מאמר שיטה

אופטימיזציה של שיטת חסימת עורק המוח התיכון לונגה עבור זילוח מלא

DOI:

10.3791/66720

⸱

22 בנובמבר 2024

 ,  , 
1Department of Histology and Embryology, University of Zagreb School of Medicine, 2Croatian institute for brain research, University of Zagreb School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג מדריך שלב אחר שלב לחוקרים לביצוע הליך חסימת עורק המוח האמצעי בעכברים באמצעות שיטת עורק התרדמה החיצוני Longa שונה. השינויים המוצגים במאמר זה נועדו להגביר את הדיוק של חסימת עורק המוח התיכון ולהבטיח זילוח מלא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מודל חסימת עורק המוח האמצעי משמש כמודל החייתי העיקרי לחקר שבץ איסכמי. למרות שנעשה בו שימוש במחקר במשך למעלה משלושה עשורים, הסטנדרטיזציה שלו נותרה בלתי מספקת. ההליך, שנערך בעיקר על חולדות ועכברים, מציב אתגרים בשל אופיים הקטן והשברירי יותר של עכברים. שלא כמו שיטת עורק התרדמה הנפוץ של קואיזומי, עורק התרדמה החיצוני של לונגה הוא מודל שבץ חוט הלהט התוך לומינלי היחיד המבטיח פרפוזיה מלאה לאחר איסכמיה. היבט זה הוא בעל משמעות קריטית עבור מחקרים החוקרים תופעות רפרפוזיה. השינויים הכירורגיים שהודגמו במאמר זה מבטיחים זרימת דם רציפה מעורק התרדמה המשותף לאורך השלב האיסכמי ולאחר הופעת הרפרפוזיה. מטרת שינויים אלה היא לחסום באופן סלקטיבי את עורק המוח האמצעי על ידי שמירה על זילוח ללא הפרעה בענפים קרובים לעורק המוח האמצעי במהלך תקופת האיסכמיה. יתר על כן, הופעת הרפרפוזיה היא פתאומית וניתנת לשליטה מדויקת, ובכך למדל טרומבקטומיה אנדווסקולרית ברפואה האנושית בצורה מדויקת יותר. מטרתנו בהצגת מאמר וידאו מקיף זה היא להקל על הכשרתם של מנתחים חדשים ולקדם סטנדרטיזציה של הליכים כירורגיים בקרב הקהילה המדעית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבץ מדורג כגורם המוות השני המוביל והגורם השלישי המוביל למוות ונכות יחד1. על פי הסיבה שלה, שבץ יכול להיות איסכמי או hemorrhagic, עם שבץ איסכמי להיות נפוץ יותר באופן משמעותי בפועל קליני. שבץ איסכמי נובע מחסימה בעורק המספק דם לרקמת המוח, מה שמוביל לאיסכמיה, מוות תאי ודלקת. מאז הופעתם של טיפולי רפרפוזיה כגון טרומבוליזה וטרומבקטומיה מכנית, חלה התקדמות רבה בטיפול בשבץ. עם זאת, כל טיפולי הרפרפוזיה נושאים את הסיכון להחמרת מצבו של המטופל על ידי גרימת מה שמכונה בדרך כלל פגיעה בזילוח2. המנגנון המדויק של פגיעה ברפרפוזיה עדיין אינו ברור, ועל מחקרים פרה-קליניים לזהות גורמים פוטנציאליים ואמצעי מניעה. לשם כך, פיתוח מודל חייתי רלוונטי לפגיעה ברפרפוזיה בעקבות שבץ איסכמי הופך להיות חיוני.

חסימת עורק מוחי אמצעי (MCAO) היא המודל הנפוץ ביותר בבעלי חיים לחקר שבץ איסכמי. הוא נערך בעיקר במכרסמים ויש לו גרסאות רבות ושונות המתוארות בספרות המדעית עד כה 3,4. שני הסוגים העיקריים, קואיזומי (Koizumi ) ולונגה (Longa), הידועים כגרסאות של עורק התרדמה המשותף (CCA) ועורק התרדמה החיצוני (ECA), נבדלים טכנית זה מזה באתר העורקים להחדרת חוטים 5,6. במאמר האחרון שלנו, על ידי ניטור in vivo של זילוח כלי הדם, הראינו כי רק שיטת לונגה יכולה להיחשב באמת איסכמיה מוחית / מודלזילוח 7. ההליך כולל החדרת חוט הלהט לתוך ECA, קידומו דרך האגודה למלחמה בסרטן, ואבטחתו בנקודת ההסתעפות של עורק המוח האמצעי (MCA) כדי לגרום לאיסכמיה של רקמת המוח. לאחר תקופה שנקבעה מראש של איסכמיה, נסיגה של חוט הלהט מאפשרת רפרפוזיה, המדמה איסכמיה מוחית חולפת. לאחר הופעת השבץ, משתנה התוצאה העיקרי המשמש במחקר הוא לרוב נפח הנגע האוטם, אשר ניתן למדוד באמצעות היסטולוגיה ex vivo או סריקות מוח in vivo. האתגרים במודלים של MCAO סובבים סביב יכולת שחזור נמוכה המיוחסת לשונות בין-משתנית, בין-אופרטורית ובין-נושאית, כאשר האחרונים מהווים מגבלה משמעותית במחקר שבץ פרה-קליני4.

