מאמר שיטה

טכניקה לבידוד ותרבית של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם לסת חולדה

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66765

⸱

31 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese PLA, 2Department of Stomatology, the First Medical Centre, Chinese PLA General Hospital, 3Department of Stomatology, Fujian People's Armed Police Corps Hospital

במאמר זה

סיכום

לתאי גזע מזנכימליים ממח עצם הלסת תפקידים משמעותיים בהתמיינות מגוונת, התחדשות עצמית ומודולציה חיסונית. הם התגלו כמאגר חיוני של תאים מקדימים בריפוי גנטי, הנדסת רקמות ורפואה רגנרטיבית. כאן אנו מציגים שיטה ייחודית לבידוד תאי גזע מזנכימליים של מח עצם הלסת בחולדות.

תקציר

תאי גזע מזנכימליים ממח עצם (BMMSCs) הם סוג של תאי גזע בעלי פוטנציאל התמיינות רב-כיווני. בהשוואה ל- BMMSCs שמקורם בעצמות התוספתן, BMMSCs שמקורם בלסת הם בעלי יכולת שגשוג והתמיינות אוסטאוגנית גבוהה יותר, והופכים בהדרגה לתאי זרע חשובים לתיקון פגמים בלסת. עם זאת, הלסת התחתונה יש מבנה גרמי מורכב תוכן ביטול פחות מאשר עצמות appendicular. קשה לרכוש מספר רב של תאי גזע מזנכימליים באיכות גבוהה שמקורם במח הלסת בשיטות מסורתיות. מחקר זה מציג "גישה מבוססת נישה על גזעיות" לבידוד וטיפוח תאי גזע מזנכימליים של מח עצם בלסת חולדה (JBMMSCs). חולדות ראשוניות בודדו ותורבתו בשיטת הדבקת מח עצם שלמה בשילוב עם שיטת עיכול פרוסות העצם. התאים שבודדו זוהו כ-JBMMSCs באמצעות תצפית במורפולוגיה של התא, גילוי סמני פני התא והשראת התמיינות רב-כיוונית. התאים המופקים בשיטה זו מציגים צורת ציר 'דמוית פיברובלסט'. התאים ארוכים, דמויי ציר ודמויי פיברובלסט. ניתוח ציטומטריית הזרימה מראה כי תאים אלה חיוביים עבור CD29, CD44 ו- CD90 אך שליליים עבור CD11b/c, CD34 ו- CD45, אשר תואם את מאפייני BMMSC. התאים מראים יכולת התרבות חזקה ויכולים לעבור התמיינות אוסטאוגנית, אדיפוגנית וכונדרוגנית. מחקר זה מספק שיטה יעילה ויציבה להשגת מספיק JBMMSCs באיכות גבוהה עם יכולת בידול חזקה בזמן קצר, אשר יכול להקל על מחקרים נוספים של חקר תפקוד ביולוגי, רפואה רגנרטיבית, ויישומים קליניים קשורים.

מבוא

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) התגלו לראשונה במוח העצם, אשר הראו יכולת ליצור מושבות דבק בתרבית ופוטנציאל אוסטאוגני חזק1. Pittinger et al.2 מצאו גם את פוטנציאל ההתמיינות הרב-כיווני שלהם לכיוון עצמות, שומן וסחוס. למרות שלכל תאי הגזע המזנכימליים ממקורות שונים יש פוטנציאל להתמיינות רב-כיוונית, לתאי גזע מזנכימליים ממח עצם יש את פוטנציאל ההתמיינות הכונדרוגני החזק ביותר בהשוואה לתאי גזע מזנכימליים שמקורם ברקמות אחרות, מה שהופך אותם לתאים המועמדים הטובים ביותר להנדסת רקמת עצם3. עם זאת, מחקרים רבים הוכיחו כי BMMSCs ממקורות שונים מציגים מאפיינים ותכונות ספציפיים לאתר כגון יכולת התמיינות אוסטאוגנית ופעילות שגשוג תאית 4,5. זה יכול להיות בגלל שכבות נבט שונות בין הלסת לבין עצמות התוספתן או הפסגה iliac6.

תאי גזע מזנכימליים של מח עצם הלסת (JBMMSCs) נובעים מתאי הפסגה העצבית של הנוירואקטודרם (neuroectoderm), בעוד שתאי BMMSC שמקורם בשריר הירך מקורם במזודרם7. בהשוואה ל-BMMSCs שמקורם בעצמות ארוכות ובפסגה האיליאקית, ל-JBMMSCs יש שיעור התרבות גבוה יותר, פעילות ALP ופוטנציאל אוסטאוגני8. חוץ מזה, השפעת היישום של BMMSCs ברקמות ובאיברים עשויה להשתנות בהתאם לסוגי תאים שונים וסביבות9. תיקון פגמים בלסת תלוי בעיקר בגיוס תאי גזע מזנכימליים שמקורם בלסת. לכן, חקר JBMMSCs יכול לספק בסיס ניסיוני ליישומו הקליני בהנדסת רקמת עצם הלסת10. עם זאת, המחקר הבסיסי והיישומים הקליניים מתמקדים בעיקר ב- BMMSCs שמקורם בעצמות התוספתן והצירי11. המחקר על JBMMSCs מוגבל, וזה יכול להיות בגלל התוכן הנמוך של עצם ביטול בלסת התחתונה והעובדה כי לסתות של חולדות יש אפילו פחות ביטולעצם 12. לכן, קשה להפריד תאי גזע מזנכימליים שמקורם בעצם הלסת באמצעות שיטת שטיפת מח העצם הרגילה, המשמשת בדרך כלל לבידוד BMMSCs מעצמות התוספתן או מסמל האיליאק13. בהתבסס על השיטות של Hong et al.14 ו- Cheng et al.15, שיערנו כי השילוב של עיכול עצם צפוף ושיטת שטיפת מח העצם יכול לבודד ביעילות JBMMSCs חולדות.

