הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

אי ספיקת לב נותרה הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם, בעיקר בשל היעדר יכולת התחדשות של קרדיומיוציטים בוגרים¹. הארכיטקטורה המורכבת של הלב ממלאת תפקיד מכריע בתפקודו ומספקת תובנות לגבי תהליכים התפתחותיים. הבנה מעמיקה של מבנה הלב חיונית להבהרת התהליכים הבסיסיים של מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש בתגובה לאוטם שריר הלב. ההתקדמות האחרונה הוכיחה כי עכברים ילודים יכולים לשחזר את תפקוד הלב לאחר פציעה, בעוד עכברים בוגרים חסרים יכולת התחדשות כזו². זה מבסס בסיס לחקר רמזים הקשורים לחריגות מבניות ותפקודיות במודלים של עכברים. לשיטות הדמיה מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, יש מגבלות טכניות, כולל עומק חדירה מוגבל, סכמת סריקה נקודתית איטית ונזקי צילום כתוצאה מחשיפה ממושכת לאור לייזר. אלה מעכבים הדמיה תלת ממדית מקיפה (3D) של הלב השלם. בהקשר זה, מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) מתגלה כפתרון רב עוצמה, המציע את היתרונות של הדמיה במהירות גבוהה, נזק מופחת לצילום ויכולות חתך אופטיות יוצאות דופן ^3,4,5. התכונות הייחודיות של LSM מציבות אותו כשיטה מבטיחה להתגבר על מגבלות הטכניקות הקונבנציונליות, ומספקות תובנות חסרות תקדים^{על התפתחות הלב} ותהליכי שיפוץ ^6,7,8.

בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיית הדמיה המשלבת LSM מתקדם עם גישות מותאמות לניקוי רקמות⁹, ומאפשרת הדמיה של לבבות עכבר שלמים ללא צורך בתיוג ספציפי ובחתך מכני. אנו מציעים גם כי ניתן לשפר את הדמיית LSM קונבנציונלית באמצעות טכניקות multiview deconvolution¹⁰ או מיקרוסקופ גיליון אור (ASLM) 11,12,13,14,15 כדי לשפר את הרזולוציה הצירית. בנוסף, שילוב של תפירת תמונה עם כל אחת מהשיטות הללו יכול להתגבר ביעילות על הפשרה בין רזולוציה מרחבית לשדה ראייה (FOV), ובכך לקדם את ההדמיה של לבבות עכברים בוגרים. השילוב של גישות רבות לניקוי רקמות, כולל שיטות הידרופוביות, הידרופיליות ומבוססות הידרוג'ל, מאפשר חדירת אור עמוקה יותר ללכידת המורפולוגיה של הלב כולו 16,17,18,19.

בעוד שיטות ניקוי מרובות תואמות למערכות LSM הנוכחיות, המטרה היא למזער את פיזור הפוטונים ולהגביר את חדירת האור ברקמות, כמו הלב, על ידי החלפת שומנים בתווך התואם באופן הדוק את מקדם השבירה שלו. iDISCO נבחרה כמייצגת^20,21 והותאמה לדימות אוטופלואורסצנטי בפרוטוקול זה הודות לעיבוד המהיר והשקיפות הגבוהה שלה (איור 1A). באופן קולקטיבי, השילוב של גישת LSM המתקדמת עם טכניקות ניקוי רקמות מציע מסגרת מבטיחה לפענוח אנטומיה לבבית מורכבת בלבבות מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי לקידום הבנתנו במורפוגנזה ופתוגנזה של הלב.

פרוטוקולים וניסויים בבעלי חיים אושרו ונערכו תחת פיקוחה של אוניברסיטת טקסס בוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בדאלאס (IACUC #21-03). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL6, כולל יילודים ביום 1 (P1) שלאחר הלידה ומבוגרים בני 8 שבועות. לא נצפה הבדל בין זכרים לנקבות. כל איסוף הנתונים ועיבוד התמונה לאחר מכן בוצעו באמצעות תוכנות קוד פתוח או פלטפורמות עם רישיונות מחקר או חינוך. המשאבים זמינים מהמחברים על פי בקשה סבירה.

1. הכנת דגימה וניקוי רקמות (6 - 10 ימים)

1. הכינו את כל התמיסות הכימיות בטבלת החומרים הנדרשים לשיטת ניקוי הרקמה לפני תחילת הליך ניקוי הרקמות.
   הערה: יש לבצע את כל ההליכים במכסה אדים תוך לבישת ציוד מגן אישי מתאים, במיוחד בעת טיפול בכימיקלים רעילים.
2. הרדימו בעלי חיים עם_CO2 על ידי הכנסתם לתא CO₂ בנקודות הזמן הרצויות, כגון P1 ו-8 שבועות, לאיסוף לב שלם וטבלו את הלב המבודד הטרי בטמפרטורת החדר (RT) ב-0.2 M KCl כדי לעצור בדיאסטולה¹⁶.
3. תקן את הלב על ידי טבילה של 4% paraformaldehyde (PFA) במי מלח חוצץ פוספט 1x (PBS) עם תסיסה עדינה על נדנדה למשך הלילה כדי לשמר את האנטומיה של הלב ב -4 מעלות צלזיוס, ראה טבלה 1.
   אזהרה: PFA הוא כימיקל רעיל ויש לבצע אותו תחת מכסה אדים.
4. שטפו את הלב עם 1x PBS ב-RT למשך 30 דקות, 3x.
   הערה: אופציונלי: הטמע את הלב בג'ל אגרוז כדי ליצור מכלול לב עבור מערכת LSM שנבנתה בהתאמה אישית בשלב 2 כמתואר להלן.
   1. מכינים את תמיסת האגרוז 1% על ידי המסת אגרוז ב-PBS ומחממים את התערובת במיקרוגל עד להמסה מלאה. יוצקים את התמיסה לתוך תבנית כדי ליצור שכבה תחתונה עד התמיסה מתקררת ל 40 מעלות צלזיוס.
   2. מניחים את הלב בתבנית וממלאים את התבנית בג'ל אגרוז עד שהוא מתמצק. סלק את כל הבועות בג'ל האגרוז כדי למזער ממצאים בהדמיה.
      הערה: הטמעת הדגימה מפחיתה את הסיכון לנזק פוטנציאלי לאנטומיה של הלב במהלך ההרכבה.
      אזהרה: יש להשתמש באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ולהימנע ממיקום הלב ישירות באגרוז מחומם כדי להפחית את הסיכון לחשיפת הדגימה לטמפרטורות גבוהות.
5. ייבשו את הלב באמצעות שיפועים של מתנול מעורבב עם מים שעברו דה-יוניזציה (איור 1B), ועברו עיבוד באמצעות ריכוזים רציפים של 20%, 40%, 60%, 80% ו-100% כמתואר בטבלה 1. יש לחזור על הפעולה עם 100% מתנול טרי פעם אחת כדי להבטיח התייבשות מוחלטת. יש לייבש לבבות עכברים יילודים למשך שעה אחת בכל תערובת מתנול עם רעידות. התאימו את זמן הדגירה לשעתיים עבור לבבות עכברים בני 8 שבועות ולבבות חולדות.
   אזהרה: מתנול הוא כימיקל נדיף, מגרה ודליק.
6. החליפו וצננו את הלב במתנול 100% טרי למשך 10 דקות ב-4°C.
7. החלף את התמיסה והלבין את הלב עם 5% מי חמצן (H₂O₂) במתנול באמצעות יחס נפח של 1:5 (30% H₂O₂ עד 100% מתנול) למשך הלילה ב 4 ° C כדי להסיר את הפיגמנטים.
   הערה: הסרת פיגמנטים מאפשרת למזער את בליעת הפוטון, מה שמוביל לשיפור איכות התמונה עם לכלוכים מופחתים.
8. החלף את התמיסה ודגר על הלב ב 100% מתנול במשך שעה אחת ב RT.
9. לטהר את הלב עם תמיסה המכילה 66% dichloromethane (DCM) ו 33% מתנול במשך 3 שעות עם רעידות. ודא שהלב שוקע לתחתית הבקבוקון בסוף שלב זה. אם לא, חדשו את התמיסה (66% DCM / 33% מתנול) והאריכו את זמן הדגירה (למשל, שעה נוספת) כדי להשיג הסרת שומנים מלאה. העבר את הלב לתמיסה חדשה במהירות כדי למנוע התייבשות, מכיוון ש- DCM נדיף מאוד.
   זהירות: השתמש בפוליפרופילן או בכלי זכוכית עבור הניסוי, מכיוון ש- DCM אינו תואם לפוליסטירן.
10. השתמש באתר דיבנזיל (DBE) להתאמת אינדקס השבירה (RI = 1.56). עבור לבבות עכבר בילוד, תהליך התאמת אינדקס השבירה אורך יומיים, ואילו עבור לבבות עכבר בני 8 שבועות, זה לוקח 5 ימים עם רעידות קלות. החליפו אותו ב-DBE טרי והאריכו את זמן הדגירה עד שהלב ישיג שקיפות מלאה.
    זהירות: DBE מסוכן. יש להימנע מכל מגע עם העור.

2. הרכבה לדוגמה (יום אחד)

הערה: במקרה שנעשה שימוש במערכת LSM מסחרית, עקוב אחר הפרוטוקול הספציפי שלה שסופק על ידי החברה כדי לתקן את הלב ולדלג על שלבים 2.1 - 2.9.

1. התאם אישית תא ומחזיק עמידים בפני פתרון התאמת אינדקס השבירה (לדוגמה, DBE בגישת iDISCO המותאמת) באמצעות מדפסת תלת-ממד וחומרי אוניקס (איור 2A)¹⁶.
2. הצמידו מגנט לתחתית התא כדי לאפשר חיבור מהיר ולוקליזציה מדויקת תחת מערכת LSM (איור 2B).
3. חברו משקפי כיסוי בגודל 25 מ"מ x 50 מ"מ x 0.17 מ"מ לתא באמצעות דבק סיליקון שקוף וודאו את שלמות התא עמיד למים על ידי מילויו ב-DBE ובדיקת נזילות לאחר יום אחד.
4. התאימו אישית מחזיק מהדק באמצעות מדפסת תלת-ממד והצמידו מגנט להרכבת מכלול הלב בתוך התא (איור 2C) או הכניסו מחט לג'ל האגרוז להרכבת מכלול הלב.
5. בצע את הפיתוח של מערכת LSM פנימית באמצעות עדשה גלילית ולייזרים במצב מוצק שאוב דיודה רציפה (DPSS) כפי שדווח בעבר^16,22. השתמשו באורך גל העירור של 532 ננומטר כדי ללכוד אוטופלואורסצנטיות משריר הלב (איור 2D).
6. הרכיבו את התא על במה 6 ממדית ואתרו את המיקום האופטימלי בו התא ניצב לכיוון התפשטות הלייזר.
7. השתמש במחזיק מהדק מגנטי כדי למקם את הדגימה במרכז התא ולחבר את המחזיק לשלב ממונע 4 ממדי (X, Y, Z ו- Yaw; איור 2D).
8. השקיעו את מכלול הלב לתוך החדר המלא ב-DBE באמצעות השלב הממונע וקבעו את טווח הסריקה לאורך ציר הגילוי (כיוון Z).
9. קבע את מהירות הסריקה (V_z) של המנוע לאורך כיוון Z בהתבסס על גודל הצעד (S) וזמן הרכישה של תמונה (T) באמצעות המשוואה הבאה:
   
   הערה: הקשר בין גודל הצעד לבין הרזולוציה הצירית של מערכת ההדמיה תואם את משפט הדגימה של ניקוויסט-שאנון. לדוגמה, גודל המדרגה נקבע על 1 מיקרומטר, בהתחשב בכך שהרזולוציה הצירית הייתה 2.91 מיקרומטר, כפי שצוין בדו"ח הקודם¹⁶.
10. כדי לאמת את הרזולוציה המרחבית ולמזער בעיות אטימות פוטנציאליות בעומקים שונים, מדדו את פונקציית פיזור הנקודות (PSF) של המערכת על ידי הדמיית חרוזים פלואורסצנטיים בקוטר של 0.53 מיקרומטר מדוללים בג'ל אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה של 1% עם ריכוז של 1:1.5 x 10⁵. חשב את PSF על פני כל הדגימה על-ידי מדידת הרוחב המלא בחצי מקסימום (FWHM)¹⁶.

3. תפירת תמונה (4-8 שעות)

1. חשב את מספר האריחים הדרושים לכיסוי לב העכבר כולו, בהתחשב ב- FOV המוגבל. עבור כל אריח, הממדים תואמים את FOV של מערכת LSM. לדוגמה, לב עכבר יילוד עם מדידת חתך של 3 x 3.6 מ"מ² דורש 2 x 2 אריחים לכיסוי ב-LSM המותאם אישית (איור 3A). לעומת זאת, לב עכבר בן 8 שבועות בגודל 5X8 מ"מ² דורש 3X4 אריחים כדי לכסות את כל מבנה הלב (איור 3B).
   הערה: תפירת תמונה נדרשת אם LSM קונבנציונאלי יש FOV מוגבל עבור הדמיה של הלב כולו.
2. צלמו תמונות של הלב החל מאריח 1, כלומר האריח השמאלי העליון של הלב (איור 3A-B).
3. צלם ברצף תמונות של שאר האריחים עם חפיפה של 10% בין אריחים עוקבים עד לכיסוי הלב כולו, כפי שמודגם באיור 3C.
4. הורד והתקן תוכנת קוד פתוח פיג'י²³ . הורד והתקן את תוסף פיג'י, BigStitcher²⁴.
5. נווט אל תפריט עזרה, בחר עדכן, בחר נהל אתר עדכון ובחר ב- BigStitcher. לאחר מכן, לחץ על סגור ולאחר מכן החל שינויים. עם השלמת הורדת התוסף, הפעל מחדש את תוכנת פיג'י.
6. פתח את תוסף BigStitcher וייבא את כל האריחים הדרושים דרך ספריית קבצי התמונה. שמור את ערכת הנתונים כקובץ HDF5.
7. ארגנו אריחים באמצעות בחירה באפשרות 'הזז אריח לפי רשת רגילה', בחרו בדוגמת המילוי המשמשת להזזת הלב ובחרו חפיפה של 10% בין כל אריח. תפור את האריחים באמצעות האפשרות אשף התפירה.
8. יצא את הנתונים התפורים באמצעות Image Fusion, ליצירת קובץ tiff.

4. Multiview deconvolution (5 ימים)

1. השתמשו בחרוזים פלואורסצנטיים לרישום תמונה של שחזור רב-תצוגות לאורך הלב (איור 3D).
   1. הכינו שרף²⁵ על ידי ערבוב Bisphenol-A diglycidyl ether (D.E.R. 332), Isophorone diamine, 5-amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine (IPDA), ואתר פוליפרופילן גליקול diglycidyl (D.E.R 736) ביחס נפח של 4:1:1.
   2. צנטריפוגה 10 μL של חרוזים פלואורסצנטיים ב 161 x גרם במשך 5 דקות ולהוסיף 20 μL של מתנול כדי להחליף את פתרון האחסון של החרוזים. חזור על כך 3x.
   3. הכינו תמיסה של 10 מ"ל עם ריכוז חרוזים של 1:1 x 10⁵ על ידי ערבוב תמיסת החרוזים המבוססת על מתנול לתוך השרף שהוכן בשלב 4.1.1.
   4. נטרלו את התמיסה בתא ואקום למשך 3 שעות כדי להסיר כיסי אוויר ובועות.
   5. יוצקים את התמיסה לתוך תבנית סיליקון או קשית שתייה פלסטיק ולחכות 2 עד 3 ימים עד שהוא מתמצק. לאחר יום אחד לפני שהשרף הופך מוצק, הכניסו את צינור הזכוכית לתוך התבנית והמתינו עד שהצינור יתחבר לשרף. הסירו את השרף מהתבנית בעזרת צינור הזכוכית (איור 3D).
   6. הכניסו את הלב לצינור הזכוכית, מלאו אותו ב-DBE והרכיבו את צינור הזכוכית בתא המלא ב-DBE.
2. צלם תמונות רציפות של לב העכבר יחד עם החרוזים מהקטע המואר על ידי סריקת מכלול הלב לאורך ציר הזיהוי (ציר Z; איור 3E-F).
   הערה: יישם תפירת תמונות בשלב 3 כדי ליצור ערימות נפרדות של תמונות אם גודל הלב חורג מה- FOV.
3. סובב את לב העכבר ב-60° לאורך ציר ה-Y כדי ללכוד את הערימות הבאות מזוויות מרובות, כלומר 0°, 60°, 120°, 180°, 240° ו-300° (איור 3E-F).
4. פתח את תוסף BigStitcher וייבא את כל התמונות דרך ספריית קבצי התמונות. שמור את ערכת הנתונים כקובץ HDF5.
5. בחר זיהוי נקודות עניין ובחר ידנית חרוזי עניין לרישום.
6. בחר Affine Transformation Model לרישום. בחרו 'פונקציית התפשטות נקודתית' והקצו PSF לכל התצוגות.
7. לחץ על Multiview Deconvolution ובחר את סוג האיטרציה כ - Efficient Bayesian. הגדר את מספר האיטרציות כ- 10 ובצע אותו²⁶.
8. לחץ על Image Fusion כדי לייצא קובץ tiff .
   הערה: מידע מפורט יותר אודות deconvolution multiview ניתן למצוא בדוחות או פרוטוקולים אחרים 24,27,28.

5. חומרת מערכת גליונות אור שנסחפה באופן אקסיאלי (יום אחד)

1. התקינו עדשה חשמלית (ETL) במישור פורייה של העדשה הגלילית (CL)²⁷ (איור 2D) כדי לסרוק את קרן הלייזר באופן אקסיאלי¹, ⁴. ודא שהממשק הנוזלי ב- ETL הוא אופקי כדי למנוע עיוות חזית הגל הנגרם על ידי כוח הכבידה. יישר ETL במדויק כדי למזער ירידת אלומה וסטיות אופטיות מסדר גבוה יותר³⁰.
2. התקן כרטיס DAQ בתחנת העבודה וחבר כבל BNC לכרטיס DAQ כדי לסנכרן את חשיפת המצלמה וסריקת ETL.
3. פתח את המארז של מנהל התקן ETL והסר את הכיסוי (איור 4).
4. הלחמת את חוט האות של כבל BNC לאנלוגי בסיכת B, כפי שמסומן בתחתית לוח המעגלים המודפסים (איור 4).
5. הלחמת את חוט הארקה של כבל BNC לסיכת GND; לאחר מכן, חבר את הקצה השני של כבל BNC ל-AO (פלט אנלוגי) בכרטיס DAQ (איור 4).
6. חבר את מנהל התקן ETL ליציאת ה- USB של תחנת העבודה, חבר את מנהל ההתקן ל- ETL באמצעות כבל hirose והתקן תוכנת בקר מנהל התקן עדשה.
7. שנה את מצב הפעולה בתוכנת בקר מנהל ההתקן של העדשה לאנלוגי כדי לשלוט ב-ETL באמצעות הדק שנוצר מכרטיס DAQ.
8. בתוכנה של מצלמת sCMOS, העבר את מצב לכידה לחיצוני (גיליון אור). ודא שכיוון סריקת הפיקסלים הפעיל מאונך לכיוון סריקת הלייזר כדי לסייע בסנכרון.
9. חבר את יציאת ההדק החיצונית בגב מצלמת sCMOS ל-AO של כרטיס DAQ באמצעות כבל BNC (איור 4).

6. סנכרון מערכת גליונות אור שנסחפו באופן אקסיאלי (7 ימים)

1. הגדר את זמן החשיפה בהתבסס על יחס אות לרקע (SBR) המקובל, אשר עבור המחקר המוצע, הוא לפחות 10. הגדל את זמן החשיפה אם SBR נמוך מ- 10.
   הערה: זמן חשיפה הנע בין 10 ל- 50 אלפיות השנייה מספק SBR מקובל בפרויקט זה.
2. הגדר את זמן הרכישה של תמונה (T) ואת מרווח השורות (L) בהתבסס על זמן החשיפה (E) של המצלמה ותדר ETL (f) באמצעות המשוואות הבאות:
   
   
   כאשר P מציין את מספר עמודות הפיקסלים בחיישן המצלמה. הפרמטרים המייצגים עבור ההפניה הם f = 1 הרץ, P = 2048, E = 10 ms ו - L = 243 μs, בהתאמה.
3. בתוכנית LabVIEW Trigger Generator.vi, יוצר טריגרים מרובעים ומשולשים לסנכרון (איור 5).
   הערה: תוכנית LabVIEW המותאמת אישית זמינה מהמחברים על פי בקשה סבירה.
4. חרוזי הר פלואורסצנטי מדוללים בג'ל אגרוז¹⁶ בעל נקודת התכה נמוכה של 1% עם ריכוז של 1:1 x 10³ כדי לאתר את מיקום מותני הקרן בתמונה (איור 6A).
5. בתוכנית, זהה את נקודות ההתחלה והסיום של קרן הלייזר מתחת ל- FOV על ידי שינוי המתח לאורך כיוון הסריקה.
6. כדי לסנכרן את מצלמת sCMOS ואת ETL, סרוק את קרן הלייזר לאורך ציר ה-X ואת הפיקסלים הפעילים לאורך ציר ה-Y כדי ליצור תמונה דו-ממדית (איור 6B). החרוזים הבהירים והחדים יותר לאורך האלכסון בתמונה מציינים את הסנכרון המדויק בין sCMOS ו-ETL.
   הערה: הסנכרון של מהירות הסריקה של הפעלת פיקסלים ETL ו-sCMOS הוא קריטי לאיכות התמונה. שגיאות אסינכרוניות נפוצות שונות מסוכמות באיור 6C-F.
7. לאחר קביעת פרמטרי סנכרון אופטימליים לסנכרון, סובב את מצלמת sCMOS ב- 90° סביב ציר Z כדי ליישר את כיוון הפיקסלים הפעילים עם כיוון סריקת הלייזר.
8. חזור על שלב 2.10 ומדוד את FWHM של PSF. השתמש באותה שיטה כפי שצוין בדוח הקודם¹⁶, עם הרזולוציות הצידיות והציריות הממוצעות של ASLM כ- 2.18 מיקרומטר ו- 2.88 מיקרומטר, בהתאמה (איור 7).
   הערה: תאורה ורזולוציה אחידות לאורך כל ה-FOV אפשריות בתנאים אידיאליים (איור 7A-B). פעולה אסינכרונית של ETL עם מצלמת sCMOS, כמו גם חוסר התאמה של התאורה והזיהוי, יכולים לגרום לרזולוציה מרחבית לא אחידה (איור 7C-D).
9. עבור הדמיית לב, לאחר יישור המערכת וקביעת הפרמטרים האופטימליים לסנכרון המערכת, המשך בשלבים 2.6 עד 2.9.

LSM הוכח כמטפח מחקרי לב 31,32,33,34,35,36,37 בשל הסיכון המינימלי לנזק לצילום, רזולוציה מרחבית גבוהה וחתך אופטי בניגוד לשיטות הדמיה אופטיות אחרות כגון שדה בהיר וטכניקות סריקה נקודתית 6,8,38,39,40 . לכן, כדי להבין טוב יותר את ארכיטקטורת שריר הלב התלת-ממדית, ביססנו את הפרוטוקול המבוסס על גישות ראשוניות כולל ניקוי iDISCO מותאם, תפירת תמונות, deconvolution multiview ו- ASLM. בעוד שהצגנו תוצאות באמצעות מודלים של עכברים, חשוב לציין שגם חולדות ומודלים אחרים של מכרסמים מתאימים לשיטות המוצעות. פרוטוקול ניקוי הרקמה המותאם מאפשר עיבוד של לב עכבר P1 שקוף תוך 4 ימים ולב עכבר בן 8 שבועות שקוף תוך 7 ימים (איור 1B). צעד זה משמש כנקודת מוצא למזעור בליעת פוטונים ופיזורם בלב שלם. Multiview deconvolution מאפשר שיפור של רזולוציה צירית על ידי מיזוג תמונות מנקודות מבט מרובות למודל יחיד. לאחר הקלטה רציפה של תמונות מ-6 תצוגות של אותו לב, שיטת הדה-קונבולוציה מרובת התצוגות משיגה רזולוציה כמעט איזוטרופית עם רוחב של 4.68 מיקרומטר וצירית של 5.06 מיקרומטר, לאחר 15 שעות של חישוב (איור 8A). כדי לייתר את המורכבות החישובית, התאמנו אישית ASLM מבוסס ETL לתמונה מלבבות עכברים בוגרים ליילודים. שיטה זו מאפשרת לנו לסרוק את שריר הלב באמצעות קרן לייזר ממוקדת היטב, למזער את הרקע הלא ממוקד ולשפר את ניגודיות התמונה בהשוואה לשיטות LSM הקונבנציונליות (איור 8B). עם תכנון ASLM הנוכחי, הרזולוציות הצידיות והציריות הממוצעות של המערכת משיגות 2.18 מיקרומטר ו- 2.88 מיקרומטר, בהתאמה, מה שמאפשר חקירה מעמיקה של טרבקוליציית שריר הלב בחדרים. בנוסף, ניתן להשתמש בתפירת תמונה באופן עצמאי, או בשילוב עם deconvolution multiview או ASLM כדי להרחיב את ה- FOV עבור גדלי דגימה גדולים יותר. שילוב תפירה עם ASLM מאפשר לנו לכסות את כל לב העכבר בן 8 השבועות ברזולוציה אחידה (איור 8C), ומספק פתרון יעיל לחקר חתך הלב כולו.

איור 1: תהליך ניקוי רקמות. (A) השיטה ההידרופובית כוללת התייבשות רקמות, מיצוי שומנים והתאמת אינדקס שבירה באמצעות אתר דיבנזיל (DBE) כממס אורגני. (B) לטבול את הלב בתמיסת 4% פורמלדהיד (PFA) ולייבש אותו עם שיפוע של מתנול ותערובות מים דה-יוניזציה (DI). אקונומיקה של הלב באמצעות 5% H2O2 במתנול ב 4 ° C. מעדנים את הלב עם דיכלורומתאן (DCM) ותמיסת מתנול עד שהדגימה שוקעת לתחתית הצינור. לבסוף, לדגור על הלב ב- DBE על מנת להשיג את מדד השבירה הרצוי. קווי רשת 5 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: סכמטי של מיקרוסקופ יריעות אור שנסחפו באופן אקסיאלי . (A) תא מודפס תלת-ממדי מותאם אישית, (B) מגנט קאמרי, (C) מחזיק מהדק ו-(D) מערכת ASLM. קיצורים: CL: עדשה גלילית; ETL: עדשה אלקטרונית; IL: עדשת תאורה; DL: עדשת זיהוי; FW: גלגל סינון; TL: עדשת צינור. נתון זה שונה מ- Ref16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תפירת תמונה ודה-קונבולוציה מרובת תצוגות. (א-ב) תפירת תמונה משמשת לכיסוי כל לבבות העכבר, כאשר לכל אריח יש חפיפה של 10% FOV עם האריחים הסמוכים לו. (C) תבנית תנועה של לב העכבר לתפירת תמונה. (D) חרוזי פלורסנט מודבקים לקצה צינור הזכוכית כדי להקל על רישום התמונה, בעוד הלב ממוקם בתוך צינור הזכוכית המכיל DBE, מה שמאפשר הדמיה בו-זמנית של לב העכבר וחרוזי פלורסנט. (E) דה-קונבולוציה מרובת תצוגות כוללת רכישה של תמונות משש נקודות מבט שונות, שכל אחת מהן אוספת תמונות מכיוונים ייחודיים. (F) נתונים גולמיים של לב עכבר P1 וחרוזים בזוויות שונות של 0°, 60°, 120°, 180°, 240° ו-300°. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. נתון זה שונהמ-16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: דיאגרמת בלוקים של מערכת ASLM. שימוש בכרטיס DAQ לסנכרון מצלמת ETL ו-sCMOS. הדיור של מנהל ההתקן ETL נפתח להלחמה של חוטי אות והארקה ל- PCB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: לוח הבקרה LabView. לוח הבקרה LabVIEW ליצירת טריגרים לסנכרון ETL ופיקסלים מופעלים של מצלמת sCMOS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: סנכרון המיקוד של גיליון אור עם פיקסלים מופעלים. (A) זיהוי נקודות ההתחלה והסיום של טווח סריקת יריעות האור מושג על-ידי הגדרת המתח המתאים עבור הדק ETL. (B) התוצאה הסינכרונית של חרוזים פלואורסצנטיים ניכרת לאורך האלכסון של התמונה. (ג-ו) הרזולוציה המרחבית הלא אחידה על פני כל ה- FOV נובעת מהפעולה האסינכרונית של ETL עם מצלמת sCMOS. ה-ETL יוזם סריקה (C) מאוחר יותר או (D) מוקדם יותר מהפיקסל שהופעל. (ה-ו) אזור המוקד אינו מקביל לאלכסון של התמונה, דבר המצביע על חוסר תאימות בין מהירויות הסריקה וההפעלה. סריקת ETL (E) מהירה יותר או (F) איטית יותר מטאטוא פיקסלים פעילים ב-sCMOS. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: פתרון בעיות של ASLM. (A) יריעת האור ממוקמת בדיוק במרחק המוקד של עדשת האיתור. ה-ETL סורק את מוקד גיליון האור לאורך כיוון ההתפשטות תוך סנכרון עם הפיקסל המופעל של חיישן sCMOS. (B) תצוגת XY של חרוזים פלואורסצנטיים כאשר ה-ETL מיושר ומסונכרן כראוי. (ג-ד) תוצאות של חרוזים פלואורסצנטיים במישור המוקד וחוסר מיקוד בתמונות חתך, דבר המצביע על חוסר התאמה בין סריקת ETL והתפשטות לייזר. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר בכניסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: הדמיה של יריעות אור של לבבות עכברים. (A) תמונה מעובדת בנפח של לב העכבר Multiview deconvolution P1 המדגישה את הטרבקולציה בתוך חלל החדר. (B) תמונות חתך רוחב של לב עכבר בן 8 שבועות שנוצרו על-ידי LSM קונבנציונלי (משמאל) ו-ASLM (מימין). התמונות מוצגות כנתונים גולמיים. (C) שילוב של תפירת תמונה ו-ASLM להדמיית לב עכבר בן 8 שבועות, הכולל 12 אריחים המסודרים ב-3 אריחים אופקית ו-4 אריחים במאונך. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. קיצורים: LV: חדר שמאלי, LA: אטריום שמאלי, RV: חדר ימני, ו- RA: אטריום ימני. נתון זה שונה מ- Ref16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: שלבי ניקוי רקמות מותאמים אישית להדמיית אוטופלואורסצנטיות.

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.