יתר על כן, אזורים אוטמים בעקבות MCAO במכרסמים הם מסיביים יחסית לגודל המוח של מכרסמים. בנוסף, אזורים אחוריים בהיפוקמפוס במוח מגויסים לעתים קרובות לנפח האוטם, למרות שאזורים אלה תלויים בעיקר בזרימת הדם מעורק המוח האחורי (PCA), ולא MCA8. כמו בשיטות קואיזומי ולונגה המתוארות בספרות, ה-CCA נשמר קשור במהלך תקופת האיסכמיה בשל הפטנט הלא שלם של מעגל ויליס בעכברים, מה שמוביל להשראת איסכמיה באזור רחב בהרבה מהמתוכנן 5,6,9. אפילו בשיטות שבהן CCA נפתח מחדש או מתוקן לאחר תקופת האיסכמיה, 30-60 הדקות הרגילות של איסכמיה גורמות לפגיעה בלתי הפיכה ברקמה באזורים שאינם MCA10. יתר על כן, בניגוד לציפיות, מחקרים קודמים הראו כי אורך ציפוי הסיליקון של חוט להט אינו משפיע על גודל הנגע11. עם זאת, בחירת אורך ציפוי הסיליקון של חוט הלהט טופלה אך ורק בדגמים עם CCA קשור במהלך תקופת החסימה.

מטרת שיטה זו הייתה לשנות את שיטת Longa MCAO בעכברים כדי לאפשר זרימת דם רציפה מה- CCA במהלך תקופת האיסכמיה, ובכך להגביר את הסלקטיביות של MCAO, כמו גם להבטיח זילוח מלא של האזור האוטם לאחר ההליך. שינויים אלה יועילו מאוד למחקרי אורך החוקרים פגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה בעכברים על ידי הורדת שיעור התמותה והפחתת השונות בין הנבדקים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הטיפול והנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת רישוי האתיקה של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת זאגרב וועדת האתיקה להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות של משרד החקלאות של הרפובליקה של קרואטיה. הליכי הניסוי נערכו על פי החוק הקרואטי להגנה על בעלי חיים (NN 102/17, 32/19), תיקונים לחוק ההגנה על בעלי חיים (NN 37/13) וההנחיות להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות (NN 55/13) העולים בקנה אחד עם המדריך האירופי לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (הנחיה 2010/63/EU).

1. הכנת החיה ואתר הניתוח

  1. הניחו את בעל החיים בקופסת נוק-אאוט והשר הרדמה באמצעות איזופלורן בנפח 5% בתערובת חמצן/חנקן (יחס של 1:2).
  2. לאחר בדיקה ויזואלית של מצב התודעה ותדירות הנשימה של החיה, הביאו אותה לסולם מעבדה ושקלו אותה.
  3. בדוק את הרפלקס על ידי צביטת העור הבין-דיגיטלי של הגפה התחתונה כדי להבטיח עומק הרדמה תקין.
  4. הניחו את בעל החיים על שולחן הניתוחים המחומם והכניסו את אפו למסכת ההרדמה. כוונו את טמפרטורת שולחן הניתוחים הראשונית ל-36°C וכווננו אותה כך שתשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים על 37°C (נמדדה באמצעות בדיקה רקטלית שהוכנסה בשלבים מאוחרים יותר). במהלך כל השלבים הנוספים, התאם את מקטע הנפח של איזופלורן כדי לשמור על קצב הנשימה של בעל החיים על 100 נשימות לדקה.
    הערה: יש לחטא ביסודיות את כל המשטחים והחומרים הבאים במגע ישיר עם בעל החיים לפני ההליך.
  5. יש למרוח משחת עיניים על עיני בעל החיים כדי להגן עליהן מפני התייבשות וגז איזופלורן.
  6. סובבו את בעל החיים על גבו והושיטו את צווארו על ידי הנחת כרית קטנה עשויה סרט כירורגי מתחתיו.
  7. אבטחו את גפי בעל החיים במקומם באמצעות סרט ניתוח. יש להקפיד לא להאריך את הגפיים הקדמיות יותר מדי כדי לא לגרום לפריקת מפרק הכתף בשוגג.
  8. לשמן את הבדיקה הרקטלית באמצעות ג'לי לבן פטרולאום ולהכניס אותו לתוך פי הטבעת למדידת טמפרטורת גוף רציפה. אבטחו את הבדיקה במקומה יחד עם הזנב באמצעות סרט כירורגי.
  9. החל זריקה לפני הניתוח של מלוחים buprenorphine (0.5 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally כדי לשמור על החיה hydrated היטב תחת שיכוך כאבים במהלך ההליך.
  10. יש לגלח את פרוות בעל החיים באזור הצוואר באמצעות קוצץ חיות אלחוטי. לאסוף את כל הפרווה מגולחת באמצעות חתיכות של סרט כירורגי. בנוסף, לגלח את האזור עם סכין גילוח כדי להפוך אותו ללא פרווה לחלוטין.
  11. בחרו חוט להט MCAO בהתבסס על משקל בעל החיים הנמדד ו/או גילו. הוציאו אותו מהמיכל שלו והניחו אותו בצלוחית פטרי במקום גלוי. שים טיפת מלח על חלק הסיליקון של חוט הלהט כדי לשמור עליו נקי וללא אבק.
    הערה: יש לבחור את עובי ציפוי הסיליקון של חוט הלהט על פי ההמלצות הרשמיות של היצרן במקרה של עכבר בן 12-16 שבועות. בנוסף, יש לתכנן מראש את אורך ציפוי הסיליקון, בהתאם לגודל שטח ההשקיה שיש לסתום (ראו דיון).
  12. הניחו וילון כירורגי נקי מעל שולחן הניתוחים.
  13. יש למרוח טיפת בטדין על עורה המגולח של החיה. השתמשו בצמר גפן כדי לשפשף את חומר החיטוי לתוך העור בצורה מעגלית מבפנים החוצה. לאחר מכן, עשו את אותו הדבר עם צמר גפן ספוג אתנול. חזור על שלב זה 3 פעמים עם זוג טרי של צמר גפן סטרילי עבור כל חזרה.
  14. החל טפיחה של ג'ל לידוקאין על האזור המחוטא של אתר החתך העתידי לשיכוך כאבים פצע מקומי.

