אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

Swetha Nagarajan; Siddhartha Bardhan; Sundar Ram Naganathan

doi:10.3791/66735

מאמר שיטה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

DOI:

10.3791/66735

⸱

19 ביולי 2024

Swetha Nagarajan^*¹ , Siddhartha Bardhan^*¹ , Sundar Ram Naganathan¹

¹Department of Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research

^* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארת אסטרטגיית הכנת דגימה להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה בתוך כוריון שלם באמצעות מיקרוסקופ יריעות אור. הוא מנתח את הכיוונים השונים שהעוברים רוכשים בתוך הכוריון בשלבי 70% אפיבולי וניצן ומפרט אסטרטגיות הדמיה להשגת רזולוציה בקנה מידה תאי בכל העובר באמצעות מערכת יריעות האור.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופ יריעות אור הפך למתודולוגיה המועדפת להדמיה חיה של עוברי דגי זברה על פני סקאלות זמן ארוכות עם רעילות פוטוטוקסית מינימלית. בפרט, מערכת multiview, המאפשרת סיבוב דגימה, מאפשרת הדמיה של עוברים שלמים מזוויות שונות. עם זאת, ברוב מפגשי ההדמיה עם מערכת multiview, הרכבת דגימות היא תהליך בעייתי מכיוון שהדגימות מוכנות בדרך כלל בצינור פולימרי. כדי לסייע בתהליך זה, פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות הרכבה בסיסיות להדמיית התפתחות מוקדמת של דגי זברה בין 70% אפיבולי לשלבי סומיט מוקדמים. באופן ספציפי, המחקר מספק נתונים סטטיסטיים על התנוחות השונות שברירת המחדל של העוברים היא בשלבי אפיבולי וניצן של 70% בתוך הכוריון. יתר על כן, הוא דן במספר הזוויות האופטימלי ובמרווח בין הזוויות הדרוש להדמיית עוברים שלמים של דגי זברה בשלבים המוקדמים של ההתפתחות, כך שניתן יהיה לחלץ מידע בקנה מידה סלולרי על ידי איחוי התצוגות השונות. לבסוף, מכיוון שהעובר מכסה את כל שדה הראייה של המצלמה, הנדרש לקבלת רזולוציה בקנה מידה סלולרי, פרוטוקול זה מפרט את תהליך השימוש במידע חרוזים מעל או מתחת לעובר לצורך רישום התצוגות השונות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבטחת רעילות אור מינימלית היא דרישה עיקרית להדמיית עוברים חיים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה לתקופות ארוכות. במהלך העשור האחרון, מיקרוסקופ גיליון אור הפך למתודולוגיה הנבחרת כדי לענות על דרישה זו 1,2,3,4,5,6,7. בקצרה, בטכניקה זו ששימשה לראשונה בשנת 2004 ללכידת תהליכים התפתחותיים⁸, שתי יריעות לייזר דקות מיושרות עוברות דרך העובר מקצוות מנוגדים, ומאירות רק את מישור העניין. מטרת גילוי ממוקמת באופן אורתוגונלי, ולאחר מכן האור הפלואורסצנטי הנפלט מכל הנקודות המוארות בדגימה נאסף בו זמנית. לאחר מכן מתקבלת תמונה תלת-ממדית על ידי הזזת העובר ברצף דרך יריעת האור הסטטית.

בנוסף, בצורה ספציפית של מתודולוגיה זו, המכונה מיקרוסקופ יריעות אור מרובות, ניתן להשעות את הדגימות בצינור פולימרי שניתן לסובב באמצעות רוטור, המאפשר הדמיה של אותו עובר מזוויות^מרובות ^9,10,11. לאחר ההדמיה, התמונות מזוויות מרובות מתמזגות בהתבסס על סמני רישום, שהם בדרך כלל סמנים פלואורסצנטיים כדוריים בתוך העובר (למשל, גרעינים) או בתוך הצינור (למשל, חרוזים פלואורסצנטיים). הדמיה ואיחוי Multiview משפרים באופן משמעותי את הרזולוציה הצירית, ומספקים רזולוציה איזוטרופית בכל שלושת הממדים¹². אמנם זהו יתרון גדול, אך אתגר מרכזי של מתודולוגיית ריבוי תצוגות הוא הרכבה של דגימות, שבה יש להרכיב עוברים ולשמור אותם במקומם בצינורות במהלך כל מהלך ההדמיה.

לצורך ביצוע הדמיה מרובת תצוגות, כדי לשמור על העוברים במקומם ולמנוע תנועה בזמן ההדמיה, ניתן להטמיע עוברים באגרוז. עם זאת, זה מוביל לעתים קרובות לצמיחה והתפתחות מזיקות, במיוחד עבור עוברים בשלב מוקדם של דגי זברה¹³, מערכת המודל שנדונה כאן. אסטרטגיית הרכבה שנייה היא להשתמש בצינור דק שהוא רק מעט גדול יותר מקוטר העובר, שבו ניתן למשוך את העובר לתוך הצינור יחד עם תווך העובר, ולאחר מכן לסגור את החלק התחתון של הצינור עם פקק אגרוז¹⁴. בשיטה זו, מכיוון שהצינור מלא בתווך עוברי, לא ניתן להשתמש בסמני רישום כגון חרוזים פלואורסצנטיים לאיחוי הדעות השונות, ולכן הרישום מסתמך על סמנים בתוך העובר. באופן כללי, חרוזים פועלים כסמני רישום טובים יותר כאשר האות של הסמנים בתוך העובר מתפרק עם המעבר עמוק יותר לתוך הדגימה בשל מגבלות הארה וגילוי של כל מיקרוסקופ.

לפיכך, גישה שלישית, שתפורט כאן ושימשה בעבר 5,13,14,15,16, היא הדמיה של עוברים מוקדמים של דגי זברה עם כוריון שלם ומילוי הצינורית באחוז מינימלי של אגרוז, המכיל חרוזים כסמני רישום. בתרחיש זה, מכיוון שהתערבות ידנית למיקום עוברים בתוך כוריון אינה אפשרית, מחקר זה מספק נתונים סטטיסטיים על כיוון ברירת המחדל אליו נופלים עוברים מוקדמים של דגי זברה, במיוחד תוך התמקדות ב-70% שלבי אפיבולי וניצן. לאחר מכן הוא דן במספר התצוגות האופטימלי הדרוש להדמיית עוברים בשלב מוקדם ברזולוציה בקנה מידה סלולרי ומפרט את תהליך האיחוי באמצעות BigStitcher, תוסף מבוסס פיג'י 10,17,18. יחד, פרוטוקול זה, המשתמש במטרה של 20x/1 NA, נועד להקל על אמבריולוגים של דגי זברה להשתמש במערכות יריעות אור מרובות עבור הדמיה של עוברים עם גרעינים וסמנים של ממברנות משלב הגסטרולציה ועד לשלבי הסומיט המוקדמים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליכי התחזוקה והניסוי של דגי הזברה ששימשו במחקר זה אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים, vide Reference TIFR/IAEC/2023-1 ו-TIFR/IAEC/2023-5. עוברים שהתקבלו על ידי חציית דגים הטרוזיגוטיים המבטאים Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹ הוזרקו עם H2A-mCherry mRNA (30 pg) בשלב התא האחד. H2A-mCherry mRNA סונתז באמצעות פלסמיד pCS2+ H2A-mCherry (מתנה ממעבדת אוטס, EPFL) על ידי שעתוק חוץ גופי . עוברים המבטאים את שני הסמנים, המכונים Utr-GFP ו-H2A-mCherry, בהתאמה, בשאר הפרוטוקול, צולמו בשלבי אפיבולי וניצן של 70%. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת דגימה להדמיית multiview

