הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדפסה ביולוגית משובצת של מבנים דמויי רקמות באמצעות מדיום תת-מיקרוג'ל κ-Carrageenan

2.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66806

⸱

3 במאי 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute of Smart Medicine and Biological Engineering, Ningbo University, 2Health Science Center, Ningbo University, 3Key Laboratory of Precision Medicine for Atherosclerotic Diseases of Zhejiang Province, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 4The First Affiliated Hospital of Ningbo University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מציג אמבט תרחיף תת-מיקרוג'ל κ-carrageenan חדשני, המציג תכונות מעבר הפיכות מדהימות של שיבוש וביטול חסימה. תכונות אלה תורמות לבניית רקמות ואיברים ביומימטיים בהדפסה ביולוגית תלת-ממדית משובצת. ההדפסה המוצלחת של רקמות דמויות לב/ושט עם רזולוציה גבוהה וצמיחת תאים מדגימה יישומים באיכות גבוהה של הדפסה ביולוגית והנדסת רקמות.

תקציר

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית (תלת-ממדית) משובצת באמצעות אמבט תומך הידרוג'ל גרעיני התפתחה כטכניקה קריטית ליצירת פיגומים ביומימטיים. עם זאת, הנדסה של מדיום מתלה ג'ל מתאים המאזן בין שקיעת ביו-דיו מדויקת לבין כדאיות התא ותפקודו מציבה אתגרים רבים, במיוחד בהשגת התכונות הויסקו-אלסטיות הרצויות. כאן, ג'ל κ-קרגינן חדשני התומך באמבטיה מיוצר באמצעות תהליך טחינה מכני קל לתפעול, המייצר חלקיקים הומוגניים תת-מיקרוסקולריים. תת-מיקרו-ג'לים אלה מפגינים התנהגות זרימה טיפוסית של בינגהאם עם לחץ תפוקה קטן ותכונות של דילול גזירה מהיר, המאפשרות שיקוע חלק של ביו-דיו. יתר על כן, המעבר ההפיך של ג'ל-סול ויכולות הריפוי העצמי של רשת מיקרו-ג'ל κ-carrageenan מבטיחים את השלמות המבנית של מבנים מודפסים, ומאפשרים יצירת מבני רקמות מורכבים ורב-שכבתיים עם מאפיינים אדריכליים מוגדרים. לאחר ההדפסה, ניתן להסיר בקלות את תת-המיקרו-ג'לים κ-carrageenan באמצעות שטיפת מלח פשוטה עם מאגר פוספטים. הדפסה ביולוגית נוספת עם דיו ביולוגי עמוס תאים מראה כי תאים בתוך מבנים ביומימטיים יש כדאיות גבוהה של 92% ולהרחיב במהירות pseudopodia, כמו גם לשמור על שגשוג חזק, דבר המצביע על הפוטנציאל של אסטרטגיית הדפסה ביולוגית זו לייצור רקמות ואיברים. לסיכום, מדיום תת-מיקרוג'ל κ-קרגינן חדשני זה מתגלה כאפיק מבטיח להדפסה ביולוגית משובצת באיכות יוצאת דופן, הנושא השלכות עמוקות על התפתחות במבחנה של רקמות ואיברים מהונדסים.

