מאמר שיטה

גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66752

⸱

26 באפריל 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

המחקר הנוכחי מציג פרוטוקולים להערכת המחויבות לגורל מוקדם של תאיT FH ספציפיים לווירוס ומניפולציה של ביטוי גנים בתאים אלה.

תקציר

תאי T מסייעים זקיקים (TFH) נתפסים כשושלת תאי CD4+ T עצמאית המסייעת לתאי B קוגניטיביים לייצר נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, ובכך לבסס חסינות הומורלית ארוכת טווח. במהלך זיהום ויראלי חריף, מחויבות הגורל של תאי TFH ספציפיים לווירוס נקבעת בשלב ההדבקה המוקדם, וחקירות של תאי TFH ממוינים מוקדם הן חיוניות להבנת חסינות הומורלית תלוית תאי T ואופטימיזציה של תכנון החיסון. במחקר, תוך שימוש במודל עכברי של זיהום בנגיף הלימפוציטיס החריף (LCMV) ועכבר TCR-transgenic SMARTA (SM) עם תאי CD4+ T המזהים באופן ספציפי אפיטופ גליקופרוטאין LCMV I-AbGP66-77, תיארנו נהלים לגישה למחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לווירוס בהתבסס על כתמי ציטומטריית זרימה. יתר על כן, על ידי ניצול התמרה רטרו-ויראלית של תאי T מסוג SM CD4+ , ניתנות גם שיטות למניפולציה של ביטוי גנים בתאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם. לפיכך, שיטות אלה יסייעו במחקרים הבוחנים את המנגנונים העומדים בבסיס המחויבות המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף.

מבוא

במפגש עם פתוגנים או איומים שונים, תאי T נאיביים CD4+ מתאימים את התגובה החיסונית שלהם על ידי התמיינות לתת-קבוצות שונות של תאי T מסייעים (TH) עם פונקציות מיוחדות1. בתרחיש של זיהום ויראלי חריף, חלק גדול מתאי T נאיביים CD4+ מתמיינים לתאי T מסייעים פוליקולריים (TFH) המספקים עזרה לתאי B 2,3. בניגוד לתת-קבוצות אחרות של תאי CD4+ TH (למשל, תאי TH1, TH2, TH9 ותאי TH17), תאיT FH מבטאים רמה משמעותית של CXCR5, שהוא קולטן הכימוקין של תאי B המבייתים כימוקין CXCL13, מה שמאפשר לתאיT FH לנדוד לזקיקים של תאי B. בזקיקי תאי B, תאיT FH מסייעים לתאי B קוגניטיביים ליזום ולשמר תגובות של מרכז הנבט, ובכך מאפשרים ייצור מהיר של נוגדנים בעלי זיקה גבוהה וזיכרון הומורלי ארוך טווח 2,3.

עם זיהום ויראלי חריף, מחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לווירוס מתרחשת בתוך 72 שעות 4,5 ונשלטת על ידי לימפומה של תאי B מדכאי שעתוק -6 (Bcl-6)5,6,7,8, הפועלת כ"רגולטור הראשי" השולט בהחלטות גורל תאי TFH. מחסור ב-Bcl-6 מקהה באופן חמור את התמיינות תאי TFH, בעוד שביטוי חוץ רחמי של Bcl-6 מקדם באופן משמעותי מחויבות לגורל תאי TFH. בנוסף ל-Bcl-6, מולקולות רבות מעורבות בהנחיית מחויבות מוקדמת לגורל תאי TFH. גורמי שעתוק TCF-1 ו- LEF-1 יוזמים התמיינות תאי TFH באמצעות השראת Bcl-6 9,10,11. עיכוב Blimp1, הן על ידי Bcl-6 והן על ידי TCF-1, נדרש עבור התחייבות מוקדמת לגורל תאי TFH 11,12. STAT1 ו-STAT3 נדרשים גם עבור התמיינות מוקדמת של תאי TFH 13. חוץ מזה, שינויים אפיגנטיים על ידי היסטון methyltransferase EZH214,15 ו m6A methyltransferase METTL316 מסייעים לייצב תוכניות שעתוק תאי TFH (במיוחד Bcl6 ו Tcf7) ובכך ראשוני מוקדם TFH גורל הגורל. בעוד שהתקדמות, כולל המולקולות הנ"ל ואחרות, המסוכמות במקום אחר3, נעשו בהבנת תקנות השעתוק והאפיגנטיקה של מחויבות מוקדמת לגורל תאי TFH, מולקולות שלא היו ידועות קודם לכן נותרו ללמידה.

במודל העכבר של זיהום חריף של וירוס choriomeningitis לימפוציטית חריפה (LCMV), מועבר באופן מאומץ TCR-transgenic SMARTA (SM) CD4+ תאי T, אשר מזהים באופן ספציפי את אפיטופ הגליקופרוטאין LCMV I-AbGP66-77, עוברים התמיינות תאי TFH או TH1 במהלך זיהום ויראלי. דפוס התמיינות התפצלות TFH/TH1 תומך בקידום מודל זיהום SM/LCMV חריף בחקר הביולוגיה של תאי TFH ספציפיים לנגיף. ואכן, מודל זיהום SM/LCMV חריף נמצא בשימוש נרחב בתחום המחקר של תאי TFH ומילא תפקיד מכריע בתגליות אבני דרך בביולוגיה של תאי TFH. זה כולל את זיהוי Bcl-6 הנ"ל כגורם השעתוק המגדיר את השושלת של תאי TFH 5,6, כמו גם גורמי שעתוק חשובים אחרים (למשל, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 ו- Itch19) המנחים התמיינות תאי TFH, תקנות לאחר שעתוק ( לדוגמה, METTL316 ו- miR-17~9220) של התמיינות תאי TFH, זיכרון תאי TFH ופלסטיות 21,22, ואסטרטגיות חיסון רציונליות המכוונות לתאי TFH (למשל, סלניום23).

