Method Article

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים

DOI:

10.3791/66771

⸱

May 3rd, 2024

 , 
1Department of Biochemistry, University of Zaragoza, 2Institute for Biocomputation and Physics of Complex Systems, University of Zaragoza

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך העשורים האחרונים, הראיות שהצטברו על קיומם של סופרקומפלקסים נשימתיים (SCs) שינו את הבנתנו את ארגון שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה, והולידו את הצעת "מודל הפלסטיות". מודל זה מניח את הדו-קיום של פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בהתאם לרקמה או למצב חילוף החומרים הסלולרי. האופי הדינמי של ההרכבה ב-SCs יאפשר לתאים לייעל את השימוש בדלקים זמינים ואת יעילות העברת האלקטרונים, למזער את ייצור מיני החמצן הריאקטיביים ולהעדיף את יכולתם של התאים להסתגל לשינויים סביבתיים.

לאחרונה דווח על חריגות בהרכבת SC במחלות שונות כגון הפרעות נוירודגנרטיביות (אלצהיימר ופרקינסון), תסמונת בארת', תסמונת לי או סרטן. התפקיד של שינויים הרכבה SC בהתקדמות המחלה עדיין צריך להיות מאושר. עם זאת, הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות כדי לקבוע את מצב הרכבה SC הוא לעתים קרובות אתגר. זה קורה עם ביופסיה או דגימות רקמה קטנות או שיש לחלק אותן לניתוחים מרובים, עם תרביות תאים שיש להם צמיחה איטית או מגיעים מהתקנים מיקרופלואידים, עם כמה תרביות ראשוניות או תאים נדירים, או כאשר יש לנתח את ההשפעה של טיפולים יקרים מסוימים (עם ננו-חלקיקים, תרכובות יקרות מאוד וכו '). במקרים אלה נדרשת שיטה יעילה וקלה ליישום. מאמר זה מציג שיטה המותאמת להשגת שברים מיטוכונדריאליים מועשרים מכמויות קטנות של תאים או רקמות כדי לנתח את המבנה והתפקוד של SCs מיטוכונדריאליים על ידי אלקטרופורזה טבעית ואחריה בדיקות פעילות בג'ל או כתם מערבי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סופרקומפלקסים (SCs) הם קשרים על-מולקולריים בין קומפלקסים בודדים של שרשרת הנשימה 1,2. מאז הזיהוי הראשוני של SCs ותיאור הרכבם על ידי קבוצת Schägger 2,3, שאושר מאוחר יותר על ידי קבוצות אחרות, נקבע כי הם מכילים מתחמי נשימה I, III ו- IV (CI, CIII ו- CIV, בהתאמה) בסטואיכיומטריות שונות. ניתן להגדיר שתי אוכלוסיות עיקריות של SCs, אלה המכילות CI (ו- CIII בלבד או CIII ו- CIV) ובעלות משקל מולקולרי גבוה מאוד (MW, החל ~ 1.5 MDa עבור SC הקטן יותר: CI + CIII2) ואלה המכילות CIII ו- CIV אך לא CIV, עם גודל קטן בהרבה (כגון CIII2 + CIV עם ~ 680 kDa). SCs אלה מתקיימים יחד בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי עם קומפלקסים חופשיים, גם בפרופורציות שונות. לכן, בעוד CI נמצא בעיקר בצורותיו הקשורות (כלומר, ב- SCs: ~ 80% בלב בקר ויותר מ -90% בסוגי תאים אנושיים רבים)3, CIV שופע מאוד בצורתו החופשית (יותר מ -80% בלב בקר), כאשר CIII מראה התפלגות מאוזנת יותר (~ 40% בצורתו החופשית השופעת יותר, כעמום, בלב בקר).

בעוד קיומם מקובל כיום, תפקידם המדויק עדיין נתון לוויכוח 4,5,6,7,8,9,10. על פי מודל הפלסטיות, פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בודדים יכולים להתקיים בהתאם לסוג התא או למצב המטבולי 1,7,11. אופי דינמי זה של ההרכבה יאפשר לתאים לווסת את השימוש בדלקים זמינים ואת היעילות של מערכת הזרחן החמצוני (OXPHOS) בתגובה לשינויים סביבתיים 4,5,7. SCs יכולים גם לתרום לשליטה בקצב ייצור מיני חמצן תגובתי ולהשתתף בייצוב ותחלופה של קומפלקסים בודדים 4,12,13,14. שינויים בסטטוס ההרכבה של SC תוארו בהקשר של מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים15,16 ועם תהליך ההזדקנות17.

לפיכך, שינויים בדפוסי SC תוארו בשמרים בהתאם למקור הפחמן המשמש לצמיחה2 ובתאי יונקים בתרבית כאשר גלוקוז מוחלף בגלקטוז4. שינויים דווחו גם בכבד עכברים לאחר צום8 ובאסטרוציטים כאשר חמצון חומצות השומן המיטוכונדריאלי נחסם18. בנוסף, ירידה או שינויים ב- SCs ו- OXPHOS נמצאו בתסמונת בארת19, אי ספיקת לב20, מספר הפרעות מטבוליות21 ונוירולוגיות 22,23,24, וגידולים שונים 25,26,27,28 . השאלה אם שינויים אלה בהרכבה וברמות SC הם הגורם העיקרי או מייצגים השפעות משניות במצבים פתולוגיים אלה עדיין נחקרת15,16. מתודולוגיות שונות יכולות לתת מידע על הרכבה ותפקוד של SCs; אלה כוללים מדידות פעילות 8,29, ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי30,31 ופרוטאומיקה32,33. חלופה שימושית שנמצאת בשימוש הולך וגובר ומהווה את נקודת המוצא לחלק מהמתודולוגיות שהוזכרו לעיל היא הקביעה הישירה של מצב הרכבה SC על ידי אלקטרופורזה מקורית כחולה (BN) שפותחה למטרה זו על ידי קבוצתו של Schägger34,35.