הכנת צינורות FEP/PTFE
1. נקו את צינורות FEP/PTFE בהתאם לנהלים שתוארו קודם לכן¹⁴.
2. לאחר הניקוי, חתכו את הצינורות לאורכים של 2-2.5 ס"מ לפי הדרישה ואחסנו אותם בצינורות מיקרוצנטריפוגות 2 מ"ל המכילים מים מזוקקים כפולים. צינורות ניתן לאחסן באופן זה במשך כחודש.
3. לפני הכנת הדגימה, חממו את הצינורות בטמפרטורה של 70-75 מעלות צלזיוס למשך כ-25 דקות כדי ליישר את הצינורות. הימנע מצפיפות יתר בכל צינור מיקרוצנטריפוגה כדי למנוע גושים, ולהבטיח מספיק מקום ליישור צינור יעיל.
  הערה: יש ללבוש כפפות במהלך כל הליך הטיפול בצינור, מכיוון שכל חלקיק טביעת אצבע/אבק שנותר על הצינורות עלול להפריע להדמיה.
הכנת אגרוז
1. הכן פתרונות מלאי E3 buffer 50x באופן הבא:
  1. מלאי 1 - 3.252 גרם של Na₂HPO₄, 0.285 גרם של KH₂PO₄, 11.933 גרם של NaCl, 0.477 גרם של KCl ב 1 ליטר של מים deionized
  2. מלאי 2 - 2.426 גרם של CaCl₂, 4.067 גרם של MgSO₄ ב 1 ליטר של מים deionized.
2. כדי ליצור חיץ E3 אחד, הוסף 20 מ"ל כל אחד מתמיסות מלאי 1 ו- 2 במים נטולי יונים, 960 מ"ל.
  הערה: אין להוסיף מתילן כחול במאגר E3 המשמש להדמיה, שכן הוא גורם לפיזור אור.
3. יש להמיס אגרוז ב-1x E3 ב-1x E3 על ידי חימום ב-70-75°C על בלוק חום תוך ערבוב עד שהתמיסה מתבהרת ללא גושים או גבישים.
4. להדמיה מרובת תצוגות, הוסף חרוזים פלואורסצנטיים הזמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים) לתמיסת אגרוז, המאפשרת רישום תמונה במהלך הניתוח. סוניק את החרוזים בטמפרטורת החדר בתדר 40 קילוהרץ למשך 20-30 דקות באולטרסאונד אמבט מים כדי לפרק את החרוזים.
5. לאחר סוניקציה, להוסיף 1 μL של חרוזים ל 10 מ"ל של תמיסת agarose בצינור 15 מ"ל ולסובב את הצינור היטב כדי להבטיח פיזור אחיד של החרוזים.
  הערה: נפח תמיסת החרוזים שיש להוסיף לאגרוז תלוי בתמיסת המלאי והיצרן. נסו מגוון נפחים ובחרו ריכוז שבו החרוזים נראים מפוזרים היטב כאשר הם מצולמים במערכת היריעות הבהירות. יותר מדי חרוזים יכולים להצטבר למרות הסוניק והמערבולות, בעוד שמעט מדי חרוזים יכולים להשפיע על רישום התמונה.
6. שמור את צינור האגרוז עם חרוזים נוספים באמבט מים סגור נשמר ב 37 ° C לפחות 30 דקות לפני הכנת הדגימה. זה מבטיח כי הטמפרטורה של agarose יורד מ 70 °C (70 °F) ל 37 °C (77 °F).
הכנת דוגמאות
1. מקמו את הדגים בזוגות עם חוצצים בערב שלפני יום ההדמיה. הסירו את החוצצים למשך כ-15 דקות ואספו עוברים בהליך^{סטנדרטי 20}.
2. לאחר שהעוברים מגיעים לשלב העניין להכנת הדגימה, יוצקים את כל 10 מ"ל האגרוז (עם חרוזים) שנשמר ב 37 מעלות צלזיוס על צלחת פטרי 6 ס"מ.
3. המתן כ 2-3 דקות כדי להביא את הטמפרטורה נמוכה מ 33 ° C לפני העברת 10 עד 15 עוברים לתמיסת agarose.
  הערה: זהו צעד חשוב למניעת כל הלם חום אפשרי לעוברים שהוחזרו לאגרוז.
4. יש לוודא כי חיץ E3 קטן ככל האפשר מתווסף לתמיסת האגרוז בעת החזרת העוברים. מערבלים את צלחת הפטרי כך שהחיץ הקטן שהיה מועבר מתפזר היטב.
5. ללבוש כפפות עבור שאר הליך הכנת המדגם.
6. קחו מיקרופיפטה של 200 μL עם קצה פיפטה מתאים והכניסו צינור ישר ונקי שהוצא מצינור המיקרוצנטריפוגה לקצה הפיפטה כפי שמוצג באיור 1A,B.
7. שאפו מעט אגרוז לתוך הצינור, ואחריו 2-3 עוברים באמצעות מיקרופיפטה (איור 1C,D). ודאו שהעוברים קרובים לתחתית הצינורית (איור 1E), דבר שיהפוך חשוב בעת יצירת ההדמיה. כמו כן, ודאו שיש מעט אגרוז בין העוברים השונים (איור 1E) כדי שחרוזים באזור הזה יוכלו לשמש כסמני רישום.
8. מבלי לשחרר את הלחץ מהפיפטה, נתקו את הצינור מקצה הפיפטה, והניחו אותו על מכסה צלחת הפטרי המלאה ב-E3 כדי שהאגרוז יתמצק (איור 1F).
9. חזור על שלבים 1.3.6 עד 1.3.8 עד שכל העוברים בצלחת הפטרי מועברים לצינורות.
10. לאחר שהאגרוז התמצק (פעולה שיכולה להימשך 5-10 דקות וניתן לאשר אותה על-ידי בדיקת האגרוז בצלחת הפטרי), העבירו את הצינורות לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל מלא ב-E3 (איור 1G).
11. אחסן את הצינורות עם העוברים באינקובטור של 28 ° C או 33 ° C, לפי הצורך, לפני שתמשיך להדמיה multiview.

2. הדמיה מרובת תצוגות

הערה: שלב זה מציג הליך כללי להדמיה מרובת תצוגות של עוברי דגי זברה בשלבי התפתחותם המוקדמים. ניתן להתאים בקלות את השיטה המפורטת להלן לכל מערכת מיקרוסקופיה של יריעות אור מרובות.