המחקר הנוכחי מתאר שיטות ניתנות לשחזור לגישה למחויבות לגורל מוקדם של תאי TFH ספציפיים לנגיף, כולל (1) הקמת מודל עכבר כימרה SM נגוע LCMV חריף המתאים לגישה לתאי TFH ממוינים מוקדמים, (2) ביצוע צביעות ציטומטריה של זרימה של מולקולות הקשורות לתאי TFH ממוינים מוקדם, ו-(3) ביצוע מניפולציה גנטית רטרו-ויראלית מבוססת וקטור ב- SM CD4+ תאי T. שיטות אלה יהיו שימושיות למחקרים החוקרים את המחויבות לגורל מוקדם של תאי TFH ספציפיים לנגיף.

פרוטוקול

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית הצבאית השלישית. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בזני העכברים הבאים: עכבר C57BL/6J (B6) (שני המינים), בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם; CD45.1+SM TCR עכבר מהונדס (B6 CD45.1 × SM TCR מהונדס), שני המינים, בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם; ועכבר מהונדס CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgenic × CXCR5-GFP knock-in), שני המינים, בגילאי 6 עד 8 שבועות, במשקל 25-30 גרם. המינים הטרנסגניים נוצרו בעקבות דו"חשפורסם בעבר 24. פרטי הריאגנטים, המאגרים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. קצירת תאי T CD45.1+ SM CD4+ + להעברה מאומצת

  1. המתת חסד (בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) את המספר הנדרש של עכברי CD45.1+ TCR-Transgenic SM בני 6 עד 8 שבועות24. בצע חתך של 1 אינץ 'בצד שמאל של דופן הצפק של העכברים המורדמים על ידי מספריים כירורגיים, לנתח את הטחול מן הצפק, ולקרוע את רקמת החיבור מאחורי הטחול25,26.
  2. הכניסו כל טחול למסננת תאים של 70 מיקרומטר בתוך צלחת פטרי (60 מ"מ × 15 מ"מ) וטחנו את הטחול עם 3 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים (RBC) באמצעות בוכנה מזרק 1 מ"ל.
    הערה: השתמש בצד העגול של בוכנה מזרק כדי לטחון את הטחול עד רק רקמת חיבור נשאר.
  3. הוסף 6 מ"ל של RPMI + 2% FBS (RPMI 2%) לכל צלחת כדי לדלל 3 מ"ל של חיץ ליזיס RBC. פיפטה התא מתלה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל מן המנה. שוטפים את הכלי בתוספת 3 מ"ל של 2% סל"ד ומעבירים לאותו צינור חרוט.
  4. צנטריפוגה את מתלי התא ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation. השהה מחדש את התאים עם מאגר בידוד והתאם את צפיפות התא ל~ 1 × 108 תאים למ"ל. מניחים את הצינור על קרח.
  5. הכינו קוקטייל נוגדנים 1x biotinylated נגד CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c ו- Ter119 במאגר בידוד להעשרת תאי CD4+ T.
    הערה: הוסף נוגדנים ביוטינילציה למאגר הבידוד בדילול המצוין כמצוין בטבלת החומרים. שמור על נפח קוקטייל הנוגדנים זהה לזה של מאגר הבידוד בשלב 1.4.
  6. צנטריפוגה את מתלי התא ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation.
  7. גלולת תא השעיה עם קוקטייל נוגדנים 1x biotinylated מצוין בצינור חרוט.
  8. הניחו את הצינור החרוטי על קרח בשייקר למשך 30 דקות ב-45 סל"ד.
  9. במהלך הדגירה עם נוגדנים biotinylated, להכין את הנפח הנדרש של חרוזים מצופים streptavidin, על פי הוראות היצרן.
    הערה: סך כל הטחול מעכבר נאיבי אחד זקוק ל-200 מיקרוליטר של חרוזים מצופים סטרפטווידין.
  10. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם עם 8-10 מ"ל של חיץ בידוד במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
  11. גלולת תא להשהות עם חרוזים מצופים סטרפטווידין מוכן.
  12. הניחו את הצינור על קרח בשייקר למשך 40 דקות ב-45 סל"ד.
  13. לאחר מכן, הניחו את הצינור על מעמד מגנטי למשך 3-4 דקות עד שכל החרוזים מורכבים בצד המגנטי.
  14. בזהירות לאסוף את supernatant ולהעביר אותו לתוך צינור חרוטי חדש 15 מ"ל.
  15. צנטריפוגה את מתלי התא ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation.
    הערה: קיימות ערכות מסחריות אחרות להעשרת תאי CD4+ T, אשר יכולות לשמש כתחליפים להליך העשרת תאי CD4+ T המתואר בשלבים 1.5-1.15.
  16. להשעות מחדש את גלולת התא עם 2-3 מ"ל של 2% סל"ד. שאפו 50 μL של תרחיף תאים לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה של יעילות העשרת תאי CD4+ T (CD4 ו-Vα2) וכדאיות התא.
  17. צנטריפוגה את מתלי התא ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation. השהה מחדש את גלולת התא עם RPMI והתאם את צפיפות התא ל- 1 × 107 תאי CD4 + Vα2+ SM למ"ל. הניחו את הצינור על קרח והתקדמו להעברת תאים מאומצת בשלב הבא.