גישה זו דורשת פרוצדורות ניתנות לשחזור ויעילות כדי להשיג ולהמיס קרומי מיטוכונדריה וניתן להשלים אותה על ידי טכניקות אחרות כגון ניתוח פעילות בג'ל (IGA), אלקטרופורזה מממד שני וכתם מערבי (WB). מגבלה במחקרים על דינמיקת SC על ידי אלקטרופורזה BN יכולה להיות כמות התאים ההתחלתיים או דגימות רקמות. אנו מציגים סדרה של פרוטוקולים לניתוח הרכבה ותפקוד SC, המותאמים לשיטות הקבוצה של Schägger, שניתן ליישם על דגימות תאים או רקמות טריות או קפואות החל מ -20 מ"ג רקמה בלבד.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: ההרכב של כל אמצעי התרבות והמאגרים מצוין בטבלה 1 ופרטים הקשורים לכל החומרים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד מיטוכונדריה מתרבית תאים

הערה: נפח התאים המינימלי שנבחן היה ~30-50 μL של תאים ארוזים (שלב 1.4). זה יכול להתאים בערך לשניים או שלושה לוחות תרבית תאים בקוטר 100 מ"מ או לצלחת אחת בקוטר 150 מ"מ ב-80-90% מהמפגש, תלוי בסוג התא (בין 5 × 10,6 ו-10,7 תאים בתאים שמקורם ב-L929 או MDA-MB-468). שבירת תאים יעילה היא שלב קריטי.

  1. לגדל תאים נצמדים לכ-80% מפגש או תאים מרחפים לצפיפות נאותה.
  2. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות (ישירות מתרחיף התא במקרה של תאים שאינם דבקים או לאחר טריפסיניזציה סטנדרטית עם תמיסת טריפסין-EDTA של 0.05% טריפסין ו 0.02% EDTA ב 1x PBS, במקרה של תאים דבקים).
  3. לשטוף תאים 2x עם קר 1x PBS ולשקוע אותם על ידי צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 5 דקות.
    הערה: מנקודה זו, יש לבצע את כל השלבים ב- 4 °C. לכן, כל הריאגנטים חייבים להיות קרים והצינורות המכילים תאים או מיטוכונדריה חייבים להישמר על קרח.
  4. לאחר הצנטריפוגה השנייה, השליכו את הסופרנטנט, העריכו את נפח כדורי התא (cpv), והקפיאו את התאים בטמפרטורה של -80°C למשך 15 דקות לפחות כדי להקל על שבירת הממברנה בשלב 1.8.
    הערה: ניתן לעצור את הפרוטוקול בשלב זה ולאחסן את התאים בטמפרטורה של -80°C למשך שבועות. בדרך כלל, 10 או 15 מ"ל צינורות מדורגים עם תחתיות חרוטיות מתאימים.
  5. תנו לתאים להפשיר לאט על קרח.
  6. השהה מחדש את גלולת התא הארוזה בנפח של חיץ היפוטוני השווה ל- 7x cpv (10 mM MOPS, 83 mM סוכרוז, pH 7.2) (למשל, 100 μL של תאים ארוזים ב- 700 μL של חיץ).
    הערה: עוצמת הקול חייבת להספיק כדי להשיג פופים יעילים (ראה הערה בשלב 1.8).
  7. מעבירים את תרחיף התא לתוך הומוגנייזר Potter-Dounce בגודל המתאים ונותנים לתאים להתנפח על ידי דגירה עליהם בקרח למשך 2 דקות. לדוגמה, עבור נפח של 700-800 μL של השעיית התא, הומוגנייזר קיבולת 1 מ"ל מספיק.
  8. שברו את קרומי התא על ידי ביצוע שמונה עד עשר פעימות בהומוגנייזר המחובר למזיק טפלון מונע מנוע המסתובב ב-600 סל"ד.
    הערה: בעת ביצוע השבץ, חשוב ליצור ואקום שיגביר את יעילות שבירת התאים יחד עם פעולות היפוטוניות והקפאה לנפיחות ושבריריות הממברנות, בהתאמה. אם זה נעשה היטב, צליל "פופ" יישמע בעת משיכת הומוגנייזר עם תנועה מהירה בכל שבץ.
  9. הוסף את אותו נפח של חיץ היפרטוני לתרחיף התא (פי 7 מה-cpv) (MOPS של 30 mM, סוכרוז של 250 mM, pH 7.2) כדי ליצור סביבה איזוטונית.
  10. מעבירים את ההומוגנאט לצינור 10-15 מ"ל וצנטריפוגה ברוטור קבוע ב 1,000 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    הערה: הצינור המקורי המכיל את התאים שלא נשברו יכול לשמש למטרה זו.
  11. מעבירים את הסופרנטנט, המכיל את החלק המיטוכונדריאלי, לצינורות פוליפרופילן בנפח 1.5 מ"ל.
  12. אופציונלי: כדי להגדיל את תפוקת המיטוכונדריה, השהה מחדש את הגלולה משלב 1.10 בפי 7 מנפח כדורי התא של חיץ A (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M סוכרוז, pH 7.4) על ידי צנרת למעלה ולמטה וצנטריפוגה ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C. שלב את הסופרנאטנט החדש עם הקודם לפני שתמשיך לשלב 1.13.
  13. צנטריפוגה במיקרופוגה ב 16,000 × גרם במשך 2 דקות ב 4 ° C כדי לאסוף את החלק הגולמי המיטוכונדריאלי.
  14. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש כל גלולה מועשרת במיטוכונדריה עם 0.5 מ"ל של חיץ A המשלב את התוכן של שני צינורות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 1.13. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
  15. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה הסופית עם 300 מיקרוליטר של חיץ A, וכמתו את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות מבחן ברדפורד. צנטריפוגה שוב כמו קודם ולהמשיך לסעיף 3.

2. בידוד מיטוכונדריה מכמויות קטנות של רקמות בעלי חיים

הערה: כמות הרקמה המינימלית ליישום פרוטוקול זה בביטחון מסוים תלויה בסוג התא ובשפע המיטוכונדריאלי שלו, אך יכולה להיות ~ 20-30 מ"ג רקמה ברוב המקרים. דגימות הרקמה יכולות להיות חומר טרי או דגימות קפואות. במקרה האחרון, לאפשר את הדגימות להפשיר חיץ הומוגניזציה להציב על קרח לפני תחילת ההליך.

