הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דיסוציאציה של דגימות רקמת גידול בבני אדם ובעכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי

3.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66766

⸱

16 באוגוסט 2024

 ,  ,  ,  , 
1Krantz Family Center for Cancer Research, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את ההליך לניתוק מהיר של דגימות גידולים אנושיים ועכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי.

תקציר

דגימות גידול אנושי מכילות שפע של מידע על המיקרו-סביבה והרפרטואר החיסוני שלהם. דיסוציאציה יעילה של דגימות רקמה אנושית לתרחיפים בני קיימא של תאים היא קלט נדרש עבור צינור ריצוף RNA חד-תאי (scRNAseq). שלא כמו גישות ריצוף RNA בתפזורת, scRNAseq מאפשר לנו להסיק את הטרוגניות השעתוק בדגימות גידול ברמת התא היחיד. הטמעת גישה זו בשנים האחרונות הובילה לתגליות רבות, כגון זיהוי מצבים חיסוניים ותאיים סרטניים ותוכניות הקשורות לתגובות קליניות לאימונותרפיה ולסוגים אחרים של טיפולים. יתר על כן, טכנולוגיות חד-תאיות המיושמות על רקמות מנותקות יכולות לשמש לזיהוי אזורי כרומטין נגישים רפרטואר קולטני תאי T ו-B, וביטוי חלבונים, באמצעות נוגדנים מקודדים של DNA (CITEseq).

הכדאיות והאיכות של הדגימה המנותקת הם משתנים קריטיים בעת שימוש בטכנולוגיות אלה, שכן אלה יכולים להשפיע באופן דרמטי על זיהום צולב של תאים בודדים עם RNA הסביבה, איכות הנתונים ופרשנות. יתר על כן, פרוטוקולי דיסוציאציה ארוכים יכולים להוביל לחיסול אוכלוסיות תאים רגישות ולהגברת הרגולציה של חתימת גן תגובת עקה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פיתחנו פרוטוקול דיסוציאציה אוניברסלי מהיר, אשר אומת על סוגים רבים של גידולים אנושיים ומורין. התהליך מתחיל בדיסוציאציה מכנית ואנזימטית, ואחריו סינון, ליזה של דם אדום והעשרת חיים מתים, המתאימים לדגימות עם קלט נמוך של תאים (למשל, ביופסיות ליבת מחט). פרוטוקול זה מבטיח תרחיף נקי ובר קיימא של תא בודד בעל חשיבות עליונה ליצירה מוצלחת של תחליב חרוזי ג'ל (GEMs), ברקוד וריצוף.

מבוא

למרות שהתפתחויות רבות בחקר הסרטן הובילו לפיתוח ולאישור ה-FDA של חומרים המכוונים לקולטנים מעכבים המתבטאים בתאי מערכת החיסון ובתאי הגידול, המכונים מעכבי חסימת נקודות ביקורת, עמידות לטיפול וזיהוי מנגנונים המניעים את תגובת המטופל נותרו מאתגרים1. האתגר המורכב של אפיון ההטרוגניות של הגידול על המגוון המולקולרי שלו ויחסי הגומלין המורכבים בין תאי הגידול לבין המיקרו-סביבה החיסונית מחייב גישות חדשות לנתח את המערכת האקולוגית המורכבת הזו ברזולוציה של תא בודד. הבנת המורכבויות המולקולריות בתוך גידולים והמיקרו-סביבות שלהם היא חיונית לקידום אסטרטגיות טיפוליות ולפענוח הביולוגיה המורכבת העומדת בבסיס התקדמות הסרטן2. ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) הפך פופולרי יותר ויותר מכיוון שהוא מספק ניתוח ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים בתוך דגימות גידול מורכבות 3,4.

