מאמר שיטה

מדידת תכולת פחמן במקרופאגים בדרכי הנשימה שנחשפו לחלקיקים המכילים פחמן

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66781

⸱

12 ביולי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, Qingdao University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול ניסויי מפורט למדידת תכולת הפחמן של מקרופאגים בדרכי הנשימה במטרה להעריך את מינון החשיפה הפנימית ברמת החשיפה לחלקיקים בודדים.

תקציר

מקרופאגים ריאתיים מציגים דפוס תלוי מינון בחלקיקי פאגוציטיזציה. לאחר הבליעה, מקרופאגים אלה מופרשים לאחר מכן באמצעות כיח, מה שהופך את המקרופאגים והחלקיקים לגלויים וניתנים לכימות תחת מיקרוסקופ אור. יש לציין כי פחמן יסודי בגוף היונקים מקורו אך ורק במזהמים חיצוניים. כתוצאה מכך, תכולת הפחמן במקרופאגים בדרכי הנשימה (CCAM) משמשת כסמן ביולוגי תקף לחשיפה, האומדת במדויק את החשיפה האישית לחומר חלקיקי המכיל פחמן (PM). מאמר זה מתאר פרוטוקול הכולל איסוף, שימור, עיבוד, הכנת שקופיות וצביעה, כמו גם רכישה וניתוח של תמונות מקרופאגים. לאחר הסרת גרעיני המקרופאגים, חושב החלק היחסי של שטח הציטופלסמה שנכבש על ידי חלקיקי פחמן (PCOC) כדי לכמת את תכולת הפחמן בכל מקרופאג. התוצאות מצביעות על עלייה ברמות CCAM לאחר חשיפה לחומר חלקיקי המכיל פחמן. לסיכום, שיטה לא פולשנית, מדויקת, אמינה ומתוקננת זו מאפשרת מדידה ישירה של חלקיקי פחמן בתוך תאי המטרה ומשמשת לכימות בקנה מידה גדול של CCAM בודד באמצעות כיח מושרה.

מבוא

זיהום אוויר סביבתי קשור למוות כתוצאה ממחלות נשימה וכלי דם, ומהווה איום רציני על בריאות האדם 1,2. נתונים אפידמיולוגיים מצביעים על כך שחשיפה כרונית לחלקיקי סביבה בקוטר של פחות או שווה ל-2.5 מיקרומטר (PM2.5) אחראית למותם בטרם עת של בין 4 ל-9 מיליון בני אדם ברחבי העולם. PM2.5 דורג כגורם הסיכון החמישי בחשיבותו לתמותה עולמית במחקר נטל עולמי של מחלות, פציעות וגורמי סיכון (GBD) לשנת 2015 (GBD)3,4,5,6. מחקרים מצאו כי הקפדה על הנחיות זיהום האוויר של ארגון הבריאות העולמי יכולה למנוע 51,213 מקרי מוות בשנה כתוצאה מחשיפה ל-PM2.53. נכון לעכשיו, רוב המחקרים חסרים הערכה של חשיפה תוך-אישית ומבוססים רק על הערכות גסות באתרי ניטור אזוריים גדולים יותר, אשר רחוקים מרמות חשיפה פרטניות. הסמנים הביולוגיים הזמינים של חשיפה פנימית, כגון PAHs בשתן ובנזו(א)פירן, אינם משקפים את הקשר בין חשיפה לחומר חלקיקי לבין השפעות בריאותיות 7,8,9. זה מוביל לחוסר היכולת ליצור קשר מדויק עם השפעות בריאותיות. לכן, החיפוש אחר סמנים המשקפים את רמת החשיפה לחומר חלקיקי אצל אדם הוא אחד המפתחות להערכת חשיפה מדויקת עבור אנשים.