  1. לשקול או להעריך קרוב ככל האפשר את כמות (מ"ג) של רקמה.
  2. חותכים את הרקמה עם זוג מספריים ולעשות 3-4 שטיפות בחיץ הומוגניזציה בעזרת מסננת דואג למנוע לאבד את החתיכות הקטנות יותר.
    הערה: שלב זה חשוב יותר ברקמות כמו שרירי השלד או הלב מאשר במוח או ברקמות רכות יותר שהתאים שלהן יכולים להתפרק בקלות ישירות על ידי שלב ההומוגניזציה.
  3. הוסף מדיום הומוגניזציה טרי (4 מ"ל לגרם כבד, 10 מ"ל לגרם לב, רקמת שומן חומה (BAT) או שריר, ו-5 מ"ל לגרם מוח או כליה; ראה הרכב חיץ ספציפי לכל מקרה בטבלה 1).
  4. העבירו את פיסות הרקמה עם חיץ להומוגנייזר ועקבו אחר פרוטוקול ההומוגניזציה ובידוד המיטוכונדריה האופטימלי בהתאם לרקמה שנבחרה.
  5. בידוד מיטוכונדריה מהכבד, הטחול והכליות
    1. הומוגניזציה עם ארבע עד שש משיכות מעלה ומטה באלווג'ם-פוטר עם טפלון מונע מנוע ב-600 סל"ד.
    2. מעבירים את הרקמה ההומוגנית לצינור צנטריפוגה סטרילי. צנטריפוגה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. מלא 1.5 מ"ל צינורות פוליפרופילן עם supernatant שהושג בשלב הקודם. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-16,000 × גרם במיקרופוגה ב-4°C והמשך לאחר מכן כמתואר קודם (שלבים 1.13 עד 1.15)
  6. בידוד מיטוכונדריה מדגימות לב ושרירים
    1. הומוגניזציה עם שש עד שמונה פעימות באלווג'ם-פוטר עם טפלון מונע מנוע ב-600 סל"ד. מעבירים את הרקמה ההומוגנית לצינור צנטריפוגה סטרילי.
    2. צנטריפוגה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. יוצקים את supernatant לתוך נקי 1.5 מ"ל צינורות פוליפרופילן.
      הערה: הומוגניזציה שנייה של הגלולה המתקבלת בשלב 2.6.2 יכולה להתבצע עם 4-5 פעימות נוספות ו-1/2 נפח של חיץ הומוגניזציה כדי להגדיל את התפוקה המיטוכונדריאלית. ניתן לשלב את הסופרנאטנט החדש (לאחר צנטריפוגה שוב ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C) עם הקודם לפני שממשיכים לשלב 2.6.3. חלופה להגדלת תפוקת המיטוכונדריה הגולמי היא לנתק דגימות רקמת לב ושריר בתמיסת טריפסין לפני הומוגניזציה36,37. במקרה זה, יש להשבית / להסיר את הטריפסין ביעילות לפני שהקרומים המיטוכונדריאליים מסיסים בדיגיטונין (שלב 3.2).
    3. צנטריפוגה ב 16,000 × גרם במיקרופוגה במשך 2 דקות ב 4 ° C כדי לקבל את החלק המיטוכונדריאלי הגולמי.
    4. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש כל גלולה מועשרת במיטוכונדריה עם 0.5 מ"ל של חיץ AT המשלב את התוכן של שני צינורות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 2.6.3. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
    5. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה הסופית עם 300 מיקרוליטר של חיץ A (ללא BSA), וכמתו את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות מבחן ברדפורד. צנטריפוגה שוב כמו קודם ולהמשיך לסעיף 3.
  7. בידוד מיטוכונדריה מהמוח
    1. הומוגניזציה של חתיכות המוח עם 10-15 שבץ באמצעות הומוגנייזר זכוכית מסוג Dounce עם מזיק זכוכית מונע ידנית. מעבירים את הרקמה ההומוגנית לצינור צנטריפוגה סטרילי.
    2. צנטריפוגה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. אספו את הסופרנאטנט לתוך צינור צנטריפוגה נקי.
    4. להשהות מחדש את הגלולה שהושגה בשלב הצנטריפוגה הקודם באותו נפח של AT בינוני המשמש הומוגניזציה הראשונה. הומוגניזציה מחדש של הגלולה על ידי חזרה על התהליך המתואר בשלב 2.7.1 באמצעות 5-10 מעברים וצנטריפוגה את המתלה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. הסר את supernatant ולהוסיף אותו לתוך הצינור מוכן בשלב 2.7.3. צנטריפוגה ב 10,000 × גרם ברוטור זווית קבועה במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לקבל את החלק המיטוכונדריאלי הגולמי.
    6. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את הגלולה ל-1/2 מנפח ההומוגניזציה הראשוני (שלב 2.7.1) של AT. פזרו את המתלה המיטוכונדריאלי לצינורות פוליפרופילן נקיים בנפח 1.5 מ"ל ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 16,000 × גרם במיקרופוגה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4°C.
    7. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש כל גלולה מועשרת במיטוכונדריה עם 0.5 מ"ל של חיץ AT המשלב את התוכן של שני צינורות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 2.7.6. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
    8. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה הסופית עם 300 מיקרוליטר של חיץ A (ללא BSA), וכמתו את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות מבחן ברדפורד. צנטריפוגה שוב כמו קודם ולהמשיך לסעיף 3.
  8. בידוד מיטוכונדריה מ-BAT
    1. הומוגניזציה עם שמונה עד עשר משיכות מעלה ומטה באלווג'ם-פוטר עם טפלון מונע מנוע ב-600 סל"ד. מעבירים את הרקמה ההומוגנית לצינור צנטריפוגה סטרילי.
    2. צנטריפוגה ברוטור מתנדנד ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    3. מלאו 1.5 מ"ל צינורות פוליפרופילן עם supernatant שהושג בשלב הקודם הימנעות שכבת השומן העליונה.
      הערה: הומוגניזציה שנייה של הגלולה המתקבלת בשלב 2.8.2 יכולה להתבצע כדי להגדיל את התשואה המיטוכונדריאלית. ניתן לשלב את הסופרנאטנט החדש (לאחר צנטריפוגה שוב ב-1,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס) עם הקודם לפני שממשיכים לשלב 2.8.4.
    4. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-16,000 × גרם למשך 2 דקות במיקרופוגה ב-4°C.
    5. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש כל גלולה מועשרת במיטוכונדריה עם 0.5 מ"ל של חיץ AT2 המשלב את התוכן של שני צינורות לאחד וצנטריפוגה באותם תנאים כמתואר בשלב 2.8.4. חזור על אותו תהליך עד שכל החומר נמצא בצינור אחד בלבד.
    6. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה הסופית עם 300 מיקרוליטר של חיץ A (ללא BSA), וכמתו את ריכוז החלבון המיטוכונדריאלי באמצעות מבחן ברדפורד. צנטריפוגה שוב כמו קודם ולהמשיך לסעיף 3.

