בידוד, טיהור וזיהוי של Bacillus licheniformis המייצר בציטראצין מצואה טרייה של חזירים בריאים

סיכום

פרוטוקול זה מספק תיאור מלא ומקיף של התהליך המפורט לבידוד, טיהור וזיהוי של Bacillus licheniformis המייצר בציטראצין מצואת חזירים בריאה.

תקציר

ל-Bacillus licheniformis ול-bacitracin יש שוק יישומים עצום וערך בתחומי הרפואה, הכימיה, החקלאות הימית, החקלאות החקלאית ומוצרי צד. לכן, יש חשיבות רבה לבחירה של B. licheniformis עם ייצור גבוה של בציטראצין. בפרוטוקול ניסיוני זה, בצילוס עם תפוקה גבוהה של בציטראצין בודד, טוהר וזוהה מצואה טרייה של חזירים בריאים. נבדקה גם ההשפעה המעכבת של מטבוליט משני בציטראצין על Micrococcus luteus . כרומטוגרפיה בשכבה דקה וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים שימשו לזיהוי איכותי וכמותי של בציטרצין. המאפיינים הפיזיולוגיים והביוכימיים של B. licheniformis נקבעו על ידי ערכות רלוונטיות. הקשרים הפילוגנטיים של B. licheniformis נקבעו ונבנו באמצעות זיהוי רצף גנים. פרוטוקול זה מתאר ומציג את תהליך הבידוד, הטיהור והזיהוי הסטנדרטי של B. licheniformis מצואה טרייה של בעלי חיים מנקודות מבט מרובות, ומספק שיטה לניצול בקנה מידה גדול של B. licheniformis ו-bacitracin במפעלים.

מבוא

בצילוס ליכניפורמיס (שם מדעי: Bacillus licheniformis) הוא מין של בצילוס ממשפחת הפירמיקטיים, הנפוץ באופן נרחב בסביבות שונות כגון מים, אדמה ומעיים^{של בעלי} חיים. ל-B. licheniformis מבנה דמוי מוט קצר וחזק והוא נע בנפרד². המושבה כמעט עגולה ומשעממת, עם בליטה מרכזית וקצוות מסודרים בצבע לבן^{אפרפר 3}. יש לו יכולת צמיחה ורבייה חזקה והוא יכול לספוג ולנצל חומרים מזינים ממקורות פחמן שונים, כגון חד סוכרים, פוליסכרידים, קטוז וחומצות אורגניות⁴. בשלב מאוחר יותר של גדילה והתפתחות, B. licheniformis יכול להתקיים בצורה של נבגים רדומים ולייצר חומרים אנטיבקטריאליים כמו בציטראצין, ליצ'ניסין וסורפקטין. זה יכול גם להתנגד למחסור תזונתי ולסביבה חיצונית קיצונית⁵. אין העדפה ברורה של קודון, ומערכת ההפרשה היעילה קובעת את הפרשת החלבון ההטרולוגית של B. licheniformis, שהיא כפולה מזו של Bacillus subtilis⁶. הוא משמש לעתים קרובות לייצור תכשירי אנזימים כגון פרוטאז, עמילאז וצלולאז⁷. בגלל היעדר רעלנים אנדוגניים, הוא מאושר כזן בטוח למזון ומופיע ב-QPS על ידי EFSA⁸. לכן, ישנם מספר שימושים פוטנציאליים, כולל ייצור תרכובות ביו-אקטיביות, שיש להם מגוון רחב של יישומים בתעשיות החקלאות הימית, החקלאות, המזון, הביו-רפואה והתרופות. כמו כן, B. licheniformis הוא מרכיב חשוב בפלורת המעיים של בעלי חיים, שיכול לקדם בעלי חיים לשיפור ביצועי הייצור, שיפור איזון חיידקי המעיים ומניעת מחלות. כל הגנום של B. licheniformis ATCC14580 נותח בשנת 2004, ומידע הרקע של תרגום השעתוק, קיפול החלבון ומנגנון ההפרשה הובן בהדרגה⁹. מידע גנטי זה הופך אותו לתורם לשינוי גנטי ברמה המולקולרית, ותורם להקלה על ייצור בקנה מידה גדול של B. licheniformis.

Bacitracin היא אנטיביוטיקה פפטידית דודקציקלית המיוצרת על ידי סינתטאז פפטיד שאינו ריבוזומלי על ידי חילוף חומרים משני ב-B. subtilis ו-B. licheniformis. בציטראצין הוא תערובת המורכבת ממרכיבים שונים כגון בציטראצין A, B ו-C, כאשר חומצת אמינו אחת או שתיים נבדלות בין כל מרכיב; מבין אלה, לבציטרצין A יש את הפעילות הביולוגית החזקה ביותר¹⁰. בציטראצין יכול לעכב חיידקים גרם חיוביים כגון סטפילוקוקוס ומיקרוקוקוס לוטאוס וכמה חיידקים גרם שליליים על ידי עיכוב היווצרות דופן התא ואינטראקציה עם חלבונים קושרי ממברנה¹¹. בינתיים, בציטראצין בטוח ויציב, לא קל לייצר עמידות לתרופות, ויכול להיות תואם לתרופות אנטיבקטריאליות אחרות¹². לכן, בציטראצין משמש בפרקטיקה רפואית ווטרינרית. בנוסף, בגלל קצב החיסול המהיר וקצב הספיגה הנמוך, הוא יכול לשמש גם כתוסף למזון לבעלי חיים¹³.

