הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66707

⸱

29 במרץ 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, The University of Texas at Dallas, 2Center for Imaging and Surgical Innovation, The University of Texas at Dallas, 3Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, UT Southwestern Medical Center

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.

תקציר

מיקרוסקופ יריעות אור (LSM) ממלא תפקיד מרכזי בהבנת המבנה התלת-ממדי (תלת-ממדי) המורכב של הלב, ומספק תובנות חיוניות לגבי פיזיולוגיה בסיסית של הלב ותגובות פתולוגיות. אנו מתעמקים בזאת בפיתוח ויישום טכניקת LSM כדי להבהיר את המיקרו-ארכיטקטורה של הלב במודלים עכבריים. המתודולוגיה משלבת מערכת LSM מותאמת אישית עם טכניקות ניקוי רקמות, הפחתת פיזור האור בתוך רקמות הלב לצורך הדמיה נפחית. השילוב של LSM קונבנציונלי עם תפירת תמונה וגישות deconvolution multiview מאפשר ללכוד את הלב כולו. כדי להתמודד עם הפשרה המובנית בין רזולוציה צירית לשדה ראייה (FOV), אנו מציגים גם שיטת מיקרוסקופ יריעות אור שנסחף באופן אקסיאלי (ASLM) כדי למזער אור מחוץ למיקוד ולהאיר באופן אחיד את הלב לאורך כיוון ההתפשטות. בינתיים, שיטות ניקוי רקמות כגון iDISCO לשפר את חדירת האור, להקל על הדמיה של מבנים עמוקים ולהבטיח בדיקה מקיפה של שריר הלב לאורך הלב כולו. השילוב של שיטות LSM וניקוי רקמות המוצעות מהווה פלטפורמה מבטיחה לחוקרים בפתרון מבנים לבביים של מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצובה מחדש.

מבוא

אי ספיקת לב נותרה הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם, בעיקר בשל היעדר יכולת התחדשות של קרדיומיוציטים בוגרים1. הארכיטקטורה המורכבת של הלב ממלאת תפקיד מכריע בתפקודו ומספקת תובנות לגבי תהליכים התפתחותיים. הבנה מעמיקה של מבנה הלב חיונית להבהרת התהליכים הבסיסיים של מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש בתגובה לאוטם שריר הלב. ההתקדמות האחרונה הוכיחה כי עכברים ילודים יכולים לשחזר את תפקוד הלב לאחר פציעה, בעוד עכברים בוגרים חסרים יכולת התחדשות כזו2. זה מבסס בסיס לחקר רמזים הקשורים לחריגות מבניות ותפקודיות במודלים של עכברים. לשיטות הדמיה מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, יש מגבלות טכניות, כולל עומק חדירה מוגבל, סכמת סריקה נקודתית איטית ונזקי צילום כתוצאה מחשיפה ממושכת לאור לייזר. אלה מעכבים הדמיה תלת ממדית מקיפה (3D) של הלב השלם. בהקשר זה, מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) מתגלה כפתרון רב עוצמה, המציע את היתרונות של הדמיה במהירות גבוהה, נזק מופחת לצילום ויכולות חתך אופטיות יוצאות דופן 3,4,5. התכונות הייחודיות של LSM מציבות אותו כשיטה מבטיחה להתגבר על מגבלות הטכניקות הקונבנציונליות, ומספקות תובנות חסרות תקדיםעל התפתחות הלב ותהליכי שיפוץ 6,7,8.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיית הדמיה המשלבת LSM מתקדם עם גישות מותאמות לניקוי רקמות9, ומאפשרת הדמיה של לבבות עכבר שלמים ללא צורך בתיוג ספציפי ובחתך מכני. אנו מציעים גם כי ניתן לשפר את הדמיית LSM קונבנציונלית באמצעות טכניקות multiview deconvolution10 או מיקרוסקופ גיליון אור (ASLM) 11,12,13,14,15 כדי לשפר את הרזולוציה הצירית. בנוסף, שילוב של תפירת תמונה עם כל אחת מהשיטות הללו יכול להתגבר ביעילות על הפשרה בין רזולוציה מרחבית לשדה ראייה (FOV), ובכך לקדם את ההדמיה של לבבות עכברים בוגרים. השילוב של גישות רבות לניקוי רקמות, כולל שיטות הידרופוביות, הידרופיליות ומבוססות הידרוג'ל, מאפשר חדירת אור עמוקה יותר ללכידת המורפולוגיה של הלב כולו 16,17,18,19.