3. הכנת דגימות לניתוח Blue Native

  1. יש להשהות מחדש את השברים המיטוכונדריאליים (המתקבלים מתרביות תאים או רקמות של יונקים) במאגר דגימת BN (50 mM NaCl, 50 mM Imidazole, 5 mM חומצה אמינוקפרואית, 4 mM PMSF) כדי לקבל ריכוז חלבון של כ -10 מ"ג / מ"ל. ראו טבלה 2 לתפוקות צפויות עבור סוגי הדגימות השונים.
  2. מסיסים את קרומי המיטוכונדריה על ידי הוספת דיגיטונין (10% תמיסת מלאי) לקבלת יחס של 4 גרם דיגיטונין/גרם של חלבון מיטוכונדריאלי (4 מיקרוליטר של דיגיטונין, 10% מלאי עבור 10 מיקרוליטר של התרחיף המיטוכונדריאלי שהוכן בשלב 3.1).
    הערה: יש למטב את יחס הדטרגנט לחלבון (g/g) עבור כל סוג דגימה כדי לקבל תוצאות הניתנות לשחזור; 2-8 גרם של digitonin/g של חלבון מיטוכונדריאלי נמצא אופטימלי עבור רוב הרקמות34,35.
  3. מערבבים בעדינות למעלה ולמטה. דגרו דגימות על קרח במשך 5 דקות.
    הערה: לאחר שלב זה, המתלה המיטוכונדריאלי אמור להיות ברור יותר (לעבור מאטום לשקוף); אחרת, זה יכול להצביע על כך שכמות חומר הניקוי אינה מספיקה למסיסות נכונה של הממברנה.
  4. צנטריפוגה במלוא המהירות במיקרופוגה (20,000 × גרם בערך) למשך 25 דקות ב-4°C להסרת חומר בלתי מסיס.
  5. אספו את הסופרנאטנט בצינור טרי. הוסף לסופרנאטנט נפח של 5% G-250 (Coomassie Blue G-250 5% בחומצה אמינוקפרואית 0.75 M) שווה ערך ל-1/3 מנפח התרחיף הראשוני (שלב 3.1, זה יתאים ליחס סופי של 1.6 גרם קומאסי/גרם חלבון) וערבב על ידי פיפטינג.
  6. יש לשמור על קרח לפני העמסה על הג'ל או להקפיא aliquots ב -80 ° C.

4. אלקטרופורזה ג'ל מקורית כחולה

הערה: האלקטרופורזה מבוצעת בחדר הקר (4-8 מעלות צלזיוס). אם אין מתקן חדר קר, ניתן להכניס בלוק קירור במיכל האלקטרופורזה. מסחרי 3-13% ג'ל פוליאקרילאמיד טבעי29 משמשים, אבל ג'לים תוצרת בית של ריכוזי שיפוע הרצוי ניתן להשתמש גם38,39.

  1. טען את החדרים העליונים והתחתונים עם קתודה קרה A ומאגרי אנודה, בהתאמה. לחלופין, טען את הדגימות בבארות לפני מילוי זהיר של החדר העליון בחיץ קתודה A.
    הערה: מאגרי אלקטרופורזה מסחריים משמשים במעבדה שלנו, אך ניתן להכין אותם כפי שמצוין בטבלה 1.
  2. יש להעמיס בין 30 ל-100 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי.
    הערה: בדרך כלל, 30-50 מיקרוגרם חלבון (עבור WB), או 40-100 מיקרוגרם חלבון (עבור IGA) נטענים לכל באר בג'ל 10 נתיבים (0.5 x 0.15 ס"מ בארות). חיץ קתודה מכיל Coomassie Blue G-250 ובעל צבע כחול עז המקשה לראות את בארות הג'ל להעמסת דגימה. זה נוח לסמן את המרכז של כל באר, עם סמן אדום, למשל, כדי לעזור בהצבת קצה פיפטה במהלך שלב זה. סמני משקל מולקולריים מקוריים יכולים להיות שימושיים בעת הגדרת טכניקת BN-PAGE כדי לאשר כי ג'ל שיפוע נוצרו כראוי וכי קומפלקסים ודפוס SCs הוא הנכון.
  3. הפעל ב 80-100 V במשך 25-30 דקות ולאחר מכן ב 160-180 V, הגבלת הזרם ל 12 mA / ג'ל, עד הצבע מגיע לתחתית הג'ל (~ 125-165 דקות בסך הכל).
  4. אם יש לבצע בדיקות פעילות בג'ל (IGAs), יש להחליף את החיץ הקתודה A בחיץ קתודה B כאשר חזית הצבע נמצאת באמצע הג'ל (~1 שעה לאחר תחילת הריצה).
    הערה: למרות שניתן לתעד את הג'לים ללא כל הכתמה מיד לאחר הריצה מכיוון שחלק מהרצועות נראות לעין (בעיקר V מורכב, שיכול להיחשב כיצרן "פנימי" עם MW של ~ 600 kDa) בשל קשירתם לצבע G-250, בדרך כלל, SCs וקומפלקסים בודדים לא יהיו גלויים ללא כתמים או בדיקות IGA. אין להכתים או לתקן את הג'לים לשימוש במבחני IGA או עבור WB.
  5. יש לפרק את הג'ל מהקלטת ולהמשיך עם צביעה כחולה של קומאסי (סעיף 5), ניתוח IGA (סעיף 6) או זיהוי חיסוני WB (סעיף 7).

5. צביעת ג'ל

  1. צבעו את הג'ל למשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) באמצעות תמיסות צבע כחול של קומאסי (צבע קומאסי R-250 ב-0.25% ב-40% מתנול, 10% חומצה אצטית; כתם למשך 10-15 דקות).
  2. יש להכתים במספר שטיפות (בדרך כלל 4-5 x 15 דקות) ב-40% מתנול בתוספת 10% חומצה אצטית ב-RT.
  3. תעדו את הג'ל.

6. במבחני פעילות ג'ל (IGA)