B. licheniformis יכול ליישב את המעי ולשפר את המיקרו-סביבה של מערכת העיכול. יכולת ההדבקה והרבייה והתפקודים הפיזיולוגיים הקשורים של בצילוס ממקורות שונים במערכת העיכול של בעלי חיים שונים שונים. B. licheniformis שמקורו בחזיר תורם יותר להתיישבות במעיים של חזירים ובעלי חיים אחרים. קיים קשר הדוק בין השפע היחסי של פרוביוטיקה במעי לבין המצב הבריאותי של מארח¹⁴. תוסף תזונה עם תערובת B. licheniformis בחזירונים נגמלים משפר את המערכת האקולוגית של המעי על ידי שינוי הרכב המיקרוביוטה והפעילות המטבולית, ומשפיע גם על רירית המעי¹⁵. צואת בעלי חיים יכולה לשקף את סוג וכמות פלורת המעיים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והטיהור של Bacillus spp. המייצר בציטראצין מצואת חזירים בריאה. הצואה מופקת מזרעי טאיהו שאינם ניזונים ממזון מורכב ויש להם ביצועי ייצור מצוינים בחוות חזירים. המבודדים זוהו כ-B. licheniformis על סמך המאפיינים המורפולוגיים שלהם, התכונות הפיזיקוכימיות והזיהוי הביוכימי שלהם.

פרוטוקול

כל הליכי הניסוי תועדו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת נאנג'ינג טק. הצואה הופקה מזרעי טאיהו בני כשנתיים (ראו טבלת חומרים), שגודלו בחוות חזירים מקצועיות וסטנדרטיות.

1. הכנת מדיה

1. מדיום נוזלי Luria-Bertani (LB): יש להוסיף 10 גרם NaCl, 5 גרם אבקת תמצית שמרים ו-10 גרם טריפטון לבקבוק חרוטי, להוסיף מים מזוקקים ל-1 ליטר, לערבב ולהמיס בעזרת מוט זכוכית. העבירו 100 מ"ל בינוני לבקבוק חרוטי של 500 מ"ל וקשרו אותו היטב עם סרט איטום נושם. יש לעקר בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס בחיטוי למשך 20 דקות (ראה טבלת חומרים).
2. מדיום מוצק LB: יש להוסיף 10 גרם NaCl, 5 גרם אבקת תמצית שמרים, 10 גרם טריפטון, 20 גרם אבקת אגר לבקבוק חרוטי, להוסיף מים מזוקקים ל-1 ליטר, להמיס עם מוט זכוכית ולקשור היטב עם סרט איטום נושם. מעקרים ב-121 מעלות צלזיוס בחיטוי למשך 20 דקות. כשהמדיום מקורר ל -50 מעלות צלזיוס, יוצקים 20 מ"ל מהמדיום לצלחות פטרי, מניחים להם להתקרר ואז מאחסנים אותם הפוך.
3. מדיום תסיסה של בציטראצין: מוסיפים 8 גרם קמח סויה, 4 גרם עמילן מסיס, 0.1 גרם (NH₄)₂SO₄, 0.6 גרם CaCO₃ ו-100 מ"ל מים מזוקקים לבקבוק חרוטי של 500 מ"ל, מערבבים עם מוט זכוכית להמסה יסודית, וקושרים היטב עם סרט איטום נושם. יש לעקר בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס בחיטוי למשך 20 דקות (ראה טבלת חומרים).
4. תרחיף M. luteus: בחר טבעת של M. luteus וחסן על צלחת תרבית LB, שהוכנה בשלב 1.2 (ראה טבלת חומרים). תרבית בחממה בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות (ראה טבלת חומרים). יש להוסיף 5 מ"ל של מי מלח רגילים לצלחת ולנער בעדינות כדי לנקות את המושבות. מדוד את ה-OD600 ודלל את התמיסה במבחנה כדי לקבל תרחיף עם OD600 של 0.3-0.7. אחסן את התרחיף של M. luteus ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
5. מדיום בדיקת פעילות אנטיבקטריאלית: הוסף 1 מ"ל של תרחיף M. luteus , שהוכן בשלב 1.4, ל-100 מ"ל של מדיום מוצק LB נוזלי שהוכן בשלב 1.2 ונער מעט. יש ליטול מיד 5 מ"ל של תמיסה זו המכילה M. luteus ולמרוח אותה באופן שווה על צלחת התרבית LB.