בעוד שיטות ניקוי מרובות תואמות למערכות LSM הנוכחיות, המטרה היא למזער את פיזור הפוטונים ולהגביר את חדירת האור ברקמות, כמו הלב, על ידי החלפת שומנים בתווך התואם באופן הדוק את מקדם השבירה שלו. iDISCO נבחרה כמייצגת20,21 והותאמה לדימות אוטופלואורסצנטי בפרוטוקול זה הודות לעיבוד המהיר והשקיפות הגבוהה שלה (איור 1A). באופן קולקטיבי, השילוב של גישת LSM המתקדמת עם טכניקות ניקוי רקמות מציע מסגרת מבטיחה לפענוח אנטומיה לבבית מורכבת בלבבות מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי לקידום הבנתנו במורפוגנזה ופתוגנזה של הלב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקולים וניסויים בבעלי חיים אושרו ונערכו תחת פיקוחה של אוניברסיטת טקסס בוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בדאלאס (IACUC #21-03). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL6, כולל יילודים ביום 1 (P1) שלאחר הלידה ומבוגרים בני 8 שבועות. לא נצפה הבדל בין זכרים לנקבות. כל איסוף הנתונים ועיבוד התמונה לאחר מכן בוצעו באמצעות תוכנות קוד פתוח או פלטפורמות עם רישיונות מחקר או חינוך. המשאבים זמינים מהמחברים על פי בקשה סבירה.

1. הכנת דגימה וניקוי רקמות (6 - 10 ימים)

  1. הכינו את כל התמיסות הכימיות בטבלת החומרים הנדרשים לשיטת ניקוי הרקמה לפני תחילת הליך ניקוי הרקמות.
    הערה: יש לבצע את כל ההליכים במכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, במיוחד בעת טיפול בכימיקלים רעילים.
  2. הרדימו בעלי חיים עםCO2 על ידי הכנסתם לתא CO2 בנקודות הזמן הרצויות, כגון P1 ו-8 שבועות, לאיסוף לב שלם וטבלו את הלב המבודד הטרי בטמפרטורת החדר (RT) ב-0.2 M KCl כדי לעצור בדיאסטולה16.
  3. תקן את הלב על ידי טבילה של 4% paraformaldehyde (PFA) במי מלח חוצץ פוספט 1x (PBS) עם תסיסה עדינה על נדנדה למשך הלילה כדי לשמר את האנטומיה של הלב ב -4 מעלות צלזיוס, ראה טבלה 1.
    אזהרה: PFA הוא כימיקל רעיל ויש לבצע אותו תחת מכסה אדים.
  4. שטפו את הלב עם 1x PBS ב-RT למשך 30 דקות, 3x.
    הערה: אופציונלי: הטמע את הלב בג'ל אגרוז כדי ליצור מכלול לב עבור מערכת LSM שנבנתה בהתאמה אישית בשלב 2 כמתואר להלן.
    1. מכינים את תמיסת האגרוז 1% על ידי המסת אגרוז ב-PBS ומחממים את התערובת במיקרוגל עד להמסה מלאה. יוצקים את התמיסה לתוך תבנית כדי ליצור שכבה תחתונה עד התמיסה מתקררת ל 40 מעלות צלזיוס.
    2. מניחים את הלב בתבנית וממלאים את התבנית בג'ל אגרוז עד שהוא מתמצק. סלק את כל הבועות בג'ל האגרוז כדי למזער ממצאים בהדמיה.
      הערה: הטמעת הדגימה מפחיתה את הסיכון לנזק פוטנציאלי לאנטומיה של הלב במהלך ההרכבה.
      אזהרה: יש להשתמש באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ולהימנע ממיקום הלב ישירות באגרוז מחומם כדי להפחית את הסיכון לחשיפת הדגימה לטמפרטורות גבוהות.
  5. ייבשו את הלב באמצעות שיפועים של מתנול מעורבב עם מים שעברו דה-יוניזציה (איור 1B), ועברו עיבוד באמצעות ריכוזים רציפים של 20%, 40%, 60%, 80% ו-100% כמתואר בטבלה 1. יש לחזור על הפעולה עם 100% מתנול טרי פעם אחת כדי להבטיח התייבשות מוחלטת. יש לייבש לבבות עכברים יילודים למשך שעה אחת בכל תערובת מתנול עם רעידות. התאימו את זמן הדגירה לשעתיים עבור לבבות עכברים בני 8 שבועות ולבבות חולדות.
    אזהרה: מתנול הוא כימיקל נדיף, מגרה ודליק.
  6. החליפו וצננו את הלב במתנול 100% טרי למשך 10 דקות ב-4°C.
  7. החלף את התמיסה והלבין את הלב עם 5% מי חמצן (H2O2) במתנול באמצעות יחס נפח של 1:5 (30% H2O2 עד 100% מתנול) למשך הלילה ב 4 ° C כדי להסיר את הפיגמנטים.
    הערה: הסרת פיגמנטים מאפשרת למזער את בליעת הפוטון, מה שמוביל לשיפור איכות התמונה עם לכלוכים מופחתים.
  8. החלף את התמיסה ודגר על הלב ב 100% מתנול במשך שעה אחת ב RT.
  9. לטהר את הלב עם תמיסה המכילה 66% dichloromethane (DCM) ו 33% מתנול במשך 3 שעות עם רעידות. ודא שהלב שוקע לתחתית הבקבוקון בסוף שלב זה. אם לא, חדשו את התמיסה (66% DCM / 33% מתנול) והאריכו את זמן הדגירה (למשל, שעה נוספת) כדי להשיג הסרת שומנים מלאה. העבר את הלב לתמיסה חדשה במהירות כדי למנוע התייבשות, מכיוון ש- DCM נדיף מאוד.
    זהירות: השתמש בפוליפרופילן או בכלי זכוכית עבור הניסוי, מכיוון ש- DCM אינו תואם לפוליסטירן.
  10. השתמש באתר דיבנזיל (DBE) להתאמת אינדקס השבירה (RI = 1.56). עבור לבבות עכבר בילוד, תהליך התאמת אינדקס השבירה אורך יומיים, ואילו עבור לבבות עכבר בני 8 שבועות, זה לוקח 5 ימים עם רעידות קלות. החליפו אותו ב-DBE טרי והאריכו את זמן הדגירה עד שהלב ישיג שקיפות מלאה.
    זהירות: DBE מסוכן. יש להימנע מכל מגע עם העור.