מחקר זה נועד לבסס שיטה יעילה לבידוד JBMMSCs של חולדות ולספק מקורות תאי זרע מספיקים להנדסת רקמת עצם הלסת.

פרוטוקול

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים בבית החולים הכללי של ה-PLA הסיני. חולדות וויסטאר זכרים בני שלושה עשר שבועות שימשו לניסוי. פרטים על בעלי החיים, הריאגנטים והציוד מופיעים בטבלת החומרים.

1. הכנה ניסיונית

  1. יש לעקר את כל כלי הניתוח, כולל מספריים אופתלמיים, פינצטה ורונג'ורים לעצמות, בטמפרטורה ולחץ גבוהים.
  2. הכינו מראש את מדיית התרבות.
    1. הכינו מדיום מלא α-MEM המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין.
    2. הכינו 0.1% קולגנאז מסוג II במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
    3. הכינו 50 מ"ל PBS עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין בצינור צנטריפוגה סטרילי חד פעמי של 50 מ"ל.

2. בידוד וטיפוח חולדות JBMMSCs

  1. בודדו את לסת החולדה לפי השלבים הבאים:
    הערה: כדי לשמור על סטריליות הדגימה, יש לחטא את כל כלי הניתוח ממתכת בטמפרטורה גבוהה על להבת מנורת אלכוהול לפחות שלוש שניות לפני השימוש.
    1. מרדימים את החולדה עם 2% נתרן pentobarbital (2 מ"ל / ק"ג) על ידי הזרקה intraperitoneal.
    2. הקריבו את החולדה המורדמת על ידי פריקת חוליות צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) לאחר שקצב הנשימה שלה יורד והשרירים נרגעים לחלוטין.
    3. טבלו את החולדה באתנול 75% למשך 30 דקות כדי לחטא אותה ואז העבירו אותה לשולחן נקי במיוחד.
    4. הניחו את החולדה על מטלית סטרילית חד פעמית או במיכל סטרילי ושמרו אותה במצב שכיבה.
    5. חותכים ומפרידים את העור והשריר מהאנגולוס אוריס למפרק לאורך הרמוס, ולאחר מכן מפרידים את הקונדיל מהפוסה הגלנואידית על ידי חיתוך דיסק המפרק הרקתי והרצועות ההיקפיות הדו-צדדיות אופקית עם מספריים אופתלמיים.
      הערה: לקבוע את המיקום של המפרק temporomandibular על ידי הזזת הלסת התחתונה והתבוננות במיקום של קונדיל חיצונית.
    6. חותכים ומפרידים את השרירים ורקמות החיבור של הלסת התחתונה הצידית באמצעות מספריים מחריץ שיווי המשקל בצד הבוקאלי של החותכות התחתונות לצד שמאל וימין.
    7. חותכים את השרירים הלשוניים של הלסת התחתונה מהפרנום הלשוני לאזור האחורי של הלסת התחתונה.
    8. הסר את הלסת התחתונה מהגולגולת.
    9. מחלקים את הלסת התחתונה לחצאים על ידי חיתוך הסימפיזיס בין החותכות התחתונות עם מספריים אופתלמיים.
    10. הסר את השרירים המחוברים הנותרים, הפאשיה ורקמות רכות אחרות על הלסת התחתונה בזהירות באמצעות מספריים ומלקחיים אופתלמיים.
  2. בודד JBMMSCs.
    1. מניחים את המקור של הרונגר בצומת של החותכות והחלק המזיאלי של הטוחנת הראשונה, מנתקים את הקשר בין החותכות התחתונות ללסת התחתונה עם הרונגר, ומחלצים את החותכות התחתונות לחלוטין.
    2. הסר את כל הטוחנות עם רונגור עצם.
    3. הסר את הרמוס המנדיבולרי עם רונגור עצם וחשף את חלל המח על ידי הפרדת החלק המרכזי של הלסת לאורך הקצה הדיסטלי של הטוחנת האחרונה16.
    4. למצוץ α-MEM מדיום שלם עם מזרק סטרילי חד פעמי 1 מ"ל. הכניסו את המחט לחלל מח העצם ושטפו את מח העצם שוב ושוב לתוך צלחת התרבית עם מדיום מלא α-MEM עד שהעצם הופכת לבנה.
    5. אספו את תמיסת שטיפת מח העצם לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה אותה במהירות של 800 x גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. השליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה, השהו מחדש את התאים עם 10 מ"ל של מדיום שלם α-MEM, והכניסו אותם לצלחת תרבית חדשה בקוטר 10 ס"מ.
    7. מחלקים את הלסת התחתונה הסמוקה לפרוסות עצם של 1-3 מ"מ מ"ק עם רונגור ומעכלים אותן עם 3 מ"ל של 0.1% collagenase מסוג II למשך 90 דקות בשייקר של 200 סל"ד לדקה ב-37°C.
    8. צנטריפוגה את הלסת המעוכלת ב 800 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant.
    9. תרבית את התאים שנקטפו ואת פרוסות העצם המעוכלת בתווך מלא α-MEM ב-37°C באינקובטור לח של 5% CO2 .
    10. שנה חצי ממדיום התרבית במדיום טרי לאחר 72 שעות ולאחר מכן שנה אותו לחלוטין כל יומיים.
      הערה: אין להזיז את מנת התרבית במשך שלושת הימים הראשונים.
    11. עוברים את התאים הדבקים ביחס של 1:2 כאשר הם מגיעים למפגש של 80%-90%. מוציאים פרוסות עצם במהלך תת-התרבות השנייה. השתמש בתאים של דורות P2 או P3 לניסויים.