2. בידוד וטיהור של בצילוס מצואה טרייה של חזירים בריאים

1. הוסף 9 מ"ל מי מלח רגילים ו -1.0 גרם צואת חזירים טרייה לבקבוק ארלנמאייר בנפח 150 מ"ל. מערבבים עם מערבל מגנטי (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר ב-60 סל"ד/דקה למשך 15 דקות.
2. הכניסו את תמצית הצואה לאמבט מים תרמוסטט של 80 מעלות צלזיוס (ראו טבלת חומרים) למשך 20 דקות כדי להרוג חיידקים שאינם מייצרים נבגים.
3. הוסף את המתלה ל-100 מ"ל של מדיום נוזלי LB בבקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל ותרבית בשייקר (ראה טבלת חומרים) ב-180 סל"ד/דקה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות.
4. בצע דילול סדרתי של תמיסת החיידקים המתורבתת במי מלח רגילים ^{מ-10-1 ל-10-8}. מרחו 0.1 מ"ל של מדלל חיידקים ^10-6, ^{10-7 ו-10-8} על צלחות תרבית LB בודדות והניחו להתייבש. לאחר 10 דקות, הניחו צלחות הפוכות באינקובטור בטמפרטורה קבועה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
5. השתמשו בטבעת החיסון כדי לבחור את המושבות שנראות דומות ל-B. licheniformis (צבע לבן קרמי, עקביות רכה, מראה רירי, קמור וגובה שטוח וצורה לא סדירה)¹⁶ופס אותן באמצעות תבנית זיגזג על מדיום בדיקת פעילות אנטיבקטריאלית שהוכן בשלב 1.5 (ראו איור 1).
6. הכניסו את הצלחות לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ושימו לב אם יש אזור עיכוב סביב המושבה.

3. סינון לעיכוב פעילות M. luteus

1. בחר מושבה בודדת שיצרה אזור מעכב והוסף ל-100 מ"ל של מדיום נוזלי LB, תרבית בשייקר ב-37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד/דקה למשך 12 שעות.
2. יש לחסן 5 מ"ל ממדיום התרבית למדיום התסיסה של בציטראצין שהוכן בשלב 1.3 ולתרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
3. אוספים את מרק התסיסה בצינור צנטריפוגה וצנטריפוגה ב-13,400 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן מסננים באמצעות קרום פילטר מיקרופורוס של 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
4. הוסף אוקספורד לצלחת בינונית לבדיקת פעילות אנטיבקטריאלית טרייה ולאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטר של פילטראט (סופרנטנט תסיסה) לכוס אוקספורד (ראה טבלת חומרים). תרבית בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לאחר הדגירה יש למדוד את קוטר האזור המעכב בעזרת קליפר ורניר (ראה טבלת חומרים).
5. בחר את הזנים ואת סופרנטנט התסיסה המתאים עם קוטר אזור מעכב גדול מ-15 מ"מ לניסויים הבאים.

4. זיהוי בציטראצין על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה

1. הוסף 60 מ"ג של תקן בציטראצין והמיס ב-1% EDTA-2Na (ראה טבלת חומרים) בבקבוק נפחי של 10 מ"ל כדי ליצור תמיסת בציטראצין של 6.0 מ"ג/מ"ל.
2. יש לדלל 1 מ"ל של חומר התסיסה ל-10 מ"ל עם 1% EDTA-2Na. נקודה של 5 מיקרוליטר של דגימה ו-5 מיקרוליטר של תמיסה סטנדרטית של בציטראצין על צלחת השכבה הדקה של סיליקה ג'ל פעיל (ראה טבלת חומרים).
3. הוסף 100 מ"ל של n-בוטנול-חומצה אצטית-מים-פירידין-אתנול (60:15:10:6:5) למיכל הכרומטוגרפי (ראה טבלת חומרים). הנח את צלחת השכבה הדקה של סיליקה ג'ל לתוך המיכל הכרומטוגרפי. מכסים ונותנים לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
4. הוציאו את צלחת השכבה הדקה של סיליקה ג'ל, רססו תמיסת בוטנול-פירידין (99:1) המכילה 1% נינהידרין (ראו טבלת חומרים), וחממו בחום של 105 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עד להופעת כתמים אדומים חומים. חשב R_f (ערך גורם שמירה) עבור התקן והמדגם לפי הנוסחה הבאה:
   R_f = מרחק נסיעה נקודתי/מרחק נסיעה ממס.