2. ניתוח אינדוקציה איסכמיה

  1. בצע חתך ראשוני על העור מחוטא באמצעות אזמל. שמור על מספר שבץ חתך העור על מינימום כדי להפוך את הפצע הניתוחי לרפא קל יותר.
    הערה: כל המכשירים חייבים לעבור עיקור בעבר. על הקורא לעיין בהנחיות המוסדיות לשימוש בכפפות סטריליות או כירורגיות.
  2. באמצעות מלקחיים מסוג 7 ו-5, קורעים את הפאשיה השטחית ומנתקים את בלוטות הרוק מהרקמה שמתחתיה.
    הערה: תמיד להתקדם עם מלקחיים סגורים ולהאריך אותו תוך כדי התרחקות כדי לדחוף את הרקמה משם. בדרך זו, ניתן לחצות חללים אנטומיים עם טראומה מינימלית לרקמות.
  3. הניחו את משענת החוט במקומה הראשוני תוך הבטחה שבלוטות הרוק לא יפריעו לשלבים הבאים.
  4. הסר את הפאשיה העמוקה של הצוואר באמצעות מלקחיים מסוג 7 ונתק את שרירי הסטרנוקלידומסטואיד מאזור התרדמה כדי למקם מחדש את המחזיר.
  5. מקם מחדש את המשענת כך שתגיע מתחת לשרירי הסטרנוקלידומסטואיד כדי לאפשר גישה לאזור התרדמה.
  6. כנסו את שריר האומוהיואיד כדי לאפשר ראייה ברורה וגישה קלה יותר לאזור התרדמה.
  7. שחררו את עורק התרדמה וענפיו מווריד התרדמה ומהעצב התועה, המוחזקים יחד בפאשיית התרדמה.
    הערה: יש להסיר פאשיה זו בזהירות כדי למנוע פגיעה בעצב התועה או גרימת דימום משמעותי.
    1. צבטו את החיתולית הצידית בצד הצדדי של שלישיית התרדמה ומשכו אותה בעדינות לרוחב כדי לזהות חזותית את העורק, העצב, הווריד וכל ענפי כלי הדם שמסביב.
    2. תוך כדי משיכת הפאשיה לרוחב, באמצעות מלקחיים מסוג 5, מפרידים את ה-CCA מהעצב והווריד הסמוכים עד לנקודת ההסתעפות ולווריד בלוטת התריס העליון, החוצה את ה-CCA.
    3. נתקו לחלוטין את החלק התחתון של CCA מהרקמה הבסיסית ומהפאשיה, באמצעות מלקחיים מעוקלים מסוג 7, וודאו שהוא מוכן להידוק בשלבים הבאים.
    4. ממשיכים בגולגולת באזור שמעל נקודת ההסתעפות של CCA, קורעים את פאשיית התרדמה באמצעות שני מלקחיים.
    5. באופן דומה, משוך את הקצה הרופף של חיתולית התרדמה מדיאלית וצידית כדי לנתק במדויק את ECA ואת עורק התרדמה הפנימי (ICA) מהפאשיה ומהרקמה שמסביב, בהתאמה.
    6. שחררו את ECA ו-ICA מהרקמה הבסיסית באמצעות מלקחיים מעוקלים מסוג 7.
  8. עם CCA מוכן בקפידה עם שני הענפים המתאימים שלה, להרים ECA באמצעות מלקחיים סוג 7 מעוקל ולהדק אותו עם סוג N0 סוגר עצמי מלקחיים.
  9. הנמיכו בזהירות את המלקחיים מסוג N0 לסגירה עצמית על שולחן הניתוחים.
    הערה: כדי למקם מחדש את נקודת ההידוק של ECA, לפעמים יש צורך לשחרר מעט את האחיזה ולדחוף את נקודת ההסתעפות של ECA בצורה קאודלית. בשלב זה, חשוב לוודא כי יותר מ 1 מ"מ של ECA נשאר בין הידוק ECA לבין נקודת הסתעפות.
  10. כאשר ECA מהודק ומוחזק היטב עם פינצטה מסוג N0, הציגו שני חוטי משי קלועים מאחורי ECA.
    הערה: חוט הגולגולת יתאים לקשר הקשירה ויש למקם אותו באופן גולגולתי מאתר ההידוק.
  11. קשרו את חוט הגולגולת לחלוטין, שכן הוא קבוע, וגזרו את החוט העודף בעזרת מספריים.
  12. קשרו את החוט הקאודלי לקשר אבטחה רופף.
    הערה: יש לשים אותו קרוב לנקודת ההסתעפות של ECA ולשמור אותו רופף כדי שחוט הלהט של MCAO יעבור.
  13. באמצעות מיקרוקליפים של כלי הדם, הדקו את ה-CCA ואת ה-ICA כדי למנוע דימום לאחר העורקים.
    הערה: חיוני לוודא שלמיקרוקליפ המיושם על CCA יש אחיזה חזקה מספיק מכיוון שה- CCA הוא עורק פועם בעל תפוקה גבוהה, וכישלון לעשות זאת עלול לגרום לדימום רב ומוות של בעל החיים בשלבים מאוחרים יותר.
  14. באמצעות מספריים micro-spring, לעשות arteriotomy קטן ממש מתחת לאתר הידוק ECA.
    הערה: הארטריוטומיה צריכה להיות גדולה מספיק כדי שחלק הסיליקון של חוט הלהט ייכנס פנימה, אך לא גדול ממחצית היקף ECA כדי לא לפגוע במתח המוחזק על ידי מלקחיים מסוג N0.
  15. עם זווית התואמת את זו של ECA, הכנס את חוט הלהט לאתר arteriotomy בכיוון פרוקסימלי ל- CCA, עובר דרך קשר האבטחה הרופף באתר ההסתעפות של ECA ונדבק לתוך לומן של CCA עם חוט הלהט.
  16. הדקו את קשר האבטחה סביב חלק הסיליקון של חוט הלהט.
    הערה: יש צורך בזהירות רבה בשלב זה מכיוון שחוט הלהט נוטה לחמוק החוצה מה- ECA באמצע התמרון האחרון, והכנסתו חזרה בנקודה זו קשה מאוד.
  17. פתח בזהירות את המיקרו-קליפ של האגודה למלחמה בסרטן והסר אותו.
  18. כאשר חוט הלהט מוכנס חלקית לתוך ECA ומאובטח כלפי מטה, בצע ארטריוטומיה שלמה ובכך שחרר את גדם ECA עם חוט הלהט MCAO בפנים. בשלב זה, שחרר את סוג N0 סוגר עצמי מלקחיים ולהסיר אותו.
  19. עם קבוצה אחת של פינצטה מסוג 5, לצבוט היטב את גדם ECA ולהרים אותו מעט. תוך כדי אחיזה בחוט הלהט המוחדר חלקית עם מלקחיים נוסף, הורידו ומשכו בעדינות את גדם ECA כדי לכוון את הקצה הפנימי של חוט הלהט לכיוון האגודה למלחמה בסרטן. לעולם אל תצבוט את חלק הסיליקון של חוט הלהט.
  20. בעזרת מלקחיים האוחזים בחוט הלהט, התקדמו לאט לאט דרך האגודה למלחמה בסרטן לעבר מעגל הצוואות.
    הערה: נקודת ההסתעפות הראשונה של האגודה למלחמה בסרטן היא גם היחידה שבה המפעיל יכול להחמיץ את נקודת ההסתעפות הרצויה של MCA. לכן, יש צורך בזווית צידית קלה של התקדמות כדי להנחות את חוט הלהט לנקודת ההסתעפות של MCA. עם זווית ההתקדמות הצידית הקלה, חוט הלהט מתעקל הרחק מעורק הפטריגופלטין (PPA) ומגדיל את הסיכוי שהקצה המתקדם ייכנס למעגל של ויליס (איור 1).