הטרוגניות גידולית, הכוללת הבדלים גנטיים, אפיגנטיים ופנוטיפיים, מציבה אתגר בחשיפת נבכי הביולוגיה של הסרטן5. השיטות המקובלות של ריצוף RNA בתפזורת נוטות לטשטש את פרופילי הביטוי והפנוטיפים הייחודיים של אוכלוסיות תאים הטרוגניות הקיימות בתוך גידולים, שכן שיטות אלה מכניסות אותות בממוצע על פני אוכלוסיות תאים שלמות4. לעומת זאת, scRNA-seq מאפשר דיסקציה של סוגי תאים בודדים, וחושף ביטוי גנים מגוון, דפוסי דיכוי ומצבים תאיים שאחרת התעלמו מהם 4,6. הנחת היסוד של scRNA-seq טמונה ביכולתו לפענח חתימות גנטיות ומולקולריות של תאים בודדים, וטומנת בחובה הבטחה עצומה בגילוי טיפולים חדשים לסרטן7.

על ידי פענוח פרופילי ביטוי הגנים של תאי הגידול ותאי הסטרומה ומערכת החיסון הסובבים אותם, החוקרים יכולים לזהות מטרות טיפוליות חדשות ולפתח אסטרטגיות רפואה גנטית מדויקות המותאמות לחולים בודדים6. יתר על כן, ניתוח הרפרטואר החיסוני בתוך המיקרו-סביבה של הגידול מספק תובנות חיוניות לגבי יחסי הגומלין בין תאי הגידול לבין גורמים חיסוניים, וסולל את הדרך להתערבויות אימונותרפיות3. למרות ההתקדמות בשימוש ב- scRNAseq על דגימות קליניות, מספר אתגרים במהלך שלבי העיבוד עלולים לפגוע בשלמות ה- RNA של התא, בכדאיות ובאיכות הנתונים שנוצרו. יתר על כן, עיבוד רקמה עם כדאיות תאים נמוכה יכול להגדיל את רמות RNA הסביבה בטיפות שנוצרו במהלך אנקפסולציה של תאים בודדים, וכתוצאה מכך זיהום צולב וביאור שגוי של סוגי תאים, בעוד פרוטוקולי דיסוציאציה ארוכים המבוצעים ב 37 ° C יכול להוביל להגברת הרגולציה של חתימת גן תגובת לחץ בסוגי תאים מרובים 8,9, 10.

ההליך ההדרגתי (איור 1A) המתואר בפרוטוקול זה מתחיל בדיסוציאציה מכנית ואנזימטית מהירה של גידולים, ולאחר מכן סינון והסרה של תאים מתים, בהתאם לכדאיות של כל דגימת גידול. נכון לעכשיו, הליך זה אומת במלנומה11, מעי גס12, קרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר13, דגימות גידול בלבלב וריאות (נתונים שלא פורסמו). טכניקות אלה מבטיחות יצירה של מתלי תאים איכותיים וברי קיימא החיוניים לניתוחים במורד הזרם14. יש לציין, הסרת תאי דם אדומים, ללא RNA מסונתז, הופך הכרחי כדי לטהר את הדגימה15. הערכה מאוחרת יותר של ספירת תאים וחיסול תאים מתים משמשים כתנאי מוקדם ליצירה מוצלחת של תחליב חרוזי ג'ל 10x גנומיקה (GEM), ברקוד, ומגבירים את ההתאוששות של תעתיקים ותאים מרוצפים מבלי לסכן את ההדרה של אוכלוסיות רגישות (למשל, נויטרופילים ותאי אפיתל)16. צעדים אלה הם בסיסיים בפתיחת הפוטנציאל של ניתוח רזולוציה של תא בודד בתוך דגימות גידול 9,10, חשיפת פרופילי ביטוי גנים חדשים וחתימות חיסוניות הנחוצות להנעת התערבויות טיפוליות חדשניות, וזיהוי נקודות תורפה חדשות של הגידול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מחקר זה עמד בכל ההנחיות המוסדיות בנוגע לדגימת רקמות אנושיות. הסכמה מדעת התקבלה ממטופלים, ונתוני מדגם הניתנים לזיהוי הפכו לאנונימיים. הדגימות נאספות בחדר הניתוח, מונחות בתמיסה של RPMI, מלוחים או PBS, ומאושרות כסרטניות באמצעות המחלקה הפתולוגית לפני השימוש במחקר. כל השלבים, למעט כאשר צוין, צריכים להתבצע ב 4 °C (75 °F) או על קרח. עבוד בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית בעת עיבוד רקמות אנושיות. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. קבלת המדגם