איתור העובר
הערה: מלא את תא הדגימה של המיקרוסקופ בתווך העובר²⁰ והגדר את הטמפרטורה של תא הדגימה לטמפרטורה המעניינת לפחות 10 דקות לפני ההדמיה.
1. להרכיב את מחזיק המדגם כפי שתואר קודם²¹, עם זאת, עם שינוי אחד. מאחר שההדמיה תתבצע דרך הצינור, הכניסו את הצינורית עם העוברים ישירות לנימים בקוטר הימני, כך שהיא מוחזקת במקומה מבלי לדחוף את האגרוז החוצה ולהפריע לעוברים בתחתית (איור 1H).
  הערה: מכיוון שלתא הדגימה יש גובה מוגדר, הקפדה על מיקום העוברים בתחתית הצינורית במהלך הכנת הדגימה (כאמור בשלב 1.3.7) תאפשר למקם את העובר בשדה הראייה מבלי לפגוע ברצפת החדר.
2. הכנס את מחזיק הדגימה למערכת multiview והשתמש בפקדי x ו- y כדי להביא את העובר למרכז שדה הראייה.
3. השתמש בבקרת z של נווט הדגימה כדי להביא את העובר למיקוד.
4. בשלב זה, הכיוון של העובר בתוך הכוריון יהיה גלוי בבירור, ואם זה לא משביע רצון, להכניס צינור חדש ולבחור את העובר עם כיוון של עניין.
יישור היריעות הבהירות
1. ברגע שהעובר נמצא במקומו, הגדר את כל הגדרות הניסוי - לייזרים, נתיב אור, מסנן, מפצל קרן ומצלמה.
2. בעת הגדרת פרמטרי הרכישה, אם התוכנה מספקת אפשרות לסריקת ציר, בחר אותה. סריקת ציר תפחית את אפקט ההצללה העולה מגיליון האור כשהיא נתקלת במבנים או באזורים אטומים בדגימה.
3. התחל סריקה חיה של הדגימה. הגדר את גודל הסיביות, עוצמת הלייזר והזום הרצוי, אשר יקבע את עובי גיליון האור, ומכאן, את הרזולוציה הצירית.
4. כדי ליישר את היריעות הבהירות, עברו תחילה לתאורה חד-צדדית ושנו את ההגדרות של שתי יריעות האור (שמאל וימין) ברצף. התקרב דיגיטלית לאזור במדגם שבו נראים מבנים ברורים של עניין.
  הערה: במחקר זה, נעשה שימוש בסמן גרעיני (H2A-mCherry) או בממברנה (Utr-GFP) ליישור היריעות. מומלץ לשנות את הגדרות גיליון האור בתוכנה, כך שהניגודיות החדה ביותר של האות מושגת באזור העניין.
5. לאחר ששתי היריעות הקלות ממוטבות בנפרד כדי להשיג את האות הטוב ביותר, הפעל את שתי היריעות הבהירות. בצע סבב שני של יישור וודא שההבהוב הוא מינימלי, מה שמצביע על יישור טוב למדי של שני היריעונות.
6. לאחר סיום היישור, הפעל את האפשרות להתיך באופן אוטומטי את התמונות שנוצרו על ידי שני הגיליונות, אם התוכנה מתירה זאת. לחלופין, ניתן תחילה ליישר באופן גס את היריעות הבהירות על ידי התמקדות בחרוזים סביב הדגימה ולאחר מכן לכוונן את היישור באמצעות מידע מהדגימה.
  הערה: בעת הדמיה עם שני פלואורופורים (כגון סמנים גרעיניים וממברנה), היישור האופטימלי הוא בדרך כלל שונה באופן שולי עבור שני המבנים. בתרחיש זה, בחר הגדרה המבוססת על אילוצים על עיבוד במורד הזרם. לדוגמה, אם רוצים לפלח את גבולות התא, תהליך יחסית אינטנסיבי יותר של עיבוד, יישרו את היריעות הקלות בהתבסס על סמן הממברנה.
הגדרת הדמיה מרובת תצוגות
1. לאחר יישור היריעות הבהירות, הפעל את האפשרויות לביצוע ערימת z וכן הדמיה מרובת תצוגות.
2. התחל סריקה חיה ונווט באמצעות נווט הדגימה כדי לבחור את התצוגה הראשונה. בתצוגה זו, הגדר את מרווח הזמן לפרוסה, ואחריו את הפרוסה הראשונה והאחרונה של ערימת z. הוסף מיקום זה בתיבת הדו-שיח מרובת תצוגות, המציינת את המיקום ואת מידע מחסנית z עבור תצוגה זו.
3. מעבר לתצוגה הבאה על-ידי שינוי הזווית בנווט הדגימות. הגדר את מחסנית z עבור התצוגה השניה והוסף את המידע בתיבת הדו-שיח מרובת תצוגות.
4. חזור על אותו הדבר עבור תצוגות נוספות.
  הערה: ודא שמספר מינימלי מסוים של פרוסות מצולם בכל תצוגה, כך שתהיה חפיפה מספקת בין התצוגות השונות, דבר שיסייע בסופו של דבר ברישום התצוגות במהלך העיבוד. מספר הפרוסות המינימלי יהיה תלוי במקדם הזום וכן במספר הזוויות שנבחרו להדמיה.
5. לאחר הגדרת כל התצוגות, שמור מידע זה בקובץ טקסט (שנקרא 'מיקומי עוברים', למשל), שיכיל מידע מחסנית z, (x, y, z) קואורדינטות של הצינור וכן מפרט של הזווית עבור כל תצוגה. לאחר השמירה, נקה את כל המיקומים מתיבת הדו-שיח ריבוי תצוגות.
6. מכיוון שההדמיה נעשית עם כוריון שלם, שהוא גדול יחסית, לא ניתן לראות את החרוזים בצינור עם אותן הגדרות. לכן, מידע חרוזים צריך להיות נרכש ממיקום אחר בצינור. כדי לעשות זאת, לתרגם לקואורדינטת 'y' שונה הרחק מהעובר שבו חרוזים גלויים. הוסף מיקום זה לתיבת הדו-שיח מרובת התצוגות ושמור מיקום זה בקובץ טקסט (בשם 'beads-y', לדוגמה).
  הערה: דמיינו את החרוזים קרוב ככל האפשר לדגימת העובר על מנת למזער את ההשפעות של הבדלים אפשריים בעקמומיות הצינור בשני המקומות. לכן, אם עוברים מרובים מותקנים בצינור, חשוב להשאיר מעט אגרוז בין הצינורות כדי לצלם חרוזים (כאמור בשלב 1.3.7).
7. עבור לתיקייה שבה נשמרים קבצי הטקסט ושכפל את הקובץ 'עמדות עוברים' לקובץ חדש בשם 'מיקומי חרוזים'. החלף את קואורדינטת y עבור כל התצוגות בקובץ 'מיקום חרוזים' בקואורדינטת y מהקובץ 'חרוזים-y'. זה יבטיח שהחרוזים יצולמו עם אותו מספר צפיות, ערימות z וקואורדינטות x אך במיקום y שונה בצינור.
8. חזור לתוכנת ההדמיה וטען את קובץ 'מיקומי החרוזים' בתוכנה. אם האפשרות סידרת זמן מופעלת, בחר מחזור אחד והתחל את הניסוי. שמור תמונות חרוזים כ'חרוזים', שישמשו לרישום התצוגות השונות במהלך עיבוד התמונה.
9. לאחר צילום תמונות החרוזים, נקה את המיקומים וטען את קובץ 'עמדות העובר' הראשוני בתוכנה. הגדר את מספר המחזורים הרצוי עם מרווח זמן מתאים והתחל את הניסוי.

3. ניתוח תמונה מרובת תצוגות

הערה: לאיחוי תמונות מרובות תצוגות, תוסף FIJI, BigStitcher, שהוא הגרסה האחרונה של תוסף Multiview Reconstruction, משמש 10,17,18. ניתן להתקין את התוסף על ידי הוספת תוסף BigStitcher בפונקציה 'ניהול אתרי עדכון', אליו ניתן לגשת באפשרות 'עדכון' תחת תפריט 'עזרה'. לאחר ההתקנה, התוסף יופיע תחת תפריט 'תוספים'. השלבים הרחבים הכרוכים באיחוי הם כדלקמן: (1) הגדר זוגות קבצים .xml/.h5 הן עבור החרוזים והן עבור העוברים; (2) לרשום את כל התצוגות בקובץ החרוזים; (3) פונקציית התפשטות נקודות חילוץ (PSF) עבור החרוזים, שיכולה לשמש לדקונבולוציה (איור 2A); (4) להעביר את פרטי הרישום וה-PSF מקובץ החרוזים לקובץ העובר ולהתחיל בפירוק רב-תצוגתי. רוב השלבים הללו תוארו בעבר בפירוט²¹, וכאן מתוארים השלבים המעובדים באופן שונה.