2. הרכבה לדוגמה (יום אחד)

הערה: במקרה שנעשה שימוש במערכת LSM מסחרית, עקוב אחר הפרוטוקול הספציפי שלה שסופק על ידי החברה כדי לתקן את הלב ולדלג על שלבים 2.1 - 2.9.

  1. התאם אישית תא ומחזיק עמידים בפני פתרון התאמת אינדקס השבירה (לדוגמה, DBE בגישת iDISCO המותאמת) באמצעות מדפסת תלת-ממד וחומרי אוניקס (איור 2A)16.
  2. הצמידו מגנט לתחתית התא כדי לאפשר חיבור מהיר ולוקליזציה מדויקת תחת מערכת LSM (איור 2B).
  3. חברו משקפי כיסוי בגודל 25 מ"מ x 50 מ"מ x 0.17 מ"מ לתא באמצעות דבק סיליקון שקוף וודאו את שלמות התא עמיד למים על ידי מילויו ב-DBE ובדיקת נזילות לאחר יום אחד.
  4. התאימו אישית מחזיק מהדק באמצעות מדפסת תלת-ממד והצמידו מגנט להרכבת מכלול הלב בתוך התא (איור 2C) או הכניסו מחט לג'ל האגרוז להרכבת מכלול הלב.
  5. בצע את הפיתוח של מערכת LSM פנימית באמצעות עדשה גלילית ולייזרים במצב מוצק שאוב דיודה רציפה (DPSS) כפי שדווח בעבר16,22. השתמשו באורך גל העירור של 532 ננומטר כדי ללכוד אוטופלואורסצנטיות משריר הלב (איור 2D).
  6. הרכיבו את התא על במה 6 ממדית ואתרו את המיקום האופטימלי בו התא ניצב לכיוון התפשטות הלייזר.
  7. השתמש במחזיק מהדק מגנטי כדי למקם את הדגימה במרכז התא ולחבר את המחזיק לשלב ממונע 4 ממדי (X, Y, Z ו- Yaw; איור 2D).
  8. השקיעו את מכלול הלב לתוך החדר המלא ב-DBE באמצעות השלב הממונע וקבעו את טווח הסריקה לאורך ציר הגילוי (כיוון Z).
  9. קבע את מהירות הסריקה (Vz) של המנוע לאורך כיוון Z בהתבסס על גודל הצעד (S) וזמן הרכישה של תמונה (T) באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
    הערה: הקשר בין גודל הצעד לבין הרזולוציה הצירית של מערכת ההדמיה תואם את משפט הדגימה של ניקוויסט-שאנון. לדוגמה, גודל המדרגה נקבע על 1 מיקרומטר, בהתחשב בכך שהרזולוציה הצירית הייתה 2.91 מיקרומטר, כפי שצוין בדו"ח הקודם16.
  10. כדי לאמת את הרזולוציה המרחבית ולמזער בעיות אטימות פוטנציאליות בעומקים שונים, מדדו את פונקציית פיזור הנקודות (PSF) של המערכת על ידי הדמיית חרוזים פלואורסצנטיים בקוטר של 0.53 מיקרומטר מדוללים בג'ל אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 1% עם ריכוז של 1:1.5 x 105. חשב את PSF על פני כל הדגימה על-ידי מדידת הרוחב המלא בחצי מקסימום (FWHM)16.