חלקיקים הנשאפים לתוך הסמפונות יכולים להיות מופרשים עם כיח באמצעות תנודות ריסניות בסימפונות. היעדר מערכת הולכת זרימה רירית בנאדיות פירושו שנתיב הפינוי העיקרי של חלקיקים הנכנסים לנאדיות הוא באמצעות פגוציטוזה וטרנסלוקציה על ידי מקרופאגים10,11. בהתבסס על המבנה האנטומי של הריאה, פינוי החומר הזר החלקיקי הבלתי מסיס שלה איטי. זה מאפשר לחומר חלקיקי לתקשר עם תאי הריאה לפרקי זמן ממושכים וליזום השפעות ביולוגיות שונות, תוך גרימת נזק לרקמת הריאה ולאיברים אחרים 12,13. גירוי על ידי חומר חלקיקי מוביל להפעלת מקרופאגים, ומעורר שרשרת של גורמים דלקתיים בריאות שיכולים לגרום לתגובה דלקתית מערכתית14. בהתחשב בתפקיד המכריע של ציטופגיית מקרופאגים ביצירת סערות ציטוקינים בריאות, קיימת תיאוריה כי חלקיקי פחמן ממקרופאגים של ריאות יכולים לשקף את המינון היעיל ביולוגית של חשיפה לחלקיקים גרעיני פחמן באוויר15. יתר על כן, מכיוון שאין צבירה של פחמן יסודי בתאי יונקים וניתן לצפות בחלקיקים המכילים פחמן כחומר חלקיקי שחור תחת מיקרוסקופ אור, איסוף המקרופאגים בנאדיות ובסימפונות ומדידת תכולת הפחמן בהם יכולים לשמש סמן להערכת חשיפה לחלקיקים16.

מחקר זה זיהה שיטה להערכה מדויקת של רמות החשיפה לחלקיקים בודדים, הידועה בשם תכולת הפחמן של מקרופאגים בדרכי הנשימה (CCAM). באופן ספציפי, דגימות כיח האוכלוסייה נאספו לאחר המשתתפים שאפו מלוחים היפרטוניים שנוצרו על ידי נבולייזר קולי. דגימות אלה נשמרו לאחר מכן באמצעות תמיסה מקבעת. המקרופאגים של דרכי הנשימה בודדו, הוכתמו וצולמו תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות מקרופאגים המכילים חלקיקים המכילים פחמן, ולאחר מכן כומתו. שיטה זו מספקת סמן ביולוגי להערכה מדויקת של רמות החשיפה לחלקיקים בודדים. הוא קובע בסיס מתודולוגי לחקר הקשר בין חשיפה לחומר חלקיקי לבין השפעות בריאותיות, ומשמש בסיס מחקרי לחקר הקשר בין חשיפה לחומר חלקיקי לבין תוצאי בריאות כגון מחלות ריאה.

פרוטוקול

המחקר קיבל אישור מוועדת האתיקה הרפואית של המכון לבריאות תעסוקתית ובקרת רעלים, המרכז הסיני לבקרת מחלות ומניעתן (NIOHP201604), עם הסכמה מדעת בכתב שהתקבלה מכל הנבדקים לפני המחקר ואיסוף הדגימות הביולוגיות. למחקר זה נבחרו אורזי פחמן שחור שעבדו במפעל פחמן שחור במשך יותר משנה ונחשפו לאירוסולים שחורים פחמניים. עובדי מפעלי מים במפעל מים ללא חשיפה תעסוקתית משמעותית לגורמים מזיקים גויסו מהאזור המקומי כאוכלוסיית ביקורת לביסוס המחקר. קריטריוני ההכללה וההדרה הבאים נבחרו עבור אוכלוסיית המחקר: קריטריוני ההכללה של אורזי פחמן שחור כללו מגע ישיר עם פחמן שחור במהלך רוב המשמרות ומינימום של שנת עבודה באזור החשיפה לפחמן שחור. עובדי מפעלי מים נכללו אם לא הייתה להם חשיפה תעסוקתית לפחמן שחור או למזהמים אחרים בסביבת עבודתם. קריטריוני ההחרגה כללו עובדים עם מחלות כרוניות כגון סרטן, אנשים שעברו חשיפה לצילומי רנטגן בשלושת החודשים האחרונים, אנשים עם היסטוריה של שחפת ריאות, ניתוחי ריאות, דלקת שריר הלב הנגיפית, מחלת לב מולדת, חום או דלקת לאחרונה, ועובדים שנטלו אנטיביוטיקה לאחרונה. הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. שימור כיח