הגדרת מערך נתונים .xml
1. הגדר מערך נתונים חדש הן עבור החרוזים והן עבור העובר כ- 'beads.xml' ו- 'embryo.xml', בהתאמה, כפי שתואר קודם לכן²¹.
איתור ורישום באמצעות נקודות עניין
1. לאחר הייצוא המוצלח של קובץ beads.xml, בחר את התצוגות הדרושות לרישום בתיבת הדו-שיח Multiview Explorer (איור 2B). לחץ לחיצה ימנית ובחר זהה נקודות עניין. המשך בשלבים כמתואר²¹.
2. לאחר זיהוי נקודות עניין, בחר את כל התצוגות, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר הירשם באמצעות נקודות עניין. בצע את הפרוטוקול כמתואר²¹.
3. בדוק היטב אם רישום החרוזים עבד בהצלחה. לאחר רישום מוצלח, חרוזים חופפים מתצוגות שונות מקבלים על גבי (איור 2C). כדי לבדוק כיצד בדיוק פעלה ההתאמה, בחר שתי תצוגות רצופות, עבור לאזור החופף ועבור בין שתי התצוגות כדי לבחון אם החרוזים המצולמים מזוויות שונות מונחים על גבי מונחים. חזור על פעולה זו עבור כל תצוגה עוקבת.
4. אם החפיפה אינה מדויקת, נסה שוב את הרישום על ידי הרפיית המשמעות הנדרשת לרישום ו / או השגיאה המקובלת של חפיפה (המכונה 'שגיאת RANSAC' בתיבת הדו-שיח 'רישום').
5. לאחר הרשמה מוצלחת, לחץ על שמור בחלון 'Multiview Explorer' כדי לשמור את קובץ .xml המעודכן.
  הערה: שמור גם את קובץ יומן הרישום, מכיוון שהוא מכיל מידע מפורט נוסף על יעילות הרישום. כדי לתרגם את פרטי הרישום מהחרוזים לעובר, בצע את השלבים המתוארים להלן.
6. פתח את קובץ bead.xml בעורך טקסט לפי בחירה והעתק את הבלוק כולו תחת "ViewRegistrations".
7. פתח את embryo.xml והחלף את הבלוק "ViewRegistrations" בבלוק שהועתק מקובץ החרוזים. אם קיימים מספר ערוצים, החלף את פרטי הרישום עבור כל ערוץ כמפורט לעיל. ניתן להעביר את פרטי הרישום באופן ידני או באמצעות קוד MATLAB הכתוב בהתאמה אישית שניתן להוריד כאן: https://github.com/sundar07/Multiview_analysis
8. פתח את הקובץ embryo.xml ב "BigStitcher" ולבדוק בזהירות אם הרישום עבד בהצלחה עבור העובר. חזור על אותו הדבר שנעשה עבור החרוזים, על ידי בדיקת החפיפה של מבנים מעניינים בכל שתי תצוגות עוקבות.
  הערה: לעיתים, רישום עוברים עשוי להיות פחות רצוי למרות שהחרוזים נרשמים בצורה מושלמת. זה אפשרי אם יש שינויים קלים בעקמומיות הצינור מהמיקום שבו החרוזים מצולמים למצב העובר. בנוסף, יכולות להיות תנועות עדינות של העובר בין ההשקפות כשהוא צף בחופשיות בתוך הכוריון. במקרה זה, לבצע סיבוב שני של רישום באמצעות סמן גרעיני בעובר.
9. לשם כך, פתח את קובץ embryo.xml ב- "BigStitcher", לחץ לחיצה ימנית על כל התצוגות בעלות הסמן הגרעיני ובחר זהה נקודות עניין.
10. שנה את שמות נקודות העניין ל'גרעינים' והמשך בשלבים כפי שבוצעו עבור חרוזים.
11. בעת קביעת פרמטרים של "הפרש גאוסיאני", ודא כי רוב, אם לא כל, הגרעינים מזוהים וכי אין גילוי גרעיני חוץ רחמי. לאחר מכן, לחץ על סיום.
12. לאחר מכן, רשום תצוגות אלה על-ידי בחירה באפשרות הירשם באמצעות נקודות עניין ובחר באפשרות מבוסס מתאר מדויק (תרגום משתנה). ודא שהאפשרות 'השווה את כל התצוגות ונקודות העניין' נבחרה והשתמש ב'גרעינים' כנקודות עניין. השתמש באפשרות לתיקון התצוגה הראשונה ואל תמפה לאחור.
13. לרישום, השתמש במודל אפין עם רגולציה נוקשה ופרמטרי ברירת המחדל בתוסף.
14. בדוק מחדש את הצלחת הרישום על ידי השוואה בין כל שתי צפיות רצופות.
15. לאחר הרשמה מוצלחת, לחץ על שמור בחלון 'Multiview Explorer' כדי לשמור את קובץ .xml המעודכן.
16. פתח את קובץ embryo.xml בעורך טקסט לפי בחירתך והעתק את פרטי הרישום מהסמנים הגרעיניים לערוצים האחרים.
חילוץ והקצאה של פונקציית התפשטות נקודתית
1. כדי לבצע דה-קונבולוציה מרובת תצוגות, חלץ את PSF של מערכת ההדמיה מערכת הנתונים של החרוזים הרשומים והחל אותו על קובץ העובר.
2. לקבלת מידע זה, בחרו בכל התצוגות בקובץ החרוזים ולאחר מכן לחצו לחיצה ימנית ובחרו אפשרויות ' פונקציות פריסה נקודתיות ' ו'חילוץ '.
3. בתיבת הדו-שיח שמופיעה, ודא שהאפשרות השתמש בנקודות עניין תואמות והסרת הקרנות עוצמה מינימלית מ-PSF מסומנת, המשך עם גדלי PSF המוגדרים כברירת מחדל ולחץ על אישור.
  הערה: אם חילוץ PSF מוצלח עבור כל התצוגות, קובץ יומן הרישום יציג 'n/n PSF שחולצו'
4. לאחר מכן, שמור מחדש את קובץ .xml. תופיע תיבת סימון מסומנת בעמודת PSF בתיבת הדו-שיח 'Multiview Explorer', ותיקיית 'psf' תיווצר בתיקייה המתאימה עם כל PSF שחולצו.
5. פתחו את קובץ embryo.xml והקצו קובץ PSF לכל תצוגה בנפרד. לחץ לחיצה ימנית על "תצוגה" → לחץ על פונקציות כפולות נקודתיות → בחר הקצה → בחר מתקדם, ולאחר מכן הקצה PSF חדש לכל התצוגות שנבחרו. לחץ על עיון, עבור אל נתיב הקובץ .xml ופתח את תיקיית psf .
6. בחר את PSF תואם עם מזהה המתאים בתצוגה שנבחרה ולחץ על אישור, ולאחר מכן תיבת הסימון PSF יופיע מסומן בחלון 'Multiview Explorer'.
7. חזור על התהליך עבור כל התצוגות האחרות.
מיזוג ודה-קונבולוציה מרובי תצוגות
1. לאחר הקצאת פונקציית כפולת הנקודות לכל התצוגות, לחץ לחיצה ימנית ובחר Multiview Deconvolution.
2. בחר בתיבה התוחמת בתצוגות הנוכחיות שנבחרו. עבור עבודה זו, האצת OSEM ברירת המחדל ומספר האיטרציות פועלים היטב.
3. בצע דגימת הפחתה של התמונות כנדרש אם נדרש חישוב מהיר יותר או אם זיכרון ה- CPU מוגבל.
  הערה: אם זיכרון ה-RAM הדרוש חורג מהזיכרון הקיים, תופיע הודעת שגיאת אזהרה בצבע אדום בתחתית החלון. אל תתחיל את deconvolution אם אזהרה זו צצה, כמו התוסף יתעכב ויפסיק להגיב בשלב כלשהו במהלך העיבוד.
4. כדי להעריך את התקדמות deconvolution, בדוק את קובץ היומן, אשר יציג תוצאות כל 5 חזרות.
5. כדי להגדיל את מהירות החישוב, בצע deconvolution multiview ב- GPU אם הותקן בעבר.
  הערה: בסוף תהליך זה, יופיע חלון תמונה מאוחה, שניתן לשמור כקובץ tiff.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כיוון הדגימה בצורה מדויקת הוא חלק חיוני בשימוש יעיל במיקרוסקופיה. עם זאת, כיוון ידני של דגימות אינו אפשרי לעתים קרובות בעת שימוש במערכת גיליון אור מרובה, בהתחשב בדרישה להכנת הדגימות בצינור. לכן, כדי לבדוק אם יש תנוחות סטריאוטיפיות שהעוברים תופסים בתוך הכוריון, עוברי דגי זברה צולמו ב-70% אפיבולי (כ-7 שעות לאחר ההפריה (hpf)), מאחר שהדמיית הילוך מהיר מגסטרולציה ועד לשלבים מוקדמים של סומיט הייתה מוקד המחקר הזה. כאשר הדגימות הוכנו מיד לפני ההדמיה ב-70% אפיבולי, העוברים לא הראו אוריינטציה ספציפית שנצפתה לעתים קרובות על פני דגימות. מכיוון שלעתים קרובות זה לא רצוי, הדגימות הוכנו הרבה לפני הגסטרולציה ואוחסנו בצינורות מיקרוצנטריפוגות בטמפרטורה המתאימה עד תחילת ההדמיה. בתנאים אלה, ב-70% אפיבולי (N=3; n = 87 עוברים), ניתן לסווג את כיווני העובר ל-(1) אופקי, כאשר ציר החי-צומח (AV) של העובר היה אורתוגונלי לציר הארוך של צינור הפולימר, (2) אנכי, כאשר ציר AV מקביל לציר הארוך של צינור הפולימר, ו-(3) אלכסוני, כאשר ציר ה-AV היה בזווית חדה (איור 3A). המיקום האופקי היה הכי פחות מיוצג, בעוד שהתנוחות האנכיות והאלכסוניות נצפו באותה מידה (איור 4).