3. תפירת תמונה (4-8 שעות)

  1. חשב את מספר האריחים הדרושים לכיסוי לב העכבר כולו, בהתחשב ב- FOV המוגבל. עבור כל אריח, הממדים תואמים את FOV של מערכת LSM. לדוגמה, לב עכבר יילוד עם מדידת חתך של 3 x 3.6 מ"מ2 דורש 2 x 2 אריחים לכיסוי ב-LSM המותאם אישית (איור 3A). לעומת זאת, לב עכבר בן 8 שבועות בגודל 5X8 מ"מ2 דורש 3X4 אריחים כדי לכסות את כל מבנה הלב (איור 3B).
    הערה: תפירת תמונה נדרשת אם LSM קונבנציונאלי יש FOV מוגבל עבור הדמיה של הלב כולו.
  2. צלמו תמונות של הלב החל מאריח 1, כלומר האריח השמאלי העליון של הלב (איור 3A-B).
  3. צלם ברצף תמונות של שאר האריחים עם חפיפה של 10% בין אריחים עוקבים עד לכיסוי הלב כולו, כפי שמודגם באיור 3C.
  4. הורד והתקן תוכנת קוד פתוח פיג'י23 . הורד והתקן את תוסף פיג'י, BigStitcher24.
  5. נווט אל תפריט עזרה, בחר עדכן, בחר נהל אתר עדכון ובחר ב- BigStitcher. לאחר מכן, לחץ על סגור ולאחר מכן החל שינויים. עם השלמת הורדת התוסף, הפעל מחדש את תוכנת פיג'י.
  6. פתח את תוסף BigStitcher וייבא את כל האריחים הדרושים דרך ספריית קבצי התמונה. שמור את ערכת הנתונים כקובץ HDF5.
  7. ארגנו אריחים באמצעות בחירה באפשרות 'הזז אריח לפי רשת רגילה', בחרו בדוגמת המילוי המשמשת להזזת הלב ובחרו חפיפה של 10% בין כל אריח. תפור את האריחים באמצעות האפשרות אשף התפירה.
  8. יצא את הנתונים התפורים באמצעות Image Fusion, ליצירת קובץ tiff.