  1. הכן את הפתרון המקבע לפי השלבים הבאים:
    1. יש להמיס 2% פוליאתילן גליקול (PEG1500) באמבט מים. קח 20 מ"ל של PEG1500 מומס בצינור צנטריפוגה. מוסיפים 20 מ"ל אתנול 50% לצינור הצנטריפוגה ומנערים את התערובת ביסודיות ליצירת ליקר האם.
    2. בהדרגה לשפוך 40 מ"ל של משקה האם לתוך 960 מ"ל של 50% אתנול. נערו היטב את התמיסה ליצירת תמיסת הקיבוע Saccomanno. אחסנו את התמיסה במקום קריר וחשוך.
  2. הוסף 20-30 מ"ל של פתרון קיבוע מוכן צינור צנטריפוגה המכיל כ 2 מ"ל של כיח. מערבבים היטב את התכולה.
    הערה: ודא שהנפח הכולל אינו עולה על 40 מ"ל.
  3. אטמו את צינור הצנטריפוגה בסרט איטום. אחסנו אותו במקום קריר וחשוך. להעביר את הצינור למעבדה לעיבוד נוסף כאשר הוא מוכן.
    הערה: יש להמיס תמיד PEG1500 באמבט מים ולהשתמש בהתאם למינון שנקבע.

2. הכנת השעיית תאים בכיח

  1. הכן את פתרון העיכול על ידי המסת 0.1 גרם של dithiothreitol ב 100 מ"ל של מלוחים לפי המינון בפועל. אחסנו את התמיסה המוכנה ב-4°C למשך עד 48 שעות.
  2. צנטריפוגה הצינור המכיל את הכיח ב 1,998 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  3. השליכו את הסופרנטנט. הוסף נפח שווה של עיכול כיח למשקע. מערבלים ומנערים היטב את התערובת.
    1. מניחים את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להנזלה מלאה (10-15 דקות).
      הערה: יש לנער ברציפות את הצינורית במהלך תהליך ההנזלה.
  4. סנן את התערובת הנוזלית עם קרום מסנן 70 מיקרומטר.
  5. צנטריפוגה את התמיסה המסוננת ב 500 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C.
  6. השליכו את הסופרנטנט, תוך שמירה על שקע התא.
  7. להשהות מחדש את שקע התא במאגר פוספט דושן. צנטריפוגה את התמיסה מחדש ב 500 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C כדי לקבל משקע תא טהור.

3. הכנת כתם תאים

  1. הוסף 200-600 μL של חיץ פוספט למשקעי התא. מערבבים היטב את התכולה; התאם את נפח המאגר בהתבסס על תוצאות ספירת התאים (כוון ל>1.0 × 105 תאים).
  2. קח 20 μL של תרחיף התא וליצור כתם התא באמצעות שיטת המטוקריט17.
  3. תנו למריחה להתייבש באוויר באופן טבעי (תוך 48 שעות). תקן את המריחה עם פתרון צביעה זמין מסחרית עבור 10 שניות.
  4. לטבול את המריחה בתמיסת כתמים למשך 8 שניות. במהלך הכתמה, הרימו בעדינות את המגלשה מעלה ומטה, ושטפו את עודפי הכתם במים זורמים.
  5. מכתימים את הכתם בתמיסת צביעה B למשך 8 שניות. הרימו את המגלשה במהלך הכתמים ושטפו את עודפי הכתם מתחת למים זורמים.
    הערה: פתרונות צביעה A ו-B זמינים בערכת הצביעה המסחרית.
  6. טובלים את המגלשה באתנול נטול מים פעמיים, כל פעם למשך 2-3 שניות.
  7. לאחר הייבוש, יש למרוח כמות מתאימה של מסטיק נייטרלי. אטמו את המגלשה בעזרת כיסויים.