  1. קבל דגימת גידול מוצקה בצינור של מדיה והנח אותה על קרח.
    1. יש להנחות את צוות חדר הניתוח להעביר את הדגימה בצינור המכיל מספיק RPMI, מלוחים או PBS כדי לטבול לחלוטין את הרקמה כדי למנוע התייבשות דגימה.
      הערה: חשוב לוודא שהדגימה אינה מיובשת, מכיוון שהדבר יקטין את הכדאיות.
  2. מצננים את כל הצנטריפוגות ל-4°C ומביאים את המיקסר התרמי ל-37°C.
  3. הוציאו אנזימי דיסוציאציה מוכנים של גידול בבני אדם או בעכברים (Table of Materials), הפשירו במיקסר תרמי בטמפרטורה של 37°C ועברו לקרח לאחר ההפשרה.
  4. אחזר aliquot 20 מ"ל של RPMI.
  5. רשום מידע רלוונטי לדוגמה (לדוגמה, מזהה מטופל, ביטול מזהה, סוג מדגם).
  6. מעבירים את הדגימה לצלחת תרבית רקמה בקוטר 60 מ"מ (מונחת על קרח) על ידי היפוך הצינור מספר פעמים ושפיכת התוכן לתוך הצלחת כדי לוודא שכל חומר הדגימה מועבר. אם הדגימה לא נמסרה במדיה עם ההגעה, הוסף מדיה RPMI טרי למנה.
    1. אם הדגימה מקוטעת, סובבו את הצינור המכיל את הדגימה בטמפרטורה של 450 × גרם, 4°C למשך 5 דקות, השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הדגימה ב-420 μL של סל"ד ועברו לסעיף 2.

2. עיכול מכני ואנזימטי

  1. פיפטה 420 μL של מדיה מצלחת דגימה 60 מ"מ לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. נסה לכלול קטעי מדגם התלויים במדיה.
  2. מעבירים את רקמת הדגימה מצלחת 60 מ"מ לצינור 1.5 מ"ל המכיל מדיה באמצעות פינצטה. חתכו את הדגימה עם מספריים נקיים בתוך הצינור כך שהחלקים יהיו בקוטר מקסימלי של 2-3 מ"מ.
  3. הוסף אנזימי עיכול, שהוכנו על פי מפרטי היצרן (רשימת חומרים), לדגימה בכרכים הבאים: 42 μL של אנזים H (פרוטאזות לא ספציפיות) עבור דגימות אנושיות, אנזים D (פרוטאזות לא ספציפיות) עבור דגימות מורין, 21 μL של אנזים R (פרוטאזות לא ספציפיות), ו 5 μL של אנזים A (nuclease).
  4. הוסף עוד 420 μL של מדיה מן המנה או עד סימן 1 מ"ל על הצינור. אין לחרוג מ-420 מיקרוליטר של חומרי הדפסה.
  5. סובבו את הצינור במשך 5 שניות והניחו אותו במערבל תרמי הממוקם אנכית על צידו (איור 1B). יש לדגור ב-37°C, 450 סל"ד, למשך 15 דקות.
    הערה: במהלך הדגירה, הוציאו את כל 10x החומרים הגנומיים הדרושים ליצירת GEM, מכיוון שהם דורשים 30 דקות כדי להתאזן לטמפרטורת החדר