3. ציטומטריית זרימה לזיהוי סמני פני התא

  1. השהה מחדש JBMMSCs מדור P2 במאגר ציטומטריית זרימה. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי והתאם את הריכוז ל 3 × 106 תאים / מ"ל.
  2. הוסף 100 μL של תרחיף תאים ו 2 μL של נוגדנים חד שבטיים (CD11b/c, CD29, CD34, CD44, CD45 ו- CD90) לכל צינור מיקרוצנטריפוגה. יש לדגור במשך 30 דקות ב-4°C17,18.
  3. שטפו את הדגימה פעמיים עם 200 מיקרוליטר של חיץ ציטומטריית זרימה וצנטריפוגו אותה למשך 5 דקות ב 250 x גרם בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant.
  4. הוסף 100 μL של חיץ ציטומטריית זרימה ו- 2 μL של נוגדן פלואורסצנטי משני המסומן בתווית PE לכל צינור. יש לדגור ב-4°C למשך 30 דקות.
  5. חזור על שלב 3.3.
  6. השהה מחדש JBMMSCs ב 300-500 μL של חיץ ציטומטריית זרימה לכל צינור.
  7. בצע את הניתוח הציטומטרי של הזרימה באמצעות ציטומטר זרימה.
    הערה: השתמש בנוגדנים הומולוגיים כבקרות שליליות כדי למנוע כתמי רקע הנגרמים על-ידי שילוב לא ספציפי של נוגדנים.

4. קביעת התפשטות תאים

  1. זרע JBMMSCs של דור P3 לתוך צלחת 96 באר בצפיפות של 5 × 103 תאים לכל באר.
  2. הוסף 10 μL של תמיסת CCK-8 לכל באר.
  3. הניחו את הצלחת בעלת 96 הבארות באינקובטור למשך שעתיים ומדדו את הספיגה (ערך OD ב-450 ננומטר) באמצעות קורא מיקרו-לוחות.
    הערה: בצע את הבדיקה באותה שעה בכל יום במשך שבעה ימים רצופים.

5. יכולת היווצרות מושבה

  1. זרעו 1000 JBMMSCs ממעבר 3 ל-10 ס"מ כלי תרבית ותרבות בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2.
  2. שנה את מדיום התרבות כל 3 ימים.
  3. בצע צביעה סגולה קריסטלית לאחר טיפוח מתמשך במשך 15 ימים.
  4. לאחר מכן, לתקן את התאים עם מתנול במשך 5 דקות וכתם עם 2% סגול קריסטל במשך 5 דקות.

6. הבחנה מרובת שושלות של JBMMSCs

הערה: השתמש בקובצי JBMMSC מדור P3 לבידול בין שושלות מרובות. קבוצת הביקורת תורבתה עם מדיום מלא של α-MEM.

  1. בצע התמיינות אוסטאוגנית.
    1. חסן 1 × 105 JBMMSCs לכל באר בצלחת שש בארות.
    2. כאשר מפגש התאים מגיע ל -70%, שנה את התווך למדיום אינדוקציה אוסטאוגני.
      הערה: שנה את מדיום ההשראה האוסטאוגנית כל 3 ימים.
    3. בצע צביעה אלקליין פוספטאז (ALP) לאחר 7 ימים של אינדוקציה אוסטאוגנית.
    4. הסר את המדיום מן צלחת שש בארות, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS שלוש פעמים.
    5. צבעו את התאים בתמיסת צביעת ALP בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות והגנו עליהם מפני אור.
    6. שוטפים את התאים עד שלא נשארת תמיסת צביעה, ומתבוננים בדגימות תחת מיקרוסקופ.
    7. בצע צביעה אדומה Alizarin לאחר 21 ימים של אינדוקציה אוסטאוגנית.
    8. הכתימו את התאים בתמיסת צביעה אדומה אליזרין למשך 5 דקות לאחר קיבוע התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות.
    9. שטפו את התאים עם PBS עד שלא תישאר תמיסת צביעה אדומה של אליזרין.
    10. שימו לב למספר גושי הסידן תחת מיקרוסקופ.
  2. בצע בידול אדיפוגני.
    1. חסן 1 × 105 JBMMSCs לכל באר בצלחת שש בארות.
    2. כאשר מפגש התאים מגיע ל -70%, שנה את המדיום למדיום אינדוקציה אדיפוגני.
      הערה: שנה את מדיום ההשראות האידיפוגניות כל שלושה ימים.
    3. יש לבצע צביעת שמן אדום O לאחר 14 יום של אינדוקציה אדיפוגנית.
    4. הסר את המדיום מן צלחת שש בארות, לתקן את התאים עם שמן אדום O פתרון תיקון במשך 20-30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS שלוש פעמים.
    5. הסר את תמיסת התיקון ושטוף את התאים במים מזוקקים פעמיים.
    6. לטבול את התאים 60% isopropanol במשך 20-30 שניות.
    7. יש להסיר 60% איזופרופנול ולהכתים את התאים בשמן אדום O מכתים למשך 20-30 דקות.
    8. הסר את תמיסת הצביעה, לשטוף את התאים עם 60% isopropanol במשך 20-30 s, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים מזוקקים.
    9. מכתימים את הגרעין בתמיסת המטוקסילין למשך 1-2 דקות.
    10. הסר את תמיסת hematoxylin ולשטוף את התאים 2-3 פעמים עם מים מזוקקים. מוסיפים חיץ O אדום שמן למשך דקה אחת ומסירים אותו.
    11. שימו לב למספר טיפות השומנים תחת מיקרוסקופ.
  3. בצע התמיינות כונדרוגנית.
    1. חסן 1 × 105 JBMMSCs לכל באר בצלחת שש בארות.
    2. כאשר מפגש התאים מגיע ל -70%, שנה את מדיום האינדוקציה הבינוני לכונדרוגני.
      הערה: שנה את מדיום ההשראות הכונדרוגניות כל 3 ימים.
    3. יש לבצע צביעה כחולה לאחר 21 יום של השראת כונדרוגני.
    4. הסר את המדיום מן צלחת שש בארות, לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם PBS שלוש פעמים.
    5. לצבוע את התאים עם צביעה כחולה Alcian ב 37 ° C במשך 1 שעה.
    6. שוטפים את התאים עד שלא נשארת תמיסת צביעה, ומתבוננים בהם תחת מיקרוסקופ.