2. ביסוס מודל עכבר SM כימרה נגוע LCMV חריף לגישה לתאי SM TFH ממוינים מוקדמים

  1. חממו את העכברים מושתלי C57BL/6 בני 6 עד 8 שבועות עם מנורת אינפרא אדום כדי להרחיב את וריד הזנב להזרקה תוך ורידית.
  2. שאפו 100 μL של תרחיף תאים המכיל 1 × 106 תאי SM שהוכנו בשלב 1.17 עם מזרק אינסולין.
    הערה: נפח ההזרקה צריך להשתנות על ידי כל חוקר ולא יעלה על נפח ההזרקה המרבי המותר על פי החוק המוסדי והמקומי.
  3. החזיקו את העכברים במקומם בעזרת קיבוע עכבר, יישרו את הזנב ונגבו את הזנב עם 75% אתנול באמצעות כדור צמר גפן כדי להפוך את וריד הזנב לגלוי.
  4. הכנס את מחט מזרק האינסולין לווריד הזנב והזריק את מתלי התאים בצורה חלקה ואיטית. לאחר מכן, הניחו לעכברים המקבלים לנוח למשך הלילה.
  5. למחרת, לדלל את מלאי וירוס ארמסטרונג LCMV עם מדיום RPMI כדי להשיג ריכוז סופי של 1 × 107 יחידות יוצרות פלאק / מ"ל.
  6. הזריקו 100 μL של תמיסת LCMV Armstrong מדוללת (המכילה 1 × 106 יחידות יוצרות פלאק) לווריד הזנב של העכברים המקבלים.
    הערה: כל חוקר צריך להיות זהיר לגבי האם הטיטר הזיהומי המומלץ מותר על פי החוק המוסדי והמקומי.

3. כתמי ציטומטריה של זרימה של תאי SM TFH ממוינים מוקדמים

  1. להקריב את העכברים (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) משלב 2.6 ביום השלישי לאחר ההדבקה, ולעבד לימפוציטים מטחול כמתואר בשלב 1. התאם את צפיפות התא לכ- 2 × 107 תאים למ"ל.
  2. טען 50 μL של מתלי תאים (~ 1 × 10,6 תאים) לצלחת עגולה תחתית של 96 בארות וממלא עם 150 μL של חיץ צביעה לכל באר. שומרים את הצלחת על קרח.
  3. הכינו את קוקטייל הנוגדנים CXCR5 נגד עכברים מטוהרים (כלומר, נוגדן ראשוני CXCR5) בדילול של 1:50 ב-50 מיקרוליטר של חיץ צביעת תאי TFH עבור כל דגימה בצינור. מערבלים היטב את הצינור וצנטריפוגות אותו ב 15,000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C כדי לצבור את החלקיקים. שמור את הצינור על קרח.
  4. צנטריפוגה את הצלחת 96 בארות ב 800 × גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  5. חזור על שלב 3.4 והשהה מחדש את התאים עם 50 של μL הנוגדן העיקרי CXCR5 לכל באר. מערבבים היטב על ידי פיטינג למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך שעה אחת.
  6. הכינו את קוקטייל הנוגדנים נגד חולדות מסוג ביוטינילציה (כלומר, נוגדן משני CXCR5) בדילול של 1:200 ב-50 מיקרוליטר של חיץ צביעת תאי TFH עבור כל דגימה בצינור חדש. מערבלים את הצינור וצנטריפוגות אותו ב 15,000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C כדי לצבור את החלקיקים. שמור את הצינור על קרח.
  7. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  8. חזור על שלב 3.7 פעמיים ושמור את הצלחת על קרח.
  9. הוסף 50 μL של נוגדן משני CXCR5 לכל באר לצלחת. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך 30 דקות.
  10. הכינו סטרפטאבידין מצומד פלואורסצנטי (כלומר, נוגדן שלישוני CXCR5) בדילול של 1:200 ב-50 מיקרוליטר של חיץ צביעת תאי TFH עבור כל דגימה. בינתיים, הוסף נוגדנים אחרים כנגד סמנים פני השטח (למשל, CD45.1, CD4, PD-1, CD25 ומולקולות מעוניינות) ואת כתם התא המת יחד עם נוגדן שלישוני CXCR5.
  11. מערבלים את הצינור וצנטריפוגות אותו ב 15,000 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C כדי לצבור את החלקיקים. שמור את הצינור על קרח.
  12. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  13. חזור על שלב 3.12 פעמיים ושמור את הצלחת על קרח.
  14. מוסיפים 50 μL של קוקטייל נוגדנים שלישוני CXCR5 לכל באר לצלחת. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך 30 דקות בחושך.
  15. הכינו 200 μL של חיץ קיבוע/חלחול לכל באר בהתאם להוראות היצרן.
  16. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  17. חזור על שלב 3.16 פעמיים ושמור את הצלחת על קרח בחושך.
  18. הוסף 200 μL של חיץ קיבוע/חלחול לכל באר. מערבבים היטב על ידי פיטום למעלה ולמטה ודגירת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות (בחושך).
    הערה: הכן את מאגר החדירות (1x) בהתאם להוראות היצרן.
  19. הכינו את קוקטייל הנוגדנים כנגד גורמי שעתוק, כולל Bcl-6, TCF-1, T-bet ומולקולות מעוניינות, ב-50 מיקרוליטר של חיץ חדירה (1x) לכל באר בצינור חדש.
  20. מערבלים את הצינור והצנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C כדי לצבור את החלקיקים.
  21. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 50 μL של קוקטייל נוגדנים גורם שעתוק לכל באר. מערבבים היטב ודגורים על קרח במשך 30 דקות בחושך.
  22. צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant, מערבלים לזמן קצר את הצלחת על ידי decantation, ולהוסיף 200 μL של חיץ permeabilization (1x) לכל באר.
  23. חזור על שלב 3.22.
  24. מוסיפים 200 μL של חיץ צביעה לכל באר, צנטריפוגות את הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C, להשליך את supernatant על ידי decantation, ולסובב לזמן קצר את הצלחת.
  25. השהה מחדש את גלולת התא בכל באר עם 200 מיקרוליטר של חיץ צביעה והעבר את התאים לצינורות ציטומטריית זרימה לניתוח ציטומטר זרימה מיידי.
    הערה: לחלופין, ניתן לזהות את הדגימות תוך 3 ימים בתנאים של הוספת 200 μl של 2% PFA לכל צינור ולהיות מאוחסן ב 4 ° C בחושך.