3. סינון לדוגמה

  1. הניחו מסנן תאים של 50 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל והפעילו את המסנן על ידי העברת 1 מ"ל של מדיה סל"ד טרי דרכו לתוך הצינור.
  2. לאחר העיכול, להעביר את הדגימה לצינור 15 מ"ל באמצעות 1,000 μL קצה פיפטה רחב שמירה נמוכה. שטפו את הצינור בנפח 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של מדיה טרייה והעבירו את המדיה למסנן כדי לוודא שכל חומר הדגימה עובר דרך המסנן.
  3. להשיג מזרק פלסטיק 1 מ"ל ולהוציא רק את הבוכנה (להשליך את שארית המזרק). בעזרת החלק האחורי של בוכנה מזרק, לטחון ולדחוף את הדגימה על המסנן בתנועה סיבובית.
  4. שטפו את המסנן עם 5 מ"ל של מדיה וכל מדיה שנותרה מהצלחת שהכילה את הדגימה (סעיף 1) כדי לאסוף תאים שאולי התנתקו מהרקמה.
  5. הניחו מסנן תאים של 30 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי חדש של 15 מ"ל, הגדילו את המסנן עם 1 מ"ל מדיה, והעבירו את תכולת הצינור המכיל את הדגימה המנותקת דרך המסנן.
    הערה: שלב זה יסיר פסולת גדולה שעלולה להיסתם או לגרום לכשל הרטבה בעת הפעלת הדגימה באמצעות שבבי מיקרופלואידים 10x Genomics.

4. ליזה של תאי דם אדומים

  1. צנטריפוגה את הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את התקשורת, להיזהר לא להפריע את הכדור.
  2. השהה מחדש במאגר ACK Lysis כדי להסיר תאי דם אדומים (RBCs) ולהקליט את עוצמת הקול בשימוש. הנפח יהיה תלוי בגודל הגלולה ובהיקף RBCs בכדור.
    הערה: תמיסת דגימת ACK מושהית מחדש צריכה להיות חסרת צבע כאשר נוסף מספיק חיץ ACK Lysis, מכיוון שפעולה זו תנקה את תאי הדם האדומים מהדגימה.
  3. צנטריפוגה את צינור הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות, ולשאוף את supernatant.
  4. חזור על שלבים 4.2-4.3 לפי הצורך עד שלגלולת הדגימה לא יהיה צבע אדום נראה לעין לאחר הצנטריפוגה (איור 2). רשום את כל אמצעי האחסון הנוספים של מאגר ACK Lysis המשמש בשלב זה.
  5. יש להשהות מחדש את גלולת הדגימה במדיה טרייה לקראת ספירה.

5. ספירת תאים

  1. מניחים 10 μL של טריפאן כחול בצינור 1.5 מ"ל. מערבבים בעדינות את התאים המנותקים, לוקחים 10 μL של דגימה ומערבבים (1:1) עם כחול טריפאן. לטעון 10 μL על כל צד של hemocytometer ולספור את התאים.
  2. רשום ריכוז תאים, ספירת תאים חיים כוללת, אחוז כדאיות ונפח מדיה סופי לאחר ספירה.
  3. ודא שספירת התאים היא בין 700 ל- 1,200 תאים/μL (7 × 10,5- 1.2 × 10,6/mL) לריצה אופטימלית של 10x גנומיקה.
    1. אם הדגימה מרוכזת מדי, דללו אותה במדיה וספרו אותה מחדש.
    2. אם הדגימה מדוללת מדי, צנטריפוגו את הדגימה בטמפרטורה של 450 × גרם, 4°C למשך 5 דקות והשהו מחדש בנפח קטן יותר של מדיה.
    3. אם כדאיות התא נמוכה מ-80%, בצע הליך של מוות חי כדי להסיר תאים מתים.
    4. אם יש פחות ממיליון תאים, ראה סעיף 6.
    5. אם יש יותר ממיליון תאים והכדאיות > 10%, ראה סעיף 6.
    6. אם יש יותר ממיליון תאים והכדאיות < 10%, ראה סעיף 7.
    7. אם כדאיות התא היא מעל 80%, לשמור את התאים המעובדים על קרח ולהמשיך מיד לייצור GEM על פי הוראות היצרן.