4. Multiview deconvolution (5 ימים)

  1. השתמשו בחרוזים פלואורסצנטיים לרישום תמונה של שחזור רב-תצוגות לאורך הלב (איור 3D).
    1. הכינו שרף25 על ידי ערבוב Bisphenol-A diglycidyl ether (D.E.R. 332), Isophorone diamine, 5-amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine (IPDA), ואתר פוליפרופילן גליקול diglycidyl (D.E.R 736) ביחס נפח של 4:1:1.
    2. צנטריפוגה 10 μL של חרוזים פלואורסצנטיים ב 161 x גרם במשך 5 דקות ולהוסיף 20 μL של מתנול כדי להחליף את פתרון האחסון של החרוזים. חזור על כך 3x.
    3. הכינו תמיסה של 10 מ"ל עם ריכוז חרוזים של 1:1 x 105 על ידי ערבוב תמיסת החרוזים המבוססת על מתנול לתוך השרף שהוכן בשלב 4.1.1.
    4. נטרלו את התמיסה בתא ואקום למשך 3 שעות כדי להסיר כיסי אוויר ובועות.
    5. יוצקים את התמיסה לתוך תבנית סיליקון או קשית שתייה פלסטיק ולחכות 2 עד 3 ימים עד שהוא מתמצק. לאחר יום אחד לפני שהשרף הופך מוצק, הכניסו את צינור הזכוכית לתוך התבנית והמתינו עד שהצינור יתחבר לשרף. הסירו את השרף מהתבנית בעזרת צינור הזכוכית (איור 3D).
    6. הכניסו את הלב לצינור הזכוכית, מלאו אותו ב-DBE והרכיבו את צינור הזכוכית בתא המלא ב-DBE.
  2. צלם תמונות רציפות של לב העכבר יחד עם החרוזים מהקטע המואר על ידי סריקת מכלול הלב לאורך ציר הזיהוי (ציר Z; איור 3E-F).
    הערה: יישם תפירת תמונות בשלב 3 כדי ליצור ערימות נפרדות של תמונות אם גודל הלב חורג מה- FOV.
  3. סובב את לב העכבר ב-60° לאורך ציר ה-Y כדי ללכוד את הערימות הבאות מזוויות מרובות, כלומר 0°, 60°, 120°, 180°, 240° ו-300° (איור 3E-F).
  4. פתח את תוסף BigStitcher וייבא את כל התמונות דרך ספריית קבצי התמונות. שמור את ערכת הנתונים כקובץ HDF5.
  5. בחר זיהוי נקודות עניין ובחר ידנית חרוזי עניין לרישום.
  6. בחר Affine Transformation Model לרישום. בחרו 'פונקציית התפשטות נקודתית' והקצו PSF לכל התצוגות.
  7. לחץ על Multiview Deconvolution ובחר את סוג האיטרציה כ - Efficient Bayesian. הגדר את מספר האיטרציות כ- 10 ובצע אותו26.
  8. לחץ על Image Fusion כדי לייצא קובץ tiff .
    הערה: מידע מפורט יותר אודות deconvolution multiview ניתן למצוא בדוחות או פרוטוקולים אחרים 24,27,28.

5. חומרת מערכת גליונות אור שנסחפה באופן אקסיאלי (יום אחד)

  1. התקינו עדשה חשמלית (ETL) במישור פורייה של העדשה הגלילית (CL)27 (איור 2D) כדי לסרוק את קרן הלייזר באופן אקסיאלי1, 4. ודא שהממשק הנוזלי ב- ETL הוא אופקי כדי למנוע עיוות חזית הגל הנגרם על ידי כוח הכבידה. יישר ETL במדויק כדי למזער ירידת אלומה וסטיות אופטיות מסדר גבוה יותר30.
  2. התקן כרטיס DAQ בתחנת העבודה וחבר כבל BNC לכרטיס DAQ כדי לסנכרן את חשיפת המצלמה וסריקת ETL.
  3. פתח את המארז של מנהל התקן ETL והסר את הכיסוי (איור 4).
  4. הלחמת את חוט האות של כבל BNC לאנלוגי בסיכת B, כפי שמסומן בתחתית לוח המעגלים המודפסים (איור 4).
  5. הלחמת את חוט הארקה של כבל BNC לסיכת GND; לאחר מכן, חבר את הקצה השני של כבל BNC ל-AO (פלט אנלוגי) בכרטיס DAQ (איור 4).
  6. חבר את מנהל התקן ETL ליציאת ה- USB של תחנת העבודה, חבר את מנהל ההתקן ל- ETL באמצעות כבל hirose והתקן תוכנת בקר מנהל התקן עדשה.
  7. שנה את מצב הפעולה בתוכנת בקר מנהל ההתקן של העדשה לאנלוגי כדי לשלוט ב-ETL באמצעות הדק שנוצר מכרטיס DAQ.
  8. בתוכנה של מצלמת sCMOS, העבר את מצב לכידה לחיצוני (גיליון אור). ודא שכיוון סריקת הפיקסלים הפעיל מאונך לכיוון סריקת הלייזר כדי לסייע בסנכרון.
  9. חבר את יציאת ההדק החיצונית בגב מצלמת sCMOS ל-AO של כרטיס DAQ באמצעות כבל BNC (איור 4).