5. איתור בציטראצין על ידי HPLC

1. הוסף 0.3 מ"ל של סופרנטנט תסיסה ו-1.2 מ"ל של 50% אתנול לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 2 מ"ל, לנער במשך 5 דקות ביד ולהניח לעמוד על 4 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
2. צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 15 דקות ומסנן לבקבוק דגימה המסומן כ-S1 עם קרום מסנן מיקרו-נקבובי של 0.22 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים).
3. הכנת תמיסת אם בציטרצין: הוסף 0.4 גרם תקן בציטראצין (60 U/mg; ראה טבלת חומרים), 100 מ"ל של 40 גרם/ליטר EDTA-2Na (ראה טבלת חומרים) לבקבוק נפחי של 100 מ"ל להכנת תמיסת אם בציטראצין של 240 U/mL.
4. הוסף 3 מ"ל של תמיסת אם בציטראצין ו-21, 9, 3, 1 ו-0 מ"ל של מים טהורים במיוחד למבחנות המסומנות A1, B1, C1, D1 ו-E1, בהתאמה. לאחר סינון עם קרום מסנן מיקרופורי של 0.22 מיקרומטר, הכניסו את המסנן לבקבוקי דגימה המסומנים A2, B2, C2, D2 ו-E2.
   הערה: הריכוזים של תמיסה סטנדרטית של בציטראצין הם 30, 60, 120, 180 ו-240 U/mL.
5. הנח את A2, B2, C2, D2, E2 ו-S1 לתוך מגש הבדיקה של מכשיר ה-HPLC. הנח 1000 מ"ל של פורמט אמוניום של 50 מ"מ/ליטר ו-1000 מ"ל של אצטוניטריל במגש הפאזה הנייד והגדר אותם כשלבים ניידים A ו-B, בהתאמה.
   הערה: יש להתאים את ה-pH של פורמט אמוניום ל-4.0 עם חומצה פורמית.
6. התקן את עמודת HPLC C18 (5 מיקרומטר, 4.6 מ"מ x 250 מ"מ) בכיוון המצוין בעמודה (ראה טבלת חומרים).
7. הגדר את פרמטרי הפאזה הניידת כ- 0 דקות, 77% A ו- 23% B; 30 דקות, 70% A ו-30% B; 40 דקות, 60% A ו-40% B; 50 דקות, 60% A ו-40% B; 51 דקות, 77% A ו-23% B; 58 דקות, 77% A ו-23% B. הגדר את גודל המדגם כ-100 מיקרוליטר; קצב זרימה, 1.0 מ"ל לדקה; טמפרטורת העמודה, 30 מעלות צלזיוס.
8. לחץ על כפתור ההפעלה כדי להפעיל את התוכנית.

6. זיהוי מורפולוגי

1. יש לדלל ולצפות את הזן בטיטר הבציטרצין הגבוה ביותר על צלחת תרבית LB ותרבית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לצבוע ולהתבונן במורפולוגיה של המושבה כמתואר להלן.
2. הוסף טיפת מים מטוהרים סטריליים למגלשה, הרם כמות קטנה של מושבות והוסף לטיפת המים. מורחים באופן שווה, נותנים לשקופית להתייבש באופן טבעי ואז מקבעים מעל להבה.
3. הוסף סגול קריסטל למשך דקה אחת כדי להכתים את הדגימה ולאחר מכן שטוף במי ברז. הוסף יוד למשך דקה אחת כדי להכתים את הדגימה ולאחר מכן שטוף במים מזוקקים.
4. יש להוסיף 95% אלכוהול, לנער את השקף עד להסרת צבע למשך דקה אחת, ולאחר מכן לשטוף במים מזוקקים.
5. הוסף זעפרן למשך דקה אחת כדי להכתים את הדגימה ולאחר מכן שטוף במים מזוקקים. הניחו למגלשה להתייבש באופן טבעי והתבוננו במורפולוגיה של המושבה תחת מיקרוסקופ עם טבילת שמן (ראו טבלת חומרים).

7. זיהוי פיזיולוגי וביוכימי

1. הוסף 2 מ"ל של מי מלח סטריליים למבחנה וחסן מושבה בודדת מהצלחת לתמיסת המלח הסטרילית באמצעות טבעת חיסון לקבלת תרחיף חיידקים.
2. הוסף 100 מיקרוליטר של תרחיף החיידקים לכל חור למדידת V-P, ציטראט, ג'לטין, 7% נתרן כלורי, pH 5.7, הפחתת חנקות והידרוליזה של עמילן על רצועת הזיהוי הביוכימית של Bacillus (ראה טבלת חומרים).
3. השתמש בטבעת החיסון כדי לבחור מושבה בודדת נוספת ולפס אותה בתבנית הזיגזג על הצינור הביוכימי של הצמיחה האנאירובית של רצועת הזיהוי הביוכימית של Bacillus .
4. השתמש בטבעת החיסון כדי לבחור את המושבות האחרות ולנקב אותן אנכית לתוך הנקבוביות לזיהוי פרופיונט, D-xylose, L-arabinose ו-D-מניטול ברצועת הזיהוי הביוכימית של Bacillus .