6. הסרת תאים מתים - ערכה 1

הערה: עבוד בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית בעת שימוש בריאגנטים להסרת תאים מתים, מכיוון שהם יכולים להזדהם בקלות.

  1. צנטריפוגה את הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות.
  2. הכינו את אמצעי הבידוד בצינור חרוטי של 15 מ"ל ושמרו אותו בטמפרטורת החדר: 9.8 מ"ל של PBS, 10 מיקרוליטר של CaCl2 ו-200 מיקרוליטר של FCS מומת בחום (נוסף במכסה מנוע של בטיחות ביולוגית).
  3. לאחר הצנטריפוגה, לשאוף את התקשורת מן הגלולה ולהשהות מחדש ב 1 מ"ל של אמצעי הבידוד.
  4. צנטריפוגה את הצינור שוב ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של אמצעי בידוד.
  5. להעביר 100 μL של דגימה באמצעי בידוד לתוך באר אחת של 0.2 מ"ל PCR strip-tube.
  6. במכסה מנוע בטיחות ביולוגית, יש להוסיף 10 μL של קוקטייל Annexin V ו-10 μL של קוקטייל בחירת ביוטין לבאר המכילה 100 μL של הדגימה באמצעי בידוד. פיפטה מערבבים את התמיסה ומניחים לה לשבת בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות.
  7. לאחר 4 דקות, מערבלים את החלקיקים המגנטיים המצופים דקסטרן במשך 30 שניות. הוסף 20 μL של החרוזים ו 60 μL של מדיה בידוד לדגימה (נפח כולל של 200 μL). אם הכדאיות נמוכה מ-40%, הגדילו את כמות החרוזים עד 40 מיקרוליטר תוך התאמת נפח מדיית הבידוד (עד 40 מיקרוליטר), תוך שמירה על נפח כולל של 200 מיקרוליטר. תערובת פיפטה ואפשרו לתמיסה לשבת בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
  8. הניחו את צינור הרצועה על מפריד מגנטי 10x Genomics (בהגדרה גבוהה) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. מעבירים את הנוזל מצינור הרצועה מבלי להפריע לחרוזים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל. אין להסיר את צינור הרצועה מהמגנט.
  10. צנטריפוגה צינור 1.5 מ"ל המכיל את הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C במשך 5 דקות. לשאוף את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה בנפח מתאים של מדיית RPMI בהתבסס על גודל הגלולה ותאי הספירה כמתואר בסעיף 5. חזור על הליך הסרת התאים המתים אם הכדאיות נשארת מתחת ל-80% (איור 3 ואיור 4).
    הערה: אין להשעות תאים באמצעי בידוד ליצירת GEM במורד הזרם, מכיוון שהסידן כלורי יפריע לתהליך האנקפסולציה ולשלב השעתוק ההפוך (RT).
  11. שמור תאים מעובדים על קרח אם כדאיות התא היא מעל 80% והמשך מיד לייצור GEM בהתאם להוראות היצרן.

7. הסרת תאים מתים - ערכה 2

הערה: יש לעבוד בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגית בעת השימוש בריאגנטים של הערכה.