4. ייצור רטרו-וירוס

  1. טפחו את תאי 293T (עם פחות מעשרה מעברים) עם DMEM 10% בינוני בכלי תרבית של 10 ס"מ למשך 2-3 מעברים.
  2. כאשר התאים הגיעו למפגש של 90%, השליכו את המדיום הישן ושטפו בעדינות את התאים עם PBS פעמיים, ולאחר מכן טריפסיניזציה קצרה של תאי 293T באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
  3. עצור את תהליך העיכול על ידי השעיית תאים ב 2 מ"ל של מדיום 10% DMEM שחומם מראש, העברתם לצינור חרוטי 15 מ"ל, וצנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא על ידי פיפטציה מעלה ומטה של תרבית מדיה עם 2 מ"ל של 10% DMEM שחומם מראש.
  5. לכמת את מספר התאים ואת הצלחת 5 × 105 תאים ב 2.5 מ"ל 10% DMEM בינוני לכל באר בצלחת 6 באר.
    הערה: מערבלים את הכלי בעדינות כדי לאפשר לתאי 293T להתפזר באופן שווה ברחבי הצלחת.
  6. כאשר מפגש התאים 293T עולה על 80%, הכינו את ריאגנטי הטרנספקציה כמתואר בשלבים 4.7 עד 4.9.
  7. עבור כל באר של צלחת 6 בארות, להוסיף 250 μL של מדיום Opti-MEM שחומם מראש לתוך צינור סטרילי 1.5 מ"ל. לאחר מכן, הוסף 3 מיקרוגרם של DNA פלסמיד (המכיל 2 מיקרוגרם של וקטור רטרו-ויראלי ו-1 מיקרוגרם של pCL-Eco) למדיום Opti-MEM, ולאחר מכן פיפטינג עדין למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב מלא.
    הערה: הווקטורים הרטרו-ויראליים המשמשים כדוגמאות במחקר זה הם MigR1 ווקטור MigR1 שונה עם אזור Bcl6 CDS במעלה הזרם של IRES-GFP (MigR1-Bcl6).
  8. לאחר מכן, הוסף 7.5 μL של מגיב טרנספקציה שחומם מראש (מתקבל מסחרית) לתערובת ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  9. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  10. יש לפזר את התערובת לאזורים נפרדים של 293T תאים שגודלו בתרבית היטב, ולאחר מכן לנדנד בעדינות את כלי התרבית בתנועה קדימה ואחורה ומצד לצד כדי להבטיח פיזור אחיד של התערובת.
  11. לדגור על תאי 293T במשך 72 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO2.
  12. זהה את התג של הווקטור הרטרו-ויראלי כפרוקסי ליעילות טרנספקציה בתאי 293T הנגועים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ציטומטריית זרימה.
    הערה: לדוגמה, אישרנו את האות הפלואורסצנטי GFP בחלק משמעותי של תאי 293T נגועים בווקטור MigR1, דבר המצביע על טרנספקציה באיכות גבוהה.
  13. אספו תרבית תאים בינונית וצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,500 × למשך 10 דקות ב-4°C כדי לסלק פסולת תאית. יש לאסוף בזהירות את הסופרנאטנט המתקבל ולאחסן אותו לשימור לטווח ארוך ב -80 ° C או להישמר באופן זמני ב -4 ° C.

