המחקר הנוכחי מציג פרוטוקולים להערכת המחויבות לגורל מוקדם של תאיT FH ספציפיים לווירוס ומניפולציה של ביטוי גנים בתאים אלה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי T מסייעים זקיקים (TFH) נתפסים כשושלת תאי CD4+ T עצמאית המסייעת לתאי B קוגניטיביים לייצר נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, ובכך לבסס חסינות הומורלית ארוכת טווח. במהלך זיהום ויראלי חריף, מחויבות הגורל של תאי TFH ספציפיים לווירוס נקבעת בשלב ההדבקה המוקדם, וחקירות של תאי TFH ממוינים מוקדם הן חיוניות להבנת חסינות הומורלית תלוית תאי T ואופטימיזציה של תכנון החיסון. במחקר, תוך שימוש במודל עכברי של זיהום בנגיף הלימפוציטיס החריף (LCMV) ועכבר TCR-transgenic SMARTA (SM) עם תאי CD4+ T המזהים באופן ספציפי אפיטופ גליקופרוטאין LCMV I-AbGP66-77, תיארנו נהלים לגישה למחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לווירוס בהתבסס על כתמי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, על ידי ניצול התמרה רטרו-ויראלית של תאי T מסוג SM CD4+ , ניתנות גם שיטות למניפולציה של ביטוי גנים בתאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם. לפיכך, שיטות אלה יסייעו במחקרים הבוחנים את המנגנונים העומדים בבסיס המחויבות המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף.
מבוא
במפגש עם פתוגנים או איומים שונים, תאי T נאיביים CD4+ מתאימים את התגובה החיסונית שלהם על ידי התמיינות לתת-קבוצות שונות של תאי T מסייעים (TH) עם פונקציות מיוחדות1. בתרחיש של זיהום ויראלי חריף, חלק גדול מתאי T נאיביים CD4+ מתמיינים לתאי T מסייעים פוליקולריים (TFH) המספקים עזרה לתאי B 2,3. בניגוד לתת-קבוצות אחרות של תאי CD4+ TH (למשל, תאי TH1, TH2, TH9 ותאי TH17), תאיT FH מבטאים רמה משמעותית של CXCR5, שהוא קולטן הכימוקין של תאי B המבייתים כימוקין CXCL13, מה שמאפשר לתאי
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בזני העכברים הבאים: עכבר C57BL/6J (B6) (שני המינים), בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם; CD45.1+SM TCR עכבר מהונדס (B6 CD45.1 × SM TCR מהונדס), שני המינים, בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם; ועכבר מהונדס CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgenic × CXCR5-GFP knock-in), שני המינים, בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם. המינים הטרנסגניים נוצרו בעקבות דו"חשפורסם בעבר 24. פרטי הריאגנטים, המאגרים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מאפיינים של תאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם במהלך זיהום LCMV חריף
כדי לחקור את מחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף, תאי SM CD4+ T קונגניים נאיביים המזהים באופן ספציפי אפיטופ LCMV GP I-AbGP66-77 הועברו באימוץ למושתלי CD45.2+ C57BL/6. למחרת, המושתלים האלה נדבקו דרך הווריד במינון גבוה של LCMV ארמסטרונג (איור 1A). ביום השלישי לאחר ההדבקה, טחול של מקבלי C57BL/6 נותח על ידי ציטומטריית זרימה, וה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המחקר בתחום תאי TFH הודגש מאז גילוי הפונקציה המיוחדת של תאיT FH בסיוע לתאי B. מחקרים מצטברים הצביעו על כך שהתמיינות תאי TFH היא תהליך רב-שלבי ורב-גורמי30, שבו המחויבות לגורל תאי TFH נקבעת בשלב המוקדם5. לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים העומדים בבסיס תאי TFH ממוינים מוקדם היא חיונית לביולוגיה של תאי TFH ולתכנון חיסונים רציונלי. כאן, סיפקנו שיטות לגשת למחויבות לגורל מוקדם של תאי TFH ספציפיים לווירוס ו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '32300785 ל- X.C.), התוכנית הלאומית לפוסט-דוקטורט בסין לכישרונות חדשניים (No. BX20230449 ל-X.C.), והפרויקט הלאומי למדע וטכנולוגיה (מס' 2021YFC2300602 ל-L.Y).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% טריפסין-EDTA | קורנינג | 25-052-CI | |
| 4% תמיסת תיקון פרפורמלדהיד, 4% PFA | Beyotime | P0099-500 מ"ל | |