4. ניתוח כמותי של CCAM

  1. השתמש במיקרוסקופ אור עם מטרת עדשת שמן 100x. צלם תמונות של מקרופאגים שנבחרו באופן אקראי, מוכתמים היטב ושלמים מורפולוגית. צלמו 50 תמונות מקרופאגים באופן אקראי עבור כל דגימה.
  2. בצע ניתוח תמונה בתוכנת Image J לפי השלבים הבאים:
    1. מדוד את קנה המידה וקבע את האורך בפועל ואת ההמרה מפיקסל לפיקסל (282 פיקסלים = 10 מיקרומטר). הגדר את קנה המידה בתמונה J (נתח > הגדר קנה מידה), מרחק קלט בפיקסלים, אורך בפועל, יחידת אורך (μm) וסמן כללי.
    2. השתמש בצורה לא סדירה כדי לתחום את התאים. הסר את הרקע (בחירות חופשיות, עריכה > נקה בחוץ). מדוד את השטח הכולל של התאים (ניתוח > מדידה).
    3. גזור את הגרעין (עריכה > גזירה). המירו את התמונה בגווני אפור לשחור-לבן (Image > Type > 8 bit).
    4. התאם את ערך גווני האפור הספציפי לכל צביעת תא לספירת חלקיקי פחמן מדויקת (תמונה > התאם סף > > החל, נתח >> מדידה).
    5. חשב את תכולת הפחמן של 50 מקרופאגים לדגימה בהתבסס על השטח הנמדד וניתוח התמונה בתוכנת Image J.

תוצאות

הכיח, שנשמר ועובד בתמיסה המקבעת, הציג מורפולוגיית מקרופאגים שלמה תחת מיקרוסקופ אופטי במהלך בדיקה מורפולוגית. המקרופאגים הציגו גרעיני תאים שקופים, עגולים או בצורת כליה, שניתן להכתים בקלות. לאחר הצביעה, גרעיני התא נראו כחלחלים-סגולים, בעוד הציטופלסמה הייתה ורודה בהירה או תכלת. השדה המיקרוסקופי הראה זיהומים מינימליים, מה שאפשר זיהוי תאים קל. בתוך התאים, חלקיקי פחמן שחור נראו בבירור בצברים קטנים, מה שאיפשר ניתוח כמותי של חלקיקי פחמן.

תמונות מייצגות של מקרופאגים של כיח מוצגות באיור 1, המתארות מספר משתנה של חלקיקי פחמן בתאים שונים. לדוגמה, איור 1A אינו מראה חלקיקי פחמן, בעוד שאיור 1D מציג את הריכוז הגבוה ביותר. ערכי CCAM נמדדו כ-0.00%, 2.24%, 6.64% ו-34.61% עבור מקרופאגים (A-D), בהתאמה. במהלך תהליך קביעת פרמטרי CCAM נערכה הערכה כמותית של תכולת הפחמן בכל מקרופאג כדי למתן הטיות הנובעות משינויים בגודל המקרופאגים והחפיפה של חלקיקי פחמן עם גרעיני תאים. חישוב וניתוח CCAM בוצעו עבור 50 מקרופאגים לכל נבדק, כפי שניתן לראות באיור 2.

המחקר בחר אורזי פחמן שחור (CBP) ממפעל ספציפי של אצטילן פחמן שחור כקבוצה שנחשפה וגייס עובדי משאבות מים ממפעלי מים מקומיים, שלא הייתה להם חשיפה תעסוקתית נראית לעין לגורמים מזיקים, כקבוצת הביקורת (Non-CBP). התוצאות המוצגות באיור 2 מצביעות על CCAM גבוה יותר בקרב עובדי אריזות שחורות פחמן בהשוואה לקבוצת הביקורת.

figure-results-1
איור 1: תמונה מיקרוסקופית אופטית שמראה חלקיקי פחמן בתוך מקרופאגים בדרכי הנשימה. הצבע השחור בציטופלסמה מייצג חלקיקי פחמן. לוחות (A-D) מציגים תמונות מייצגות של מקרופאגים בדרכי הנשימה, שכל אחד מהם מציג רמות שונות של CCAM. ערכי CCAM עבור מקרופאגים ב- (A-D) היו 0.00%, 2.24%, 6.64% ו- 34.61%, בהתאמה. רמת ה-CCAM הגבוהה ביותר נצפתה ב-(D). פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
תרשים 2: רמות כמותיות של CCAM באוכלוסייה. חמישים מקרופאגים ציטופלזמיים שלמים ומוכתמים היטב נבחרו באופן אקראי לניתוח וכימות לכל נבדק מחקר. הנתונים נותחו באמצעות מבחן t של התלמיד: *P < 0.05. CBP: אורזים שחורים פחמן; Non-CBP: קבוצת ביקורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

מחקר זה מציג פרוטוקול ניסויי מפורט לשימוש ב-CCAM המושרה שמקורו בכיח כסמן ביולוגי לחשיפה פנימית לחומר חלקיקי אטמוספרי. ניתן לזהות ולכמת CCAM באמצעות מיקרוסקופ אופטי, המשמש כסמן ביולוגי מדויק לחשיפה פנימית המשקף את הקשר עם השפעות בריאותיות. לכן, יש צורך להקים ולייעל שיטת שימור כיח מושרית נוחה, אמינה ויעילה ושיטת כימות CCAM לסטנדרטיזציה של ההליכים המתודולוגיים.