5. הפעלת In vivo , התמרה רטרו-וירוס והעברה מאמצת של תאי SM CD4+ T

  1. הזריקו עכבר CD45.1+ SM אחד (בגיל 6 עד 8 שבועות) תוך ורידי עם 200 מיקרוגרם של LCMV GP61-77 פפטיד11,14 בנפח של 100 μL של מדיום RPMI.
    הערה: נפח ההזרקה צריך להשתנות על ידי כל חוקר ולא יעלה על נפח ההזרקה המרבי המותר על פי המוסד והחוק המקומי.
  2. יש להרדים את עכבר ה-SM לאחר 16-18 שעות לאחר הזרקת פפטיד (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות). לרכוש את הטחול בעקבות ההליכים הנ"ל בשלב 1.
    הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בשיטת גירוי27,28 נגד CD3/anti-CD28 במבחנה כדי להפעיל תאי SM CD4+ T במקום גירוי פפטידי in vivo המתואר בשלבים 5.1 ו-5.2.
  3. להשעות את splenocytes עם 2% RPMI ולהתאים את צפיפות התא כ 1 × 108 תאים לכל מ"ל בצינור חרוטי 15 מ"ל. שמור את הצינור על קרח.
  4. יש לפזר 50 μL של תרחיף תאים לתוך צלחת עגולה בעלת תחתית של 96 בארות ולהשלים עם 150 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  5. צנטריפוגות את הצלחת 96 בארות ב 800 × גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C כדי pellet את התאים, בזהירות להסיר את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ מכתים לכל באר.
  6. חזור על שלב 5.5 והשהה מחדש את התאים עם 50 μL של קוקטייל נוגדנים משטח, כולל CD4, CD25 ו- CD69, כדי לזהות את מצב ההפעלה של תאי SM CD4+ T. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך 30 דקות בחושך.
  7. מלא כל באר עם חיץ צביעה ל 200 μL, ואחריו צנטריפוגה של הצלחת ב 800 × גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקונציה וערברו לזמן קצר את הצלחת.
  8. חזור על שלב 5.7 פעמיים.
  9. להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של חיץ צביעה ולהעביר אותם לתוך ציטומטריה זרימה ציטומטריה.
  10. נתח את התאים המוכתמים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים עם ציטומטריית זרימה כדי להעריך את מצב ההפעלה של תאי SM CD4+ T.
    הערה: תאי SM CD4+ T מופעלים הציגו ביטויי CD25 ו- CD69 בשפע בהשוואה לתאים נאיביים, ובכך אפשרו הליכי התמרה עוקבים.
  11. הוסף 1 × 106 תאי SM CD4+ T (משלב 5.3) לכל באר לתוך צלחת 24 באר. סובב תאים כלפי מטה ב 800 × גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C, ולאחר מכן בזהירות להסיר את המדיום על ידי decantation.
  12. הוסף 1 מ"ל של מדיום רטרווירוס כמתואר בשלב 4.13 ו 8 מיקרוגרם של פוליברן לכל באר.
  13. ספין-התממר את התאים ב 800 × גרם במשך 2 שעות ב 37 ° C.
  14. יש להשליך בזהירות את מדיום הרטרו-וירוס על ידי פיפטינג ולהוסיף 1 מ"ל של 10% סל"ד שחומם מראש בתוספת 10 ננוגרם/מ"ל מורין רקומביננטי IL-2 לכל באר.
  15. לדגור על התאים במשך 48 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO2.
  16. העבירו את תרחיף התאים לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל וסובבו את התאים בטמפרטורה של 800 × למשך 6 דקות ב-4°C.
  17. הסר את supernatant על ידי decantation ו resuspend את התאים עם נפח מתאים של 2% RPMI כדי להפוך צפיפות תאים של 1 × 108 תאים לכל מ"ל בצינור חרוטי 15 מ"ל. שמור את הצינור על קרח.
  18. יש לפזר 50 μL של תרחיף תאים לתוך צלחת עגולה בעלת תחתית של 96 בארות ולהשלים עם 150 μL של חיץ צביעה לכל באר.
  19. צנטריפוגות את הצלחת 96 בארות ב 800 × גרם במשך 1 דקות ב 4 ° C כדי pellet את התאים, בזהירות להסיר את supernatant על ידי decantation, מערבל לזמן קצר את הצלחת, ולהוסיף 200 μL של חיץ מכתים לכל באר.
  20. חזור על שלב 5.19 והשהה מחדש את התאים עם 50 μL של קוקטייל נוגדנים משטח, כולל CD4, Vα2 ונוגדן הקשור לתג וקטורי. מערבבים היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודגרים על קרח במשך 30 דקות בחושך.
  21. ממלאים כל באר בחיץ צביעה ל -200 μL, ולאחר מכן צנטריפוגה של הצלחת ב 800 × גרם למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנאטנט על ידי דקונציה וערברו לזמן קצר את הצלחת.
  22. חזור על שלב 5.21 פעמיים.
  23. להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של חיץ צביעה ולהעביר אותם לתוך ציטומטריה זרימה ציטומטריה.
  24. נתח את התאים המוכתמים בנוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים עם ציטומטריית זרימה כדי להעריך את יעילות ההעברה בתאי SM CD4+ T.
    הערה: תאי SM CD4+ T שהותמרו ביעילות הציגו ביטוי גבוה של התג של רטרו-וירוס, כגון GFP, במחקר.
  25. צנטריפוגה את מתלי התא משלב 5.17 ב 800 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant על ידי decantation. השהה מחדש את גלולת התא עם RPMI והתאם את צפיפות התא ל- 1 × 107 CD4 + Vα2+ תאי SM / מ"ל.
  26. העברה מאומצת של 1 × 106 תאי CD45.1+ SM CD4+ T לכל עכבר מקבל C57BL/6 (בגיל 6 עד 8 שבועות) על ידי הזרקה תוך ורידית של 100 μL של תרחיף תאים בשלב 5.25.
  27. למחרת, הדביקו עכברים מושתלי C57BL/6 ב-1 × 106 יחידות יוצרות פלאק LCMV ארמסטרונג באמצעות הזרקה תוך ורידית.

6. ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי SM TFH המומרים רטרו-וירוס בשלב מוקדם של זיהום LCMV חריף

  1. רכשו את הטחול מעכברי C57BL/6 משלב 5.25 ביום השלישי לאחר ההדבקה.
  2. בצע צביעת ציטומטריה של זרימה של סמני פני שטח, כולל CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 ומולקולות מעוניינות, בטחול כמתואר בשלב 3.
  3. לזיהוי גורמי שעתוק בתאי SM CD4+ T המומרים ברטרו-וירוס המתויג על ידי חלבונים פלואורסצנטיים, יש להוסיף 200 μL של 2% PFA לכל באר ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בחושך.
  4. ביצוע קיבוע/חלחול, צביעת ציטומטריית זרימה של גורמי השעתוק המעוניינים, וביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה כמתואר בשלב 3.

תוצאות

מאפיינים של תאי TFH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם במהלך זיהום LCMV חריף
כדי לחקור את מחויבות הגורל המוקדמת של תאי TFH ספציפיים לנגיף, תאי SM CD4+ T קונגניים נאיביים המזהים באופן ספציפי אפיטופ LCMV GP I-AbGP66-77 הועברו באימוץ למושתלי CD45.2+ C57BL/6. למחרת, המושתלים האלה נדבקו דרך הווריד במינון גבוה של LCMV ארמסטרונג (איור 1A). ביום השלישי לאחר ההדבקה, טחול של מקבלי C57BL/6 נותח על ידי ציטומטריית זרימה, והתוצאות הצביעו על כמות גדולה של תאי CD45.1+ SM CD4+ T מועברים (~10% מכלל תאי CD4+ T) (איור 1B), אשר סיפקו מספר מספיק של תאי CD4+ T ספציפיים לווירוס להמשך חקירה. ניתוחים נוספים של תאי SM CD4+ T שהועברו הראו ביטוי משותף של CXCR5 ו-Bcl-6/TCF-1 וביטוי הדדי של CXCR5 ו-CD25/T-bet, ובכך הגדירו שושלות TFH (CXCR5+Bcl-6+ או CXCR5+TCF-1+) ו-TH1 (CXCR5-CD25+ או CXCR5-T-bet+) (איור 1C). כדי להעריך את הספציפיות והרגישות של צביעת נוגדנים CXCR5 שהוצגו במחקר, חצינו עוד יותר את קו העכבר CD45.1+ SM שהוזכר לעיל עם קו העכבר CXCR5-GFP, שנוצר על ידי החדרת מבנה IRES-GFP לאחר מסגרת הקריאה הפתוחה של Cxcr529. לאחר מכן, תאי SM של כתב CD45.1+ CXCR5-GFP הועברו למושתלי C57BL/6. מושתלים אלה נדבקו ב- LCMV ארמסטרונג, והטחול שלהם נותח ביום השלישי לאחר ההדבקה. ואכן, האות הפלואורסצנטי של שיטת צביעת הנוגדנים CXCR5 במחקר חפף היטב עם אות GFP בכתב CXCR5-GFP מועבר29 תאי SM CD4+ T ביום השלישי לאחר ההדבקה (איור 1D), מה שמצביע על הספציפיות הגבוהה של שיטת צביעת הנוגדנים CXCR5 בת שלושת השלבים.