figure-protocol-1
איור 1: המחשה של התקדמות חוט החסימה של עורק המוח האמצעי מעבר לנקודת ההסתעפות של עורק הפטריגופלטין. התקדמות נכונה של חוט הלהט (משמאל) מושגת על ידי כיוון חוט הלהט MCAO באופן כזה שהוא נשען לאחור על הקיר הצידי של האגודה למלחמה בסרטן ומתעקם מנקודת ההסתעפות של PPA. אי ביצוע פעולה זו (מימין) עלול לגרום לכך שחוט הלהט ייכנס ל-PPA ולא יגרום לשבץ מוחי. במקרה האחרון, חוט הלהט לא יוכל להתקדם ככל שצריך והמנתח צריך למשוך את חוט הלהט עד שקצהו יתגלה בנקודת ההסתעפות של האגודה למלחמה בסרטן ויתחיל לקדם את חוט הלהט שוב. עורקים בצבע ירוק מייצגים עורקים מתקשרים אחוריים (PcomA), לרוב ללא פטנט בעכברים. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

  1. התקדמו לאט לאט את חוט הלהט MCAO דרך מעגל וויליס עד שתורגש עלייה פתאומית בהתנגדות.
    הערה: בשלב זה, חשוב להקפיד על האורך הנותר של חוט הלהט. חוט הלהט צריך להתקדם ללא מאמץ לפחות 7 מ"מ מנקודת ההסתעפות של ICA בעכבר בוגר.
  2. הדקו את הקשר המאובטח כדי להבטיח שחוט הלהט לא יזוז במהלך איסכמיה.
  3. הסר את קליפ CCA ושים לב לשעה.
    הערה: פעולה זו מסמנת את תחילת הופעת האיסכמיה.
  4. ארוז את הקצה הרופף של חוט הלהט MCAO בחריץ שבין משולש התרדמה לבין שריר הסטרנוקלידומסטואיד האיפסילטרלי כדי שלא יבלוט החוצה מהפצע הניתוחי.
  5. הסר את החוט האחורי וקרב את קצוות הפצע הניתוחי זה לזה. תן לאתר הניתוח להסתפק בכמה שניות כדי שהרקמה תחזור למקומה האנטומי.
  6. סגור את פצע הניתוח באמצעות סגירת פצע סרט כדי להקל על פתיחה מהירה יותר של הפצע לאחר תקופת האיסכמיה.
    הערה: אם חוקר רוצה לתת לבעל החיים להתעורר במהלך תקופת האיסכמיה, מומלץ לתפור את הפצע כדי למנוע פתיחה מחדש בטרם עת של הפצע.

3. תקופת איסכמיה

  1. לאמת את הצלחת הניתוח באמצעות MRI או שיטת מדידה כמותית אחרת של זילוח.
    הערה: במקרה של ביצוע סריקת MRI, הדמיה משוקללת זילוח (PWI) צריכה להראות איסכמיה קריטית באזור MCA הרחב והדמיה משוקללת דיפוזיה (DWI) צריכה לתאר את האתר של מקדם דיפוזיה נראה מופחת (ADC) עקב בצקת תאים.
  2. הכניסו את בעל החיים לכלוב נקי עד לסיום תקופת האיסכמיה.