  1. הניחו את המיקרו-כדוריות ואת תמיסת מאגר ה-Binding Buffer 20x בתוך מכסה מנוע לבטיחות ביולוגית.
  2. צנטריפוגה את השעיית הדגימה ב 450 × גרם, 4 ° C למשך 5 דקות.
  3. הכן תמיסת חיץ 1x בתנאים סטריליים באמצעות 1 מ"ל של תמיסת מלאי חיץ מחייב 20x המוחדרת לתוך 19 מ"ל של מים מזוקקים ללא DNAse, RNAse.
  4. לאחר השלמת הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט, הוסיפו את המיקרו-חרוזים, ערבבו בעדינות את הדגימה ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
    1. כאשר ספירת התאים היא 107 או פחות, להוסיף 100 μL של microbeads.
    2. עבור ספירות גבוהות מ 107 תאים סה"כ, להתאים את microbeads לריכוז סופי של 100 μL לכל 107 תאים חיים.
  5. במהלך הדגירה, השג עמודת בחירה חיובית אחת של MACS, MACS multistand, ואת המפריד המגנטי המתאים. ודא שהמפריד מפולס על המעמד הרב-ראשי ושאין מתכת או חפץ מגנטי אחר בקרבת המעמד, מכיוון שהכוח המגנטי חזק ועלול להשפיע על יעילות הסרת התאים המתים. הניחו את העמוד בנוחות במחזיק מפריד עם כנפיים הפונות החוצה.
  6. לאחר הדגירה של הדגימה, אם נפח המתלה הכולל קטן מ-500 μL, יש להוסיף 1x Binding Buffer עד שהנפח הכולל יהיה 500 μL.
  7. מניחים צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל מתחת לעמודה, ומעלים את העמוד עם 3 מ"ל של 1x Binding Buffer.
  8. החלף את הצינור החרוטי בחרוטי חדש של 15 מ"ל לאיסוף דגימות תאים והוסף את הדגימה לעמודה, מה שמאפשר לה לזרום לחלוטין דרך העמודה.
  9. שטפו את העמוד 4X3 מ"ל של 1x Binding Buffer, והוסיפו רק כביסה אחת בכל פעם לאחר שהכביסה הקודמת זרמה כולה דרך העמודה.
  10. לאחר השטיפה הרביעית, צנטריפוגה את הצינור החרוטי המכיל את התאים המבודדים במשך 5 דקות ב 450 × גרם, 4 ° C. מחק את העמודה ואת מאגר האיגוד 1x הנותר.
  11. השהה מחדש את תמיסת הדגימה בכמות המתאימה של מדיית RPMI בהתבסס על גודל הגלולה וספור את התאים המבודדים באמצעות השיטה המתוארת בסעיף 5 (איור 3 ואיור 5).
    1. אם הכדאיות נשארת מתחת ל- 80%, ומספר התאים הכולל הוא 106 או פחות, חזור על סעיף 6.
    2. אם כדאיות התא היא מעל 80%, שמור תאים מעובדים על קרח והמשך מיד לייצור GEM בהתאם להוראות היצרן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ביופסיית מלנומה תלויה בסל"ד התקבלה והונחה מיד על קרח. הדגימה הועברה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל שהכיל 420 מיקרוליטר של סל"ד ואנזימי עיכול, נטחנה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים, ועברה עיכול אנזימטי לאחר מכן במשך 15 דקות במערבל תרמי בטמפרטורה אנכית של 37°C (איור 1). לאחר העיכול, הדגימה סוננה דרך מסנן חד פעמי סטרילי של 50 מיקרומטר, והמסנן נשטף בסל"ד טרי כדי להגדיל את תפוקת התאים (איור 1). שאר חלקי הרקמה שנותרו לאחר השטיפות הושלכו, שכן מדובר בחומרים ביולוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר דיסוציאציה של דגימות גידול אנושיות או מורין לתרחיף חד-תאי לצורך ריצוף scRNA באמצעות המערכת המיקרופלואידית 10x Genomics. בעיבוד רקמות שלעתים קרובות מגיעות מסרטן נדיר או שהן חלק מניסויים קליניים מתמשכים או ניסויים ארוכים בגידולי מורין, הדגימה חייבת להישמר בצורה אופטימלית וקפדנית בין כל השלבים. כל השלבים צריכים להתבצע במהירות על קרח או ב -4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על פרופילי הרנ"א התאיים המקוריים ולמנוע התפרקות, שכן עבודה בטמפרטורת החדר לפרקי זמן ממושכים תשפיע על איכות השעתוק17,18