6. סנכרון מערכת גליונות אור שנסחפו באופן אקסיאלי (7 ימים)

  1. הגדר את זמן החשיפה בהתבסס על יחס אות לרקע (SBR) המקובל, אשר עבור המחקר המוצע, הוא לפחות 10. הגדל את זמן החשיפה אם SBR נמוך מ- 10.
    הערה: זמן חשיפה הנע בין 10 ל- 50 אלפיות השנייה מספק SBR מקובל בפרויקט זה.
  2. הגדר את זמן הרכישה של תמונה (T) ואת מרווח השורות (L) בהתבסס על זמן החשיפה (E) של המצלמה ותדר ETL (f) באמצעות המשוואות הבאות:
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    כאשר P מציין את מספר עמודות הפיקסלים בחיישן המצלמה. הפרמטרים המייצגים עבור ההפניה הם f = 1 הרץ, P = 2048, E = 10 ms ו - L = 243 μs, בהתאמה.
  3. בתוכנית LabVIEW Trigger Generator.vi, יוצר טריגרים מרובעים ומשולשים לסנכרון (איור 5).
    הערה: תוכנית LabVIEW המותאמת אישית זמינה מהמחברים על פי בקשה סבירה.
  4. חרוזי הר פלואורסצנטי מדוללים בג'ל אגרוז16 בעל נקודת התכה נמוכה של 1% עם ריכוז של 1:1 x 103 כדי לאתר את מיקום מותני הקרן בתמונה (איור 6A).
  5. בתוכנית, זהה את נקודות ההתחלה והסיום של קרן הלייזר מתחת ל- FOV על ידי שינוי המתח לאורך כיוון הסריקה.
  6. כדי לסנכרן את מצלמת sCMOS ואת ETL, סרוק את קרן הלייזר לאורך ציר ה-X ואת הפיקסלים הפעילים לאורך ציר ה-Y כדי ליצור תמונה דו-ממדית (איור 6B). החרוזים הבהירים והחדים יותר לאורך האלכסון בתמונה מציינים את הסנכרון המדויק בין sCMOS ו-ETL.
    הערה: הסנכרון של מהירות הסריקה של הפעלת פיקסלים ETL ו-sCMOS הוא קריטי לאיכות התמונה. שגיאות אסינכרוניות נפוצות שונות מסוכמות באיור 6C-F.
  7. לאחר קביעת פרמטרי סנכרון אופטימליים לסנכרון, סובב את מצלמת sCMOS ב- 90° סביב ציר Z כדי ליישר את כיוון הפיקסלים הפעילים עם כיוון סריקת הלייזר.
  8. חזור על שלב 2.10 ומדוד את FWHM של PSF. השתמש באותה שיטה כפי שצוין בדוח הקודם16, עם הרזולוציות הצידיות והציריות הממוצעות של ASLM כ- 2.18 מיקרומטר ו- 2.88 מיקרומטר, בהתאמה (איור 7).
    הערה: תאורה ורזולוציה אחידות לאורך כל ה-FOV אפשריות בתנאים אידיאליים (איור 7A-B). פעולה אסינכרונית של ETL עם מצלמת sCMOS, כמו גם חוסר התאמה של התאורה והזיהוי, יכולים לגרום לרזולוציה מרחבית לא אחידה (איור 7C-D).
  9. עבור הדמיית לב, לאחר יישור המערכת וקביעת הפרמטרים האופטימליים לסנכרון המערכת, המשך בשלבים 2.6 עד 2.9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

LSM הוכח כמטפח מחקרי לב 31,32,33,34,35,36,37 בשל הסיכון המינימלי לנזק לצילום, רזולוציה מרחבית גבוהה וחתך אופטי בניגוד לשיטות הדמיה אופטיות אחרות כגון שדה בהיר וטכניקות סריקה נקודתית 6,8,38,39,40

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התקדמות שיטות ההדמיה, החישוב וניקוי הרקמות סיפקה הזדמנות חסרת תקדים לחקור באופן נרחב את מבנה הלב ותפקודו. זה טומן בחובו פוטנציאל גדול להעמקת ההבנה שלנו של מורפוגנזה ופתוגנזה של הלב באמצעות מודל לב מכרסם שלם. בניגוד למחקרי in vivo של לב דג זברה בגישה דומה 40,41,42,43, השילוב של טכניקות LSM מתקדמות ושיטות ניקוי רקמות מאפשר לנו להתגבר על אתגרים בין רזולוציה מרחבית לעומק חדירה בעת הדמיה של מכרסם מודל