8. קביעת רצף הגנים של הזן

1. חלץ את ה-DNA של הזן באמצעות ערכת מיצוי DNA של חיידקים (ראה טבלת חומרים): הוסף 2 מ"ל של נוזל זרעים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 5 מ"ל וצנטריפוגה ב-11,500 x גרם למשך דקה אחת. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו לגלולה 110 מיקרוליטר של מאגר (המכיל 20 מ"מ טריס, pH8.0; 2 מ"מ Na 2-EDTA ו-1.2% טריטון) ו-70 מיקרוליטר של תמיסת ליזוזים של 50 מ"ג/מ"ל ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
2. מוסיפים 4 מיקרוליטר של 100 מ"ג/מ"ל RNase A למשך 15 שניות ומשאירים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 20 מיקרוליטר תמיסת פרוטאינאז K ומערבבים היטב.
3. הוסף 220 מיקרוליטר של מאגר GB, לנער במשך 15 שניות עד שהגלולה מושעית, להניח בטמפרטורה של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להבהיר את התמיסה, ולבצע סיבוב קצר כדי להסיר את חרוזי המים על דופן הצינור.
4. הוסף 220 מיקרוליטר אתנול נטול מים, הלם מלא למשך 15 שניות, הפרדה קצרה. העבירו את התמיסה ואת משקעי הפלוקולציה לעמודת הספיחה CB3 של צינור האיסוף, צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 30 שניות, והשליכו את הסופרנטנט.
5. הוסף 500 מיקרוליטר של GD מאגר לעמודת הספיחה, צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-13,400 x גרם, והשליך את הסופרנטנט. הוסף 600 מיקרוליטר של PW לעמודה, צנטריפוגה למשך 30 שניות ב-13,400 x גרם, והשליך את הסופרנטנט.
6. החזירו את עמודת הספיחה לצינור האיסוף, צנטריפוגה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 13,400 x גרם, והשליכו את הסופרנטנט.
7. הנח את עמוד הספיחה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לייבוש. העבירו את העמודה לצינור הצנטריפוגה והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר TE לאמצע קרום הספיגה.
8. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לאסוף את הזרימה לתוך צינור הצנטריפוגה והצנטריפוגה למשך 2 דקות בטמפרטורה של 13,400 x גרם.
9. הוסף 25 מיקרוליטר של תערובת מאסטר 2x (ראה טבלת חומרים), 2.5 מיקרוליטר של דגימת DNA שהתקבלה בשלב 8.8, 2 מיקרוליטר של פריימר 27F קדימה, 2 מיקרוליטר של פריימר הפוך 1492R ו-18.5 מיקרוליטר של H₂O מזוקק כפול לצינור PCR של 0.1 מ"ל.
   הערה: רצפי הגנים של הפריימרים הם 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ו-1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'.
10. הכנס את צינור ה-PCR למכונת ה-PCR (ראה טבלת חומרים) בתנאים הבאים: קדם-דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. הפעל את מחזור שלושת השלבים של דנטורציה, חישול והארכה למשך 32x.
11. קח 5 מיקרוליטר מהמוצר ובצע אלקטרופורזה עם ג'ל אגרוז 1% ב -120 וולט למשך 30 דקות.
    1. ממיסים 500 מ"ג אגרוז ב-50 מ"ל של מאגר TAE 1x. מחממים את התמיסה במיקרוגל למשך 1-2 דקות עד להמסה מלאה של האגרוז. מוסיפים 5 מיקרוליטר של צבע מכתים DNA, ואז יוצקים למגש ג'ל ומכניסים את לוחית הפתח. מניחים לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עד שהוא מתמצק; הכניסו את הג'ל למיכל האלקטרופורזה והוסיפו 1x מאגר TAE כדי להטביע את הג'ל. הוסף 2 מיקרוליטר של סולם DNA של 2 קילו-בייט (10 מ"ג/מיקרוליטר) לבאר הראשונה ומוצר PCR של 5 מיקרוליטר מעורבב עם 1 מיקרוליטר של צבע טעינה לבארות הנותרות בג'ל.
12. מניחים את הג'ל במערכת הדמיית הג'ל ומצלמים תמונה. חותכים את רצועות ה- DNA במהירות באור אולטרה סגול ומשקלים.
13. הוסף רצועות לצינור מיקרו-צנטריפוגה והוסף נפח שווה של תמיסת PN. שמור את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עד שהג'ל נמס לחלוטין.
14. הוסף 500 מיקרוליטר של נוזל שיווי משקל BL לעמודת הספיחה CA2, צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך דקה אחת, והשליך את הסופרנטנט.
15. הוסף את תמיסת הג'ל המומסת לעמוד הספיחה CA2 והניח אותה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, צנטריפוגה אותה ב-13,400 x גרם למשך 30 שניות, והשליך את הסופרנטנט.
16. הוסף 600 מיקרוליטר של PW לעמודת הספיחה CA2, צנטריפוגה ב-13,400 x g למשך דקה אחת, השליך את הסופרנטנט וחזור על 1x.
17. הנח את עמוד הספיחה CA2 לתוך צינור איסוף, צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 2 דקות, והשליך את הסופרנטנט.
18. הנח את עמוד הספיחה CA2 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לייבוש יסודי ולאחר מכן הכניס אותו לצינור צנטריפוגה נקי.
19. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר EB לסרט הספיחה התלוי בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות, ואסוף את תמיסת ה-DNA על ידי צנטריפוגה ב-13,400 x גרם למשך 2 דקות.
    הערה: התמיסות או הריאגנטים שהוזכרו לעיל כלולים בערכת הטיהור (ראה טבלת חומרים).
    1. שלח את תמיסת ה-DNA שנאספה לחברת ריצוף מקצועית (ראה טבלת חומרים) לריצוף. השווה את תוצאות הריצוף של Blast במסד הנתונים של GenBank של NCBI. על פי הומולוגיה של רצף, בחר זנים שונים ובנה עצים פילוגנטיים בשיטת הסבירות המקסימלית ב-MEGA-X כדי לקבוע את יחסי המינים של הזנים.

תוצאות

בניסוי זה, 48 זנים של בצילוס בודדו מצואה טרייה של חזירים בריאים, שמספרם נע בין 1001 ל-1048. ביניהם, ל-15 זנים הייתה פעילות אנטיבקטריאלית נגד M. luteus. מתוך 15 הזנים, הטיטר של בציטראצין נמדד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים, כפי שמוצג בטבלה 1. ביניהם, ל-B. licheniformis מס' 1026 היה טיטר ה-bacitracin הגבוה ביותר, 456.35 ±-21.75 U/mL, כך שמס' 1026 נבחר לניסויים הבאים.