קביעת תכולת הפחמן של מקרופאגים ריאתיים כוללת מספר שלבים, כולל איסוף מקרופאגים ריאתיים, מריחה, צביעה, צילום וניתוח תמונה. כיום קיימות שתי שיטות לאיסוף מקרופאגים ריאתיים: כיח מושרה ושטיפת ריאות, כל אחת עם יתרונות ומגבלות משלה18,19. שטיפת ריאות יכולה להניב מקרופאגים הומוגניים רבים של הריאה, אך זוהי שיטת דגימה טראומטית הדורשת הרדמה ומצבים רפואיים אחרים. לכן, הוא אינו מתאים לדיגום אוכלוסייה כללית בקנה מידה גדול. לעומת זאת, כיח מושרה קל לביצוע, אינו פולשני ומתאים לדגימה בקנה מידה גדול של האוכלוסייה הכללית. זה גם מאפשר לקבל דגימות חוזרות. שטיפת ריאות מקבלת מקרופאגים מנאדיות או ברונכיולים דיסטליים, בעוד שכיח מושרה משיג מקרופאגים שעשויים להגיע מדרכי הנשימה. במחקר זה, ביצענו כיח מושרה בהתאם לפרוטוקול הסטנדרטי שפורסם על ידי החברה האירופית לנשימה20.

שיעור ההצלחה של כיח מושרה מושפע מגורמים שונים, כולל ריכוז של מלוחים נשאפים נבולי ונוכחות של מחלות נשימה אצל המטופל 21,22,23. דגימות כיח עשויות להכיל גם רוק, אשר יכול להפריע למדידת תכולת הפחמן של מקרופאגים, מה שעשוי להפחית את ספירת המקרופאגים בדרכי הנשימה במדגם24. הנהלים המבצעיים במחקר זה היו סטנדרטיים, השיטות היו פשוטות ויכולת השחזור הייתה גבוהה. נצפה כי גורמים כגון גודל קצב זרימת השאיפה המעורפלת, הלימות זמן האינדוקציה ונוכחות המרווחים במהלך האינדוקציה השפיעו על שיעור ההצלחה של כיח מושרה. שיקולים אלה חשובים להבטחת מדידה מדויקת ואמינה של CCAM כסמן ביולוגי לחשיפה לחומר חלקיקי.

התמיסה המקובעת Saccomanno, המורכבת מ-50% אתנול ו-2% פוליאתילן גליקול, משמשת בדרך כלל כקיבוע לשימור דגימות ביולוגיות כמו נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי. במחקר זה, לראשונה, נעשה שימוש בתמיסה מקובעת זו לשימור כיח המתקבל מחקירות שדה אפידמיולוגיות. התוצאות פגשו את הכימות הבא של פחמן במקרופאגים, בדומה לשימור תאי כיח בבוקר כדי לקבל מריחות תאים סרטניים ברורות25. הנהלים המבצעיים היו סטנדרטיים, השיטות היו פשוטות ויכולת השחזור הייתה גבוהה. היתרונות של שימור כיח מושרה במחקר זה כוללים: (1) תצורה קלה של קיבוע, (2) אין צורך בקירור לשימור, הנוח לסקרים אפידמיולוגיים בקנה מידה גדול, ו-(3) ניתן לשמר דגימות במקום קריר הרחק מאור. מבט ברור מתחת למיקרוסקופ לאחר הצביעה, עם גרעינים הניתנים לזיהוי, זיהומים מינימליים ומורפולוגיה שלמה של התא. זה עדיף על עיבוד כיח ישיר ויישום כתם במונחים של מורפולוגיה26.