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

מ.ס-פ. קיבל מימון מבריסטול מאיירס-סקוויב, איסטארי אונקולוגיה, והיה יועץ עבור Galvazine Therapeutics.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרן אדלסון למחקר רפואי (AMRF), הברית לחקר מלנומה (MRA) ו-U54CA224068. איור 1, איור 4 ואיור 5 נוצרו עם BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x PBSCorning21-040-CV
10 מ"ל פיפטה סרולוגיתקורנינג357551
1000 μ L קצות פיפטה עם שמירה נמוכהRainin30389213
1000 μ L קצות פיפטה רחבים עם שמירה נמוכהRainin30389218
1000 μ קצות פיפטה LRainin30389212
10x מפריד מגנטי10x גנומיקה120250
15 מ"ל צינורות חרוטייםקורנינג430052
2 מ"ל פיפטה שואבתקורנינג357558
20 μ L קצות פיפטה עם שמירה נמוכהRainin30389226
20 μ L קצות פיפטהRainin30389225
200 μ L קצות פיפטה עם שמירה נמוכהRainin30389240
200 μ קצות פיפטה LRainin30389239
50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילןפלקון352098
60 x 15 מ"מ צלחת תרבית רקמותפלקון353004
ACK מאגר ליסינגGibcoA10492-1
BD 1 מ"ל מזרקBecton, Dickinson and Company3090659
Bright-Line HemocytometerHausser Scientific551660
תמיסת סידן כלורידסיגמא אולדריץ'2115-100 מ"ל
ריינג'ר תאים 10x GenomicsN/Ahttps://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
שקופיות ספירת תאים עבור מונה תאי TC20Bio-Rad1450015
CellTrics 30μ מסננים חד פעמיים סטריליים MSysmex04-004-2326
CellTrics 50μ m מסננים חד פעמיים סטרילייםSysmex04-004-2327
ערכת הסרת תאים מתים Miltenyi Biotec130-090-101חנות ב -20 מעלות; C; ערכה 2
מלקחיים לניתוח, קצה עדיןVWR82027-386
צינורות מיקרוצנטריפוגה DNA LoBind, 1.5 מ"לEppendorf22431021
EasySepTM הסרת תאים מתים
(נספח V) ערכת		STEMCELL Technologies17899חנות ב-4 מעלות; C; ערכה 1
צנטריפוגה אפנדורף 5425Rאפנדורף5406000640
צנטריפוגה אפנדורף 5910Rאפנדורף2231000657
בקר פיפטה אלקטרוניאפנדורףEP4430000018
אפנדורף תרמומיקסר F1.5 דגם 5384אפנדורףEP5384000012
FBSGibco26140-079יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C, שימוש במכסה מנוע
ביולוגי גרמני נירוסטהמספריים Fine ScienceTools 14568-12
Leica Dmi1 מיקרוסקופLeica Microsystems454793
LS ColumnMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
Pipet-Lite LTS פיפטה L-1000XLS+Rainin17014382
Pipet-Lite LTS פיפטה L-200XLS+Rainin17014391
Pipet-Lite LTS פיפטה L-20XLS+Rainin17014392
Quadro MACS מגנטMiltenyi Biotec130-091-051
RPMI בינוני 1640 (1x)Gibco21870-076חנות ב-4 מעלות; C
TempAssure 0.2 מ"ל PCR 8 רצועות צינורארה"ב Scientific1402-4700
כתם כחול טריפן 0.4%Thermo Fisher ScientificT10282
ערכת דיסוציאציה של גידולים, HumanMiltenyi Biotec130-095-929חנות ב -20 & deg; C, הכינו אנזימים לפי הוראות הערכה:
הרכיבו מחדש את בקבוקון האנזים H הליופילי ב-3 מ"ל של RPMI 1640
הרכיבו מחדש את בקבוקון האנזים הליופילי R ב-2.7 מ"ל של RPMI 1640
הרכיבו מחדש את בקבוקון האנזים הליופילי A ב-1 מ"ל של Buffer A שסופק עם הערכה.
ערכת דיסוציאציה של גידולים, עכברMiltenyi Biotec130-096-730חנות ב -20 & deg; C, הכינו אנזימים לפי הוראות הערכה:
הרכיבו מחדש את בקבוקון האנזים הליופילי D ב-3 מ"ל של RPMI 1640
הרכיבו מחדש את בקבוקון האנזים הליופילי R ב-2.7 מ"ל של RPMI 1640
הרכיבו מחדש את בקבוקון האנזים הליופילי A ב-1 מ"ל של מאגר A שסופק עם הערכה.
UltraPure מים מזוקקיםInvitrogen10977-015חנות ב-4 מעלות; ג
צנטריפוגה