4. ניתוח נסיגה נימה

  1. כ-5 דקות לפני תום זמן האיסכמיה המוקצב, הניחו את בעל החיים והדביקו אותו שוב על שולחן הניתוחים.
  2. הסר את סגירות פצעי הסרט ופתח מחדש את פצע הניתוח באמצעות מסיר התיל.
  3. שחררו את הקצה הרופף של חוט הלהט MCAO מהרקמה שמסביב ומהקצוות של חוט הקשר המבטיח.
  4. עם סוג N0 מלקחיים, לצבוט ולמשוך את קצה גדם ECA הגחון כדי להפעיל מתח על זה. הורידו בזהירות את המלקחיים הצובטים כלפי מטה, בדומה להליך הכירורגי הראשון.
    הערה: על המפעיל להימנע מצביטה של הקשר המבטיח, מכיוון שהדבר יגרום לכך שהקשר לא יוכל להתיר.
  5. הדקו שוב את ה-CCA בעזרת קליפס מיקרו-וסקולרי.
  6. באמצעות מלקחיים מסוג 5, שחררו את קשר האבטחה כדי לאפשר נסיגה של חוט הלהט.
    הערה: הדרך הטובה ביותר להתחיל לשחרר את הקשר היא להמשיך לצבוט אותו עד שהוא נפרד לחלקים בודדים ואז לדחוף את קצוות החוט לכיוון הקשר.
  7. משכו באיטיות את חוט הלהט MCAO עד שחלק הסיליקון מתחיל לבלוט החוצה מגדם ה-ECA. הדקו מעט את קשר האבטחה כדי להתכונן לנסיגה מלאה של חוט הלהט.
  8. כאשר הוא קרוב לקצה הסיליקון של חוט הלהט, הדקו את קשר האבטחה כך שהוא ידחוף החוצה את חוט הלהט MCAO ויסגור את גדם ECA בתמרון יחיד. הדקו את הקשר לחלוטין לאחר שחוט הלהט מחליק החוצה.
  9. פתח והסר את המלקחיים הצובטים יחד עם תפס CCA.
    הערה: זה מסמן את סוף תקופת האיסכמיה ואת תחילת תהליך הרפרפוזיה.
  10. הסר את משענת החוט וקרב שוב את שולי הפצע הניתוחי.
  11. יש לתפור את פצע הניתוח החל מהפריפריה, ולסגור את הפצע לחלוטין ללא כל רקמה תחתונה נראית לעין.
    הערה: מספר התפרים הנדרש תלוי בגודל הפצע הניתוחי.
  12. יש לנקות ולחטא את אתר הניתוח באמצעות מגבוני אלכוהול.

5. טיפול לאחר ניתוח

  1. הכניסו את בעל החיים לכלוב נקי ואפשרו לו להתעורר באופן ספונטני מהרדמה.
  2. הניחו את המזון הכדורי בתחתית הכלוב להגעה קלה יותר. מרככים את כדורי המזון באמצעות מי שתייה. ממלאים צלחת פטרי קטנה במי שתייה ומביאים גם אותה לרצפת הכלוב.
  3. ב 48 השעות הבאות, להזריק 0.25 מ"ל מלוחים עם buprenorphine (0.5 מ"ג / ק"ג) כל 24 שעות intraperitoneally.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סריקות MRI תוך ניתוחיות או לאחר ניתוח, במיוחד סריקות דימות משוקלל זילוח (PWI) ו/או דימות משוקלל דיפוזיה (DWI) (איור 2) יכולות להציע הוכחה סופית להליך מוצלח. PWI תוך ניתוחי מראה איסכמיה קריטית באזור MCA ipsilateral ובכך מאשר כי מיקום חוט הלהט הביא לחסימה מוחלטת. PWI לאחר הניתוח של הליך מוצלח מציג זילוח יתר בליבת הנגע, כמו גם מידה מסוימת של רפרפוזיה בגבולות אזור MCA. נגעי DWI תוך ניתוחיים תואמים את האזורים האיסכמיים שנצפו ב- PWI תוך ניתוחי. נגעי DWI לאחר הניתוח מפגינים התכווצות לכיוון ליבת הנגע האיסכמי, המלווה בירידה משמעותית במקדם הדיפוזיה הנראה לעין של הנגע, מה שהופך אותו כהה יותר מנגעי ה- DWI התוך ניתוחיים ומרקמת המוח המעורבת שמסביב. סריקות אנטומיות סטנדרטיות מסוג T2, הן תוך ניתוחיות והן לאחר ניתוח, בדרך כלל אינן מראות דבר ראוי לציון, אלא אם כן מתרחש דימום הנגרם על ידי נימה

(איור 3). במקרים כאלה, סריקות PWI ו- DWI חושפות איסכמיה חלקית או ללא איסכמיה.

תהליך הרפרפוזיה מתרחש ב-48 השעות הבאות, ואושר שהוא התרחש בסריקות MRI שנעשו ביום השני לאחר ההליך (איור 2, CBF ביום 2). סריקות PWI מראות רפרפוזיה מלאה באתר הנגע עם זילוח יתר קל בליבת הנגע. סריקות DWI מראות אזורים מרובים של מקדמי דיפוזיה נראים נמוכים יותר עקב היווצרות בצקת מוחית. סריקות אנטומיות מסוג T2 מצביעות על אזורים אינטנסיביים במיוחד של בצקת העוטפים אזורי MCA, ללא מעורבות של אזורים שאינם MCA כגון ההיפוקמפוס.

עם התעוררות, החיה מראה סימנים ברורים של שבץ חריף. תסמינים התנהגותיים נפוצים כוללים טונוס שרירים מוגבר בצד הנגע, הגורם לבעל החיים לכופף את פלג גופו העליון לכיוון זה. סיבוב וסיבוב בכיוון ipsilateral הם גם סימנים ברורים של שבץ חריף. אטקסיה הליכה מציעה לעתים קרובות את מעורבות ההיפוקמפוס בנפח הנגע האיסכמי. עם זאת, סימפטום זה עשוי להיות חסר ספציפיות בשלב hyperacute עקב תופעות לוואי הרדמה isoflurane. בימים שלאחר מכן, בעל החיים צריך לפתח כיפוף הגפה הקדמית ipsilaterally והחמרה של מצב היציבה שלה, מלווה היעדר רפלקס שפם. התמותה מגיעה לשיאה בסביבות 3 ימים לאחר ההליך עקב בצקת מוחית. השלב הכרוני מתחיל לאחר שהבצקת במוח מתחילה להיעלם. במהלך תקופה זו, החיה יכולה להציג עם שימור שתן. מסיבה זו, חשוב לבדוק את בעל החיים עבור נוקשות שלפוחית השתן, כמו גם כובע מוצק על היציאה השופכה. רוב הזמן, בעיה זו יכולה להיפתר על ידי עיסוי עדין של שלפוחית השתן כדי להקל על מתן שתן. סימני התאוששות ממשקל מופיעים בדרך כלל במהלך 7 הימים הראשונים לאחר תחילת השבץ.