7. PCR בזמן אמת

  1. יש לחלץ את סך הרנ"א באמצעות ערכת מיצוי ה-RNA ולמדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות סמן אנזים (בהתאם להוראות היצרן).
  2. סנתז cDNA באמצעות 500 ng של RNA19.
  3. בצע qRT-PCR במערכת בזמן אמת עם 10 μL של תערובת qRT-PCR המכילה 1 μL של cDNA, 3.5 μLof מים מזוקקים כפול, 5 μL של SYBR, ו 0.5 μL של תערובת פריימר (0.1 μM).
    הערה: רצפי פריימר מפורטים בטבלה 1. תנאי המחזור התרמי הם כדלקמן: 50 ° C במשך 2 דקות, 95 ° C במשך 2 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° C במשך 15 שניות, 60 ° C במשך 2 דקות, ולאחר מכן מרווחים של 0.5 ° C עבור 5 s מ 60 ° C ל 95 ° C עבור עקומת ההתכה.
  4. השתמש ב- GAPDH כבקרה פנימית16.

תוצאות

לאחר 72 שעות של חיסון תאים, רוב התאים היו מרחפים ועגולים בצורתם, ומעט מאוד נדבקו לקיר (איור 1B). ביום החמישי הופיעו מושבות תאים דבקים, שהציגו צירים או צורות דמויות פיברובלסטים (איור 1C). ביום השביעי, תאים דבקים הגיעו למפגש של 90%, ויצרו צורת "אסכולת דגים" עם מספר קטן של תאים מרחפים לסירוגין (איור 1D). תאים שעברו גדלו במהירות ועברו כל 3 ימים. המורפולוגיה של התא הייתה הומוגנית יחסית, בעיקר בצורת ציר, וסודרה בתבנית דמוית מערבולת לאחר מפגש (איור 1E-G).

ניתוח ציטומטריית זרימה גילה רמות ביטוי גבוהות של סמני פני השטח של תאי גזע מזנכימליים CD90, CD29 ו- CD44, עם שיעורים חיוביים של 97.2%, 97.7% ו- 95.7%, בהתאמה. לעומת זאת, סמני פני השטח של תאי גזע המטופויטיים CD45, CD34 ו-CD11b/c הראו ביטוי נמוך, עם שיעורים חיוביים של 1.37%, 0.66% ו-1.49%, בהתאמה (איור 2A). לאחר שבועיים של תרבית, JBMMSCs הדגימו קולוניזציה, כפי שמעידה צביעת קריסטל סגול (איור 2B). הם הפגינו יכולת התפשטות יציבה במבחנה, כאשר עקומת גדילת התאים פעלה לפי תבנית טיפוסית "דמוית S" (איור 2C). תהליך התפשטות התאים כלל תקופה סמויה, שלב גדילה לוגריתמי ושלב מישורי. הצמיחה המהירה החלה לאחר יומיים, ואחריה האטה לאחר שישה ימים. תאים בודדים הציגו מאפיינים של שכפול עצמי והתפשטות.