ביטוי יתר Bcl-6 מבוסס רטרווירוס בתאי T מסוג SM CD4+
Bcl-6 היא אחת המולקולות החשובות ביותר בטיפוח התמיינות תאי TFH 6,7,8. כדי לוודא את אמינות הפרוטוקול הנוכחי בגישה לתאיT FH ממוינים מוקדם, תאי CD45.1+ SM CD4+ T הופעלו והומרו עם רטרו-וירוס סופרנאטנט מתאי 293T בעלי ביטוי יתר של פלסמיד MigR1 או MigR1-Bcl6 (איור 2 ואיור 3A). תאי SM CD4+ T מותמרים רטרו-וירוס הועברו לאחר מכן למקבלי C57BL/6, שלאחר מכן נדבקו ב-LCMV Armstrong (איור 3B). ביום השלישי לאחר ההדבקה, מצאנו ביפורקציה מאוזנת של תאי TFH ו-TH1 בתאי MigR1-SM CD4+ T, בעוד התמיינות דומיננטית של תאי TFH מכוונת בתאי MigR1-Bcl6-SM CD4+ T (איור 3C). באופן עקבי, רמת הביטוי Bcl-6 השתפרה בתאי MigR1-Bcl6-SM CD4+ T בהשוואה לזו שבתאי MigR1-SM CD4+ T (איור 3D). לכן, הפנוטיפ שגרם ל-Bcl-6 התמיינות תאי TFH 6 המונעת על ידי ביטוי חוץ-רחמי שוחזר בעדינות בעקבות הפרוטוקול הנוכחי.

figure-results-1
איור 1: ניתוחי ציטומטריית זרימה של מחויבות גורלית מוקדמת של תאי SM TFH במהלך זיהום ארמסטרונג LCMV. (A) תכנון ניסויי. תאי T ספלניים CD4+ נקצרו מעכברי CD45.1+ SM ולאחר מכן הועברו באופן מאומץ למושתלי C57BL/6 (CD45.2+). למחרת, מושתלים אלה נדבקו ב- LCMV ארמסטרונג. ביום השלישי לאחר ההדבקה, תאי CD45.1+ SM שהועברו מהטחול של המושתלים נותחו על ידי ציטומטריית זרימה. (B) נתוני ציטומטריית זרימה מייצגים המציגים את אסטרטגיית ה- gating של תאי CD45.1+ SM CD4+ T מועברים מהטחול של הנמענים ביום 3 לאחר זיהום LCMV ארמסטרונג. (C) נתוני ציטומטריית זרימה מייצגים המראים צביעות משותפות של CXCR5 ומולקולות אחרות הקשורות לתאי TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 ו-T-bet) בתאי SM CD45.1+ מועברים מטחול הנמענים ביום 3-לאחר זיהום LCMV ארמסטרונג. (D) נתוני ציטומטריית זרימה מייצגים המראים כתמים משותפים של נוגדן מצומד פלואורסצנטי כנגד אות CXCR5 ו- GFP בתאי SM מועברים CD45.1+ CXCR5-GFP מכתבי מטחול של מושתלים ביום 3 לאחר זיהום LCMV ארמסטרונג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: התמרה רטרו-ויראלית בתאי T מסוג SM CD4+ . (A) תרשים סכמטי של ייצור רטרו-וירוס והתמרה רטרו-ויראלית בתאי SM CD4+ T. לצורך ייצור רטרו-וירוס, 293T תאים שנזרעו בצלחת בעלת 6 בארות הודבקו בפלסמידים של DNA מטרה כאשר צפיפות התאים מגיעה למפגש של ≥80%. לאחר מכן, supernatant תרבית תאים המכיל רטרו-וירוסים נאסף 72 שעות לאחר transfection ומיד בשימוש או מאוחסן ב -80 ° C. עבור התמרה רטרו-ויראלית בתאי SM CD4+ T, עכבר CD45.1+ SM הוזרק תוך ורידי עם 200 מיקרוגרם של פפטיד LCMV GP61-77 . לאחר מכן, הטחול נותח מעכבר SM 16-18 שעות לאחר הזרקת פפטידים, וזוהה מצב ההפעלה של תאי CD4+ T טחוליים. תאי SM CD4+ T מופעלים הומרו עם סופרנאטנט תרבית המכיל רטרו-וירוסים וגודלו בתרבית במבחנה במשך 48 שעות לפני הגישה ליעילות הטרנסדוקציה. (B) הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית של GFP בתאי פלסמיד 293T נגועים בדנ"א. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. (C) ניתוח ציטומטריית זרימה של רמות ביטוי CD25 ו- CD69 בתאי T נאיביים של CD4+ ספלניים מעכבר נאיבי (נאיבי, משמאל) או תאי SM CD4+ T ספלניים מעכבר SM GP61-77 מוזרק פפטיד עכבר SM (מופעל, מימין). (D) ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי GFP בתאי SM CD4+ T מותמרים רטרו-וירוס (מותמרים, משמאל) או תאי SM CD4+ T שאינם מומרים רטרו-וירוס (לא מותמרים, משמאל). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: השפעות של ביטוי יתר של Bcl-6 במחויבות לגורל תא SM TFH . (A) מפות ליניאריות של עמוד השדרה הרטרו-ויראלי של MigR1 (פאנל למעלה) ווקטור MigR1 שונה עם אזור Bcl6 CDS במעלה הזרם של IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (לוח תחתון). (B) תכנון ניסויי. תאי T מסוג SM CD4+ עם התמרת MigR1 או MigR1-Bcl6 הועברו באופן מאומץ למושתלי C57BL/6 (CD45.2+) יום אחד לפני LCMV ארמסטרונג. ביום השלישי לאחר ההדבקה, תאי CD45.1+ SM CD4+ T שהועברו מהטחול של המושתלים נותחו על ידי ציטומטריית זרימה. (C) ניתוח ציטומטריית זרימה של CXCR5 ו-CD25 בתאי GFP+ CD4+ T מותמרים של MigR1 או MigR1-Bcl6. המספרים הסמוכים לשער מציינים את התדרים של תאי TFH בתאי T מסוג SM CD4+ T. (D) ניתוח ציטומטריית זרימה של רמת ביטוי Bcl-6 בתאי SM CD4+ T מותמרים של MigR1 או MigR1-Bcl6. MFI, עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