  1. הכינו פתרונות IGA לניתוח מתחמי הנשימה השונים לפני סוף האלקטרופורזה ותשמרו עליהם בחושך (באמצעות קופסאות פלסטיק בצבע כהה או כיסויים ברדיד אלומיניום, למשל). הרכבו של כל חיץ מפורט בטבלה 1.
  2. הניחו את הג'ל או את הנתיבים לשימוש בקופסת פלסטיק קטנה ככל האפשר כדי להכיל אותה.
  3. הוסף נפח מספיק של התמיסה המתאימה כדי לכסות את הג'ל (בדרך כלל 5 או 10 מ"ל עבור 5 או 10 נתיבי ג'ל, בהתאמה) ודגור ב- RT עם ניעור עדין (60-80 סל"ד) והרחק מאור.
    הערה: זמן הדגירה תלוי במתחם שיש לנתח ובאופי וכמות הדגימה שהועמסה; CI ו- CIV הם הקלים והמהירים ביותר לתת תוצאות. לכן, פעילות CI בדרך כלל תתחיל להיות גלויה לאחר מספר דקות, בעוד CII ו CIV צריך ~ 30 דקות כדי להיות נצפה CV ~ 1.5-2 שעות. התגובה יכולה להימשך שעות בכל המקרים וניתן להפחית את קצב הגברת האות על ידי העברת הדגירה לחדר קר (4-6 מעלות צלזיוס), למשל, לדגירת לילה (ON). פעילות CIII פועלת רק עבור אלקטרופורזה מקומית ברורה (CN), לא עבור BN34.
  4. כאשר התפתחו הפסים המתאימים, הפסיקו את התגובות על ידי הסרת תמיסות הבדיקה, שטיפה 2x במים מזוקקים, וקיבוע הג'ל עם 40% מתנול בתוספת 10% חומצה אצטית (למעט CV אשר קבוע רק עם מתנול) למשך 30 דקות.
    1. כדי לנתח את פעילות ה-CIV לאחר זיהוי CI על ידי IGA, שטפו את הג'ל 2x במים מזוקקים, תיעדו את פעילות ה-CI, דגרו על הג'ל (מבלי לתקן אותו!) עם חיץ אשלגן פוספט של 50 מילימטר (pH 7.2) 2x למשך 30 דקות, ולאחר מכן עם מאגר התגובה המלא של CIV עד להופעת רצועות IV מורכבות (בדרך כלל על ידי דגירה ON ב-RT או 4°C).
  5. תעדו את הג'לים.
    הערה: עבור פעילות ATPase, מכיוון שהרצועות המפותחות הן לבנות, בעת תיעוד הג'ל, הניחו אותו על רקע כהה כך שהרצועות השקופות יהיו גלויות.

7. ניתוח כתמים מערביים

  1. הכינו את חיץ ההעברה לפי טבלה 1 ושמרו על טמפרטורה של 4°C עד סוף האלקטרופורזה.
  2. מניחים את הג'ל במגש ומוסיפים מאגר העברה. יש לדגור ב-RT למשך 10-15 דקות.
  3. חותכים חתיכת קרום PVDF באותו גודל כמו הג'ל ומפעילים אותו מתנול במשך 10 שניות תחת תסיסה. שטפו מספר פעמים במים מזוקקים והוסיפו מאגר העברה. יש לדגור ב-RT במשך 10-15 דקות עם רעידות עדינות.
  4. מכינים את כריך ההעברה, מלמטה למעלה, ונמנעים מבועות בין הג'ל לממברנה, בסדר הבא: צד שחור של קסטה-ספוג-נייר כתמים-ג'ל-ממברנה-נייר כתמים- צד ספוג-שקוף של קלטת.
  5. סוגרים ונועלים את הקלטת ומכניסים את הכריך למיכל ההעברה בכיוון הנכון להעברה (צד שחור לכיוון הקוטב השלילי).
  6. מלא את מיכל ההעברה במאגר העברה, הוסף מערבל מגנטי כדי לעורר את המאגר, וחבר את ספק הכוח ב- 80 V למשך שעתיים או ב- 100 V למשך שעה אחת. בצע את ההעברה בין 4 ל 8 ° C (למשל בחדר קר) ועם בלוק קירור במערכת ההעברה.
  7. יש לאחזר את הממברנה ולהמשיך בפרוטוקול כתם מערבי סטנדרטי, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים לזיהוי מתחמי הנשימה השונים29.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תפוקת המיטוכונדריה המתקבלת בעקבות הפרוטוקולים המתוארים לעיל משתנה בהתאם למספר גורמים כגון קו התא או סוג הרקמה, אופי הדגימות (כלומר, אם נעשה שימוש ברקמות טריות או קפואות), או יעילות תהליך ההומוגניזציה. יבולים צפויים של מיטוכונדריה מקווי תאים ורקמות שונים נאספים בטבלה 2. לאחר קבלת השברים המיטוכונדריאליים, השלב הבא הוא ניתוח דפוס SCs נשימתיים, המבוצע לאחר מסיסות הדגימה המיטוכונדריאלית הגולמית וההפרדה האלקטרופורטית על ידי BN-PAGE ואחריו ניתוח IGA או זיהוי חיסוני WB. איור 1 מראה את ההיבט של נתיבי ג'ל לא מוכתמים מיד לאחר הריצה, ואת תבנית הפסים לאחר צביעת קומאסי סטנדרטית של קו תאים בתרבית ודגימת מיטוכונדריה של כבד עכבר.

באיור 2A,B ניתן להבחין בהבדלים ברורים בין תבניות ההרכבה של SC בתאי אדם ועכבר לאחר שימוש במבחני IGA. לכן, קומפלקס חופשי I נצפה בתאי עכבר בעוד שהוא אינו ניתן לגילוי במיטוכונדריה אנושית. תבנית קומפלקס IV-IGA דומה מאוד בשני קווי התאים האנושיים (איור 2B), בעוד שהיא מציגה הבדלים בין שני קווי תאי העכבר שנותחו באיור 2A. הבדלים אלה נובעים מהעובדה שתאי BL6 מבטאים גרסה מוטנטית של SCAF18.

דפוסי SC, המתקבלים עם הפרוטוקול לבידוד מיטוכונדריאלי המתואר כאן לעבודה עם דגימות קטנות, נשמרים ביחס לפרוטוקולים "הקונבנציונליים" המשמשים לדגימות גדולות יותר. ניתן לראות זאת באיור 2C, על-ידי השוואת נתיבים 1 ו-6 (שהתקבלו לאחר בידוד מיטוכונדריאלי באמצעות פרוטוקול קונבנציונלי מ-3 גרם כבד ו-1.1 גרם BAT) עם, בהתאמה, נתיבים 2 ו-5 (שהתקבלו באמצעות הפרוטוקולים שהוצגו כאן מסביבות 0.1 גרם של שתי הרקמות). כפי שהוצע במודל הפלסטיות, החלק היחסי של מתחמי נשימה ו- SCs משתנה בהתאם לסוג התא ולמצב המטבולי. כפי שניתן לראות באיור 2C,D, הרקמות השונות מראות דפוסי הרכבה שונים של SC. לפיכך, מיטוכונדריה במוח מראים רמות נמוכות מאוד של קומפלקס I חופשי ושיעור גבוה יותר של SCs בהשוואה לרקמות אחרות, ו-BAT מאופיין ברמות נמוכות של CV (איור 2A) ובכמויות גבוהות של SC III + IV (איור 2D). מיטוכונדריה בלב מציגים רמות גבוהות של SCs ו-CV. דפוסי הרכבת CV דומים מאוד בין קו התאים בתרבית לבין דגימת מיטוכונדריה של כבד עכבר (איור 2E).

