נתמכים על ידי קרנות סטודנטים ועוזרי מחקר מ- VISTEC, בהתאמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת <חזקה>חומרית
בטאיןSigma-AldrichB0300-1VL
DEPC במיםInvitrogenAM9915G
Dithiothreitol (DTT)Merck3870-25GM
EpiScript reverse transcriptaseLucigenERT12925K
Gly-Gly-Gly& נ.ב.פ;Sigma-AldrichSIA-50239-1G
LwaCas13aייצור פנימישם הזן: Leptotrichia wadei, קיצור: Lwa, שם חלבון: LwaCas13a
תמיסת מגנזיום כלוריד, 1MSigma-AldrichM1028-10X1ML
NxGenT7 RNA פולימראזLucigen30223-2
פולי (אתילן גליקול)סיגמא-אולדריץ'81300-1 ק"ג
תמיסת אשלגן אצטט, 5Mסיגמא-אולדריץ'95843-100ML-F
תערובת תמיסת ריובקלאוטידNEBN0466L
RNase HNEBM0297L
סוכרוזTCITCI-S0111-500G
טרהלוז דיהידראטסיגמא-אולדריץ'SIA-90210-50G
תמיסת טריזמה הידרוכלוריד, 1M, pH 7.4Sigma-AldrichT2194-100ML
TwistAmp ערכה בסיסיתTwistDxTABAS03KIT
<חזק>ציוד
BluPAD כפול LED משדר אור כחול/לבןBio-HelixBP001CU
אמבטיה יבשה בלוק כפולELITE4-2-EL-02-220דגם: EL-02
מיקרופלייט פלואורסצנטי קוראTecan30050303אינסופי 200 Pro
LABCONCO794001030FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer
Microplate 384-wellGreinerGDE0784076F-Bottom, נפח קטן, Hibase, Med. כריכה, שחור
אמת תרמי (CFX Connect מערכת PCR בזמן אמת)Bio-Rad185-5201דגם: CFX Connect Optics Module
<פריימר RPA חזק>אוליגונוקלאוטיד
s-גן קדימהIDTGAAATTAATACGACTCAC
TATAGGGAGGTTTCAAAC
TTTACTTGCTTTACATAGA
s-gene reverse RPA פריימרIDTTCCTAGGTTGAAGA
TAACCCACATAATAAG
n-gene forward RPA פריימרIDTGAAATTAATACGACTC
ACTATAGGAACTTCTC
CTGCTAGAATGGCTG
n-gene reverse RPA פריימרIDTCAGACATTTTGCTCTC
AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA עבור הגן sSynthegoGAUUUAGACUACCACCAAAAAAC
GAAGGGGACUAAAACGCAGCA
CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA עבור הגן nSynthegoGAUUUAGACUACCAAAAACG
AAGGGGACUAAAACAAAGCAAG
AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporterIDT56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F פריימר RPAIDTGAAATTAATACGACTCACTA
TAGGGTACGGATGAACCATA
CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R פריימר RPAIDTAAGATCCATAGTAGATTC
CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah IDTGCGCATCCATATTCTTCAT
CTGCATTTAGTTTTAGTCC
CCTTCGTTTTTTTGGGGTA
GTCTAAATCCCCTATAGT
GAGTCGTATTAATTTC
דגם: מייבש הקפאה בזמן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  2. Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. CRISPR-based diagnostics. Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).
  3. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and classification of CRISPR-Cas systems. Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).
  4. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  5. Arizti-Sanz, J., et al. Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants. Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).
  6. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  7. Patchsung, M., et al. A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance. CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).
  8. Patchsung, M., et al. Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA. Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 360 (6387), 439-444 (2018).
  10. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  11. Myhrvold, C., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 360 (6387), 444-448 (2018).
  12. Wu, H., et al. Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges. Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).
  13. Yao, R., et al. CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus. Front Vet Sci. 8, 603919(2021).
  14. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  15. Selvam, K., et al. RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods. Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).
  16. Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA. J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).
  17. Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection. Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).
  18. Twistamp. Twistamp® assay design manual. , (2023).
  19. Qian, J., et al. An enhanced isothermal amplification assay for viral detection. Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).
  20. Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications. ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).
  21. Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies. Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).
  22. Fang, X., et al. Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes. Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).
  23. Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction. Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).
  24. Wan, J., et al. Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables. J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).
  25. Curti, L. A., et al. Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2. Viruses. 13 (3), 420(2021).
  26. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRISPRCas13a

מאמרים קשורים