כאשר העוברים הושארו בצינורות, העוברים היו יציבים בתנוחות אלה עד 90% אפיבולי, ולאחר מכן רוב העוברים שינו את כיוונם. לכן, נדרש סבב שני של תיעוד אוריינטציות בשלב ניצן של אמבריוגנזה (כ -10 hpf) כדי להסביר את האוריינטציות שהשתנו. זה בוצע עבור דגימות שהוכנו באופן עצמאי. לצורך הדמיה של שלבי סומיט מוקדמים, דווח בעבר כי עובר עם אורתוגונלי נוטוכורד לציר הארוך של צינור הפולימר היה הכיוון האידיאלי מכיוון שהוא מאפשר הדמיה של סומיט דו-צדדי מרובים הנוצרים לאורך ציר¹⁵. כאשר הדגימות הוכנו לפני הגסטרולציה (N = 3, n = 93 עוברים), כ -25% מהעוברים הציגו כיוון זה (איור 4) ועוברים אלה נשארו יציבים בכיוון זה לפחות עד שלב 8-סומיט, בהתאם לדיווחים קודמים¹⁵. שאר העוברים הציגו אוריינטציות שונות אחרות בשלב הניצן (מסווגים באיור 3B ובאיור 4); עם זאת, רבים מהם כיוונו מחדש למצב אופקי במהלך היווצרות סומיט מוקדם. מעניין לציין כי אחוז דומה של עוברים הציג כיוון אופקי בשלב הניצן ללא קשר אם הדגימה הוכנה לפני הגסטרולציה, ב -70% אפיבולי, או מיד לפני שלב הניצן. לפיכך, תזמון הכנת הדגימה נראה פחות קריטי עבור הכיוון האופקי של העניין עבור שלבי סומיט הדמיה, בניגוד למה שנצפה עבור הדמיה ב 70% epiboly.

היתרון של מערכת multiview הוא היכולת להציג את אותה דגימה מזוויות מרובות. עם זאת, עבור עוברים של דגי זברה בשלבים שהוזכרו, מספר התצוגות הדרושות לקבלת רזולוציה תאית על פני העובר כולו אינו ברור. כדי לאפיין זאת, עוברי דגי זברה צולמו באמצעות מטרת NA 20x/1 בזרוע הגילוי עם מקדם זום של 1, אשר התאים לעובי יריעה בהירה של 4.57 מיקרומטר. תחת הגדרות אלה, העובר כיסה את כל שדה הראייה של מצלמת sCMOS בגודל פיקסל של 6.5 מיקרומטר ושטח של 1920 על 1920 פיקסלים. מיקרו-הזרקה של mRNA עבור פלואורופור מתויג היסטון (H2A-mCherry) בעוברים בשלב 1 תאים שהתקבלו מקו מהונדס שסימן חוטי אקטין (Utr-GFP) אפשרה הדמיה של שני גרעיני וקרום התא בעובר. כדי לבצע איחוי רב-תצוגות של עוברים במרווחים זוויתיים שונים, בוצעה רכישה של 360° של העוברים הטרנסגניים הכפולים וכן חרוזים בצינור בכל 30° (n = 3 עוברים ב-70% אפיבולי; n = 3 עוברים בשלב הניצן) או 45° (n = 3 עוברים ב-70% אפיבולי; n = 3 עוברים בשלב הניצן) מרווחים עם כ-100 פרוסות בכל זווית ומרווח פרוסה של 2 מיקרומטר. על-ידי דילוג על זוויות חלופיות במהלך עיבוד תמונה, רכישות 30° ו- 45° סיפקו בנוסף את ערכות הנתונים של 60° ו- 90°.

התמונות שנרכשו נרשמו לאחר מכן באמצעות פרטי החרוזים, ופרטי הרישום הועברו לערכת נתוני העובר כמתואר בסעיף הפרוטוקול. רישום מוצלח באמצעות תוסף BigStitcher הושג עבור הרכישות השונות למעט מערך הנתונים של 90°, אשר ככל הנראה נובע מכיסוי קטן יותר של הדגימה מכל זווית. כדי להתגבר על כך, צולמו עוברים כל 90° עם כ-400 פרוסות בכל זווית ומרווח פרוסה של 2 מיקרומטר, הן בשלב האפיבולי והן בשלב הניצן, שנרשמו בהצלחה (n = 3 עוברים לכל שלב).

השלב הבא היה לבצע מיזוג multiview ו deconvolution של ערכות הנתונים הרשומות. זה נעשה עם 4x downsampling כדי להאיץ את החישוב. כפי שניתן לראות בייצוג גרעינים מנקודות מבט אינדיבידואליות ובעובר משוחזר מרובה תצוגות (איור 5), התצוגות האינדיבידואליות מכסות שדה ראייה קטן יותר, אשר, לאחר האיחוי, הניב תמונה של העובר כולו. לצורך הייצוג, גרעינים זוהו באמצעות Mastodon (https://github.com/mastodon-sc/mastodon), תוסף מבוסס FIJI, שניתן להוסיף בסעיף "ניהול אתרי עדכון" בתפריט "עזרה" בפיג'י ולגשת אליו תחת תפריט התוספים לאחר הוספתו. לצורך זיהוי, התמונות בהתאמה הומרו תחילה לפורמט XML/hdf5, ולאחר מכן בוצע גילוי גרעיני באמצעות תוסף 'זיהוי' של מסטודון עם גלאי DoG (קוטר 6 מיקרומטר וסף איכות 80).

בין התמונות המאוחות השונות, מערך הנתונים של 90° הראה רקע גבוה מאוד עמוק יותר בדגימה, מה שהופך אותו ללא מתאים לביצוע כימות כלשהו. לכן, בניגוד לדגימות קטנות יותר כגון עוברי דרוזופילה, אשר צולמו לעתים קרובות במרווח של 90 מעלות במחקרים אחרים ^9,22, הדבר אינו מומלץ להדמיית עוברים מוקדמים של דגי זברה באמצעות מטרה NA של 20x/1. בין מערכי הנתונים המאוחים של 30°, 45° ו-60°, מבחינה איכותית, לא היה הבדל משמעותי במידע על גרעינים (איור 6B, שורה עליונה); אולם מבנים עדינים יותר כמו גבולות תאים נראו הרבה יותר פתורים עם מערך הנתונים המאוחד של 30° בהשוואה לשאר (איור 6C, שורה עליונה).