figure-results-1
איור 2: דוגמה מייצגת של MCAO מוצלח עם רפרפוזיה מלאה שאושרה בסריקות MRI. CBF, ADC ו- T2w מייצגים מפות זרימת דם מוחיות, מפות מקדמי דיפוזיה לכאורה וסריקות אנטומיות משוקללות T2, בהתאמה. IntraOP, postop, ו- D02 מסמנים 3 נקודות זמן שונות של הדמיה לאחר הופעת איסכמיה, לאחר הופעת רפרפוזיה, וביום השני לאחר MCAO, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 3: סריקות MRI מייצגות של דימום הנגרם על ידי חוט להט במהלך הליך MCAO. CBF, ADC ו- T2w מייצגים מפות זרימת דם מוחי, מפות מקדמי דיפוזיה לכאורה וסריקות אנטומיות משוקללות T2, בהתאמה. IntraOP, postOP ו-D02 מסמנים 3 נקודות זמן שונות של הדמיה: לאחר הופעת איסכמיה, לאחר הופעת רפרפוזיה, וביום השני לאחר MCAO, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 4: המחשה של מיקום נכון של חוט הלהט בענף עורק המוח האמצעי. ברוב המקרים, חלק הסיליקון של חוט הלהט (צבוע לבן) נתקע בחלק הפרוקסימלי של עורק המוח הקדמי (ACA) כ -2 מ"מ רחוק יותר מנקודת ההסתעפות MCA. בדרך כלל אזור המוח ACA אינו מושפע בעכברים כאשר ACA מצטרף עם אחד contralateral לתוך ACA azygos יחיד. העורקים הפגועים מוצגים באפור. משמאל, CCA נשאר פטנט במהלך תקופת האיסכמיה, ובכך מספק דם לכל ענפי ICA עד MCA אשר מוסתר עם חלק הסיליקון של חוט הלהט. מימין, חוט הלהט ממוקם באופן זהה, למעט קשירת CCA נשמרת במהלך תקופת האיסכמיה. מכיוון ש- PcomA (בצבע ירוק) אינו פטנט ברוב המקרים, אם קשירת CCA נשמרת, השבץ עוטף באופן לא סלקטיבי את רוב ההמיספרה האיפסילטרלית באמצעות MCA, AchA, VTA, HTA ו- PCA. במקרים אלה, סימנים של אוטם חריף של העין (leukocoria ו anisocoria) ניתן לראות גם עקב PPA חסום. נוצר באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MCAO הוא הליך תובעני מאוד עבור המפעיל ומתיש עבור החיה. מסיבה זו, יש חשיבות עליונה לחוקרים שיהיה הליך ניתוח סטנדרטי שממזער את חומרת השבץ, מפחית כשל פרוצדורלי ומשפר את רווחת בעל החיים לאחר ההליך. פרוטוקול MCAO זה מדגיש כמה מהיבטי המפתח של שיקול בעת ביצוע הליך זה על עכבר.

הבחירה של חוט הלהט MCAO משפיעה על גודל ומיקום הנגע המושרה שבץ ולכן הוא שלב קריטי בהליך זה11. חוטים מצופים סיליקון, כמו אלה שפותחו על ידי Doccol, עשו קפיצה גדולה בהורדת השכיחות של דימומים הנגרמים על ידי חוטים12. עם זאת, חוטים מצופים סיליקון מגיעים במגוון רחב של גדלים ואורכים, מה שמציב אתגר לחוקרים חדשים לבחור חוטים מתאימים ל-MCAO בחיות ניסוי. בעוד יצרני חוטים בדרך כלל מספקים הנחיות לבחירת קוטר החוט הנכון למשקל בעל חיים נתון, אורך ציפוי הסיליקון נחשב להעדפה אישית של המפעיל ויש לבחור אותו רק על בסיס מיומנותו של המפעיל. בעבודה זו, אנו תומכים במזעור אורך הסיליקון כדי להבטיח שנגע השבץ המושרה יקיף רק את אזור ההשקיה של MCA ובכך לשפר את יכולת השחזור. איור 4 ממחיש שעורק המוח האחורי (PCA), ענף ה-ICA התוך-גולגולתי הראשון, מספק את האזורים האחוריים של המוח, כולל חלקים של ההיפוקמפוס. מחקרי מיקרו-CT שנערכו לאחרונה בעכברים זיהו שלושה ענפים קטנים נוספים שמקורם ב-ICA לפני נקודת ההסתעפות של MCA13. עורק ההיפותלמוס העדין והמשתנה (HTA), עורק הטגמנטל הגחוני (VTA) ועורק הכורואיד הקדמי (AChA), בסדר הסתעפותם, תורמים באופן משמעותי לשונות תוך וריאנטית ותוך-נושאית8. יתר על כן, מחקרי מיקרו-CT הראו כי בעכברים, המרחק הממוצע מנקודות הסתעפות MCA ו-PCA הוא כ-1.7 מ"מ, קצר משמעותית מאורך ציפוי הסיליקון של רוב החוטים המיוצרים14. מכיוון שהמשוב היחיד שמפעיל מקבל בעת קידום חוט הלהט הוא עלייה פתאומית בהתנגדות כאשר חוט הלהט מגיע לנקודת ההסתעפות של MCA, האורך הנגרר של ציפוי הסיליקון של חוט הלהט הוא מה שגורם לאיסכמיה ל-MCA, ובהתאם לאורך ציפוי הסיליקון, ל-AChA, VTA, HTA ואפילו PCA, הצגת שונות המנוגדת למודל MCAO המיועד. לכן, כדי לשמור על יכולת הרבייה ורווחת בעלי החיים לאחר הניתוח, המטרה צריכה להיות אך ורק חסימת MCA. Doccol מציעה חוטי MCAO עם ציפויי סיליקון בטווח של 1 עד 2 מ"מ, אך הניסיון שלנו מצביע על כך ששימוש בציפויים של 1-2 מ"מ גורם לעתים קרובות לפעולת דמה מבלי לגרום לשבץ. סריקות MRI תוך ניתוחיות גילו כי חוט הלהט מתקדם עד 2 מ"מ מעבר לנקודת ההסתעפות של MCA לעורק המוח הקדמי (ACA) לפני מתן משוב התנגדותי קריטי למפעיל. מסיבה זו, אנו ממליצים בחום להשתמש בציפויי סיליקון באורך של 2 עד 3 מ"מ, המפחיתים את מעורבות ההיפוקמפוס בנגעי שבץ בהשוואה לציפויי סיליקון ארוכים יותר על חוטי MCAO.