תוצאות הזיהוי על ידי TLC מוצגות באיור 2A. מיקום הכתמים העיקריים במרק התסיסה של זן מס' 1026 והתמיסה הסטנדרטית של בציטראצין היה זהה, וערך ה-R_היה 0.61. עבור ניתוח HPLC, משוואת העקומה הסטנדרטית של בציטראצין היא y = 50.287x - 250.55, ומקדם המתאם R² = 0.9968 (איור 2B). זמן השיא של סופרנטנט התסיסה היה עקבי עם תקן ה-bacitracin (איור 2C), כך שהחומר הבקטריוסטטי זוהה כ-bacitracin, והטיטר של bacitracin היה 456.35 ±-21.75 U/mL.

המושבה של זן מס' 1026 תורבתה על מדיום LB במשך 12 שעות, כפי שמוצג באיור 3A. המושבה הייתה עגולה ושקופה בצורת טיפות מים, עם בליטות מלאות וקצוות מסודרים. בין 12 שעות ל-24 שעות, החיידקים נכנסו לשלבי הגדילה המאוחרים יותר. כפי שמוצג באיור 3B, המושבות התפשטו בצורת שזיף, המרכז נוצר מקופל, והצבע העמיק בהדרגה ללבן חלבי. זה עולה בקנה אחד עם תיאור המורפולוגיה של המושבה של B. licheniformis¹⁶. היה ריר שקוף בקצה. לאחר צביעת גרם, זן מס' 1026 נצפה תחת המיקרוסקופ, כפי שמוצג באיור 3C. התאים היו מוטות סגולים, מה שמעיד על חיידקים גראם-חיוביים.

כפי שמוצג בטבלה 2, זן מס' 1026 יכול לגדול בסביבה אנאירובית. הזן נבדק חיובי לבדיקת V-P, ניצול ציטראט, הפחתת חנקות והידרוליזה של עמילן. הזן הצליח להתפרק ולנצל את רוב מקורות הפחמן. היו לו אותם מאפיינים פיזיולוגיים וביוכימיים כמו B. licheniformis.

גודל שבר ה-16S rDNA של זן מס' 1026 היה בערך 1400 bp (איור 4A). תוצאות הריצוף של זן מס' 1026 הראו דמיון של 99.58% לזה של B. licheniformis DSM 13 ב-GenBank. לאחר מכן נבנה העץ הפילוגנטי, כפי שמוצג באיור 4B. אורך הענף האבולוציוני של B. licheniformis DSM 13 הוא 0.000, מה שמצביע על כך שמדובר ב-B. licheniformis.

בהתבסס על המאפיינים המורפולוגיים, הפיזיולוגיים והביוכימיים של זן מס' 1026 והניתוח ההומולוגיה של רצף הגנים 16S rDNA, זן מס' 1026 זוהה כ-B. licheniformis.

איור 1: תרשים סכמטי של חיסון הזן. טבעת החיסון שימשה לבחירת המושבות ולסימון שלהן בתבנית זיגזג על מדיום בדיקת הפעילות האנטיבקטריאלית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זיהוי חומרים בקטריוסטטיים. (A) כרומטוגרפיה בשכבה דקה. (B) עקומה סטנדרטית HPLC של בציטרצין. (C) כרומטוגרמה HPLC. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מאפיינים מורפולוגיים וצביעה גראם של זן מס' 1026. מורפולוגיה של המושבה ב-(A) 12 שעות ו-(B) 24 שעות. (C) צביעת גרם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: זיהוי ביולוגי מולקולרי של זן מס' 1026. (A) הגברה גנטית של זן מס' 1026 16S rDNA. (B) עץ פילוגנטי מזן מס' 1026. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

לא.	טיטר בציטראצין (U/mL)	לא.	טיטר בציטראצין (U/mL)
1003	423.57±18.62	1021	317.46±13.46
1004	325.82±13.23	1026	456.35±21.75
1009	326.26±14.52	1027	435.57±19.18
1011	376.65±16.11	1030	382.48±17.64
1015	325.27±12.37	1031	215.37±11.73
1016	256.56±15.37	1039	353.67±16.16
1017	352.47±16.47	1041	342.36±14.36
1018	328.73±16.12

טבלה 1: טיטר הבציטרצין של זני פעילות אנטיבקטריאליים.

פריטים	תוצאות	פריטים	תוצאות
בדיקת גדילה אנאירובית	+	בדיקת D-מניטול	+
מבחן סמנכ"ל	+	בדיקת ג'לטין	+
מבחן ניצול ציטראט	+	7% מבחן NaCl	+
מבחן פרופיונאט	+	מבחן pH5.7	+
מבחן D-xylose	+	מבחן הפחתת חנקות	+
ל-ארבינוז	+	בדיקת הידרוליזה של עמילן	+

טבלה 2: זיהוי פיזיולוגי וביוכימי של זן מס' 1026.