כדי לאשר תצפית זו, מסטודון שימש לגילוי גרעינים בתמונות המאוחות שהתקבלו מהדמיה כל 30°, 45° ו-60°. לצורך הניתוח נבחרו שלושה אזורים בתמונות המאוחות, אחד בעומק של 20 מיקרומטר (איור 6A), 50 מיקרומטר ו-100 מיקרומטר מפני השטח של העובר. כדי להשוות את יעילות זיהוי הגרעינים בין תמונות, הגילוי בוצע כמתואר לעיל, עם פרמטרים זהים על פני תמונות מאוחות ממרווחים זוויתיים שונים. בכל האזורים שנותחו, כל גרעין זוהה ללא קשר לתמונות מאוחות שהתקבלו מהדמיה כל 30°, 45° או 60° (איור 6B, שורה תחתונה). לפיכך, מבנים כדוריים כגון גרעינים ניתן לצלם בכל אחד מהמרווחים הזוויתיים לעיל ללא אובדן מידע.

לניתוח גבולות תאים, נעשה שימוש ב- Tissue Analyzer²³, תוסף FIJI המשמש באופן שגרתי לפילוח תאים 24,25,26. בדומה למסטודון, ניתן להוסיף את תוסף Tissue Analyzer בסעיף "ניהול אתרי עדכון" בתפריט "עזרה" בפיג'י ולגשת אליו תחת תפריט התוספים לאחר הוספתו. גבולות התא חולקו באמצעות אלגוריתם קו פרשת המים עם פרמטרי ברירת מחדל וטשטוש חזק שנע בין 1.5 ל-2 בהתאם לעומק הרקמה וטשטוש חלש של 1. פרמטרים אלה נשמרו קבועים בכל הניתוחים, מה שאפשר השוואה פשוטה. כאשר התמונות המקוטעות הושוו ידנית לתמונות הקלט המקוריות, נצפו שגיאות, כאשר התוכנה נכשלה בזיהוי גבול תא או ציירה גבולות תא שאינם קיימים (איור 6C, שורה תחתונה). מספר השגיאות שנעשו על ידי תוסף מנתח הרקמות נורמל למספר הכולל של איגרות חוב שזוהו באזור וחושב כ'שגיאת פילוח גבול'. בעוד שהשגיאות האלה היו קיימות בכל האזורים שנותחו, מספר השגיאות גדל באופן דרסטי בתמונות מאוחות שהתקבלו מהדמיה במרווחים זוויתיים של 45° ו-60°, בהשוואה ל-30° (איור 6D). זה הצביע על כך שהרזולוציה בתמונות המאוחות הייתה גרועה יותר ויותר כאשר המרווח הזוויתי גדל. לכן, עבור פילוח מבנים עדינים יותר כגון גבולות התא, מרווח זוויתי הדוק יותר מאפשר עיבוד קל יותר במורד הזרם.

figure-results-1
איור 1: הכנת דגימות באמצעות צינורות פולימר. (A) צינור פולימרי מצינוריות המיקרוצנטריפוגות המאוחסנות נלקח באמצעות מלקחיים. (B) חיבור הצינור לקצה מיקרופיפטה של 200 μL. (C) שאיפת עוברים בעזרת פיפטה לתוך הצינור. (ד,ה) צינור פולימרי עם עוברים בשלב ניצן גלויים לכיוון תחתית הצינור. (F) צינורות הפולימר מונחים על צלחת פטרי עם E3 כדי למצק את האגרוז. (G) אחסון צינורות הפולימר בצינור מיקרוצנטריפוגה מלא E3. (H) מחזיק דגימה מורכב עם צינור הפולימר המותקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תהליך עבודה של ניתוח תמונות מרובות ורישום באמצעות חרוזים. (A) צינור ניתוח התמונות מרובות התצוגות. (B) התמונה מציגה את החלון "Multiview Explorer" ב-BigStitcher, תוסף FIJI, שבו כל תצוגה מופיעה כשורה אחת ומכילה מידע על הזווית, הערוץ, הרישום, נקודות העניין וה-PSF. כל הפקודות הנדונות בפרוטוקול מופיעות כשבוחרים תצוגה ולאחריה לחיצה ימנית, כמתואר בתפריט הנפתח. ניתן להציג באופן חזותי את התצוגות שנבחרו בחלון BigDataViewer, כפי שמוצג. (C) תמונת חרוז מייצגת לפני (משמאל) ואחרי הרישום (מימין) המתקבלת מהדמיה במרווחים זוויתיים של 30°. כל התצוגות הזוויות נבחרו והוצגו. פסי קנה מידה: 75 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: סקירה כללית של כיווני ברירת המחדל של עוברים. תמונות מייצגות של הכיוונים שהעוברים נופלים אליהם בתוך הכוריון בשלבי אפיבולי (A) וניצן (B) של 70%. השורה העליונה בכל חלונית מציגה תמונות בעלות שדה בהיר המתקבלות ממערכת גיליונות האור, והשורה התחתונה מציגה קריקטורות מייצגות. חצים ב-(B) מציינים את מיקום הנוטוכורד, ששימש לזיהוי הכיוון. אפ, מוט בעלי חיים; סמנכ"ל, קוטב צמחי; A, קדמי; P, אחורי. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
תרשים 4: סטטיסטיקה של אוריינטציות עובריות שונות. (A) העמודה המוערמת מציינת את אחוז העוברים הנופלים לכיוונים שצוינו ב-70% אפיבולי כאשר הדגימות מוכנות לפני הגסטרולציה. (B) העמודות המוערמות מציינות את אחוזי העוברים הנופלים לכיוונים המצוינים בשלבי ניצן כאשר הדגימות מוכנות לפני הגסטרולציה (משמאל), ב-70% אפיבולי (באמצע) ובשלבי ניצן (מימין). N, מספר הציפורניים העצמאיות שמהן התקבלו עוברים; n, המספר הכולל של עוברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ייצוג גרעינים מעובר משוחזר מרובה תצוגות. (א) תרשים הפיזור התלת-ממדי מייצג גרעינים שזוהו בעובר משוחזר במולטי-וויו שצולם במרווח זוויתי של 30 מעלות. כל מעגל מייצג גרעין והצנטרויד של מיקומי הגרעינים משורטט. הקואורדינטות הגרעיניות הושגו באמצעות מסטודון, תוסף FIJI. (B) פיזור תלת-ממדי של חלקות גרעינים משלוש תצוגות מייצגות של אותו עובר - התיאורים מרוחקים זה מזה ב-60 מעלות. צבעים לכל גרעין הוקצו באופן אקראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: השוואה של מידע בקנה מידה סלולרי בתמונות מאוחות. (A) התמונה משמאל מציגה תצלום בזק מעובר ששוחזר במולטי-וויו בעומק של 20 מיקרומטר מפני השטח. העיגול הצהוב מתאר את האזור המשמש לניתוח נוסף. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר (בכל הלוחות). (B) תמונות גולמיות מייצגות של גרעינים בעומק 20 מיקרומטר מפני השטח של העובר משלוש ערכות נתונים שצולמו כל 30°, 45° ו-60° בהתאמה (למעלה). גרעינים שזוהו (בירוק) באותן תמונות על ידי Mastodon, תוסף FIJI (למטה). (C) תמונות גולמיות מייצגות בעומק 20 מיקרומטר מפני השטח של העובר משלוש ערכות נתונים שצולמו כל 30°, 45° ו-60° בהתאמה, באמצעות סמן האקטין Utr-GFP (למעלה). גבולות מפולחים על ידי Tissue Analyzer, תוסף FIJI, מוצגים עבור אותן תמונות (למטה). החיצים מציינים שגיאות שנעשו על ידי מנתח הרקמות בסגמנטציה של גבולות, כאשר החץ הצהוב מייצג גבול חסר והחץ הלבן מייצג גבולות שזוהו באופן שגוי כאשר מבחינה חזותית נראה שאין גבולות. (D) תרשים הקופסה מתאר את אחוז הטעויות שעשה מנתח הרקמות בין עוברים משוחזרים מרובי תצוגות שצולמו כל 30°, 45° ו-60° בעומקים שונים. קווי שגיאה מציינים פי 1.5 מהטווח הבין-רבעוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקום העובר בכיוון הנכון כדי לדמיין את אזור העניין הוא אחד השלבים המגבילים את הקצב שלעתים קרובות גורם לסשן מיקרוסקופיה כושל עבור המשתמש. הדבר נכון יותר במיקרוסקופ יריעות אור מרובות תצוגות, שם קשה לבצע מניפולציה ידנית של הכיוון מכיוון שהדגימות מוטמעות בתוך צינור. כדי לסייע בתהליך זה, מחקר זה מדווח על נתונים סטטיסטיים של מיקומים שונים שעובר דג זברה תופס בין 70% אפיבולי לשלבי סומיט מוקדמים בתוך כוריון, כאשר צינור הפולימר עם העוברים נשמר זקוף בצינור מיקרוצנטריפוגה.