מקורות

  1. Liu, C., Yang, M., Zhang, D., Chen, M., Zhu, D. Clinical cancer immunotherapy: Current progress and prospects. Front Immunol. 13, 961805(2022).
  2. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Commun Signal. 18 (1), 59(2020).
  3. Sun, G., et al. Single-cell RNA sequencing in cancer: Applications, advances, and emerging challenges. Mol Ther Oncolytics. 21, 183-206 (2021).
  4. Huang, D., et al. Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research. J Hematol Oncol. 16 (1), 98(2023).
  5. Ottaiano, A., et al. From chaos to opportunity: decoding cancer heterogeneity for enhanced treatment strategies. Biology. 12 (9), 1183(2023).
  6. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
  7. Erfanian, N., et al. Deep learning applications in single-cell genomics and transcriptomics data analysis. Biomed Pharmacother. 165, 115077(2023).
  8. Jovic, D., et al. Single-cell RNA sequencing technologies and applications: A brief overview. Clin Transl Med. 12 (3), e694(2022).
  9. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell RNA sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  10. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  11. Sade-Feldman, M., et al. Defining T cell states associated with response to checkpoint immunotherapy in melanoma. Cell. 176 (1-2), 404(2019).
  12. Pelka, K., et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer. Cell. 184 (18), 4734-4752 (2021).
  13. Bill, R., et al. CXCL9:SPP1 macrophage polarity identifies a network of cellular programs that control human cancers. Science. 381 (6657), 515-524 (2023).
  14. Al'Khafaji, A. M., et al. High-throughput RNA isoform sequencing using programmed cDNA concatenation. Nat Biotechnol. 42 (4), 582-586 (2024).
  15. Xing, Y., et al. The effect of cell isolation methods on the human transcriptome profiling and microbial transcripts of peripheral blood. Mol Biol Rep. 48 (4), 3059-3068 (2021).
  16. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Curr Opin Hematol. 28 (3), 221-229 (2021).
  17. Fan, X. -J., et al. Impact of cold ischemic time and freeze-thaw cycles on RNA, DNA and protein quality in colorectal cancer tissues biobanking. J Cancer. 10 (20), 4978-4988 (2019).
  18. LoCoco, P. M., et al. Reliable approaches to extract high-integrity RNA from skin and other pertinent tissues used in pain research. Pain Rep. 5 (2), e818(2020).
  19. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  20. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), (2023).
  21. Janssen, P., et al. The effect of background noise and its removal on the analysis of single-cell expression data. Genome Biol. 24 (1), 140(2023).
  22. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  23. Sutermaster, B. A., Darling, E. M. Considerations for high-yield, high-throughput cell enrichment: fluorescence versus magnetic sorting. Sci Rep. 9 (1), 227(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

פירוק רקמת גידולהכנת תרחיף תאיםדגימות גידול אנושיותדגימות גידול מעכבריםפירוק מכניפירוק אנזימטיליזיס של כדוריות דם אדומותהעשרה של תאים חיים ומתיםספירת תאים באמצעות המוציטומטר
דיסוציאציה של דגימות רקמת גידול בבני אדם ובעכברים לצורך ריצוף RNA חד-תאי
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.