לגבי שיטות ניסוי, צוינו הפרטים הבאים: כיח היה מזועזע מעת לעת במהלך העיכול באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד נוזלי לחלוטין. לאחר הנזלה, סינון על קרום 70 מיקרומטר נעשה לפני צנטריפוגה כדי להסיר זיהומים עבור רקע מכתים ברור יותר. משקעים סלולריים נשטפו שוב עם DPBS לפני שנמרחו על שקופיות. עודפי נוזלים הוסרו במהלך הכתמים על ידי שטיפת מגלשות במים זורמים. מחזיקי המגלשות הוחלפו בין כתם I לכתם II כדי למנוע שאריות. לצילום נבחרו באופן אקראי מקרופאגים עם מורפולוגיה מלאה וצביעה טובה, מה שהשפיע על כימות CCAM27.

אפשרויות תוכנת ניתוח כמותי למחקר זה כוללות את Image SXM ו- Image J28. Image SXM דורש עריכת תמונה ידנית לפני ניתוח כדי לשפר את הדיוק, מה שמאריך באופן משמעותי את הזמן הנדרש. הוא מוגבל גם לעיבוד סוג תא יחיד. לעומת זאת, תוכנת Image J המשמשת במחקר זה מציעה ספציפיות טובה יותר בעיבוד תמונה ותאימות רחבה יותר. בדיסציפלינות אחרות, שיטות מיקרוסקופיית סינון בעלות תוכן גבוה שימשו לבחירה ולניתוח עוקב של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי, והשיגו פעולות אוטומטיות בעלות תפוקה גבוהה. הכיוון העתידי של המחקר המתודולוגי עשוי לכלול פיתוח תיוג אוטומטי של מקרופאגים בכיח והליכי סינון29. במהלך עיבוד תמונה J, הגורמים המשפיעים על מדידת CCAM כוללים את הידע של המודד במידע הדגימה ואת קביעת ערכי סף בגווני אפור. אימוץ גישה עיוורת יכול להפחית את הטיית המשקיף, וייתכן שיהיה צורך למדוד דגימות מסוימות שוב ושוב כדי להעריך את יכולת השחזור. לכידה וניתוח עצמאיים של תמונות על ידי שני אנשים בעלי מומחיות ברמה גבוהה יכולים לשפר את הדיוק של זיהוי מקרופאגים.

המחקר השתמש בשיטות סטנדרטיות של המכון הלאומי לבטיחות ובריאות תעסוקתית (NIOSH) כדי להעריך את חשיפת הנבדקים לחומר חלקיקי תעסוקתי. הערכות מרובות נערכו על רמות חומר חלקיקי דק (PM2.5) ותכולת פחמן יסודי (EC) הקשור ל- PM2.5 באזור אריזת הפחמן השחור ובאזורי העבודה של עובדי מפעל המים של קבוצת הביקורת. עד 99.6% מחלקיקי הפחמן השחור (CB) היו בעלי קוטר אווירודינמי קטן מ-2.5 מיקרומטר, ו-96.7% היו קטנים מ-1.0 מיקרומטר. בסתיו 2012, רמת PM2.5 הממוצעת במתקן האריזה CB הייתה 800 מיקרוגרם למ"ק, עם רמת EC הקשורה ל- PM2.5 של 657.0 מיקרוגרם למ"ק30,31. בסתיו 2018, הממוצע הגיאומטרי של CB היה 637.4 מיקרוגרם / מטר3, ורמת EC הקשורה ל- PM2.5 הייתה 364.6 מיקרוגרם / מטר3. בשתי התצפיות, יחס EC/TC עלה על 92.5%, עקבי עם העובדה כי CB הוא כמעט EC טהור. לפיכך, ניתן להסיק ממחקר זה כי חלקיקי פחמן במקרופאגים נגזרים בעיקר מחשיפה לפחמן שחור30,31. כתוצאה מכך, ריכוז PM2.5 בסביבת העבודה של האוכלוסייה שנחשפה לפחמן שחור במחקר זה היה 637.4 מיקרוגרם/מ"ר 3, גבוה משמעותית מריכוז PM2.5 בסביבת העבודה של אוכלוסיית הביקורת (130.0 מיקרוגרם/מ"ר 3) וגבוה פי חמישה בקירוב מזה של אוכלוסיית הביקורת. רמות הפחמן האלמנטלי באוכלוסייה שנחשפה לפחמן שחור היו 364.6 מיקרוגרם/מ"ר 3, הרבה יותר מ-2.0 מיקרוגרם/מ"ר 3 באוכלוסיית הביקורת.