ב-70% עוברים אפיבוליים, אנכיים או אופקיים מספקים מידע משלים על אירועים על פני העובר כולו. בעוד שהכיוון האופקי מאפשר הדמיה של הדינמיקה התאית בקוטב החי כמו גם את הדינמיקה של תאים העוברים אפיבולי כפי שהיא נראית מהקוטב הצמחי, הכיוון האנכי מאפשר הדמיה של הצדדים הגביים והגחונים של העובר, כולל דינמיקה תאית בארגון הגבי, הפנמה של תאים במהלך גסטרולציה וזרימת התכנסות-הרחבה. מחקר זה מראה כי קיימת סבירות גבוהה לקבלת עובר בכיוון האנכי במקרה בלבד אם הדגימות מוכנות מספר שעות לפני ההדמיה; עם זאת, נראה כי הכיוון האופקי הרבה פחות נפוץ בשלבים אלה. עבור שלבים לפני 70% אפיבולי, מומלץ למשתמשים לתעד נתונים סטטיסטיים דומים של כיוון העובר בתוך הכוריון לפני שימשיכו בהדמיית קיטועי זמן, שכן מידע זה מראש חוסך זמן בטווח הארוך.

משלב הניצן, הכיוון הטוב ביותר להדמיה הוא עובר הממוקם אופקית, שכן זה מאפשר לעקוב אחר דינמיקה תאית לאורך כל ציר הגוף הקדמי של עוברים¹⁵. קבלת עובר בכיוון זה היא פשוטה יחסית, שכן כ -25% מהעוברים נופלים למצב יציב זה ללא קשר למועד הכנת הדגימה. באופן כללי, לצורך הדמיה בכל שלב של עניין, מומלץ להכין כ-15 צינוריות עם שניים עד שלושה עוברים בכל צינור, מה שיבטיח סבירות גבוהה לקבלת עוברים בכיוון הרצוי ומכאן מפגש מיקרוסקופ מוצלח בכל יום נתון. בנוסף, מומלץ למיין את הצינורות כשעה לפני שלב העניין כדי לבחור עובר עם הכיוון הנכון להדמיית קיטוע זמן.

לאחר קבלת עובר בכיוון הנכון, חשוב לקחת בחשבון את מספר התצוגות ואת מרווח הזווית בין התצוגות להדמיה. הדבר תלוי ברזולוציה המרחבית והזמנית המינימלית הנדרשת. ככל שמצולמים יותר זוויות שמהן מצולם מבנה או אזור מסוים של העובר, כך הרזולוציה המרחבית טובה יותר (כפי שמוצג באיור 6), אך הדבר מוביל לפשרה ברזולוציית הזמן. בפרוטוקול זה, עם מערכת בעלת שתי זרועות הארה וזרוע גילוי אחת, הדמיה של שני ערוצים על פני 360° מלאים עם מרווח זוויתי של 30° וכ-100 פרוסות z בכל זווית עם מרווח פרוסה של 2 מיקרומטר, ארכה כ-3 דקות לנקודה חד פעמית. בעוד שזה מספיק כדי לעקוב אחר תאים בשלבים עובריים מוקדמים, אם רוצים ללכוד אירועים עם דינמיקה מהירה יותר, יש לרכוש מספר קטן יותר של זוויות, מה שמבטיח רזולוציה טמפורלית טובה יותר, אך עם פשרה על רזולוציה מרחבית, במיוחד אם מבנים עדינים יותר כגון גבולות התא צריכים להיות מקוטעים. אפשרות שנייה שיש לשקול כדי לשפר את הרזולוציה הטמפורלית היא להשתמש במערכת multiview עם שתי זרועות גילוי, אשר יגדיל באופן משמעותי את מהירות הרכישה כפי ששימשה לאחרונה למעקב אחר תנועות תאים במהלך gastrulation בעוברים דגי זברה¹⁶. בנוסף, למרות שרק המטרה 20x/1 NA נבדקה בפרוטוקול זה, בהתאם לדגימה המצולמת, הרזולוציה המרחבית הנדרשת ושדה הראייה, יש לקחת בחשבון את המטרה הנכונה. יחד, בהתבסס על העיבוד והכימות הנדרשים במורד הזרם עבור מדגם מסוים ושדה ראייה מסוים, יש לבחור בקפידה את מספר התצוגות ואת מרווח הזווית. עם זאת, עבור הדמיה של עוברים שלמים של דגי זברה מוקדמים, במיוחד עם רזולוציה בקנה מידה תאי מזוויות מרובות, מטרת NA של 20x/1 נראית אופטימלית, שכן מטרה עם הגדלה נמוכה יותר ו-NA (למשל, יעד 10x/0.5 NA) יהיה ברזולוציה נמוכה בהרבה, מה שככל הנראה יוביל ליותר טעויות סגמנטציה, בעוד שמטרה עם הגדלה גבוהה יותר ו-NA לא תהיה ריאלית לכיסוי כל העובר בשדה הראייה של המצלמה.

במחקר זה, כדי לדון באסטרטגיות הרכבה והדמיה, נעשה שימוש בסמן אקטין (actin marker), שיכול לשמש כפרוקסי למעקב אחר גבולות התא, ובסמן היסטון (histone), לגילוי גרעינים ולמעקב אחריהם. למעשה, רוב המחקרים שפורסמו בעבר שהשתמשו במערכת יריעות אור מרובות תצוגות השתמשו באופן מועדף בסמנים דומים 5,7,15,16,27. הסיבה העיקרית לבחירת סמנים אלה היא שמיקרוסקופ יריעות אור מרובות משמש בעיקר למעקב אחר דינמיקה בקנה מידה תאי (למשל, צורת התא וסידור מחדש של תאים) בסקאלות רקמה או לאורך העובר כולו לפרקי זמן ארוכים הנמשכים מספר שעות עד ימים. מצד שני, אם יש צורך בקבלת רזולוציה תת-תאית, ניתן להשתמש בקו מהונדס אחר המסמן את אזור העניין, אך בתרחיש זה, מיקרוסקופ גיליון אור מרובה תצוגות עשוי שלא להיות הבחירה הטובה ביותר של המכשיר, אלא קונפוקל, מערכת סופר-רזולוציה או אפילו מיקרוסקופ גיליון אור סריג²⁸^,²⁹ עשוי להתאים יותר לבעיה הנחקרת.