WB יכול גם לנתח את הרכבת SC כפי שמוצג באיור 3 עבור שתי דגימות שהתקבלו מבקרת הטחול ומתאי גידול. במקרה זה, 30-50 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי הם בדרך כלל מספיק כדי לזהות את קומפלקסים שונים SCs עם נוגדנים ספציפיים. איור 4 מראה כמה מהמלכודות העיקריות שיכולות להתרחש במהלך היישום של הפרוטוקולים האלה. שיפועי ג'ל שגויים יכולים לייצר דפוסי נדידה חריגים ולא רצויים כמו באיור 4A, נתיב 1, שבו ה-SCs נשארים קרובים לבאר בחלק העליון של הנתיב עקב ריכוז אקרילאמיד גבוה מהרגיל בג'ל. הדגירה של הדגימות, אפילו לזמנים קצרים יחסית, בטמפרטורות גבוהות (כאן 37°C ו-40°C למשך 10 דקות) גורמת להתכלות של SCs ו-CI (איור 4A , נתיבים 2-4). כמו כן, יחס דטרגנט לחלבון הוא קריטי לתוצאות טובות ורזולוציית ג'ל נאותה. מתחת ליחס של 2 גרם של דיגיטונין/גרם חלבון, רזולוציית הפס מופחתת בהדרגה ובריכוז הנמוך יותר (0.5 גרם/גרם) ניתן לראות רק כתם באזור המתאים ל-SCs (איור 4B).

figure-results-1
איור 1: תבנית של קומפלקסים וסופר-קומפלקסים מיטוכונדריאליים לאחר הפרדת BNGE של מיטוכונדריה חדירה לדיגיטונין מקו תאי תרבית (L929Balbc) ומכבד עכבר. הנתיבים משמאל (1 ו-2) מייצגים את ההיבט של הג'ל הלא מוכתם מיד לאחר הריצה, שם ניתן לזהות רק קורות חיים, ואילו הנתיבים מימין (3 ו-4) מראים את תבנית הפסים לאחר צביעת קומאסי. קיצורים: BNGE = אלקטרופורזה ג'ל מקורי כחול; CV = V מורכב; SCs = קומפלקסים-על. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: ניתוח IGA של מיטוכונדריה שבודדו מקווי תאים שונים ומרקמות עכבר שונות. (A,B) פעילות בג'ל של הקומפלקסים המצוינים במיטוכונדריה שבודדו מ-(A) עכבר או (B) קווי תאים אנושיים. L929Balbc הוא קו תאים טרנסוכונדריאלי שנוצר במעבדה שלנו על ידי העברת מיטוכונדריה מטסיות עכבר Balb/cJ לתאי ρ°L929neo כפי שתואר קודם40,41. פיברובלסטים BL6 הם קו תאים אימורטלי שנוצר במעבדה שלנו מביופסיה באוזן של עכבר BL6. (C) תבניות CI-IGA ממיטוכונדריה של עכברים שבודדו בשיטה קונבנציונלית המתחילה ב-3 גרם כבד (נתיב 1) ו-1.1 גרם BAT (נתיב 6) או בפרוטוקול המוצג כאן ומתחילה בכ-0.1 גרם רקמה בכל המקרים (נתיב 2, כבד; נתיב 3, לב; נתיב 4, מוח ונתיב 5 BAT). (D) תבניות CIV-IGA (מבוצעות לאחר CI-IGA המוצגות בלוח 2C, נתיבים 2-5) בכבד, בלב, במוח ובמיטוכונדריה של עכברים. (E) פעילות CV-IGA המנותחת בתאי תרבית עכבר ובכבד. בסביבות 60-75 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי בכל נתיב הועמסו. קיצורים: IGA = פעילות בג'ל; SCs = קומפלקסים-על; CI = קומפלקס I; BAT = רקמת שומן חומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: זיהוי חיסוני WB של קומפלקסים מיטוכונדריאליים וסופרקומפלקסים שונים בדגימות טחול. לאחר הפרדת Blue Native PAGE של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ו-SCs שהתקבלו מדגימות בקרת טחול (Spleen M9) וגידול (Tumor M9), הם הועברו לקרום PVDF והכלאה רציפה עם נוגדנים המזהים את תת-היחידות CI, CIII, CIV ו-CII שצוינו (לוחות A-D, בהתאמה). בסביבות 50 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי הועמסו בכל נתיב. כוכביות מציינות את האות שנותר מכתם מערבי קודם. קיצורים: SC = סופר-מורכב; CI = קומפלקס I; CIII = קומפלקס III; CIV = קומפלקס IV; CII = קומפלקס II. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: מלכודות בניתוח SC על-ידי Blue-Native PAGE. CI IGA-אנליזה של מיטוכונדריה שבודדו מ-(A) כבד עכבר טרי ו-(B) כבד חולדה קפוא בתנאי מסיסות שונים. (A) נתיב 1, ריכוז שיפוע ג'ל שגוי (8-13% במקום 3-13% הרגיל). נתיבים 2-4, דגימות מודגרות במשך 10 דקות על קרח או ב 37 ° C ו 40 ° C לפני הטעינה, בהתאמה. (B) תבנית אחרי IGA עבור CI של מיטוכונדריה המתקבלת מכבד חולדה קפוא באמצעות יחסי דיגיטונין/חלבון שונים למסיסות. קיצורים: SC = סופר-מורכב; PAGE = אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד; CI = קומפלקס I; IGA = פעילות בג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בינוניהרכב
חיץ היפוטוני10 מ"מ MOPS, 83 מ"מ סוכרוז, pH 7.2
חיץ היפרטוני30 mM MOPS, 250 mM סוכרוז, pH 7.2
חוצץ הומוגניזציה A10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M סוכרוז, pH 7.4
חוצץ הומוגניזציה AT225 מ"מ מניטול, 1 מ"מ EGTA, 75 מ"מ סוכרוז, 0.01% BSA pH 7.4
חוצץ הומוגניזציה AT2225 מ"מ מניטול, 1 מ"מ EGTA, 75 מ"מ סוכרוז, 0.02% BSA pH 7.4
מאגר דגימות BN50 mM NaCl, 50 mM Imidazole, 2 mM חומצה Aminocaproic, 1 mM EDTA pH 7.0
תמיסת דיגיטונין10% דיגיטונין ב-50 מ"מ NaCl, 50 מ"מ אימידזול, 5 מ"מ אמינוקפרואיק, 4 מ"מ PMSF
מאגר טעינה BN5% קומאסי כחול G ב-0.75 מטר חומצה אמינוקפרואית
חיץ קתודה BN A50 mM טריצין, 15 mM Bis-Tris pH = 7.0 (4 ° C), 0.02% G-250 (Coomassie מבריק כחול G-250)
חיץ קתודה BN B50 מ"מ טריצין, 15 מ"מ ביס-טריס pH=7.0 (4 °C), 0.002% G-250
מאגר אנודה BN50 מ"מ ביס-טריס, pH=7.0
מצע IGA קומפלקס I5 מ"מ Tris-HCl pH 7.4, 0.1 מ"ג/מ"ל NADH, 2.5 מ"ג/מ"ל טטרזוליום Nitroblue (NBT)
מצע IGA קומפלקס II50 מ"מ אשלגן פוספט חוצץ pH 7.4, 20 mM נתרן סוקצינאט, 0.2 mM פנזין מתוסולפט (PMS), 2.5 מ"ג / מ"ל NBT
מצע IGA קומפלקס III50 mM אשלגן פוספט חיץ pH 7.2, 0.05% diaminobenzidine (DAB)
מצע IGA קומפלקס IVאותו פתרון כמו CIII בתוספת 50 מיקרומטר ציטוכרום c
מצע IGA קומפלקס V35 mM Tris, 270 mM גליצין pH 8.3, 14 mM MgSO4, 0.2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP
פתרון צביעהצבע קומאסי R-250 ב-0.25% ב-40% מתנול ו-10% חומצה אצטית
פתרון הקמה/תיקון40% מתנול, 10% חומצה אצטית
מאגר העברה48 מ"מ טריס, 39 מ"מ גליצין, 20% מתנול