המחקר בתחום תאי TFH הודגש מאז גילוי הפונקציה המיוחדת של תאיT FH בסיוע לתאי B. מחקרים מצטברים הצביעו על כך שהתמיינות תאי TFH היא תהליך רב-שלבי ורב-גורמי30, שבו המחויבות לגורל תאי TFH נקבעת בשלב המוקדם5. לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים העומדים בבסיס תאי TFH ממוינים מוקדם היא חיונית לביולוגיה של תאי TFH ולתכנון חיסונים רציונלי. כאן, סיפקנו שיטות לגשת למחויבות לגורל מוקדם של תאי TFH ספציפיים לווירוס ולתפעל ביטוי גנים בתאי TFH ממוינים מוקדמים על ידי ניצול מודל הזיהום הנגיפי LCMV Armstrong, עכבר SM מהונדס TCR והתמרה בתיווך רטרו-וירוס.

קולטן הכימוקין CXCR5 הוא סמן פני שטח חשוב המבדיל תאי TFH מתת-קבוצות אחרות של תאי CD4+ TH 6,7,8,31, ובכך מחייב את שיטת הצביעה CXCR5 של ספציפיות גבוהה ורגישות במחקר תאי T FH. במחקר הודגמה שיטת צביעה תלת-שלבית של סטרפטווידין-ביוטין CXCR5 בזיהוי תת-קבוצה של תאי TFH (איור 1C). אף על פי שאובדן ספציפיות הוא בעיה דביקה אחת עבור גישות צביעת נוגדנים של שניים או שלושה סטרפטוקוקוס בעלי רגישות גבוהה, נמצא כי האות הפלואורסצנטי על ידי צביעת נוגדנים CXCR5 בשלושה שלבים חפף כמעט לחלוטין עם אות GFP בתאי CXCR5-GFP29 SM CD4+ T ביום השלישי לאחר ההדבקה (איור 1D), מה שמרמז על השגת ספציפיות ורגישות על ידי שיטת צביעת נוגדנים CXCR5 בת שלושה שלבים. ואכן, אסטרטגיית צביעת CXCR5 תלת-סטרפטוקוקוס זו נוסתה ואמינה וסייעה לחוקרים לחקור טוב יותר את הביולוגיה של תאי TFH 11,14,15,21 כמו גם סוגי תאי T אחרים המבטאים CXCR5 29,32.

עם הדבקה וחיסון, מחויבות הגורל של תאי TFH מעוצבת בדרך כלל על ידי התמיינות מפוצלת של תאי T נאיביים CD4+ לתאי TFH או תאי T H שאינם TFH משפיעים 2,3,30. מחקר זה הראה את הביפורקציה המאוזנת של תאי TFH ו- TH1 בתאי SM CD4+ T שהועברו. יתר על כן, תאי SM CD4+ T מועברים אלה הם בכמות תאים נאותה בשלב ההדבקה המוקדם, ובכך פועלים כמודל מתאים לחקר התמיינות תאי TFH. אין ספק, ביטוי חוץ רחמי בתיווך רטרו-וירוס Bcl-6 בתאי SM CD4+ T שהועברו היה מוטה מאוד לכיוון התמיינות תאי TFH בהשוואה לזה שבתאי SM CD4+ T (86.6% לעומת 53.8%) (איור 3C), אשר מיושר עם דוח קודם6 ומוכיח עוד יותר את הדיוק של הפרוטוקולים המתוארים במחקר. לחלופין, ניתן ליישם את הפרוטוקולים הנ"ל גם על הפלות בתיווך רטרו-וירוס של גנים מעוניינים (למשל, bcl6, Tcf7) בתאי SM CD4+ T11 שהופעלו מוקדם (הנתונים אינם מוצגים).

מגבלה אחת בפרוטוקול היא בעיית העיתוי (יותר משעתיים בסך הכל) והתהליך הרב-שלבי של שיטת הצביעה CXCR5 בת שלושת השלבים. לחלופין, שיטות צביעה שלשלב אחד 18,33 או שני שלבים 4,9,34 CXCR5 יושמו גם במחקר תאי TFH. השוואה של הספציפיות/רגישות של שיטות צביעה CXCR5 אלה מתבקשת.