התאים הציגו חלקיקי צביעת ALP כחולים-סגולים ביוםהשביעי וגושים מינרליים אדומים ביוםה-21 . נוסף על כך, לאחר 14 יום של אינדוקציה אדיפוגנית, התאים הציגו טיפות שומנים עם חרוזים אדומים, בעוד שהשראת התמיינות כונדרוגנית הביאה להיווצרות רקמה דמוית סחוס כחול (איור 3A). יתר על כן, לאחר 7 ימים של אינדוקציה אוסטאוגנית, רמות ביטוי ה-mRNA של ALP, OCN ו-Runx2 ב-JBMMSCs היו גבוהותב-15 (איור 3B).

figure-results-1
איור 1: בידוד ותרבות של JBMMSCs. (A) סקירה כללית של הפרוטוקול. (ב-ד) תמונות של תאים בתרבית במשך 3 ימים, 5 ימים ו-7 ימים בתרבית ראשונית, בהתאמה. (ה-ג) תמונות של תאי P1, P2 ו- P3, בהתאמה. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: זיהוי JBMMSCs. (A) תוצאות ניתוח ציטומטריית זרימה של חולדות JBMMSCs. ניתוח ציטומטריית זרימה גילה כי תאים אלה היו חיוביים עבור CD29, CD44 ו- CD90, בהתאם למאפיינים של BMMSC. לעומת זאת, הם היו שליליים עבור CD11b/c, CD34 ו-CD45. (B) תמונות מייצגות של מושבות JBMMSCs מוכתמות בסגול קריסטל (פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר). (C) עקומת גדילת התאים הראתה את קצב התפשטות התאים. הנתונים וקווי השגיאה מציינים ממוצע ± סטיית תקן, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: התמיינות רב-שושלתית (אוסטאוגנית, אדיפוגנית וכונדרוגנית) של JBMMSCs. (A) לאחר 7 ימים של אינדוקציה אוסטאוגנית נצפתה פעילות ALP מוגברת. לאחר 21 יום לאחר האינדוקציה האוסטאוגנית, גושים מינרליים רבים הוכתמו באדום עם כתמים אדומים של אליזרין. צביעת O בצבע אדום שמן חשפה מספר לא מבוטל של טיפות שומנים. צביעה כחולה אלקיאנית הדגישה את התאים המושרים לכונדרוציטים לאחר השראת כונדרוגני. (B) ביטוי mRNA של הגן הקשור לאוסטאוגניות ALP, OCN ו-Runx2 של JBMMSCs לאחר אינדוקציה אוסטאוגנית במשך 7 ימים. (***P < 0.001, לעומת קבוצת הביקורת). הנתונים וקווי השגיאה מציינים ממוצע ± סטיית תקן, n = 3. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

גןרצפי פריימר (5'-3')
גדףF: ACCCAGAAGACTGTGGATGG
R: CACATTGGGGGTAGGAACAC
ALPF: CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA
R: CCTTGTAACCAGGCCCGTTG
OCNF: GGTGGTGAATAGACTCCGGC
R: GCAACACATGCCCTAAACGG
Runx2F: GCACCCAGCCCATAATAGA
R: TTGGAGCAAGGAGAACCC

טבלה 1: פריימרים המשמשים ב-PCR בזמן אמת.

דיון

תאי גזע מזנכימליים ממח עצם (BMMSCs) מייצגים תת-קבוצה של תאי גזע לא המטופויטיים השוכנים במח העצם, המאופיינים ביכולות ההתחדשות העצמית שלהם, פוטנציאל התמיינות רב-כיווני ופונקציות תומכות להמטופויזה. תאים אלה ממלאים תפקידים מרכזיים בתהליכים פיזיולוגיים שונים כגון התחדשות רקמות, אנגיוגנזה וויסות הפעילות התאית20. כתוצאה מכך, BMMSCs משמשים לעתים קרובות בתיקון רקמות והנדסה רגנרטיבית כמקור תאי זרע אופטימלי21.

תאי גזע מזנכימליים של מח עצם הלסת (JBMMSCs), שבודדו לראשונה ממח עצם הלסת האנושי בשנת 2005 על ידי Matsubara et al.22, מציגים מאפייני התמיינות ייחודיים המיוחסים למקורות הייחודיים ולמסלולי ההתפתחות של הלסת בהשוואה לאתרי שלד אחרים 4,23. בהתחשב במנגנונים ההתפתחותיים והפתולוגיים המובהקים השולטים בעצם הגולגולתית, מתן עדיפות ל-JBMMSCs בתיקון פגמים בעצם הגולגולת נראה הכרחי, בשל תכונותיהם ההתפתחותיות ההומולוגיות23. יתר על כן, JBMMSCs מפגינים תאימות מוגברת עם מיקרו-סביבה אוראלית בשל מקורות הרקמה העוברית המשותפת שלהם24,25. למרות יתרונות אלה, פרוטוקול בידוד סטנדרטי ובטוח עבור JBMMSCs נותר חמקמק, והמחקר על JBMMSCs נותר מוגבל יחסית.

הבידוד והטיפוח של BMMSCs חסרים כיום סטנדרטיזציה, עם שיטות נפוצות הכוללות מיון חרוזים אימונומגנטיים, מיון ציטומטריית זרימה, צנטריפוגת שיפוע צפיפות, ותרבית דבק מח עצם שלם26. בין אלה, שיטת החרוזים האימונומגנטית ושיטת מיון ציטומטריית זרימה מבודדות תאים על ידי זיהוי אנטיגנים ספציפיים על פני התא. עם זאת, שיטות אלה כרוכות בפעולות מסורבלות, דורשות מכשירים מיוחדים, ועשויות להשפיע על פעילות התא למרות שהן מניבות תאים בעלי טוהר גבוה27. שיטת צנטריפוגת שיפוע הצפיפות מפרידה תאים באמצעות צנטריפוגה וריבוד, אשר יכולים לשנות את המיקרו-סביבה של התא, מה שמוביל לצמיחה איטית יותר של תאים ולהזדקנות תאית מוגברת28. לעומת זאת, שיטת תרבית הדבקת מח עצם שלמה מפרידה ומטהרת BMMSCs על ידי החלפה לסירוגין של המדיום והמעבר בהתבסס על יכולות הדבקה שונות בין סוגי תאים שונים במוח העצם. שיטה זו גורמת נזק מינימלי לתאים והיא פשוטה לביצוע16.