דיון

B. licheniformis גדל במהירות בתנאי גידול פשוטים וצריכת סוכר מהירה, וטכנולוגיית התסיסה הבוגרת מסייעת בחיסכון בעלויות הייצור התעשייתי¹³. היישום הנרחב של B. licheniformis והפרשותיו, Bacitracin, קבע את שווי השוק המבטיח שלו. בחקלאות, B. licheniformis משמש כדשן ביולוגי לשיפור צמיחת הצמח וספיגת החומרים המזינים על ידי שיפור פוריות הקרקע, קידום התפתחות השורשים וסיוע בפירוק החומר האורגני¹⁵. לייצור אנזימים תעשייתיים, B. licheniformis מייצר מגוון אנזימים כגון פרוטאזות, עמילאזות, צלולאזות וליפאזות, מה שקובע את שווי השוק שאין לו תחליף בעיבוד מזון, ייצור חומרי ניקוי, עיבוד עור ותעשיית טקסטיל¹⁶. לאור הפעילות הפרמקולוגית האנטיבקטריאלית המעולה של B. licheniformis ו-bacitracin, הוא שימש בתחום הרפואי לטיפול במגוון מחלות זיהומיות הנגרמות על ידי חיידקים ופטריות¹. בינתיים, בהתחשב בגידול צמחי מרפא כמו גם בהצטברות של מרכיבים פעילים פרמקולוגית בצמחים, B. licheniformis הוא משפר פוטנציאלי של צמיחת צמחים כמו גם שימושי לייצור תרכובות כמו סלידרוסיד^17,18 שמקורו ברודיולה. היתרונות הנ"ל של B. licheniformis ו-bacitracin הופכים אותם לשימושיים מאוד בתעשייה, חקלאות, חקלאות ימית, ביוטכנולוגיה ותעשיות רפואיות. לכן, ההפרדה והטיהור של B. licheniformis עם תפוקה גבוהה של בציטראצין הם גורם מכריע בהבטחת ייצור ויישום בקנה מידה גדול לאחר מכן.

למרות שניתן להכין בציטראצין על ידי סינתזה כימית, השלבים מסורבלים, ויש תוצרי לוואי רבים. בתעשייה, בציטראצין מיוצר בעיקר על ידי תהליך מטבולי משני של קמח תירס וקמח סויה המותסס על ידי B. licheniformis. בייצור התעשייתי המודרני של בציטראצין, עלות גבוהה ותשואה נמוכה מעכבים את המשך יישומו¹⁰. לכן, סינון זני בציטראצין בעלי תפוקה גבוהה ושיפור קצב הניצול של חומרי גלם הם המפתח לשיפור ייצור הבציטרצין.

כיום, גידול זני בציטראצין בעלי יבול גבוה הוא בעיקר באמצעות רבייה טבעית מהאדמה ומסביבות אחרות, גידול מוטציות באמצעות זנים קיימים המייצרים בציטראצין, או גידול מבוסס הנדסה גנטית. פעולת הגידול הטבעית פשוטה, ולזנים המוקרנים כושר ייצור יציב, אך התהליך לוקח זמן רב ועומס העבודה גדול. לגידול מוטציות יש שיעור מוטציות גבוה ומקצר את זמן הרבייה, אך ייתכן שהמוטציה לא תוכל לעבור בתורשה יציבה בדורות הבאים¹⁶. גידול מבוסס הנדסה גנטית ממוקד יותר להשגת זנים בעלי יבול גבוה¹⁰, אך ישנם חששות בטיחותיים הנגרמים על ידי החדרת גנים אקסוגניים. צואת בעלי חיים בוגרים בריאים מכילה שפע של משאבים פרוביוטיים שיכולים לשמור על איזון הפלורה.

במאמר זה, בהתבסס על המאפיינים של B. licheniformis לייצור נבגים רדומים בסביבות קיצוניות¹⁹, דילול צואת חזירים בריא הוצב בסביבה בטמפרטורה גבוהה כדי להרוג את החיידקים והפטריות שאינם מייצרי נבגים עמידים בחום. מכיוון ש-M. luteus רגיש לייצור פפטידים בקטריוסטטיים על ידי B. licheniformis בשלב מאוחר של הגידול ומייצר פיגמנט צהוב לצפייה קלה, הוא משמש לסינון הפעילות האנטיבקטריאלית על סמך הערכת אזור העיכוב. על פי המורפולוגיה של המושבה הדומה למורפולוגיה של B. licheniformis, המורפולוגיה של התא היא קצרה בצורת מוט, גראם-חיובית, מאפיינים פיזיולוגיים וביוכימיים של B. licheniformis, 16 s RNA קרוב מאוד ל-B . licheniformis, כדי לקבוע שהזן מס' 1026 הוא B. licheniformis. החומר הבקטריוסטטי זוהה על ידי TLC ו-HPLC כבציטרצין. כך התקבל B. licheniformis המייצר בציטראצין. לשיטה זו יש גם חסרונות, כמו תהליך המיון שלוקח זמן רב והניתוח דורש ניסיון מסוים.