טבלה 1: מאגרים והרכב מדיה.

סוג תא/רקמהסכום התחלתיתפוקה צפויה (מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי)מספר נתיבים (50-60 מיקרוגרם לנתיב)
תאים בתרבית
מד"א-MB-468100 μL vpc300-400 מיקרוגרם6-9
נגזר 143B100 μL vpc200-350 מיקרוגרם4-7
פיברובלסטים של עכבר100 μL vpc150-200 מיקרוגרם3-5
לב100 מ"ג400-500 מיקרוגרם10-12*
שרירי השלד100 מ"ג300-400 מיקרוגרם8-10*
כבד100 מ"ג400-500 מיקרוגרם8-10
טחול50 מ"ג150-250 מיקרוגרם3-5
עטלף100 מ"ג200-300 מיקרוגרם4-6
מוח100 מ"ג250-300 מיקרוגרם5-8

טבלה 2: תפוקות צפויות של מיטוכונדריה מסוגי תאים שונים ומרקמות עכבר שונות. השברים המיטוכונדריאליים המתקבלים משרירי הלב או השלד טהורים יותר מאלה המתקבלים מרקמות אחרות. לכן, כמויות קטנות יותר ניתן לטעון בג'לים (*).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתאמות המתודולוגיות שהוכנסו בפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו למנוע הפסדים ולהגדיל את התשואה תוך שמירה על פעילויות מורכבות במיטוכונדריה (שהיא חיונית כאשר הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות נפגעת) ולשחזר את התבנית הצפויה של SCs ברקמה או בקו התא (ראו איור 2C). למטרה זו ומכיוון שלא נדרש טוהר מיטוכונדריאלי גבוה כדי לזהות כראוי את ה-SCs, מספר השלבים, הזמנים והנפחים הופחתו בכל פעם שהדבר היה אפשרי.

כך, לאחר הומוגניזציה וסילוק גרעינים ותאים בלתי שבורים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, הסופרנאטנטים המכילים את המיטוכונדריה מועברים לצינורות פוליפרופילן בנפח 1.5 מ"ל, והצנטריפוגות הבאות להשגת שברי המיטוכונדריה הגולמי מבוצעות במיקרופוגה על ידי הגברת המהירות והפחתת הזמנים והנפחים ביחס לפרוטוקולים קונבנציונליים. זה מאפשר עיבוד של מספר דגימות בזמן קצר יחסית: הערכה קרובה היא שניתן לעבד 10 דגימות ב~2-2.5 שעות (מתחילת ההומוגניזציה (שלב פרוטוקול 1.6. או שווה ערך לרקמות) ועד להשגת חלק SCs מוכן לטעינה בג'ל (שלב פרוטוקול 3.7) וממזער את ההפסדים תוך שמירה על פעילויות. שינוי נוסף ביחס לפרוטוקולים הקבוצתיים המקוריים של Schägger הוא להחליף, לאחר מסיסות הממברנה עבור קבלת שבר SCs, צעד אולטרה-צנטריפוגה בצנטריפוגה מיקרופוגה פשוטה (פרוטוקול שלב 3.4).

ישנם כמה שלבים קריטיים בהליך. ראשית, יעילות שבירת תאים, במיוחד במקרה של תאים בתרבית (ראה הערה לאחר פרוטוקול שלב 1.8) ובמיוחד במקרה של תאים קטנים. רקמות וקווי תאים מציגים דרגת קושי משתנה בשבירת תאים: לדוגמה, בלב ובשריר, שלב זה הוא בדרך כלל פחות יעיל מאשר בכבד או בטחול, אך הוא מפוצה בתשואה מכיוון שלראשונים יש תוכן מיטוכונדריאלי גבוה יותר. חלופה אחת לשיפור תפוקת המיטוכונדריה כאשר מבודדים משריר או לב תהיה טיפול בדגימות עם טריפסין לפני הומוגניזציה. המוח הוא רקמה נוספת המציגה יעילות נמוכה בשבירת תאים בגלל ההומוגניזציה הידנית, שהיא מתונה יותר ויעילה פחות וכנראה גם בגלל השונות הגבוהה יותר בסוגי התאים ברקמה זו, כפי שדווח בעבר 42. ניתן לפצות על כך חלקית על ידי שלב הומוגניזציה שני כפי שמוצע בפרוטוקול שלנו (שלב 2.7.4). מצד שני, אם שבירת התאים מוגזמת, הדגימה הסופית המכילה SCs עלולה להיות מזוהמת במקטעי דנ"א גרעיני שעלולים להפריע לפעולה האלקטרופורטית. בעיה זו מוצגת כעלייה בצמיגות הדגימה כאשר מוסיפים דיגיטונין כדי להמיס את קרומי המיטוכונדריה וניתן לפתור אותה על ידי טיפול ב- DNAse I.

שנית, אם יחס הדטרגנט לחלבון נמוך מדי, התוצאה תהיה מסיסות פחות יעילה של הממברנה ואפשרות להיווצרות אגרגטים. זה יכול להראות בג'לים כרזולוציה ירודה ב-SCs בעלי משקל מולקולרי גבוה (ראו איור 4) או כ-CIV הנותן פסים מרובים המתאימים לאוליגומרים43. אם היחס גבוה מדי, זה יכול להוביל לפירוק של SCs (בעיקר CI-SCs). שלישית, חשוב להימנע מחימום דגימות במהלך כל התהליך (ראו איור 4) ולהימנע ממחזורים חוזרים ונשנים של הקפאה-הפשרה, שכן הם עלולים להשפיע על מצב ההרכבה של SC.