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

תודות

אנו מביעים את תודתנו לקבוצתו של ד"ר אריק אולסון במרכז הרפואי UT Southwestern על שיתוף נדיב של דגמי בעלי החיים. אנו מעריכים את כל ההערות הבונות שסופקו על ידי חברי החממה D ב- UT דאלאס. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) ותוכנית UT Dallas STARS (Y.D).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>1% אגרוז
התכה נמוכה אגרוזתרמו פישר16520050
מים נטולי יונים-
כימיקלים <חזקים>לניקוי רקמות 
5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, תערובת של cis ו-transSigma-Aldrich118184
D.E.R.™ 332Sigma-Aldrich31185
D.E.R.™ 736Sigma-Aldrich31191
Dibenzyl ether (DBE)Sigma-Aldrich33630
דיכלורומתאן (DCM)סיגמא-אולדריץ'270997
חרוזי פלואורסצנטSpherotechFP-0556-2
מי חמצן (H2O2)Sigma-Aldrich216736
מתנולסיגמא-אולדריץ'439193
פרפורמלדהיד (PFA)תרמו פישר47392
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)סיגמא-אולדריץ'79383
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא-אולדריץ'P3911
<חזק>תוכנה ואלגוריתמים
אמירהתרמו פישר סיינטיפיק2021.2
BigStitcherHö rl et al.22
Fiji-ImageJSchindelin et al.201.54f
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
רכיבי מפתח של מערכת גיליונות האור המותאמת אישית
0.63 - 6.3X זום גוףאולימפוסMVX-ZB10 
10X מטרת תאורהNikonMRH00105
1X מטרת זיהויOlympusMV PLAPO 1X/0.25 
473nm DPSS לייזרלייזרLRS-0473-PFM-00100-05
532nm DPSS לייזרLRS-0532-PFM-00100-05
589  nm DPSS לייזרLaserglow TechnologiesLRS-0589-GFF-00100-05
מחבר BNCמכשיר לאומיBNC-2110
עדשה גליליתThorlabsACY254-050-A
בקר מנוע DC, 4 ציריםPhysik InstrumenteC-884.4DC
ETLOptotuneEL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
כבל ETLOptotuneCAB-6-300
ETL דרייבר עדשהOptotuneEL-E-4i
מסנןChromaET525/30
מסנןChromaET585-40
ChromaET645-75
גלגל מסנן מכשיר תריסLAMBDA 10-B
שלב תרגום ממונעPhysik InstrumenteL-406.20DG10
שלב תרגום ממונעPhysik InstrumenteL-406.40DG10
שלב תרגום ממונעPhysik InstrumenteM-403.4PD
NI רב תכליתי I/Oמכשיר לאומיPCIe-6363
מצלמת sCMOSHamamatsuC13440-20CU
מנוע צעדפולולו1474
עדשת צינוראולימפוסMVX-TLU
נקודת טכנולוגיות לייזר טכנולוגיות