לסיכום, המחקר הנוכחי סיפק פרוטוקולים לגישה לתאיT FH ספציפיים לווירוס ממוינים מוקדם ולחקור גנים מעוניינים שעשויים לווסת את התמיינות תאי TFH . פרוטוקולים אלה יתדלקו את החקירות של מחויבות מוקדמת לגורל תאי TFH .

גילויים

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '32300785 ל- X.C.), התוכנית הלאומית לפוסט-דוקטורט בסין לכישרונות חדשניים (No. BX20230449 ל-X.C.), והפרויקט הלאומי למדע וטכנולוגיה (מס' 2021YFC2300602 ל-L.Y).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTAקורנינג25-052-CI
4% תמיסת תיקון פרפורמלדהיד, 4% PFABeyotimeP0099-500 מ"ל
70 μ מסננת תאים mMerckCLS431751
Alexa Fluor 647 נגד עכבר TCR Vα 2 (שיבוט B20.1)Biolegend1278121:200 דילול
Alexa Fluor 700 נגד עכבר CD45.1 (שיבוט A20)Biolegend1107241:200 דילול
APC נגד עכבר CD25 (שיבוט PC61)Biolegend1019101:200 דילול
B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb / BoyJ) עכברמעבדת ג'קסון002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
ביוטין נגד עכבר F4/80 נוגדן (שיבוט BM8)Biolegend1231061:200 דילול
ביוטין חולדה נגד עכבר CD11c (שיבוט N418)Biolegend1173041:200 דילול
ביוטין חולדה נגד עכבר CD19 (שיבוט 6D5)Biolegend1155041:200 דילול
ביוטין חולדה נגד עכבר CD8a (שיבוט 53-6.7)Biolegend1007041:200 דילול
ביוטין חולדה נגד עכבר NK-1.1 (שיבוט PK136)Biolegend1087041:200 דילול
ביוטין חולדה נגד עכבר TER-119/תאי אריתרואיד (שיבוט TER-119)Biolegend1162041:200 דילול
אלבומין בסרום בקר, BSASigmaA7906
Brilliant Violet 421 anti-T-bet (שיבוט 4B10)Biolegend6448161:100 דילול
Brilliant Violet 605 נגד עכבר CD279 (PD-1) (שיבוט 29F.1A12)Biolegend1352201:200 דילול
C57BL/6J (B6) עכברמעבדת ג'קסון000664
CXCR5-GFP עכברמדווחבבית; קו העכבר הדפוק CXCR5-GFP נוצר על ידי הכנסת מבנה IRES-GFP לאחר מסגרת הקריאה הפתוחה של Cxcr5.
DMEM 10% בינוניDMEM בינוני המכיל 10% FBS
DMEM בינוניGibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSסרוםBiosciences
, FBSSigmaF8318
FlowJo (גרסה 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer SetInvitrogen00-5523-00הערכה מכילה שלושה ריאגנטים: א. תרכיז קיבוע/פרמביליזציה (4X); ב. מדלל קיבוע / פרמביליזציה; ג. מאגר פרמביליזציה.
נוגדן IgG נגד חולדות עיזים (H+L),מעבדות וקטורBA-9400-1.51:200 דילול
Invitrogen EVOS FL מערכת הדמיית תאים אוטומטייםThermoFisher מאגר
FACS המכיל 0.5% BSA ו-2mM EDTA
ערכת כתמי תאים מתים LIVE / DEAD הניתנת לתיקון קרוב ל- IR, לעירור של 633 או 635 ננומטרLife TechnologiesL10199דילול 1:200
MigR1addgene# 27490
NaN3SigmaS2002
Opti-MEM בינוניGibco31985070
pCL-Ecoaddgene# 12371
PE נגד עכבר CD69 (שיבוט H1.2F3)Biolegend104508דילול 1:200
PE עכבר נגד Bcl-6 (שיבוט K112-91)BD Biosciences561522דילול 1:50
פוספט חוצץ מלח, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
חולדה מטוהרת נגד עכבר CXCR5 (שיבוט 2G8)BD Biosciences551961דילול 1:50
חולדה חד שבטית PerCP Anti-Mouse CD4 (שיבוט RM4-5)Biolegend1005381:200 דילול
עכבר רקומביננטי IL-2Gibco212-12-1MG
מאגר ליזה של תאי דם אדומיםBeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 בינוניSigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 בינוני המכיל 2% FBS
SMARTA (SM) TCR עכבר טרנסגניהקו הטרנסגני SM TCR במעבדה שלנו הוא מתנה מד"ר רפי אחמד (אוניברסיטת אמורי). בנוסף, ניתן להשיג קו עכבר זה גם ממעבדת ג'קסון (stain#: 030450).
מאגרPBS המכיל 2% FBS ו-0.01% NaN3
Streptavidin PE-Cyanine7eBioscience25-4317-821:200 דילול
TCF1/TCF7 (C63D9) ארנב mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) טכנולוגיית איתות תאים6444S1:400 דילול
מאגרמאגר FACS המכיל 1% BSA ו-2% סרום
עכבר מגיב TransIT-293Mirus BioMIRUMIR2700
בקר עוברי BD ביוטיניל בידוד מדעי LCMV GP61-77 פפטיד (GLKGPDIYKGVYQFKSV) חברת פפטידים סינית צביעה צביעת תאי TFH

מקורות

  1. O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
  2. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  3. Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
  4. Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
  5. Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
  6. Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
  7. Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
  8. Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
  9. Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
  10. Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
  11. Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
  12. Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
  13. Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
  14. Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
  15. Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).
  16. Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).
  17. Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
  18. Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
  19. Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
  20. Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
  21. Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
  22. Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
  23. Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
  24. Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
  25. Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).
  26. Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).
  27. Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
  28. Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931(2021).
  29. He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
  30. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
  31. Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
  32. Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
  33. Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).
  34. Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

TTLCMVT CD4TBCL6T
גישה להבחנה מוקדמת של תאי T CD4+ עוזר זקיקים ספציפי לווירוס בעכברים נגועים ב- LCMV חריף
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.