בהשוואה לעצם הירך, הלסת קטנה יותר בגודלה ויש לה חלל מח עצם צר יותר, עם הפרעה של תאים בשן או ברצועה חניכיים. שיטת השטיפה וההדבקה של מח עצם דורשת כמות גדולה יחסית של מח עצם ומתאימה לבעלי חיים גדולים ולבני אדם29. JBMMSCs בחולדות שחולצו על ידי יישום שיטת שטיפת מח העצם המסורתית הם נדירים במספרם, מתרבים לאט ובאיכות ירודה30,31. התוכן של JBMMSCs במח העצם הוא נמוך מאוד, והם נמצאים בעיקר עצם קומפקטית אנדוסטיאום. Bu-Kyu Lee et al.32 השתמשו בשאיפה המנדיבולרית כדי לבודד JBMMSCs, בעוד שזמן השאיפה הכולל ל-10 מ"ל דם מח הלסת היה ארוך פי חמישה מזה של הפסגה האיליאקית, והתשואה הראשונית של MSCs מהלסת התחתונה הייתה נמוכה פי שלושה מזו של הפסגה האיליאקית. שטיפת מח העצם לבדה אינה יכולה לבודד ביעילות את התאים בעצם הקומפקטית ובאנדוסטום.

בשנים האחרונות מחקרים מצאו כי עצם קומפקטית היא מקור חדש ואמין ל-BMMSC, ונגזרה שיטה פשוטה יחסית לבידוד BMMSC, שיטת תרבית עיכול פרוסות עצם33. BMMSCs שבודדו בשיטה זו הם בעלי טוהר גבוה34. Guo et al.35בודדו בהצלחה תאי גזע מזנכימליים של עצם מעצם הירך של עכברים באמצעות שיטת תרבית עיכול פרוסות עצם. Yamazaet al.12 ו- Cheng et al.15 יישמו את שיטת תרבית עיכול פרוסות העצם לבידוד תאי גזע מזנכימליים של מח עצם מנדיבולרי עכבר ואימתו תכונות MSC על ידי התפשטות תאים, אימונופנוטיפ והתמיינות רב-שושלת. ניסוי זה השתמש בשילוב של הידבקות מח עצם שלמה סמוקה ועיכול פרוסות עצם כדי לבודד ולתרבת JBMMSCs ראשוניים של חולדות. מח העצם נשטף ביסודיות מהחלל ללא סינון כדי לשמור על ההרכב התאי המקורי וגורמי הגדילה במוח העצם. לאחר מכן, פרוסות העצם נחתכו לחתיכות קטנות ועוכלו באמצעות קולגנאז מסוג II כדי להקל על התאים לטפס מתוך שברי עצם. לבסוף, פרוסות העצם חוסנו על צלחת תרבית ותורבתו כדי לאפשר לתאים לזחול החוצה מפרוסות העצם. השיטה המשולבת גורמת למערכת התרבית של התא הראשוני להכיל בו זמנית רכיבים של תאי גזע המטופויטיים, עצם מבטלת ועצם קליפת המוח, אשר יכולים לדמות טוב יותר את המיקרו-סביבה של תאי גזע מזנכימליים ממח עצם בגוף ותורמים יותר לשמירה על המאפיינים הביולוגיים המקוריים של התאים. שיטה זו נקראת אפוא "גישה מבוססת נישה על גבעול"36. Luet al.37 הדגיש גם את החשיבות של נישות תאי גזע בבידוד של BMMSCs, אבל הם רק מעורבים microenvironment במח העצם ללא עצם קליפת המוח. שיטה זו יושמה בהצלחה בבידוד תאי גזע מזנכימליים של מח עצם מעכברים לסת38.

כמו כן, בודדנו וטיפחנו בהצלחה JBMMSCs של חולדות באמצעות גישה מבוססת נישה זו. ראשית, התאים המבודדים הציגו צורה דמוית פיברובלסט ונצמדו לצלחות תרבית פלסטיק במבחנה. שנית, התאים ביטאו באופן חיובי את סמני פני השטח CD90, CD29 ו- CD44 וביטאו באופן שלילי CD45, CD34 ו- CD11b/c. שלישית, התאים יכולים להתמיין לאוסטיאוציטים, אדיפוציטים וכונדרוציטים. התאים שהתקבלו היו בעלי מורפולוגיה טובה, קצב התפשטות מהיר ויכולת התמיינות שעמדו בקריטריונים המינימליים לזיהוי תאי גזע מזנכימליים שמקורם בבני אדם שהוצעו על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי17.