מקורות

  1. Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
  2. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
  3. Stelzer, E. H. K. K., et al. Light sheet fluorescence microscopy. Nat Rev Methods Prim. 1, 73(2021).
  4. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. J Opt. 20, 053002(2018).
  5. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14, 360-373 (2017).
  6. Ding, Y., et al. Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system. JCI Insight. 3, e121396(2018).
  7. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Sci Rep. 7, 42209(2017).
  8. Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Sci Rep. 6, 1-12 (2016).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  10. Stelzer, E. H. K., Huisken, J., Swoger, J., Greger, K., Verveer, P. Multi-view image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
  11. Dean, K. M., Roudot, P., Welf, E. S., Danuser, G., Fiolka, R. Deconvolution-free subcellular imaging with axially swept light sheet microscopy. Biophys J. 108, 2807-2815 (2015).
  12. Dean, K. M., et al. Isotropic imaging across spatial scales with axially swept light-sheet microscopy. Nat Protoc. 17, 2025-2053 (2022).
  13. Hedde, P. N., Gratton, E. Selective plane illumination microscopy with a light sheet of uniform thickness formed by an electrically tunable lens. Microsc Res Tech. 81, 924(2018).
  14. Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative: open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nat Meth. 16, 1105-1108 (2019).
  15. Giardini, F., et al. Mesoscopic optical imaging of whole mouse heart. J Vis Exp. (176), e62795(2021).
  16. Sodimu, O., et al. Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice. J Biophotonics. 16, e202200278(2023).
  17. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
  18. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nat Rev Methods Prim. 1, 1-24 (2021).
  19. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21, 61-79 (2020).
  20. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  21. Kirchner, K. N., et al. A hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue. J Vis Exp. (166), e61821(2020).
  22. Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. J Vis Exp. (139), e57769(2018).
  23. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82, 518-529 (2015).
  24. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16, 870-874 (2019).
  25. Becker, K., et al. Reduction of Photo Bleaching and Long Term Archiving of Chemically Cleared GFP-Expressing Mouse Brains. PLoS One. 9, e114149(2014).
  26. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  27. Guo, M., et al. Rapid image deconvolution and multiview fusion for optical microscopy. Nat. Biotechnol. 38, 1337-1346 (2020).
  28. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat Methods. 9, 755-763 (2012).
  29. Fahrbach, F. O., Voigt, F. F., Schmid, B., Helmchen, F., Huisken, J. Rapid 3D light-sheet microscopy with a tunable lens. Opt Express. 21, 21010-21026 (2013).
  30. Liu, Y., Rollins, A. M., Jenkins, M. W. CompassLSM: axially swept light-sheet microscopy made simple. Biomed Opt Express. 12, 6571-6589 (2021).
  31. Kolesová, H., Olejníčková, V., Kvasilová, A., Gregorovičová, M., Sedmera, D. Tissue clearing and imaging methods for cardiovascular development. iScience. 24 (4), 102387(2021).
  32. Sands, G. B., et al. It's clearly the heart! Optical transparency, cardiac tissue imaging, and computer modelling. Prog Biophys Mol Biol. 168, 18-32 (2022).
  33. Wilson, A. J., Sands, G. B., LeGrice, I. J., Young, A. A., Ennis, D. B. Muscle mechanics and ventricular function: Myocardial mesostructure and mesofunction. Am J Physiol - Hear Circ Physiol. 323, H257(2022).
  34. Lee, S. E., et al. Three-dimensional cardiomyocytes structure revealed by diffusion tensor imaging and its validation using a tissue-clearing technique. Sci. Reports. 8, 1-11 (2018).
  35. Sereti, K. I., et al. Analysis of cardiomyocyte clonal expansion during mouse heart development and injury. Nat Commun. 9, 754(2018).
  36. Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Sci. Reports. 10, 1-9 (2020).
  37. Olianti, C., et al. Optical clearing in cardiac imaging: A comparative study. Prog Biophys Mol Biol. 168, 10-17 (2022).
  38. Baek, K. I., et al. Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging. Prog Biophys Mol Biol. 138, 105-115 (2018).
  39. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10, 1-14 (2019).
  40. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae. APL Bioeng. 7, 26112(2023).
  41. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. J Clin Invest. 126, 1679-1690 (2016).
  42. Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. Computational Analysis of Cardiac Contractile Function. Curr Cardiol Rep. 24, 1983-1994 (2022).
  43. Zhang, X., et al. 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction. J Vis Exp. (203), e66263(2024).
  44. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
  45. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Mol Syst Biol. 17, 9807(2021).
  46. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-clear: a tissue clearing method for three-dimensional imaging of adipose tissue. J Vis Exp. (137), e58271(2018).
  47. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light-sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Ann Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  48. Yuan, J., et al. Extended reality for biomedicine. Nat Rev Methods Prim. 3, 1-1 (2023).
  49. Ding, Y., et al. Saak transform-based machine learning for light-sheet imaging of cardiac trabeculation. IEEE Trans Biomed Eng. 68, 225-235 (2020).
  50. Buffinton, C. M., Benjamin, A. K., Firment, A. N., Moon, A. M. Myocardial wall stiffening in a mouse model of persistent truncus arteriosus. PLoS One. 12 (9), e0184678(2017).
  51. Trincot, C. E., et al. Adrenomedullin induces cardiac lymphangiogenesis after myocardial infarction and regulates cardiac edema via Cx43. Circ Res. 124, 101(2019).
  52. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12, e0182072(2017).
  53. Coram, R. J., et al. Muscleblind-like 1 is required for normal heart valve development in vivo. BMC Dev Biol. 15, 36(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מיקרוסקופיית גילי אורדימוי מבנה לבבישקיפות רקמותדימוי לב של מכרסמיםמיקרו-מבנה השריר הלבבימיקרוסקופיה בסריקה ציריתתפירת תמונותדה-קונבולוציה רב-מבטיתהתאמת מקדם שבירהרמודלינג לבבי
הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.