לסיכום, מחקר זה השתמש בכיח המושרה במי מלח היפרטוניים כדי לאסוף דגימות, השיג מקרופאגים לריאות, ביצע מריחות תאים וכימת את תכולת הפחמן בתוך 50 מקרופאגים, תוך שימוש במספר החציוני כדי לייצג את רמת תכולת הפחמן של המקרופאגים עבור כל אדם. מתודולוגיית מחקר זו יכולה להיות מותאמת לדגימות אוכלוסייה בקנה מידה גדול ולהשתמש בה כדי להעריך במדויק את רמת החשיפה הפנימית של הפרט לחומר חלקיקי.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה כספית על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82273669, 82241086, 42207488), תוכנית המלגות Taishan של מחוז שאנדונג (No. tsqn202211121), ותוכנית החדשנות והטכנולוגיה לחוקרי הנוער המצטיינים להשכלה גבוהה של מחוז שאנדונג (2022KJ295).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3 מ"ל קשיות סטריליותשנחאי YEASEN ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ84202ES03
50 מ"ל צינור צנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב339652
אלכוהול אתילי מוחלטסינופארם קבוצה ריאגנט כימי ושות 'בע"מ64-17-5
שמן ארזשנחאי מקלין ביוכימיה טכנולוגיה ושות', בע"מC805296
צביעה מהירה דיפרנציאלית פתרוןשנחאי YEASEN ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ40748ES76
DithiothreitolSolebo Bio Co., LtdD8220
דושן פוספט מאגר (DPBS)תרמו פישר סיינטיפיק, ארה"ב14190144
מצלמת מיקרוסקופאולימפוס תאגיד יפןDP72
מסטיק עץ ניטרליSolebo Bio Co., LtdG8590
קרום מסנן ניילון 70umBD Falcon Bioscience, ארה"ב211755
מיקרוסקופ אופטיאולימפוס תאגיד יפןBX60
פוליאתילן גליקולסינופארם קבוצה מגיב כימי ושות' בע"מ25322-68-3
אולטרה-צנטריפוגהתרמו פישר סיינטיפיק, ארה"בSL40R
שקופיות צמיגותג'יאנגסו SHitAI ציוד ניסיוני ושות 'בע"מ
188105