לסיכום, פרוטוקול ניסיוני זה הציג באופן מקיף ומפורט את תהליך הרכישה והזיהוי המעבדתי השגרתי של B. licheniformis המייצר בציטרצין, שיש לו סיכוי יישום רחב וערך שוק שלא יסולא בפז²⁰. שיטות אלה פשוטות, אפשריות וקלות ליישום, וללא ספק יהוו התייחסות יעילה לייצור בקנה מידה גדול של B. licheniformis. מאמר זה מספק גם רעיון סינון לייצור זנים עבור פפטידים אנטי-מיקרוביאליים אחרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2 ופעמים; Phanta פלאש מאסטר מיקס	נאנג'ינג Vazyme ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, נאנג'ינג, סין	P252-01
2kb DNA סמן	בייג'ינג טרנס ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, בייג'ינג, סין	BM121-01
Acetonitrile	שנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	A104443
אגר אבקת	שנחאי מקלין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	A800730
Agarose	שנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	A104062
אמוניום סולפט ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., שנחאי, סין	10002917
Autoclave סטריליזטור	Zealway Instrument Inc., שיאמן, סין	GI36DWS
רצועת זיהוי ביוכימית Bacillus	צ'ינגדאו Haibo ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, צ'ינגדאו, סין	HBIG14
Bacitracin	שנחאי Yuanye ביו-טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	B65740
ערכת מיצוי DNA חיידקים	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., בייג'ינג, סין	DP209
סרט איטום נושם	בייג'ינג לייבורון ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ	BS-QM-01A
בוטנול	שנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	B433378
C18 (5 μ m, 4.6 ופעמים; 250 מ"מ) עמוד HPLC	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, סין	C1805-462510
סידן פחמתי (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., שנחאי, סין	10005717
צנטריפוגה	ניו ברונסוויק סיינטיפיק ושות', בע"מ, בריטניה	5452
טנק כרומטוגרפי	נאנג'ינג Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., נאנג'ינג, סין	P-1
בקבוק חרוטי	סצ'ואן Shubo  ושות', בע"מ, צ'נגדו, סין	18012
חממת טמפרטורה קבועה	Taist Instrument Co., Ltd., טיאנג'ין, סין	GH4500
דיפוטסיום פוספט (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., גואנגדונג, סין	XL0015
EDTA-2Na	שנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	E397526
איזון אלקטרוני	מטלר טולדו אינטרנשיונל ושות', בע"מ	FA2104
אלכוהול אתילי	שנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	E130059
ג'ל טיהור מידי ערכת	טיאנגן ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, בייג'ינג, סין	DP302
מוט זכוכית	צ'נגדו Yibang Kexi מכשיר ושות', בע"מ	1294
גלוקוז	שנחאי מקלין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין
גרם	צ'ינגדאו Haibo ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, צ'ינגדאו, סין	HB8278
כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים	Agilent Technologies, Inc., קליפורניה, אמריקה	1260
מכשיר	אלקטרופורזה אופקיבייג'ינג Liuyi ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, בייג'ינג, סין	DYCP-31DN BIOMATE
טבעת חיסון	שנחאי Muchen ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	3171026
מערבל מגנטי	Wiggens GmbH ושות', בע"מ, גרמניה	WH220 PLUS
מתיל אלכוהול	שנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	M116115
צינור מיקרוצנטריפוגה	שנחאי Muchen Biotechnology Co., Ltd., שנחאי, סין	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, סוג'ואו, סין	BNCC102589
קרום מסנן מיקרופורוס	Nantong Suri ציוד ניסיוני ושות', בע"מ	PES0.22
Ninhydrin	שנחאי Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., שנחאי, סין	N105629
מיקרוסקופ אופטי	מפעל מכשירים אופטיים, שנחאי, סין	DYS-108
צואת חזירים	נאנג'ינג Quanfu חוות חזירים, נאנג'ינג, סין
מגבר תגובת שרשרת פולימראז (PCR)	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., סוג'ואו, סין	ETC811
חברת ריצוף מקצועית	ביולוגיה כללית (אנהוי) ושות', בע"מ, אנהוי, סין
פירידין	שנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי,	סין P111516
שייקר	Taicang Qiangle ציוד ניסיוני ושות', בע"מ, Taicang, סין	HYL-C
סיליקה ג'ל GF254 צלחת	שכבה דקהYantai Huayang חומר חדש ושות', בע"מ, Yantai, סין	HPT-HSGF5025023
נתרן כלורי (NaCl)	שנחאי מקלין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	S805275
נתרן ציטראט	סינופארם מגיב כימי ושות 'בע"מ, שנחאי, סין	C39197100001
עמילן מסיס	שנחאי מקלין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	S817547
אמבט מים תרמוסטט	שנחאי Heheng ציוד מכשירים ושות', בע"מ, שנחאי, סין	DK-8D
טריפטון	שנחאי אלאדין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מ, שנחאי, סין	T139519
Ultra GelRed	נאנג'ינג Vazyme ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, נאנג'ינג, סין	GR501-01
מכשיר מים טהורים במיוחד	Merck KGaA ושות', בע"מ, גרמניה	מילי Direct-Q8
מנקה אולטרסאונד	ג'יאנגסו Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., ג'יאנגסו, סין	SB-100DT
קליפר Vernier	חברת Sanfeng, יפן	N20P
אבקת תמצית שמרים	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., בייג'ינג, סין	LP0021