בטבלה 2 מוצג סיכום של התשואות הצפויות עבור מספר סוגי תאים ודגימות רקמות. הערכים משוערים ויהיו תלויים ביעילות שבירת התא ובאופי המקור. במקרה של רקמות, אם חומר המוצא קפוא הוא נוטה לתת תשואה גבוהה יותר מאשר עם דגימות טריות. מוצגת הערכה של מספר הנתיבים (בהתחשב בעומס בין 50 ל-60 מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי לכל נתיב) שניתן להעמיס.

הפרוטוקולים המוצגים כאן מכסים מגוון רקמות וסוגי תאים בווריאציות קטנות, ניתן להשתמש בהם עם דגימות טריות או קפואות ודורשים ציוד פשוט ועלות נמוכה יחסית, שאינה כרוכה בשימוש בערכות טיהור או שיפועים יקרים. עם זאת, הם עשויים להזדקק להתאמות מסוימות כדי לשמש עם סוגי תאים מסוימים או דגימות, כמו גם כאשר אוכלוסיות מיטוכונדריאליות ספציפיות, כגון מיטוכונדריה סינפטית במוח או מיטוכונדריה subsarcolemmal שרירים, למשל, הם מושא הניתוח.

מאחר שעדיין לא הוגדרו התפקידים הפיזיולוגיים המדויקים, כמו גם המעורבות הפוטנציאלית של SCs במצבים פתולוגיים, יש צורך בניתוח הדינמיקה שלהם והגורמים המשפיעים על הרכבתם, יציבותם ותפקודם. הפרוטוקולים שלנו יכולים לייצג כלים יקרי ערך המאפשרים להשיג תוצאות הניתנות לשחזור על תבניות SCs עם דגימות קטנות וממגוון סוגי תאים ורקמות, במיוחד כאשר יש צורך להשוות בין תנאי ניסוי מרובים29.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מספר "PGC2018-095795-B-I00" מ- Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) ועל ידי מענקים "Grupo de Referencia: E35_17R" ומענק מספר "LMP220_21" מ- Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) ל- PF-S ו- RM-L.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
חומצה אצטיתPanReac131008
חומצה אמינוקפרואיתפלוקה אנליטי7260
ATPסיגמא-אולדריץ'A2383
ביס טריסאקרונים אורגניים327721000
בדיקת ברדפורד Biorad5000002
Coomassie Blue G-250Serva17524
Coomassie Blue R-250Merck1125530025
ציטוכרום cסיגמא-אולדריץ'C2506
דיאמינו  בנזידין (DAB)סיגמא-אולדריץ'D5637
דיגיטוניןסיגמא-אולדריץ'D5628
EDTAPanReac131669
EGTAסיגמא-אולדריץ'E3889
ללא חומצות שומן BSARoche10775835001
GlycinePanReacA1067
הומוגנייזר עלי טפלוןDeltalab196102
ImidazoleSigma-AldrichI2399
K2HPO4PanReac121512
KH2PO4PanReac121509
MannitolSigma-AldrichM4125
מתנולLabkemMTOL-P0P
MgSO4PanReac131404
Mini Trans-Blot CellBioRad1703930
MOPSSigma-AldrichM1254
MTCO1 נוגדן חד שבטיInvitrogen459600
NaClSigma-AldrichS9888
NADHRoche10107735001
NativePAGE 3 עד 12% מיני ג'ל חלבוןInvitrogenBN1001BOX
תוסף NativePAGE Cathode Buffer (20x)InvitrogenBN2002
NativePAGE מאגר ריצה (20x) InvitrogenBN2001
NDUFA9 נוגדן חד שבטיInvitrogen459100
Nitroblue מלח טטרזוליום (NBT)Sigma-AldrichN6876
Pb(NO3)2Sigma-Aldrich228621
PDVF ממברנהAmersham10600023
Phenazine methasulfate (PMS)Sigma-AldrichP9625
Pierce ECL מצעתרמו מדעי32106
PMSFMerckPMSF-RO
SDHA נוגדן חד שבטיInvitrogen459200
נתרן סוקסינטסיגמא-אולדריץ'S2378
סטרפטומיצין/פניציליןPAN ביוטקP06-07100
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S3089
TrisPanReacA2264
UQCRC1 נוגדן חד שבטיInvitrogen459140
XCell  SureLock Mini-CellInvitrogen  EI0001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  2. Schagger, H., Pfeiffer, K. Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria. EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).
  3. Schagger, H., Pfeiffer, K. The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).
  4. Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
  5. Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).
  6. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  7. Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes. EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).
  8. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  9. Milenkovic, D., et al. Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes. Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).
  10. Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).
  11. Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. Clinical Bioenergetics. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).
  12. Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain. Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).
  13. Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role. Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).
  14. Lopez-Fabuel, I., et al. Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).
  15. Mukherjee, S., Ghosh, A. Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases. Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).
  16. Nesci, S., et al. Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology. Life (Basel). 11 (3), 242(2021).
  17. Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex. Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).
  18. Morant-Ferrando, B., et al. Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition. Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).
  19. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients. J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).
  20. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  21. Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).
  22. Gonzalez-Rodriguez, P., et al. Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism. Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).
  23. Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).
  24. Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging. Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).
  25. Hollinshead, K. E. R., et al. Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer. Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).
  26. Ikeda, K., et al. Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance. Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).
  27. Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer. Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).
  28. Marco-Brualla, J., et al. Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells. Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).
  29. Moreno-Loshuertos, R., et al. How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria. Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).
  30. Vonck, J., Schafer, E. Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane. Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).
  31. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  32. Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
  33. Gonzalez-Franquesa, A., et al. Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity. Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis. Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).
  35. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  36. Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. J Vis Exp. (49), e2452(2011).
  37. Lai, N., et al. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).
  38. Schagger, H. Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes. Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).
  39. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
  40. Chomyn, A., et al. Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers. Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).
  41. Moreno-Loshuertos, R., et al. Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants. Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).
  42. Celis, J. E. Cell Biology (Third Edition). , Academic Press. 69-77 (2006).
  43. Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial IsolationMitochondrial SupercomplexesBlue Native ElectrophoresisSmall Tissue SamplesCell Culture MitochondriaSupercomplex AssemblyIn Gel Activity AssayMitochondrial Protein QuantificationElectron Transport ChainRespiratory Supercomplexes

Related Articles