| 70 μ מסננת תאים m | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 נגד עכבר TCR Vα 2 (שיבוט B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 דילול |
| Alexa Fluor 700 נגד עכבר CD45.1 (שיבוט A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 דילול |
| APC נגד עכבר CD25 (שיבוט PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 דילול |
| B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb / BoyJ) עכבר | מעבדת ג'קסון | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| ביוטין נגד עכבר F4/80 נוגדן (שיבוט BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 דילול |
| ביוטין חולדה נגד עכבר CD11c (שיבוט N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 דילול |
| ביוטין חולדה נגד עכבר CD19 (שיבוט 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 דילול |
| ביוטין חולדה נגד עכבר CD8a (שיבוט 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 דילול |
| ביוטין חולדה נגד עכבר NK-1.1 (שיבוט PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 דילול |
| ביוטין חולדה נגד עכבר TER-119/תאי אריתרואיד (שיבוט TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 דילול |
| אלבומין בסרום בקר, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (שיבוט 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 דילול |
| Brilliant Violet 605 נגד עכבר CD279 (PD-1) (שיבוט 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 דילול |
| C57BL/6J (B6) עכבר | מעבדת ג'קסון | 000664 | |
| CXCR5-GFP עכבר | מדווחבבית; קו העכבר הדפוק CXCR5-GFP נוצר על ידי הכנסת מבנה IRES-GFP לאחר מסגרת הקריאה הפתוחה של Cxcr5. | ||
| DMEM 10% בינוני | DMEM בינוני המכיל 10% FBS | ||
| DMEM בינוני | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSסרום | Biosciences | ||
| , FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (גרסה 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | הערכה מכילה שלושה ריאגנטים: א. תרכיז קיבוע/פרמביליזציה (4X); ב. מדלל קיבוע / פרמביליזציה; ג. מאגר פרמביליזציה. |
| נוגדן IgG נגד חולדות עיזים (H+L), | מעבדות וקטור | BA-9400-1.5 | 1:200 דילול |
| Invitrogen EVOS FL מערכת הדמיית תאים אוטומטיים | ThermoFisher מאגר | ||
| FACS המכיל 0.5% BSA ו-2mM EDTA | |||
| ערכת כתמי תאים מתים LIVE / DEAD הניתנת לתיקון קרוב ל- IR, לעירור של 633 או 635 ננומטר | Life Technologies | L10199 | דילול 1:200 |
| MigR1 | addgene | # 27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM בינוני | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | # 12371 | |
| PE נגד עכבר CD69 (שיבוט H1.2F3) | Biolegend | 104508 | דילול 1:200 |
| PE עכבר נגד Bcl-6 (שיבוט K112-91) | BD Biosciences | 561522 | דילול 1:50 |
| פוספט חוצץ מלח, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| חולדה מטוהרת נגד עכבר CXCR5 (שיבוט 2G8) | BD Biosciences | 551961 | דילול 1:50 |
| חולדה חד שבטית PerCP Anti-Mouse CD4 (שיבוט RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 דילול |
| עכבר רקומביננטי IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| מאגר ליזה של תאי דם אדומים | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 בינוני | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR עכבר טרנסגני | הקו הטרנסגני SM TCR במעבדה שלנו הוא מתנה מד"ר רפי אחמד (אוניברסיטת אמורי). בנוסף, ניתן להשיג קו עכבר זה גם ממעבדת ג'קסון (stain#: 030450). | ||
| מאגר | PBS המכיל 2% FBS ו-0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 דילול |
| TCF1/TCF7 (C63D9) ארנב mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | טכנולוגיית איתות תאים | 6444S | 1:400 דילול |
| מאגר | מאגר FACS המכיל 1% BSA ו-2% סרום | ||
| עכבר מגיב TransIT-293 | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
מקורות
- O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