הפרוטוקול הנדון עובד היטב מגסטרולציה ועד 15 עוברים של דגי זברה בשלב 15 סומיט³⁰ (כ -17 hpf) ללא כל שינוי, ולמרות שלא נבדק כאן, סביר להניח שהוא יעבוד גם עבור עוברים מוקדמים יותר לפני שלב הגסטרולציה. מעבר לשלב 15-סומיט, התכווצויות שרירים ספונטניות מתחילות^30,31, אשר ניתן לדכא על ידי הוספת טריקאין, חומר הרדמה, בצינור, כמו גם בתא הדגימה. בנוסף, בסביבות 18 hpf, היפוך זנב הרחק החלמון מתחיל³⁰, אשר מרחיק את העובר משדה הראייה. כדי לטפל בכך, יש להשתמש באלגוריתם מעקב העוקב אחר הקצה המתארך כדי לשמור על העובר בפוקוס³². יתר על כן, לצורך הדמיה של עוברים בשלב מאוחר יותר כאשר הם נטולי כוריון, כגון לצורך מעקב אחר התפתחות עצבית, יש להשתמש באסטרטגיית הרכבה חלופית כפי שבוצעה לאחרונה³³.

לצורך הדמיה של עוברים של דגי זברה עם כוריון שלם, לכידת שני החרוזים, המשמשים כסמני רישום, והעובר באותו שדה ראייה אינה אפשרית באמצעות מטרת NA 20x/1. מחקר זה מספק חלופה פשוטה על ידי רישום התצוגות השונות עם מידע מחרוזים הנמצאים מעל או מתחת לדגימה, ולאחר מכן העברת הרישום מהחרוזים לעובר במהלך העיבוד. לאחר רישום דגימת העובר בדרך זו, ניתן לבצע סבב רישום שני באמצעות גרעינים כסמני רישום, הנמצאים בתוך הדגימה, לצורך כוונון נוסף של הרישום הראשוני. בעת ביצוע הדמיה בהילוך מהיר, מידע הגרעינים, בתורו, יכול לשמש לרישום של נקודות זמן רצופות כפי שדווח בעבר²¹. חלופה אחת לפרוטוקול זה היא לוותר על חרוזים ובמקום זאת להשתמש במידע הגרעיני לרישום הראשוני. אבל הרישום נכשל לעתים קרובות (לא מוצג כאן) בתוסף BigStitcher, אולי בגלל שילוב של גרעינים רבים שלא מתגלים עמוק יותר בעובר במהלך העיבוד וגם בגלל מספר קטן יחסית של גרעינים שנמצאים בעובר כאשר מסתכלים מזוויות מסוימות (למשל כאשר מסתכלים על הגחון בשלבים אפיבוליים מאוחרים).

בפרוטוקול זה, מכיוון שמידע חרוזים מלמעלה או מתחת לדגימה משמש לרישום ואין צורך בהדמיה של חרוזים באותה תצוגה כמו הדמיה של הדגימה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה להדמיית אזורי עניין ספציפיים בלבד אך בהגדלה גבוהה מזוויות שונות במקום העובר כולו. יתר על כן, קל להתאים פרוטוקול זה להדמיית דגימות מרובות המוערמות אנכית בצינור באמצעות מידע חרוזים בין הדגימות לרישום.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין אינטרס מתחרה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר קאלידס קוהלה וצוותו על תחזוקת מתקן הדגים ול- KV Boby על תחזוקת מיקרוסקופ היריעה. SRN מכירה בתמיכה כספית מהמחלקה לאנרגיה אטומית (DAE), ממשלת הודו (מס' זיהוי פרויקט). RTI4003, DAE OM No. 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 מיום 11.02.2020), תוכנית קבוצת השותפים של אגודת מקס פלנק (M.PG. A MOZG0010) ומענק מחקר סטארט-אפ של מועצת המחקר למדע והנדסה (SRG/2023/001716).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז, טמפרטורת ג'ל נמוכה	סיגמא-אולדריץ'	A9414
סידן כלוריד דיהידראט	סיגמא-אולדריץ'	12022
FIJI			: ImageJ 1.54f
חרוזי לטקס, פוליסטירן שונה בקרבוקסילט, אדום ניאון, 0.5 μ m גודל חלקיקים ממוצע, מתלה מימי	Sigma-Aldrich	L3280
מגנזיום גופרתי heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 ערכת תמלול	ThermoFischer Scientific	AM1340	להעברה חוץ גופית של H2A-mדובדבן פלסמיד
אשלגן Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
אשלגן פוספט מונו-בסיסי	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE שרוול AWG 15L - 1.58 מ"מ קוטר פנימי x 0.15 מ"מ קיר +/- 0.05	חידושי Adtech בפלואורופלסטיקה	STW15	צינורות PTFE
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	S3014
נתרן פוספט דיבאסי	סיגמא-אולדריץ'	71640
מנקה אולטרסאונד	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 מערכת	Zeiss

גרסת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
Keller, P. J., et al. high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat Methods. 7 (8), 637-642 (2010).
Keller, P. J. Imaging morphogenesis: Technological advances and biological insights. Science. 340 (6137), 1234168(2013).
Schmid, B., et al. High-speed panoramic Light sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4 (1), 2207(2013).
Strnad, P., et al. Inverted Light sheet microscope for imaging mouse pre-implantation development. Nat Methods. 13 (2), 139-142 (2016).
McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview Light sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat Methods. 9 (7), 730-733 (2012).
Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Methods. 7 (6), 418-419 (2010).
Swoger, J., Verveer, P., Greger, K., Huisken, J., Stelzer, E. H. K. Multiview image fusion improves resolution in three-dimensional microscopy. Opt Express. 15 (13), 8029-8042 (2007).
Swoger, J., Huisken, J., Stelzer, E. H. Multiple imaging axis microscopy improves resolution for thick-sample applications. Opt Lett. 28 (18), 1654-1656 (2003).
Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119(2014).
Naganathan, S. R., Popović, M., Oates, A. C. Left-right symmetry of zebrafish embryos requires somite surface tension. Nature. 605 (7910), 516-521 (2022).
Shah, G., et al. Multi-scale imaging and analysis identify pan-embryo cell dynamics of germlayer formation in zebrafish. Nat Commun. 10 (1), 5753(2019).
Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Hörl, D., et al. BigStitcher: Reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nat Methods. 16 (9), 870-874 (2019).
Behrndt, M., et al. Forces driving epithelial spreading in zebrafish gastrulation. Science. 338 (6104), 257-260 (2012).
Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
Icha, J., et al. Using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development. J Vis Exp. (110), e53966(2016).
Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview Light sheet microscopy. Nat Methods. 9 (7), 755-763 (2012).
Aigouy, B., Prud'homme, B. Segmentation and quantitative analysis of epithelial tissues. Methods Mol Biol. 2540, 387-399 (2022).
Mancini, L., et al. Apical size and deltaA expression predict adult neural stem cell decisions along lineage progression. Science Adv. 9, 7519(2023).
Piscitello-Gomez, R., Mahmoud, A., Dye, N., Eaton, S. Sensitivity of the timing of Drosophila pupal wing morphogenesis to external perturbations. bioRxiv. , (2023).
Tsuboi, A., Fujimoto, K., Kondo, T. Spatiotemporal remodeling of extracellular matrix orients epithelial sheet folding. Science Adv. 9, 2154(2023).
Fu, Q., Martin, B. L., Matus, D. Q., Gao, L. Imaging multicellular specimens with real-time optimized tiling Light sheet selective plane illumination microscopy. Nat Commun. 7 (1), 11088(2016).
Chen, B. C., et al. Lattice Light sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998(2014).
York, H. M., et al. Deterministic early endosomal maturations emerge from a stochastic trigger-and-convert mechanism. Nat Commun. 14 (1), 4652(2023).
Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
Melançon, E., Liu, D. W. C., Westerfield, M., Eisen, J. S. Pathfinding by identified zebrafish motoneurons in the absence of muscle pioneers. J Neurosci. 17 (20), 7796(1997).
Rohde, L. A., et al. Cell-autonomous timing drives the vertebrate segmentation clock's wave pattern. eLife. , 13:RP93764 (2024).
Haynes, E. M., et al. KLC4 shapes axon arbors during development and mediates adult behavior. eLife. 11, e74270(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים