הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד תאי גזע מזנכימליים של ג'לי וורטון והאקסוזומים הנגזרים מהם/שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות

1.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66778

⸱

11 בנובמבר 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

במאמר זה

סיכום

רקמת חבל הטבור היא מקור עשיר, זמין ולא פולשני לתאי גזע מזנכימליים (MSCs). בפרוטוקול זה, ניתנים שלבים מפורטים לבידוד ואפיון של MSCs ג'לי וורטון אנושיים (WJ-MSCs), ואחריהם פרוטוקול קצר פשוט לבידוד האקסוזומים הנגזרים שלהם או שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות.

תקציר

בתחום הרפואה הרגנרטיבית, תאי גזע מזנכימליים (MSCs) עוררו תשומת לב מיוחדת. MSCs מרקמת חבל הטבור (UC), המכונה ג'לי וורטון, התבססו במיוחד במגוון יישומים. בהשוואה למקורות MSC אחרים, MSCs הג'לי של וורטון (WJ-MSCs) מציעים מספר יתרונות ומבודדים מ-UC, שבדרך כלל נפטרים כפסולת רפואית. לפיכך, WJ-MSCs אינם מעלים סוגיות אתיות דומות לאלו הנוגעות לתאי גזע עובריים. נעשה שימוש בטכניקת explant פשוטה וניתנת לשחזור כדי לבודד WJ-MSCs מרקמת UC. תוך חמישה עד עשרה ימים מבידוד, ה-WJ-MSCs מתגלים כתאים דבקים בעלי צורה פיברובלסטית. לאחר הבידוד, התאים מגיעים לכ-80% מפגש תוך 14-18 יום. לאחר מכן, במעבר 3, ה-WJ-MSCs המבודדים אופיינו במלואם על ידי גרימתם להתמיין לאורך השושלות המזנכימליות האדיפוגניות, האוסטיאוגניות והכונדרוגניות. בנוסף, נבדקו אימונופנוטיפ עבור סמני משטח שליליים של התמיינות (CD), כולל CD34, CD14 ו-HLA-DR, כמו גם סמני משטח MSC ייחודיים כמו CD105, CD90, CD73 ו-CD44. יתר על כן, נעשה שימוש במגיב משקע בגישה פשוטה לבידוד אקסוזומים/שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) מהמדיום המותנה של אותם WJ-MSCs. לאחר הבידוד, נצפו אקסוזומים/sEVs תחת מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה, וניתוח גודל החלקיקים שימש לחישוב גודלם הממוצע. לסיכום, WJ-MSCs מספקים אספקה זמינה, לא פולשנית ומתחדשת של תאי גזע שעשויים לשמש כמפעלים לייצור אקסוזומים/רכבי גזע. ניתן להשתמש ב-WJ-MSCs אלה ובאקסוזומים/sEVs הנגזרים מהם במגוון רחב של יישומי מחקר טיפוליים ומורד הזרם.

מבוא

רק לפני כמה שנים, תאי גזע חשבו שהם מובילים ברפואה 1,2. עם זאת, הדאגה האתית שמציבים תאי גזע עובריים (ESCs) היוותה מכשול עצום שעיכב התקדמות מהירה בתחום3. זה הצית עניין רב בחקר מקורות מתחדשים חלופיים לתאי גזע, במיוחד אלה שניתן לבודד לאחר הלידה מחבל הטבור (UC)4. ה-UC מתחבר באופן טבעי לשליה ולעובר בתוך אם בהריון. התפקיד המולד של ה-UC הוא להזין את העובר הגדל באספקת דם רציפה ומספקת דרך כלי הדם ולהבטיח את ההגנה על כלי דם אלה באמצעות הימנעות מכל פיתול, דחיסה או כיווץ אפשרי של העובר במהלך תנועתו5. מבחינה אנטומית, ה-UC האנושי מורכב משני עורקים ווריד המוטבעים בתוך רקמת חיבור רירית וסגורים בתוך שכבה חיצונית של אפיתל מי שפיר6. מטריצת UC, או רקמת החיבור הרירית הסוגרת את שלושת כלי הטבור, ידועה בשם "ג'לי וורטון" (WJ) ועשויה בעיקר מפרוטאוגליקנים וקולגן7.

לאחרונה, תאי גזע מזנכימליים (MSCs) משכו תשומת לב רבה בהיותם שיטה טיפולית חדשה ויעילה למגוון רחב של יישומי רפואה רגנרטיבית 7,8,9,10,11,12. מה שהכי מסקרן ב-MSCs הוא קלות הבידוד שלהם, כמו גם פעילויות אימונומודולטוריות מוכחות ורב-פוטנטיות 13,14,15. יתרונות עדיפים נוספים של MSCs בכלל ואלה הנגזרים מ-WJ בפרט הם שאף טרטומה לא באה לידי ביטוי בעת ההשתלה, בניגוד ל-ESCs, והעובדה שהם שומרים על תכונת הגזע שלהם גם לאחר מספר מעברי תאים16,17. לפיכך, כיום מאמינים כי MSCs אכן יכולים לספק התערבויות טיפוליות מהפכניות למחלות שונות 8,18,19. חשוב לציין כי בשנת 2006, האגודה הבינלאומית לטיפול בתאים וגנים (ISCT) הגדירה קריטריונים מינימליים ספציפיים לאפיון נכון של MSCs20. ראשית, כאשר מגדלים/מתורבתים בתנאי תרבית סטנדרטיים, MSCs אמורים להיות דבקים בפלסטיק. שנית, MSCs חייבים לבטא אשכול אופייני כלשהו של סמני משטח התמיינות (CD) כמו CD90, CD105 ו-CD73, ואסור להם להראות ביטוי של אחרים כמו CD14, CD34 ו-CD45. שלישית, MSCs חייבים להתמיין לשושלות אוסטאוגניות, אדיפוגניות וכונדרוגניות במבחנה20. עד היום, MSCs בודדו ממקורות מרובים, כולל רקמות בוגרות כגון מח עצם (BM), רקמת שומן21, כמו גם מקורות עובריים/סביב הלידה כמו שליה, דם UC (UCB) ומטריצת UC22,23. ראוי לציין כאן שכאשר משווים את שיעור ההצלחה לקצירת MSCs, דווח שהוא מגיע לכמעט 100% מרקמת WJ בהשוואה לכ-6% בלבד מ-UCB 24,25. לפיכך, למרות ש-UCB הוא אכן מקור עשיר לתאי גזע המטופויאטיים, הוא נחשב גם למקור טוב ל-MSCs, אם כי נמוך משמעותית מ-WJ 26,27,28.

WJ-MSCs הם יוצאי דופן בהשוואה לסוגים אחרים של MSCs מכיוון שלמרות שהם MSCs בתום לב (טיפוסי), בעלי תכונות דומות לעמיתיהם הבוגרים, יש להם גם ביטוי של סמני פלוריפוטנטיות/ESCs שונים17,29. בהתאם לכך, מאמינים כי WJ-MSCs נמצאים איפשהו בין תאי גזע בוגרים לתאי גזע עובריים17. מעניין לציין שנמצא כי WJ-MSCs מבטאים הן MSCs אנושיים והן סמני ESCs ומסוגלים לשמור על גזע במשך מספר קטעים16. למרבה המזל, עם ההשתלה, הם אינם יוצרים טרטומות17. ניתן להבהיר זאת על ידי הפרופיל הטרנסקריפטומי הייחודי שלהם בהשוואה ל-ESCs, כמו גם MSCs אחרים29,30. WJ-MSCs מציגים יתרונות שונים על פני MSCs בוגרים, ואפילו על פני סוגים אחרים של תאי גזע באופן כללי. אמצעי הבידוד שלהם זמינים, באמצעות UC שנזרק באופן שגרתי בלידה, ולכן נחשב לפסולת רפואית. לכן, בניגוד ל-ESCs, ל-WJ-MSCs אין חששות אתיים, ובניגוד ל-BM-MSCs, זה מבודד באמצעות טכניקה פולשנית31. יתר על כן, בדומה לסוגים אחרים של MSC, WJ-MSCs חסרים את הביטוי של אנטיגן לויקוציטים אנושיים הקשורים ל-D (HLA-DR), ובמיוחד נמצאו כמבטאים אנטיגן לויקוציטים אנושיים-G (HLA-G), המספק להם פריבילגיה חיסונית נוספת32. זה מצביע על כך ש-WJ-MSCs מפגינים תפקיד מדכא חיסוני המדמה את מה שקורה בדרך כלל בממשק העובר-האם in vivo 33,34,35. לבסוף, כמו האנלוגים שלהם המבודדים מ-UCB, ל-WJ-MSCs יש פוטנציאל גדול לבנקאות36. בהתחשב בכל היתרונות הללו, WJ-MSCs תומכים בכך להיות תקן הזהב החדש לטיפולים מבוססי MSC30.

מעניין לציין שמחקרים רבים גילו כי MSCs מציגים את ההשפעות הטיפוליות שלהם בעיקר באמצעות איתות פרקריני. במקרים רבים, דווח על השפעות כאלה בתגובה לאקסוזומים/שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs) המופרשות על ידי MSCs37. אקסוזומים/sEVs ידועים כשלפוחיות ביו-אקטיביות בגודל ננומטרי הנרכשות מהמערכת האנדומברנית של התא. הם פועלים כמעבורות המעבירות מטענים ספציפיים של חלבונים, mRNA, כמו גם RNA לא מקודד כמו microRNA ו-RNA ארוך שאינו מקודד (LncRNAs), כהודעה בבקבוק38. כתוצאה מכך, הם יכולים לתכנת מחדש את תאי הנמען ומסומנים כ"סיגנלוזומים "המתמרנים פונקציות תאיות חיוניות39. אקסוזומים/sEVs שמקורם ב-MSCs הוכיחו את עליונותם על טיפולי MSCs בהיותם חלופה אפשרית נטולת תאים. בדומה ל-MSCs האב שלהם, נמצא כי אקסוזומים/sEVs מעוררים השפעות טיפוליות והתחדשות תאית במספר מחלות. עם זאת, בניגוד לתאי האב שלהם, הם יכולים לעבור מחסומים ביולוגיים ביתר קלות. יתר על כן, הם נטולי חששות בטיחותיים קריטיים; הם אינם מקנים סיכון לדחייה חיסונית או להיווצרות גידול לטווח ארוך40. יתר על כן, ניתן להשתמש באקסוזומים/sEVs ליישומי ריפוי גנטי כאמצעי למערכת אספקת תרופות, בהיותם מצוידים באופן טבעי להעברת מידע גנטי41. לפיכך, אקסוזומים/sEVs אכן הציתו אפיקים חדשים ומרגשים להתערבויות טיפוליות חדשות במחלות שונות 42,43,44.

בפרוטוקול זה, מוצג פרוטוקול יסודי מבוסס צמח צעד לבידוד ואפיון של WJ-MSCs מרקמת UC. לאחר מכן יבוא פרוטוקול תמציתי לבידוד אקסוזומים/רכבי EV ממדיה מותנית של WJ-MSCs אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הניסויים והנהלים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו ואושרו על ידי ועדות האתיקה של הפקולטה לרוקחות, אוניברסיטת עין שמס, קהיר, מצרים (ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220) והפקולטה לרוקחות, האוניברסיטה הבריטית במצרים, קהיר, מצרים (CL-2309). ה-UCs הושגו לאחר קבלת הסכמה מדעת חתומה מההורים.

1. בידוד WJ-MSCs מחבל הטבור האנושי

  1. מניחים כ-30-40 מ"ל מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) במיכל (שקית איסוף אטומה) לאיסוף חבל הטבור (UC) (באורך של כ-15 ס"מ) מיד לאחר הלידה. שמור את ה-UC שנאסף על קרח ועבד אותו תוך 4-5 שעות לכל היותר מהאיסוף.
    הערה: לא ניתן לעבד את הדגימה לאחר 4-5 שעות, מכיוון שהדבר יפחית מאוד את תפוקת ה-MSCs. ודא שה-PBS והמיכל סטריליים.
  2. הכן מצע תרבית שלם עבור WJ-MSCs המורכב ממדיום הנשר המותאם של Dulbecco (LG-DMEM) עם 10% סרום בקר עוברי (FBS), 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B.
  3. הנח 3 מ"ל מדיה שלמה לבאר בצלחות של 6 בארות, ולאחר מכן הנח את צלחות 6 הבארות עם מדיה בחממת CO2 המוגדרת ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 כדי להתחמם ולהתכונן.
  4. בארון הבטיחות הביולוגית, הכינו שמונה כלי תרבית תאים בגודל 10 ס"מ, כל אחד מהם מלא ב -10 מ"ל PBS סטרילי.
  5. בזהירות, באמצעות מלקחיים מעוקרים, העבירו את ה-UC משקית הניילון האטומה לצלחת הפטרי הראשונה המכילה PBS כדי לשטוף את הדם (חזור על שלב זה עד שכל הדם נשטף מהדגימה).
  6. רססו 70% אתנול על ספוגית סטרילית והשתמשו בה כדי לנגב את ה-UC למשך 30 שניות.
  7. העבירו את ה-UC לצלחת פטרי חדשה מלאה ב-PBS סטרילי כדי להסיר שאריות אתנול.
  8. מעבירים את ה- UC לצלחת פטרי אחרת ממולאת מראש ב- PBS סטרילי ובעזרת מספריים סטריליים חותכים את ה- UC לחתיכות קטנות יותר (כ -3 ס"מ כל אחת). לאחר מכן, העבירו את החתיכות באורך 3 ס"מ לצלחת פטרי אחרת עם PBS סטרילי טרי כדי למנוע שחרור דם בתהליך החיתוך.
    הערה: מנקודה זו ואילך, יש לשמור על חלקי ה-UC על קרח, כמו גם את כל שלבי העיבוד הבאים. זה חשוב מאוד כדי למנוע שחרור של חומר ג'לטיני ולהבטיח את הצלחת הליך הבידוד של WJ-MSCs מרקמת ה-UC. עיבוד ה-UC שנאסף תוך 4-5 שעות לכל היותר הוא חיוני להצלחת תהליך הבידוד. בעבר, ה-UC עובד תוך תקופות ארוכות יותר לאחר האיסוף, ולמרבה הצער, ההליך לא הראה תוצאות מוצלחות (הנתונים לא הוצגו).
  9. התחל לעבד את חתיכות ה-UC בזו אחר זו (על קרח) בצלחת פטרי מלאה ב-PBS סטרילי. השתמש במספריים ובמלקחיים סטריליים כדי לחתוך כלי דם ולבודד את רקמת הג'לי של וורטון (WJ). לאחר מכן מניחים את חתיכות ה- WJ השקופות בצלחת פטרי נוספת מלאה ב- PBS סטרילי על קרח.
    הערה: במהלך בידוד רקמת WJ מחתיכת ה-UC, החתך הראשון נעשה בצד השקוף של חתיכת ה-UC, הרחק מכלי הדם, כדי למנוע חיתוך דרך הכלי. לאחר מכן, כלי הדם מהודקים, נחתכים ונמשכים.
  10. חזור על השלב הקודם על כל חלקי ה-UC כדי לקבל רקמת WJ ברורה ללא כלי דם.
    הערה: החלף את צלחת הפטרי PBS, במידת הצורך, במהלך עיבוד חלקי ה-UC והסרת כלי הדם, אם תמיסת ה-PBS הופכת מדממת או לא ברורה במהלך בידוד רקמות WJ.
  11. שוטפים את חתיכות ה- WJ שנאספו עם PBS על ידי העברתם לכלי תרבית תאים טרי בגודל 10 ס"מ מלא ב- PBS סטרילי.
  12. השתמש באזמל סטרילי וחד ובמלקחיים כדי לחתוך את רקמות ה-WJ שנאספו לחתיכות קטנות באורך 10 מ"מ.
  13. העבירו חתיכות WJ לצלחות 6 הבארות שהוכנו בעבר בשלב 1.3. מניחים 5-6 חתיכות WJ לבאר, ואז מדגרים את צלחות 6 הבארות המכילות צמחי רקמת WJ באווירה לחה עם 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס בחממת CO2 ומשאירים ללא הפרעה למשך 3 ימים.
  14. ביוםהרביעי מהנחת צמחי הרקמה של WJ, הוסף בזהירות 1 מ"ל מדיה לכל באר, תוך הקפדה לא להפריע לצמחים.
    הערה: הימנע מלגעת או לשרוט בתחתית הצלחת שבה מחוברים חלקי ה-WJ.
  15. חזור על השלב הקודם ביוםהשישי לאחר הנחת צמחי הרקמה של WJ.
  16. ביום השמיני לאחר הנחת צמחי הרקמה של WJ (כלומר, כמעט שבוע לאחר הנחת השתל), התחל להחליף מחצית מהמדיה לבאר כל יומייםעד היום ה-12-14 לאחר הנחת השתל. החלף מחצית ממצע התרבות מכל באר על ידי הסרת כ-2.5 מ"ל מכל באר והוספת 2.5 מ"ל טריים של מדיה חמה מלאה (37 מעלות צלזיוס).
    הערה: משוך את המדיה מפני השטח של הבאר והימנע מלגעת או לשרוט בתחתית הצלחת שבה מחוברים חלקי ה-WJ. ה-WJ-MSCs מופיעים בדרך כלל מתחת ומסביב לצמחי רקמת WJ תוך 5-10 ימים לאחר הנחת האקספלנטים.
  17. התבונן בלוחות 6 הבארות באופן שגרתי תחת מיקרוסקופ הפוך (הגדלה פי 10), ואם התאים המשוחררים מתרבים והמפגש שלהם גדל, ומגיע ל-50-60%, המשך לשלב הבא; אם לא, חזור על שלב 1.16. שוב. חלקי ה-WJ מתכווצים משמעותית בגודלם עם הזמן.
  18. הסר בעדינות את צמחי ה- WJ המחוברים לתחתית הבארות והסר את כל המדיה. הסרת חלקי צמח WJ נעשית בדרךכלל ביום ה-12-14 מהצבתם הראשונית.
    הערה: סובב מעט את הלוחות בזווית של 45° תוך הסרת המדיה כדי להבטיח שכל המדיה מוסרת.
  19. שוטפים כל באר עם 2 מ"ל PBS, מערבבים בעדינות את הצלחת ואז זורקים PBS. חזור על שלב כביסה זה פעמיים.
    הערה: הוסף בעדינות PBS לדופן הבאר והימנע מלגעת בתחתית הבארות כדי להבטיח שלא תהיה הפרעה לתאים כלל.
  20. הוסף 2 מ"ל של מדיה שלמה חמה לבאר בעדינות (מדיה עם הרכב מדויק כמתואר בשלב 1.2) ודגר את צלחות 6 הבארות בתנאי לחות עם 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס.
  21. החלף את המדיה לחלוטין כל יומיים (2 מ"ל של מדיה שלמה לבאר) עד שהתאים מגיעים לכ-80% מפגש.
  22. כאשר התאים מגיעים לכ-80% מפגש, מעבירים את התאים באמצעות טריפסין-EDTA לצלוחיות תרבית תאים T25 (ניתן להעביר את סך התאים המתקבלים מצלחת אחת של 6 בארות לבקבוק תרבית T25 אחד, השתמש ב-8-9 מ"ל של מדיה שלמה לכל בקבוק T25). WJ-MSCs אלה מסומנים כתאי P1.
    הערה: אין להשאיר תאים זמן רב מדי עם טריפסין-EDTA כדי למנוע השפעות רעילות; בדרך כלל, 3 דקות מספיקות לניתוק התאים. ספקים שונים יכולים לספק ל-Trypsin-EDTA עוצמה משתנה. בהתאם לכך, יש לקחת זאת בחשבון בעת ציון זמן הדגירה.
  23. החלף את המדיה כל יומיים. לאחר שהתאים הגיעו לכ-80% מפגש, העבירו את התאים באמצעות טריפסין-EDTA לצלוחיות תרבית תאים T75 (ניתן להעביר את סך התאים המתקבלים מבקבוק תרבית T25 אחד לבקבוק תרבית T75 אחד; השתמש ב-15-18 מ"ל של מדיה שלמה לכל בקבוק T75); WJ-MSCs אלה מסומנים כתאי P2.
  24. החלף את המדיה כל יומיים. לאחר שהתאים הגיעו לכ-80% מפגש, נתקו את התאים באמצעות טריפסין-EDTA, ואז זרעו WJ-MSCs בצפיפות של כ-0.75 x 106-1 x 106 תאים לכל בקבוק T75. WJ-MSCs אלה מסומנים כתאי P3.
    הערה: השתמש בתאים בין P3-P5 לניסויים עתידיים המתוארים בפרוטוקול זה.
  25. שימור בהקפאה של WJ-MSCs בחנקן נוזלי באמצעות אמצעי שימור בהקפאה המורכב מ-80% FBS, 10% מדיה שלמה (כמתואר בשלב 1.2) ו-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO).
    הערה: הצגה סכמטית של כל השלבים עבור בידוד WJ-MSCs מסופקת באיור 1.

2. אפיון WJ-MSCs מבודדים על ידי אימונופנוטיפ באמצעות אנליזה ציטומטרית זרימה לסמני משטח CD שונים

  1. נתק את התאים באמצעות טריפסין-EDTA במעבר 4. שוטפים את התאים עם PBS פעמיים וסופרים את מספרם באמצעות המוציטומטר.
    הערה: זמן דגירה מינימלי (למשך 3 דקות) במהלך טריפסיניזציה הוא קריטי לניתוק תאים בהצלחה מבלי לגרום נזק. דגירה ממושכת עם טריפסין-EDTA עלולה לגרום לפגיעה בסמני פני התא ולהשפיע לרעה על תוצאות הבדיקה האימונופנוטיפית.
  2. דגרו כ-100,000 תאים (בתנאי חושך) למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים חד-שבטיים אנושיים המסומנים בפיקואריתרין (PE) או פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) כדלקמן: Anti-CD90 PE, Anti-CD73 PE, Anti-CD105 FITC, Anti-CD44 PE, Anti-CD34 PE, Anti-CD14 PE ו-Anti-HLA-DR FITC, והשתמשו בתאים לא מוכתמים כבקרות
  3. שטפו את התאים עם PBS והשעו אותם לאחר מכן ב-500 מיקרוליטר של מאגר FACS; לנתח באמצעות ציטומטריית זרימה45.

3. הערכת פוטנציאל ההתמיינות של WJ-MSCs מבודדים כלפי שושלות מזנכימליות שונות

  1. התמיינות אדיפוגנית
    1. השעו מחדש את התאים במצע התפשטות מלא (כמתואר בשלב 1.2). לאחר מכן, תרבית התאים בצפיפות של 3.7 x 104 תאים/באר (0.5 מ"ל בינוני/באר) בצלחת תרבית רקמה של 24 בארות. לאחר מכן, דגרו בתנאי לחות של 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס. הבא, הבא, כל יומיים, שנה את המדיה עד שהתאים מגיעים לכמעט 100% מפגש; זה בדרך כלל לוקח בערך 3-4 ימים.
    2. הסר את אמצעי ההתפשטות והחלף אותו באמצעי התמיינות אדיפוגני כדי לגרום לאדיפוגנזה. השלימו את המדיה של LG-DMEM עם סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל, פניצילין 100 U/mL, 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B והתוסף האדיפוגני המסופק בערכת הזיהוי התפקודי של תאי גזע מזנכימליים. לאחר מכן, החלף את המדיה בעדינות (0.5 מ"ל/באר) כל 3 ימים והימנע מהפרעה בוואואול השומנים.
    3. לאחר כ-21 יום, באמצעות בדיקה מיקרוסקופית, יש לצבוע את הווקואול השומני באדום שמן כדי להעריך את ההתמיינות האדיפוגנית.
    4. הכינו תמיסת מלאי טרייה של שמן אדום; ממיסים 30 מ"ג כתם שמן אדום ב-10 מ"ל איזופרופנול ומניחים לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו תמיסת עבודה על ידי ערבוב 2 חלקים מים מזוקקים כפולים (ddH2O) עם תמיסת מלאי של 3 חלקים, ערבבו אותם היטב והניחו להם לנוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, סנן באמצעות מסנן 0.22 או 0.45 מיקרומטר.
      הערה: לקבלת תוצאות הצביעה הטובות ביותר, הכינו טרי את הכתם האדום שמן.
    5. לתיעוד מוצלח של התמיינות אדיפוגנית, שטפו את התאים פעמיים עם PBS וקבעו אותם עם 10% פורמלין ניטרלי (0.75 מ"ל/באר) למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים עם PBS באמצעות 1 מ"ל/באר (לפני השלכת ה-PBS לאחר כל שטיפה, דגרו על התאים למשך כ-5 דקות).
      הערה: תאים הנשמרים באמצעי התפשטות (המתוארים בשלב 1.2) משמשים כתאי בקרה לא מושרים. הוסף פורמלין ניטרלי לאט לדפנות, לא ישירות על התאים, כדי למנוע נזק לתאים. לאחר הכביסה הסופית עם PBS, שאיפה מלאה של PBS היא חיונית לפני הוספת תמיסת העבודה של כתמי שמן אדום כדי למנוע צביעה לא יעילה.
    6. לאחר הכביסה הסופית, צבעו את התאים (1 מ"ל/באר) בתמיסת עבודה אדומה שמן ודגרו אותם למשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, משוך והשליך את תמיסת הכתם ושטוף בעדינות את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן, מתחת למיקרוסקופ, התבונן בטיפות השומנים המוכתמות.
  2. התמיינות אוסטאוגנית
    1. השעו מחדש את התאים במצע התפשטות מלא (כמתואר בשלב 1.2). לאחר מכן, בצלחת תרבית רקמה של 24 בארות, זרעו 7.4 x103 תאים לבאר (הוסיפו 0.5 מ"ל בינוני/באר), ודגרו אותם במשך 3 ימים בתנאים לחים ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס כדי להגיע לכמעט 70% מפגש.
    2. בכ-70% מפגש, החלף את אמצעי ההפצה במדיית התמיינות-אינדוקציה המשלבת את התוסף האוסטיאוגני - המסופק בערכת הזיהוי הפונקציונלי של תאי גזע מזנכימליים - במדיה LG-DMEM בתוספת 10% FBS, יחד עם 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B.
    3. יש להחליף את מדיית ההתמיינות אחת ל-3 ימים, ולהמשיך באינדוקציה האוסטאוגנית למשך כ-21 יום.
    4. הכן פיתרון עבודה של כתם Alizarin Red S; הביאו 9 מ"ל של ddH2O והמיסו בו 200 מ"ג של כתם Alizarin Red S, ולאחר מכן השתמשו באמוניום הידרוקסיד ו-HCl כדי להתאים את ה-pH ל-4.1-4.3. לאחר מכן, השלם את הנפח ל-10 מ"ל עם ddH2O. לאחר מכן, סנן את התמיסה באמצעות מסנן (0.22 או 0.45 מיקרומטר) כדי להסיר משקעים.
    5. בתום תקופת האינדוקציה יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן לתקן אותם באמצעות פורמלין ניטרלי 10% (0.75 מ"ל/באר) ולתת להם לנוח במשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים באמצעות PBS (1 מ"ל לבאר), והקפידו לדגור על התאים במשך 5 דקות בכל שטיפה.
      הערה: תאים הנשמרים באמצעי התפשטות (המתוארים בשלב 1.2) משמשים כתאי בקרה לא מושרים.
    6. הוסף את תמיסת העבודה 2% Alizarin-Red S שהוכנה בשלב 3.2.4 לאותם תאים קבועים מהשלב הקודם, ודגר בחושך כ-45-60 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. לאחר מכן, השליכו את תמיסת הכתם, ושטפו את התאים עם ddH2O פעמיים ולאחר מכן עם PBS פעם אחת, ואז העריכו התמיינות אוסטאוגנית מוצלחת תחת המיקרוסקופ על ידי התבוננות במטריצה החוץ-תאית המוכתמת העשירה בסידן.
  3. התמיינות כונדרוגנית
    1. השעו מחדש את התאים במצע התפשטות מלא (כמתואר בשלב 1.2). לאחר מכן, בצלחת תרבית רקמה של 24 בארות, זרעו 7.4 x 103 תאים לבאר (הוסיפו 0.5 מ"ל מדיום/באר) ודגרו אותם בתנאים לחים ב-5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים כדי להגיע לכמעט 90% מפגש.
    2. בהתכנסות של כ-90%, התחל לגרום להתמיינות כונדרוגנית באמצעות DMEM/F12 ללא סרום בתוספת אינסולין-טרנספרין סלניום (ITS), ותוסף כונדרוגני - המסופק עם ערכת הזיהוי התפקודי של תאי גזע מזנכימליים - יחד עם 0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B, 100 U/mL פניצילין, 2 מ"מ L-גלוטמין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין46.
      הערה: אמצעי האינדוקציה הכונדרוגני השלם נשמר בחושך בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.
    3. המשך באינדוקציה כונדרוגנית למשך כ-21 יום; בינתיים, החלף את המדיה כל 3 ימים.
    4. הכן את תמיסת העבודה של כתם כחול אלציאני באופן הבא: ראשית, הכינו חומצה אצטית קרחונית 3% ב-ddH2O (הוסיפו 3 מ"ל חומצה אצטית קרחונית ומלאו עד 100 מ"ל ב-ddH2O). לאחר מכן, הכינו תמיסת עבודה של כתמים כחולים של Alcian על ידי הוספת 20 מ"ג עד 20 מ"ל של תמיסת חומצה קרחונית 3%, שמירה על עמידה למשך כ-30 דקות, ולאחר מכן סינון באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר או 0.45 מיקרומטר כדי להסיר משקעים.
    5. בתום תקופת האינדוקציה, שטפו את התאים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן תקנו אותם באמצעות פורמלין ניטרלי של 10% (0.75 מ"ל/באר) ותנו להם לנוח במשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים פעמיים באמצעות PBS (1 מ"ל לבאר). הקפד לדגור על התאים למשך 5 דקות בכל פעם.
      הערה: תאים הנשמרים באמצעי התפשטות (כמתואר בשלב 1.2) משמשים כתאי בקרה לא מושרים.
    6. דגרו את התאים הקבועים בתמיסת העבודה המוכנה בכחול אלציאני 0.1% למשך כ-60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. שטפו את התאים עם ddH2O פעמיים ועם PBS פעם אחת כדי להסיר את הכתם שנותר. לאחר מכן, באמצעות בדיקה מיקרוסקופית, התבונן בפרוטאוגליקנים המוכתמים בסולפטציה.

4. בידוד של אקסוזומים/sEVs ממדיה מותנית של WJ-MSCs

  1. השעו מחדש את WJ-MSCs במצעי התפשטות מלאים (כמתואר בשלב 1.2) וצלחות תרבית רקמה של 6 בארות זרעים עם WJ-MSCs אלה בצפיפות של 150,000 תאים/באר (2 מ"ל מדיה/באר) ודגרו אותם ב-37 מעלות צלזיוס בתנאים לחים ב-5% CO2.
  2. הכן מצעי איסוף אקסוזומים נטולי סרום (SF) באופן הבא: מדיום הנשר המותאם של דולבקו (LG-DMEM) עם 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-0.25 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B.
    הערה: למדיית איסוף האקסוזומים יש הרכב זהה למדיית ההתפשטות המלאה (המתוארת בשלב 1.2) אך ללא FBS.
  3. עקוב אחר לוחות 6 הבארות (שהוכנו בשלב 4.1) והחלף את המדיה כל יומיים באמצעות אמצעי ההפצה (כמתואר בשלב 1.2). התבונן בתאים במיקרוסקופ עד שהם מגיעים לכ- 75-80% מפגש.
  4. כאשר מגיעים ל-70% מפגש, שטפו את התאים פעמיים עם PBS (1 מ"ל/באר), ולאחר מכן הוסיפו חומרי איסוף אקסוזומים נטולי סרום (SF) (1.5 מ"ל/באר) (מתואר בשלב 4.2), ודגרו במשך 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס בתנאים לחים ב-5% CO2.
  5. לאחר 48 שעות, אסוף את המדיה המותנית של WJ-MSCs מלוחות תרבית הרקמה של 6 בארות שהונחו בשלב הקודם בצינורות איסוף צנטריפוגה של 15 מ"ל. לאחר מכן, בצע את שלבי הצנטריפוגה והסינון הרציפים הבאים כדי לנקות את המדיה המותנית שנאספה47.
    הערה: באמצעות צבע אי הכללה כחול טריפאן ואחריו ספירת תאים באמצעות המוציטומטר, העריכו את אחוז הכדאיות של התאים ששימשו בתחילה להפקת המדיה המותנית שנאספה; התאים ברי הקיימא צריכים להיות באופן אידיאלי יותר מ-90%. לאחר מכן, אחסן את כדור התא שנאסף ב-80 מעלות צלזיוס למקרה שיידרש לחקירות עתידיות.
    1. צנטריפוגה את המדיה המותנית שנאספה ב-300 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי להיפטר מכל תאים תלויים. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט ובצעו את שלב הצנטריפוגה הבא עבור הסופרנטנט שנאסף (מדיה מותנית).
    2. צנטריפוגה המדיה המותנית המתקבלת משלב 4.5.1 ב 3000 x g למשך 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס כדי להיפטר מתאים נמקיים כמו גם פסולת תאים.
      הערה: רצוי לבצע את שלבי הצנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, אך ניתן לבצע אותם גם בטמפרטורת החדר עם תוצאות דומות.
    3. סנן את הסופרנטנט שהתקבל מהשלב הקודם על ידי העברתו דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור פוליפרופילן חדש של 50 מ"ל כדי להיפטר מכל שאריות תאים ורכבים חשמליים גדולים.
      הערה: ניתן להשתמש במדיה הממוזגת המסוננת באופן מיידי לשלבים הבאים לבידוד אקסוזומים/sEVs, לאחסן במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולהשתמש בה לא יותר מ-3 ימים, או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך עד שנדרש בידוד אקסוזומים/רכבי EV. המדיה המותנית המאוחסנת ב-80 מעלות צלזיוס עדיפה לעיבוד תוך פרק זמן מרבי של 1-3 חודשים; כמה שיותר מהר יותר טוב.
  6. הנח 7.5 מ"ל של מדיה ממוזגת מנוקה (המתקבלת משלב 4.5) בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, והוסף 1.5 מ"ל של ריאגנט. הוסף את המגיב למדיה ביחס של 1:5 (כלומר, 1 מ"ל של מגיב משקע Exoquick-TC לכל 5 מ"ל מדיה). לאחר מכן, הפוך את הצינור למעלה ולמטה, והעיף אותו מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב נכון של המגיב המשקע עם המדיה.
    הערה: המגיב המשקע הוא מגיב כבד וצמיג. לפיכך, יש למשוך את הנפח הנדרש לאט ובזהירות כדי להבטיח שהנפח המיועד מועבר במלואו.
  7. אחסן את הצינור עם המדיה עם המגיב המשקע 4 מעלות צלזיוס במצב עמידה זקוף למשך כ-16 שעות (לפחות 12 שעות).
  8. למחרת, צנטריפוגה את תערובת המגיב המדיה/משקעים ב-1500 x גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, כדור האקסוזומים/sEVs מופיע ככדור לבן או בז' קטן מאוד שהתיישב בתחתית הצינור.
    הערה: שלב צנטריפוגה זה יכול להיעשות גם בטמפרטורת החדר עם תוצאות דומות. במקרה שגלולת האקסוזום/sEVs אינה נראית בסוף שלב צנטריפוגה זה, ניתן להוסיף זמן צנטריפוגה נוסף ב-3000 x g למשך 20-30 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס. לפעמים גלולת האקסוזומים/EVs נשארת בלתי נראית גם לאחר זמן הצנטריפוגה הממושך, מה שאומר שיש כמות קטנה של אקסוזומים/רכבי EV. במקרה זה, המשך בפרוטוקול על ידי השארת 5-10 מיקרוליטר התחתון של הצינור.
  9. שאפו את הסופרנטנט, וצנטריפוגה כלפי מטה שאריות מדיה/תערובת ריאגנטים משקעים ב-1500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בזהירות רבה, שאפו את שאריות הנוזל הנותרות מבלי להפריע לכדורי האקסוזומים/sEVs המשקעים.
  10. השעו את גלולת האקסוזומים/sEVs ב-100-300 מיקרוליטר של PBS סטרילי בהתאם לגודל הגלולה והראות. לאחר מכן, ניתן להשתמש באקסוזומים/sEVs אלה באופן מיידי או לאחסן אותם במקפיא אולטרה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניסויים הבאים.
    הערה: במקרה של התחלה עם יותר מצינור צנטריפוגה אחד לאותה מדיה (מתואר בשלב 4.9), וכדורי האקסוזומים/sEVs (שהושגו בשלב 4.10) אינם נראים, ניתן לאגד את כדורי האקסוזומים/sEVs שנאספו מכולם באמצעות כ-100-300 מיקרוליטר של PBS סטרילי כדי להשעות את כולם יחד.
  11. כמת את האקסוזומים/sEVs שנאספו ביחס לתכולת החלבון שלהם באמצעות ערכת כימות חלבון חומצה ביצינצ'ונינית (BCA) זמינה מסחרית, כפי שצוין על ידי היצרן.
    הערה: הצגה סכמטית של כל שלבי הבידוד של אקסוזומים/רכבי EV שמקורם ב-WJ-MSCs מסופקת באיור 2.

5. הדמיה של אקסוזומים/sEVs מבודדים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)

  1. השעו אקסוזומים/sEVs מבודדים טריים ב-100-300 מיקרוליטר של PBS סטרילי בהתאם לגודל הגלולה והנראות (כפי שתואר קודם לכן בשלב 4.11).
    הערה: עדיף להשתמש באקסוזומים/רכבי EV מבודדים טריים ולא קפואים להדמיית TEM
  2. פיפטה 20 מיקרוליטר של אקסוזומים/רכבי EV מתלים על רשת מצופה פחמן ומניחים לייבוש למשך 10 דקות.
  3. תקן את האקסוזומים/sEVs הממוקמים באמצעות תמיסת גלוטרלדהיד (2% במים מזוקקים) למשך כ-15 דקות.
  4. לאחר מכן, צבעו את האקסוזומים/sEVs הקבועים ב-2% אורניל אצטט והשאירו למשך כ-3 דקות בחושך, ולאחר מכן בחנו אותם תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) (הגדלה של 20000) באמצעות הגדרות ברירת המחדל של TEM.

6. קביעת הגודל הממוצע של אקסוזומים/sEVs מבודדים באמצעות מנתח גודל חלקיקים

  1. לדלל אקסוזומים/sEVs מבודדים טריים עם PBS pH סטרילי 7.4 ביחס של 1:250.
  2. מדוד את התפלגות גודל החלקיקים הממוצעת של אקסוזומים/sEVs מבודדים באמצעות מנתח גודל חלקיקים ב-25 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בידוד ואפיון של WJ-MSCs

כפי שמודגם באיור 3, תאים קטנים דמויי פיברובלסטים הופיעו בתחילה מתחת לרקמות האקספלנט של WJ וסביבן תוך 5-10 ימים לאחר זריעת האקספלנטים האלה (איור 3A). ה-WJ-MSCs המשוחררים הללו ממשיכים להתרבות ובדרך כלל מגיעים לכ-80% מפגש תוך 14-18 ימים לאחר הבידוד. ראוי לציין כאן כי רקמות האקספלנט ממשיכות להתכווץ ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה, הצלחנו להציג שלבים מפורטים לבידוד WJ-MSCs מרקמת UC אנושית וגם לבודד את האקסוזומים/sEVs הנגזרים שלהם. UC הוא מקור לא פולשני בלתי מנוצל בקלות להשגת MSCs, ואין צורך בציוד מיוחד לאיסוף או עיבוד 11,15,30,32,48. פרוטוקולים שונים שימשו לבידוד WJ-MSCs מרקמת UC. בעיקרון, בניגוד לפרוטוקול זה, השתלת רקמות3...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים השותפים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים הקשור לעבודה זו.

תודות

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי אוניברסיטת עין שמס - מענק תמיכה במחקר תוכנית אסטרטגית (2024/2025), מצרים, והמרכז לחקר ננוטכנולוגיה (NTRC) - פרס Access (2019/2020), האוניברסיטה הבריטית במצרים (BUE), קהיר, מצרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלסיאן בלו 8GXסיגמא-אלדריץ', ארה"בA3157
אליזרין רד Sסיגמא-אלדריץ', ארה"בA5533
הידרוקסיד אמוניוםפישר סיינטיפיק, גרמניה1336-21-6
נוגדן ל-CD-105 אנושי, FITCR& D Systems Inc., מינסוטה, ארה"בFAB10971F
נוגדן ל-CD-14 אנושי, PEבקמן קולטר, ארה"בIM0650U
נוגדן ל-CD-34 אנושי, PEבקמן קולטר, ארה"בIM1420
נוגדן ל-CD-44 אנושי, PEבקמן קולטר, ארה"בA32537
נוגדן ל-CD-73 אנושי, PER& D Systems Inc., מינסוטה, ארה"בFAB5795P
נוגדן ל-CD-90 אנושי, PER& D Systems Inc., מינסוטה, ארה"בFAB2067P
נוגדן ל-HLA-DR אנושי, FITCבקמן קולטר, ארה"בIM1638U
ערכת כימות חלבון לחומצה ביצינכונינית (BCA)תרמופישר23227
ארון בטיחות ביולוגית, זרימה למינרית, MSC Advantageתרמו סיינטיפיק, ארה"ב
CO2 אינקובטור, Direct Formaתרמו סיינטיפיק, ארה"ב
צנטריפוגה קירורסיגמא, גרמניה
צנטריפוגה קירוראפנדורף, גרמניה
CytoFLEX Flow Cytometer בקמן קולטר, פלורידה, ארה"ב
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)פישר סיינטיפיק, גרמניהBP231-100
DMEM - רמת סוכר נמוכה 1 גרם לליטרלונצה, שווייץ12-707F
DMEM/F12 לונצה, שווייץ12-719F
מים חופשיים מ-DNAse/RNAseגיבקו תרמו פישר, ארה"ב10977-035
אתנול אבסולוט, דרגת ביולוגיה מולקולריתסיגמא-אלדריך, גרמניה24103
ExoQuick-TCמערכות ביולוגיות (SBI), ארה"בEXOTC50A-1סוכן משקיע
סרום בקר עוברי (FBS)גיבקו תרמו פישר, ברזיל10270-106
פורמלדהיד 37%פישר סיינטיפיקBP531-500
חומצה אצטית קרחוניתסיגמא אלדריץ', גרמניהA38S-500
תמיסת גלוטאראלדהיד סיגמאG7776
חומצה כלורית (HCl)פישר סיינטיפיק, גרמניהA144-212
מיקרוסקופ הפוךאולימפוס, יפן
L-גלוטמיןגיבקו תרמו פישר, ארה"ב25030-024
ערכת זיהוי תאי גזע מזנכימליים  R& D Systems Inc., מינסוטה, ארה"בSC006
קורא מיקרופלטכרומט, טכנולוגיות מודעות, ארה"ב
צבע שמן אדוםסיגמא-אלדריץ', ארה"בO0625
פניצילין-סטרפטומיצין-אמפוטריציןגיבקו תרמו פישר, ארה"ב15240062
סליין עם בופר פוספט, פעם אחת, ללא Ca/Mgלונצה, שווייץBE17-516F
אמבט מים רועדדייהאן ויסבאת', קוריאה
מסנן מזרק, 0.2 מיקרוןקורנינג, ארה"ב431224
מיקרוסקופ אלקטרונים מעברייםJEM-1200EX II, ג'אול, גרמניה
כחול טרייפן גיבקו תרמו פישר, ארה"ב15250061
Trypsin-Versne-EDTA, 1xלונצה, שווייץCC-5012
תמיסת אצטט אורניל (2%)מדעי מיקרוסופיה אלקטרונית, ארה"ב22400-2
ספקטרופוטומטר UV-Visibleשימאדזו, יפן
מערבולתSciLogex
Zeta-sizer Nano ZNMalvern Panalytical Ltd, בריטניה  מנתח גודל חלקיקים

מקורות

  1. Zakrzewski, W., Dobrzyński, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 68(2019).
  2. Humes, H. D. Stem cells: the next therapeutic frontier. Trans Am Clin Climatol Assoc. 116, discussion 183-164 167-184 (2005).
  3. Sugarman, J. Ethical issues in stem cell research and treatment. Cell Res. 18 (1), S176(2008).
  4. Weiss, M., Troyer, D. Stem cells in the umbilical cord. Stem Cell Rev. 2 (2), 155-162 (2006).
  5. Kim, D., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  6. Ellis, H. Anatomy of fetal circulation. Anesth Intensive Care Med. 6 (3), 73(2005).
  7. Cook, H. J. Thomas Wharton's adenographia, first published in London in 1656. Med Hist. 42 (3), 411-412 (1998).
  8. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H. Handbook of Stem Cell Therapy. , Springer. Singapore. (2022).
  9. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: a meta-analysis study. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 484(2020).
  10. Nabil, M., Kassem, D. H., Ali, A. A., El-Mesallamy, H. O. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ameliorate cognitive impairment in Alzheimer's disease rat model: emerging role of SIRT1. BioFactors. 49 (6), 1121-1142 (2023).
  11. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  12. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles: a potential game changer for the COVID-19 crisis. Front Cell Dev Biol. 8, 587866(2020).
  13. Han, Y., et al. Mesenchymal stem cells for regenerative medicine. Cells. 8 (8), 886(2019).
  14. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. J Cell Biochem. 123 (5), 906-920 (2022).
  15. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: achievements and challenges. Front Cell Dev Biol. 8, 16(2020).
  16. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2009).
  17. Troyer, D., Weiss, M. Concise review: Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
  18. Wang, S., Qu, X., Zhao, R. Clinical applications of mesenchymal stem cells. J Hematol Oncol. 5, 19(2012).
  19. Batsali, A., Kastrinaki, M., Papadaki, H., Pontikoglou, C. Mesenchymal stem cells derived from Wharton's jelly of the umbilical cord: biological properties and emerging clinical applications. Curr Stem Cell Res Ther. 8 (2), 144-155 (2013).
  20. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  21. Kassem, D. H., Habib, S. A., Badr, O. I., Kamal, M. M. Isolation of rat adipose tissue mesenchymal stem cells for differentiation into insulin-producing cells. JoVE. (186), e63348(2022).
  22. Da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P., Nardi, N. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J Cell Sci. 119 (11), 2204-2213 (2006).
  23. Ma, S., et al. Immunobiology of mesenchymal stem cells. Cell Death Differ. 21 (2), 216-225 (2014).
  24. Shetty, P., Cooper, K., Viswanathan, C. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix, cord blood, and bone marrow mesenchymal stem cells. Asian J Transfus Sci. 4 (1), 14-24 (2010).
  25. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., Mesallamy, H. O. E. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regen Med. 10 (7), 841-855 (2015).
  26. Sibov, T. T., et al. Mesenchymal stem cells from umbilical cord blood: parameters for isolation, characterization and adipogenic differentiation. Cytotechnology. 64 (5), 511-521 (2012).
  27. Arutyunyan, I., Elchaninov, A., Makarov, A., Fatkhudinov, T. Umbilical cord as prospective source for mesenchymal stem cell-based therapy. Stem Cells Int. 2016, 6901286(2016).
  28. Knudtzon, S. In vitro growth of granulocytic colonies from circulating cells in human cord blood. Blood. 43 (3), 357(1974).
  29. Fong, C., et al. Human Wharton's jelly stem cells have unique transcriptome profiles compared to human embryonic stem cells and other mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 7 (1), 1-16 (2011).
  30. El Omar, R., et al. Umbilical cord mesenchymal stem cells: the new gold standard for mesenchymal stem cell based therapies. Tissue Eng Part B Rev. 20, 523-544 (2014).
  31. Hass, R., Kasper, C., Böhm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): a comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  32. La Rocca, G., et al. Isolation and characterization of Oct-4+/HLA-G+ mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol. 131 (2), 267-282 (2009).
  33. Moffett, A., Loke, Y. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal. Placenta. 25 (1), 1-8 (2003).
  34. Chao, K., Chao, K., Fu, Y., Liu, S. Islet-like clusters derived from mesenchymal stem cells in Wharton's jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes. PLoS One. 3 (1), e1451(2008).
  35. Tsai, P., et al. Transplantation of insulin-producing cells from umbilical cord mesenchymal stem cells for the treatment of streptozotocin-induced diabetic rats. J Biomed Sci. 19, 47(2012).
  36. Chatzistamatiou, T., et al. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood. Transfusion. 54 (12), 3108-3120 (2014).
  37. Newton, W. C., Kim, J. W., Luo, J. Z. Q., Luo, L. Stem cell-derived exosomes: a novel vector for tissue repair and diabetic therapy. J Mol Endocrinol. 59 (4), R155-R165 (2017).
  38. Wei, W., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: a promising biological tool in nanomedicine. Front Pharmacol. 11, 590470(2021).
  39. Bjorge, I. M., Kim, S. Y., Mano, J. F., Kalionis, B., Chrzanowski, W. Extracellular vesicles, exosomes and shedding vesicles in regenerative medicine-a new paradigm for tissue repair. Biomater Sci. 6 (1), 60-78 (2018).
  40. Zhang, K., Cheng, K. Stem cell-derived exosome versus stem cell therapy. Nat Rev Bioeng. 1 (9), 608-609 (2023).
  41. Colao, I. L., Corteling, R., Bracewell, D., Wall, I. Manufacturing exosomes: a promising therapeutic platform. Trends Mol Med. 24 (3), 242-256 (2018).
  42. Zheng, W., et al. Identification of scaffold proteins for improved endogenous engineering of extracellular vesicles. Nat Commun. 14 (1), 4734(2023).
  43. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  44. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  45. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of Flow Cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration. , Wiley-Blackwell. (2010).
  46. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 108(2016).
  47. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (Unit 3.22), (2006).
  48. Xu, Y., et al. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells isolated by a novel explantation technique can differentiate into functional endothelial cells and promote revascularization. Stem Cells Dev. 19 (10), 1511-1522 (2010).
  49. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  50. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  51. Hua, J., et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix: proliferation and multilineage differentiation as compared to mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and bone marrow. Cell Biol Int. 38 (2), 198-210 (2013).
  52. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Curr Protoc Stem Cell Biol. 48 (1), e68(2019).
  53. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplant. 27 (1), 181-193 (2018).
  54. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  55. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell Tissue Res. 372 (1), 91-98 (2018).
  56. Börger, V., et al. Mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles and their potential as novel immunomodulatory therapeutic agents. Int J Mol Sci. 18 (7), 1450(2017).
  57. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  58. Kou, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles for immunomodulation and regeneration: a next generation therapeutic tool. Cell Death Dis. 13 (7), 580(2022).
  59. Huang, L., et al. Research advances of engineered exosomes as drug delivery carrier. ACS Omega. 8 (46), 43374-43387 (2023).
  60. Sun, Y., et al. Mesenchymal stem cells-derived exosomes for drug delivery. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 561(2021).
  61. Chopra, N., et al. Biophysical characterization and drug delivery potential of exosomes from human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells. ACS Omega. 4 (8), 13143-13152 (2019).
  62. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2023).
  63. Kamei, N., et al. Comparative study of commercial protocols for high recovery of high-purity mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle isolation and their efficient labeling with fluorescent dyes. Nanomedicine. 35, 102396(2021).
  64. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87, 31-45 (2015).
  65. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. J Extracell Vesicles. 11 (2), e12184(2022).
  66. Manning, R. R., et al. Analysis of peptides using asymmetrical flow field-flow fractionation (AF4). J Pharm Sci. 110 (12), 3969-3972 (2021).
  67. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 131(2018).
  68. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells Int. 2020, 8898221(2020).
  69. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).
  71. Witwer, K. W., et al. Updating MISEV: evolving the minimal requirements for studies of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 10 (14), e12182(2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.