הבידוד של JBMMSCs פותח ומשמש לבידוד תאים בבני אדם. Matsubara et al.22 היו הראשונים לבודד JBMMSCs מדגימות מח עצם מכתשית אנושית במהלך ניתוח אוראלי. סיבוכים אפשריים עלולים להתרחש בתהליך השאיפה הלסתית, כולל נזק לרקמה סמוכה, זיהום עקב זיהום חיידקי בפה ועוד. Zong et al.39 שטפו את חלל מח העצם של חתיכות דגימת העצם כדי להשיג JBMMSCs אנושיים. Park et al.40 בודדו JBMMSCs אנושיים משבבי עצם מכתשית שהתקבלו במהלך קידוח השתל בשיטת עיכול רציפה. Mason et al.41 בודדו ישירות JBMMSCs אנושיים מליבות מח עצם הלסת ושאפו של מטופלים שעברו השתלת שיניים שגרתית. היה שיעור הצלחה גבוה של בידוד תאים משאפתנים או מליבה ושיעור הצלחה גבוה יותר של השילוב. עם זאת, למרות שהשיטות הנ"ל בודדו בהצלחה JBMMSCs מבני אדם, יש להשוות את ההבדלים ביעילות בין השיטות. נכון לעכשיו, שיטה זו שהוצגה שימשה רק בעכברים וחולדות, ואין מחקר על יישום שיטה זו לבידוד של JBMMSCs אנושיים. ישנן מגבלות לשיטה זו, במיוחד כאשר היא מיושמת על בני אדם. ראשית, שיטה זו של שילוב שטיפת מח עצם ועיכול פרוסות עצם היא מסובכת יחסית ודורשת שלבים נוספים. שנית, תהליכים מורכבים מציבים דרישות גבוהות יותר לסטריליות הפעולות, שהיא קריטית לפרוטוקול. שלישית, אי אפשר לשטוף את כל חלל מח העצם של עצם הלסת האנושית, ולכן יש צורך לחקור כמה שיטות מקבילות, כגון שטיפת שברי עצם מבטלים.

לסיכום, מחקר זה בודד בהצלחה ותרבית חולדות JBMMSCs באמצעות שילוב של שטיפת מח עצם ועיכול פרוסות עצם בהתבסס על העיקרון של "נישת תאי גזע". תוצאות זיהוי התאים אישרו כי שיטה זו יכולה לבודד JBMMSCs מספיקים ובעלי טוהר גבוה, ולספק מקורות תאים רבים להנדסת רקמת עצם הלסת, במיוחד בתיקון פגמים בעצם, שהוא בעל משמעות רבה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי פרויקטי הבריאות של מחלקת הלוגיסטיקה של הוועדה הצבאית (19BJZ22), הקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (7232154) ופרויקטי המחקר הקליני הרביעי של Mil Med Univ (2021XB025).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alizarin Red S Solution 0.2%SolarbioG1450
BCIP/NBT ערכת פיתוח צבע פוספטאז אלקלייןBeyotimeC3206
Bio-Rad CFX96 מערכת בזמן אמתBio-Rad
CCK8 ערכתDujindoCK04
צלחת תרבית תאים 10 ס"מ
צינור צנטריפוגה אפנדורף5810R
15 מ"ל קורנינג430790
50 מ"ל קורנינג430828
חממת CO2תרמו פישר3111
מתנד בטמפרטורה קבועהשנחאי Zhicheng Analysis Instrument Manufacturing Co., Ltd.ZWY-100H
סרום בקר עובריBI04-001-1ACS
ציטומטר זרימהBDFACS C6 
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוךאולימפוסCKX41 
ערכת זיהוי סמני משטח של תאי גזע מזנכימליים (חולדות) OricellRAXMX-09011
קורא מיקרו-פלטות רב תכליתי BioTekSynergy LX Multi-Mode
שמן אדום ערכת כתמיםSolarbioG1262
Paraformaldehyde 4%SolarbioP1110
PBSMACGENECC008
פניצילין-סטרפטומיצין 0.25%MACGENECC004
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher A25742
PrimeScript RT מאסטר מיקס TakaraRR036A
מח עצם חולדה תאי גזע מזנכימליים ערכת התמיינות אדיפוגניתOricellRAXMX-90031
מח עצם חולדה תאי גזע מזנכימליים ערכת התמיינות כונדרוגניתOricellRAXMX-90041
מח עצם חולדה תאי גזע מזנכימליים ערכת התמיינות אוסטאוגנית ערכת מיצויRAXMD-90021
TIANGENDP419
ספסל סופר נקיבייג'ינג Yataikelong Instrument Technology Co., Ltd.KLCZ-1220A
Trypsin-EDTA  0.25%MACGENECC012
קולגנאז מסוג IISolarbioC8150
עכברוש Wistarבייג'ינג Yataikelong Instrument Technology Co. Ltd.
α-MEM מדיום תרבית GibcoC12571500BT
צנטריפוגה 353003 קורנינג צינור צנטריפוגה RNA