השלב הקריטי השני בהליך זה הוא מיקום נכון של חוט הלהט MCAO על מנת להשיג חסימה מוחלטת של MCA. כניסה שגויה לסניף הראשון של האגודה למלחמה בסרטן, עורק הפטריגופלטין (PPA), היא בעיה נפוצה עבור המפעיל, שכן אין כמעט משוב על כך שחוט הלהט של MCAO עשה פנייה שגויה במהלך התקדמותו. מסיבה זו, אנו ממליצים על זווית צידית קלה של התקדמות כך שהקצה המצופה סיליקון של חוט הלהט יתעקם מנקודת ההסתעפות של PPA, מה שמגדיל את הסיכוי שהוא ייכנס לחלק התוך גולגולתי של ICA. (איור 1) כאמור בסעיף הפרוטוקול, חשוב להקפיד על אורכו של חוט הלהט הנגרר כדי להסיק אם מיקום חוט הלהט מספק. במקרה שבו לא ניתן להחדיר את חוט הלהט לפחות 7 מ"מ מנקודת ההסתעפות של האגודה למלחמה בסרטן, על המפעיל למשוך את חוט הלהט ולחזור על הפעולה. כל כוח מיותר המופעל במהלך החדרת חוט הלהט עלול לגרום לדימום ולהליך כושל. לצורך העניין, ניתן להשתמש במדידת זילוח לייזר-דופלר רציפה כדי לאשר מיקום נימה נכון.

הבטחת זרימת דם ללא הפרעה מה- CCA במהלך התקופה האיסכמית היא צעד קריטי נוסף בפרוטוקול זה. בניגוד לרוב האיורים המתארים מעגל ויליס שלם בעכבר, מחקרים הראו כי עורק התקשורת האחורי (PcomA) לרוב אינו פטנט דו-צדדי בעכברים ואינו יכול לספק באופן אמין את הצד האיפסילטרלי של מעגל ויליס אם ה-CCA נשאר סגור במהלך תקופת האיסכמיה15,16. במקרים אלה, גם אם חוקר בוחר בקפידה את האורך הנכון של ציפוי הסיליקון של חוט הלהט, שבץ יעטוף את כל חצי הכדור או רק את אזור MCA, בהתאם לפטנט PcomA, מה שיגרום לשונות בלתי מוסברת של גדלי שבץ. מסיבה זו, שינינו את הנוהל כך שיכלול את שלב ההוראה שבו המפעיל מסיר את תפס CCA מיד לאחר הגדרת חוט הלהט MCAO המסתיר. שינויים אלה יכולים להגדיל את הדיוק ואת יכולת השחזור של הניתוח ולהפחית את ההטרוגניות של התוצאות בו זמנית. סטנדרטיזציה של השיטות תשפר עוד יותר את שיעור ההצלחה ואת יכולת ההשוואה, כמו גם את הפוטנציאל התרגומי של התוצאות17.

המגבלה הגדולה ביותר של הטכניקה המוצעת היא העובדה כי ECA נשאר קשור לאחר ההליך, אשר עלול להחמיר את מצבו של בעל החיים במהלך ההתאוששות18. עד כה, לא הצלחנו במאמצים לתקן את ECA תוך שמירה על אחוזי הצלחה גבוהים מספיק. זו נותרה נקודה פוטנציאלית לשיפורים עתידיים בשיטה. יתר על כן, צמצום הזמן שבו CCA נשאר מהודק הוא אתגר, אבל זה חיוני כדי למנוע גיוס של אזורים שאינם MCA בשבץ. מכיוון שזה יכול לספק מקור לשונות בין ותוך אופרטורים, מומלץ למדוד את משך ההידוק של CCA, מה שעשוי לאפשר לחוקרים להסביר סטטיסטית לפחות חלק קטן מהשונות הכוללת שנצפתה בגודל הפעימות. מצד שני, מיומנות וניסיון המפעיל ממלאים תפקיד מכריע בהפחתת הזמן של ליגטורה CCA ומשך ההליך הכולל11.

השיטה המוצגת משמעותית מכיוון שהיא מאפשרת לחוקרים להסתיר באופן סלקטיבי את ה- MCA, ובכך להפוך את הופעת הרפרפוזיה לפתאומית וניתנת לשליטה רבה. השיטה מחקה את כריתת התרומבקטומיה האנדווסקולרית ואת פגיעת הרפרפוזיה שבאה בעקבותיה בצורה מדויקת יותר מהשיטות הקיימות כיום, ומספקת פרטים עבור מודל איסכמיה / פגיעה בבעלי חיים הניתן לשחזור ורלוונטי מבחינה קלינית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף. למחברים אין כל זיקה לשמות מסחריים ולסימנים מסחריים המוזכרים בעבודה זו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי פרויקט קרן המדע הקרואטית BRADISCHEMIA (UIP-2017-05-8082); GA KK01.1.1.0007 ממומן על ידי האיחוד האירופי באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי ועל ידי האיחוד האירופי באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי תחת הסכם מענק מס '. KK.01.1.1.07.0071, פרויקט "SineMozak. עבודתם של הדוקטורנטים רוק איסטר ומרתה פונגראק נתמכה במלואה על ידי "פרויקט פיתוח הקריירה של חוקרים צעירים - הכשרת דוקטורנטים" של קרן המדע הקרואטית הממומנת על ידי האיחוד האירופי מהקרן החברתית האירופית. ההליך צולם באמצעות סמארטפון אנדרואיד המורכב על מיקרוסקופ כירורגי באמצעות תושבת מצלמה גנרית. חומרי הווידאו נערכו, והקריינות הוקלטה באמצעות עורך הווידאו Wondershare Filmora.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסה עורית בטדין 10 גרם/100 מ"לאלקלואיד סקופיהN/A
תפר משי קלועFine Science Tools18020-60
תפר דפילון 5/0 DS16B. BraunC0936154
Dolokain 20 מ"ג/גרםג'ל Jadran-Galenski LaboratorijN/A
Dumont #5 מלקחייםFine Science Tools11251-202 חלקים
Dumont #7 מלקחייםFine ScienceTools 11271-30
Dumont N0 מלקחיים לסגירה עצמיתFine Science Tools11480-11
Durapore סרט כירורגי 1,25 ס"מ x 9,1 מ'3M7100057169
סרט כירורגי Durapore 2,5 ס"מ x 9,1 מ'3M7100057168
תרמוסטט חיצוניPetnap1012536
מחזיקי מחט HalseyFine Science Tools12500-12
מעקר חרוזים חםFine Science Tools18000-50
מספריים איריסFine Science Tools14060-10
Isoflurane USPPiramal טיפול קריטיN/A
לייזר דופלר מוניטורMoorMOORVMS-LDF2
מתכת לחיות מחמד כרית חוםPetnap
מספריים קפיציים של מיקרו ואנאסכלי מדע עדינים15000-00
מפסק מיני-קוליבריFine ScienceTools 17000-01
משחת עיניים RecugelBausch & LombN/A
S& T B-1 כלי מיקרו מהדק כלי מדע עדינים00396-012 חלקים
S& T מיקרו מהדק מריחת מלקחייםFine Science Tools00071-14
Schwartz micro serrefinesFine Science Tools18052-01
Stemi DV4 מיקרוסקופ סטריאו ספוטZeiss0000000-1018-453
סגירות עור דבק מחוזק ברצועת Steri 3 מ"מ x 75 מ"מ3M7100236545
מלקחיים רקמות ישרותFine Science Tools11023-10
SZX Stand ArmOlympusSZ2-STS
Tec III 300 סדרת וופורייזר מכוילוופורייזר מכירות ושירות בע"מ
מעמד אוניברסלי מסוג 2OlympusSZ2-STU2
VetFlo מעמד הרדמה שישה ערוציםKent ScientificVetFlo-1225שונה לערבוב O2/N2
1012525

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feigin, V. L., et al. regional, and national burden of stroke and its risk factors, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. Neurology. 20 (10), 1-26 (2021).
  2. Bai, J., Lyden, P. D. Revisiting cerebral postischemic reperfusion injury: New insights in understanding reperfusion failure, hemorrhage, and edema. Int J Stroke. 10 (2), 143-152 (2015).
  3. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  4. Hill, J. W., Nemoto, E. M. Transient middle cerebral artery occlusion with complete reperfusion in spontaneously hypertensive rats. MethodsX. 1, 283-291 (2014).
  5. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. Nosotchu. 8 (1), 1-8 (1986).
  6. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  7. Justić, H., et al. Redefining the Koizumi model of mouse cerebral ischemia: A comparative longitudinal study of cerebral and retinal ischemia in the Koizumi and Longa middle cerebral artery occlusion models. J Cereb Blood Flow and Metab. 42 (11), 2080-2094 (2022).
  8. El Amki, M., et al. Hypothalamic, thalamic and hippocampal lesions in the mouse MCAO model: Potential involvement of deep cerebral arteries. J of Neurosci Methods. 254, 80-85 (2015).
  9. Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling Stroke in Mice - Middle Cerebral Artery Occlusion with the Filament Model. J Vis Exp. (47), e2423(2011).
  10. Trotman-Lucas, M., Kelly, M. E., Janus, J., Gibson, C. L. Middle cerebral artery occlusion allowing reperfusion via common carotid artery repair in mice. J Vis Exp. (143), e58191(2019).
  11. Morris, G. P., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the longa and koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLoS One. 11 (2), e0148503(2016).
  12. Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).
  13. Guan, Y., et al. Effect of suture properties on stability of middle cerebral artery occlusion evaluated by synchrotron radiation angiography. Stroke. 43 (3), 888-891 (2012).
  14. Yuan, F., et al. Optimizing suture middle cerebral artery occlusion model in C57BL/6 mice circumvents posterior communicating artery dysplasia. J Neurotrauma. 29 (7), 1499-1505 (2012).
  15. Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: Evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J Cereb Blood Flow and Metab. 18 (5), 570-579 (1998).
  16. McColl, B. W., Carswell, H. V., McCulloch, J., Horsburgh, K. Extension of cerebral hypoperfusion and ischaemic pathology beyond MCA territory after intraluminal filament occlusion in C57Bl/6J mice. Brain Res. 997 (1), 15-23 (2004).
  17. Li, Y., et al. Distinctions between the Koizumi and Zea Longa methods for middle cerebral artery occlusion (MCAO) model: a systematic review and meta-analysis of rodent data. Sci Rep. 13 (1), 10247(2023).
  18. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament mcao model: impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ischemic Stroke ModelExternal Carotid ArteryIntraluminal Filament ModelRodent Stroke ModelSurgical StandardizationPerfusion Weighted ImagingApparent Diffusion Coefficient

מאמרים קשורים