מקורות

  1. Münzel, T., et al. Environmental stressors and cardio-metabolic disease: part I-epidemiologic evidence supporting a role for noise and air pollution and effects of mitigation strategies. Eur Heart J. 38 (8), 550-556 (2017).
  2. Guarnieri, M., et al. Lung function in rural Guatemalan women before and after a chimney stove intervention to reduce wood smoke exposure: results from the randomized exposure study of pollution indoors and respiratory effects and chronic respiratory effects of early childhood exposure to respirable particulate matter study. Chest. 148 (5), 1184-1192 (2015).
  3. Khomenko, S., et al. Premature mortality due to air pollution in European cities: a health impact assessment. Lancet Planet Health. 5 (3), e121-e134 (2021).
  4. Kulkarni, N., Pierse, N., Rushton, L., Grigg, J. Carbon in airway macrophages and lung function in children. N Engl J Med. 355 (1), 21-30 (2006).
  5. Krzyzanowski, M. WHO air quality guidelines for Europe. J Toxicol Environ Health A. 71 (1), 47-50 (2008).
  6. Cohen, A. J., et al. Estimates and 25-year trends of the global burden of disease attributable to ambient air pollution: An analysis of data from the Global Burden of Diseases Study 2015. Lancet. 389 (10082), 1907-1918 (2017).
  7. Hajat, A., et al. The association between long-term air pollution and urinary catecholamines: Evidence from the multi-ethnic study of atherosclerosis. Environ Health Perspect. 127 (5), 57007(2019).
  8. Traffic-related air pollution: A critical review of the literature on emissions, exposure, and health effects. , Available from: https://www.healtheffects.org/publication/traffic-related-air-pollution-critical-review-literature-emissions-exposure-and-health (2010).
  9. Uccelli, R., et al. Female lung cancer mortality and long-term exposure to particulate matter in Italy. Eur J Public Healt.h. 27 (1), 178-183 (2017).
  10. Zhang, L., et al. Indoor particulate matter in urban households: sources, pathways, characteristics, health effects, and exposure mitigation. Int J Environ Res Public Health. 18 (21), 11055(2021).
  11. Wang, K., Zeng, R. Cough and expectoration. Handbook of Clinical Diagnostics. , 27-29 (2020).
  12. Qi, Y., et al. Passage of exogeneous fine particles from the lung into the brain in humans and animals. PNAS. 119 (26), e2117083119(2022).
  13. Comunian, S., Dongo, D., Milani, C., Palestini, P. Air pollution and COVID-19: The role of particulate matter in the spread and increase of COVID-19's morbidity and mortality. Int J Environ Res Public Health. 17 (12), 4487(2020).
  14. Sharma, J., et al. Emerging role of mitochondria in airborne particulate matter-induced immunotoxicity. Environ Pollut. 270, 116242(2021).
  15. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  16. Kupiainen, K., Klimont, Z. Primary emissions of fine carbonaceous particles in Europe. Atmos Environ. 41 (10), 2156-2170 (2007).
  17. Tueller, C., et al. Value of smear and PCR in bronchoalveolar lavage fluid in culture positive pulmonary tuberculosis. Eur Respir J. 26 (5), 767-772 (2005).
  18. Takiguchi, H., et al. Macrophages with reduced expressions of classical M1 and M2 surface markers in human bronchoalveolar lavage fluid exhibit pro-inflammatory gene signatures. Sci Rep. 11 (1), 8282(2021).
  19. Andelid, K., et al. Lung macrophages drive mucus production and steroid-resistant inflammation in chronic bronchitis. Resp Res. 22 (1), 172(2021).
  20. Weiszhar, Z., Horvath, I. Induced sputum analysis: Step by step. Eur Respiratory Soc. 9, 300-306 (2013).
  21. Popov, T., et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis. Eur Respir J. 8 (4), 559-565 (1995).
  22. Sumner, H., et al. Predictors of objective cough frequency in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 187 (9), 943-949 (2013).
  23. Brugha, R. E., et al. Carbon in airway macrophages from children with asthma. Thorax. 69 (7), 654-659 (2014).
  24. Simpson, J. L., Timmins, N. L., Fakes, K., Talbot, P. I., Gibson, P. G. Effect of saliva contamination on induced sputum cell counts, IL-8 and eosinophil cationic protein levels. Eur Respir J. 23 (5), 759-762 (2004).
  25. Risse, E. K., Van't Hof, M. A., Laurini, R. N., Vooijs, P. G. Sputum cytology by the Saccomanno method in diagnosing lung malignancy. Diagn Cytopathol. 1 (4), 286-291 (1985).
  26. Eells, T. P., Pratt, D. S., Coppolo, D. P., Alpern, H. D., May, J. J. An improved method of cell recovery following bronchial brushing. Chest. 93 (4), 727-729 (1988).
  27. Bai, Y., et al. Mitochondrial DNA content in blood and carbon load in airway macrophages. A panel study in elderly subjects. Environ Int. 119, 47-53 (2018).
  28. Jary, H., Rylance, J., Patel, L., Gordon, S. B., Mortimer, K. Comparison of methods for the analysis of airway macrophage particulate load from induced sputum, a potential biomarker of air pollution exposure. BMC Pulm Med. 15, 1-9 (2015).
  29. Gilbert, D. F., Meinhof, T., Pepperkok, R., Runz, H. DetecTiff: A novel image analysis routine for high-content screening microscopy. J Biomol Screen. 14 (8), 944-955 (2009).
  30. Dai, Y., et al. Effects of occupational exposure to carbon black on peripheral white blood cell counts and lymphocyte subsets. Environ Mol Mutagen. 57 (8), 615-622 (2016).
  31. Cheng, W., et al. Carbon content in airway macrophages and genomic instability in Chinese carbon black packers. Arch Toxicol. 94 (3), 761-771 (2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חשיפה לחלקיקים מרחפיםאיסוף ליחהכימות פחמן בציטופלזמהמיקרוסקופיה של אורצביעת תאיםניתוח ב-ImageJליחה מושרהמדידת סמנים ביולוגיים
מדידת תכולת פחמן במקרופאגים בדרכי הנשימה שנחשפו לחלקיקים המכילים פחמן
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.