מקורות

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  3. Shao, J., Zhang, W., Yang, T. Using mesenchymal stem cells as a therapy for bone regeneration and repairing. Biol Res. 48, 62(2015).
  4. Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. Long-bone marrow stromal cells. J Dent Res. 89 (11), 1293-1298 (2010).
  5. Mendi, A., Ulutürk, H., Ataç, M. S., Yılmaz, D. Stem cells for the oromaxillofacial area: Could they be a promising source for regeneration in dentistry. Adv Exp Med Biol. 1144, 101-121 (2019).
  6. Couly, G. F., Coltey, P. M., Le Douarin, N. M. The triple origin of skull in higher vertebrates: A study in quail-chick chimeras. Development. 117 (2), 409-429 (1993).
  7. Leucht, P., et al. Embryonic origin and hox status determine progenitor cell fate during adult bone regeneration. Development. 135 (17), 2845-2854 (2008).
  8. Jeyaraman, M., et al. Is mandible derived mesenchymal stromal cells superior in proliferation and regeneration to long bone-derived mesenchymal stromal cells. World J Methodol. 13 (2), 10-17 (2023).
  9. Mouraret, S., et al. The potential for vertical bone regeneration via maxillary periosteal elevation. J Clin Peri.odontol. 41 (12), 1170-1177 (2014).
  10. Li, T. Q., Meng, X. B., Shi, Q., Zhang, T. Research progress in biological characteristics and influencing factors of jaw bone marrow mesenchymal stem cell. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 57 (1), 107-112 (2022).
  11. Arthur, A., Gronthos, S. Clinical application of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells to repair skeletal tissue. Int J Mol Sci. 21 (24), 9759(2020).
  12. Yamaza, T., et al. Mouse mandible contains distinctive mesenchymal stem cells. J Dent Res. 90 (3), 317-324 (2011).
  13. Chen, L., et al. Directional homing of glycosylation-modified bone marrow mesenchymal stem cells for bone defect repair. J Nanobiotechnology. 19 (1), 228(2021).
  14. Hong, Y., et al. Isolation and cultivation of mandibular bone marrow mesenchymal stem cells in rats. J Vis Exp. (162), e61532(2020).
  15. Cheng, B., et al. Isolation, culture and biological characteristics of high-purity orofacial-bone-derived mesenchymal stem cells of the rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 25 (1), 67-72 (2021).
  16. Lee, D. J., et al. Osteogenic potential of mesenchymal stem cells from rat mandible to regenerate critical sized calvarial defect. J Tissue Eng. 10, 2041731419830427(2019).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fathi, E., Mesbah-Namin, S. A., Vietor, I., Farahzadi, R. Mesenchymal stem cells cause induction of granulocyte differentiation of rat bone marrow c-kit(+) hematopoietic stem cells through jak3/stat3, erk, and pi3k signaling pathways. Iran J Basic Med Sci. 25 (10), 1222-1227 (2022).
  19. Xu, W., et al. Exosomes from microglia attenuate photoreceptor injury and neovascularization in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Ther Nucleic Acids. 16, 778-790 (2019).
  20. Chu, D. T., et al. An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application of human bone marrow mesenchymal stem/stromal cells. Int J Mol Sci. 21 (3), 708(2020).
  21. Liu, Y., et al. Systemic infusion of mesenchymal stem cells improves cell-based bone regeneration via upregulation of regulatory T cells. Tissue Eng Part A. 21 (3-4), 498-509 (2015).
  22. Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: Differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 20 (3), 399-409 (2005).
  23. Zhang, G., Li, Q., Yuan, Q., Zhang, S. Spatial distributions, characteristics, and applications of craniofacial stem cells. Stem Cells Int. 2020, 8868593(2020).
  24. Akintoye, S. O. The distinctive jaw and alveolar bone regeneration. Oral Dis. 24 (1-2), 49-51 (2018).
  25. Park, J. B., Kim, I., Lee, W., Kim, H. Evaluation of the regenerative capacity of stem cells combined with bone graft material and collagen matrix using a rabbit calvarial defect model. J Periodontal Implant Sci. 53 (6), 467-477 (2023).
  26. Ni, X., et al. Isolation, culture and identification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering. Materials Exp. 12, 817-822 (2022).
  27. Abdallah, B. M., Khattab, H. M. Recent approaches to isolating and culturing mouse bone marrowderived mesenchymal stromal stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (5), 599-607 (2021).
  28. Tan, S. L., Ahmad, T. S., Selvaratnam, L., Kamarul, T. Isolation, characterization and the multilineage differentiation potential of rabbit bone marrow-derived mesenchymal stem cells. J Anat. 222 (4), 437-450 (2013).
  29. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).
  30. Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: Basic science to clinical translation. Int J Biochem Cell Biol. 43 (3), 286-289 (2011).
  31. Liu, J., Watanabe, K., Dabdoub, S. M., Lee, B. S., Kim, D. G. Site-specific characteristics of bone and progenitor cells in control and ovariectomized rats. Bone. 163, 116501(2022).
  32. Lee, B. K., Choi, S. J., Mack, D., Oh, S. H. Isolation of mesenchymal stem cells from the mandibular marrow aspirates. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 112 (6), e86-e93 (2011).
  33. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  34. Short, B. J., Brouard, N., Simmons, P. J. Prospective isolation of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Methods Mol Biol. 482, 259-268 (2009).
  35. Guo, Z., et al. In vitro characteristics and in vivo immunosuppressive activity of compact bone-derived murine mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 24 (4), 992-1000 (2006).
  36. Pal, B., Das, B. In vitro culture of naïve human bone marrow mesenchymal stem cells: A stemness based approach. Front Cell Dev Biol. 5, 69(2017).
  37. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  38. Cao, W., et al. Mir-344d-3p regulates osteogenic and adipogenic differentiation of mouse mandibular bone marrow mesenchymal stem cells. PeerJ. 11, e14838(2023).
  39. Zong, C., Zhao, L., Huang, C., Chen, Y., Tian, L. Isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells from the human mandible. J Vis Exp. (182), e63811(2022).
  40. Park, J. C., et al. Acquisition of human alveolar bone-derived stromal cells using minimally irrigated implant osteotomy: In vitro and in vivo evaluations. J Clin Periodontol. 39 (5), 495-505 (2012).
  41. Mason, S., Tarle, S. A., Osibin, W., Kinfu, Y., Kaigler, D. Standardization and safety of alveolar bone-derived stem cell isolation. J Dent Res. 93 (1), 55-61 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

טכניקה לבידוד ותרבית של תאי גזע מזנכימליים של מח עצם לסת חולדה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.