מבוא

פיגומים להנדסת רקמות, כולל סיבים אלקטרו-סובבים, ספוגים נקבוביים והידרוג'לים פולימריים, ממלאים תפקיד מרכזי בתיקון ושחזור של רקמות ואיברים פגומים על ידי מתן מסגרת מבנית התומכת בצמיחת תאים, התחדשות רקמות ושיקום תפקוד איברים 1,2,3. עם זאת, פיגומים מסורתיים נתקלים באתגרים בשכפול מדויק של מבני רקמות מקומיים, מה שמוביל לחוסר התאמה בין הרקמות המהונדסות והטבעיות. מגבלה זו מעכבת ריפוי יעיל של רקמות פגומות, ומדגישה את הצורך הדחוף בהתקדמות בעיצוב פיגומים כדי להשיג ביומימיקרי מדויק יותר. הדפסה ביולוגית תלת מימדית (3D) היא טכניקת ייצור חדשנית הבונה במדויק מבנים מורכבים של רקמות ביולוגיות שכבה אחר שכבה באמצעות דיו ביו-חומרי ותאים4. בין ביו-חומרים שונים, הידרוג'לים פולימריים מתגלים כביו-דיו אידיאליים עם הרשת הייחודית שלהם המאפשרת אנקפסולציה באתרם של תאים ותומכת באופן מכריע בצמיחתם 5,6. עם זאת, הידרוג'לים רכים ורוויי לחות רבים נוטים לגרום לטשטוש או לקריסה מהירה של מבני פיגומים מודפסים במהלך תהליך ההדפסה, כאשר הם משמשים כדיו ביולוגי. כדי להתמודד עם אתגר זה, טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית משובצת משתמשת באמבט מיקרוג'ל כחומר תמיכה, המאפשר שיקוע מדויק של דיו ביו-דיו רך. עם ג'לציה של bioinks הידרוג'ל, פיגומים ביוניים מזוקקים עם מבנים מורכבים מתקבלים על ידי הסרת אמבט מיקרוג'ל. חומרים כמו ג'לטין 7,8, אגרוז9 וגלן גאם10,11 שימשו ליצירת אמבטיות מיקרוג'ל להדפסה ביולוגית תלת-ממדית משובצת, מה שמקדם משמעותית את היישום של הידרוג'לים רכים בהנדסת רקמות. עם זאת, גודל החלקיקים ברמת מיקרון ולא אחיד של ג'לים חלקיקיים אלה משפיע לרעה על הרזולוציה והנאמנות של הדפסת תלת ממד 12,13,14. יש צורך דחוף לייצר תרחיף דמוי ג'ל עם חלקיקים קטנים ומפוזרים באופן אחיד, המציע יתרונות בהשגת הדפסה ביולוגית באיכות גבוהה.

בפרוטוקול זה, אמבט תרחיף κ-carrageenan גרגירי חדשני עם רמת תת-מיקרון אחידה מוצג להדפסה תלת-ממדית משובצת. התנהגות אמבטיה תת-מיקרוג'לית חדשנית זו של מעבר מהיר לשיבוש ושחרור חסימה מאפשרת ייצור מדויק של פיגומי הידרוג'ל ביומימטיים עם נאמנות מבנית גבוהה15. תוך שימוש בתווך ההשעיה החדש הזה, סדרה של מבני רקמות ואיברים ביומימטיים הכוללים מבני רקמות רב-שכבתיים מודפסים בהצלחה, תוך שימוש בביו-דיו מרוכב המורכב מג'לטין מתקרילט ומשי פיברו מתקרילט. במחקר זה, בחרנו בוושט כאובייקט הביומימטי התלת-ממדי המודפס ביולוגית, בעיקר משום שהוושט הוא לא רק בעל מבנה רקמתי רב-שכבתי, אלא גם שכבת השריר שלו מציגה מבנה שכבות מורכב פנימי מעגלי ואורכי חיצוני. הבטחת יישור וארגון נאותים של שכבות אלה חיונית להתחדשות רקמות תפקודית. לכן, אנו רוצים מאוד לשכפל את הארכיטקטורה הרב-שכבתית של הוושט. חשוב מכך, השתמשנו בתת-מיקרו-ג'לים κ-carrageenan כאמבט תרחיף וב-GelMA/SFMA כביו-דיו כדי לתכנן ולבנות פיגום ביומימטי להנדסת רקמות. הוושט המודפס יכול להשתחרר בקלות על ידי שטיפה חוזרת ונשנית של מי מלח חוצצים בפוספט. יתר על כן, אמבט κ-carrageenan sub-microgel הוא ללא חומרים ציטוטוקסיים, הבטחת cytocompatibility גבוהה15. תאי השריר החלק העמוסים בתוך פיגומים אנאיזוטרופיים מפגינים פעילות התפשטות בולטת. מדיום תרחיף תת-מיקרוג'ל אחיד זה מציע דרך חדשה לייצור רקמות ואיברים מורכבים באמצעות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית משובצת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת אמבט ההשעיה κ -carrageenan sub-microgel

  1. הכינו 500 מ"ל של אמבט תרחיף κ-carrageenan (0.35% wt/vol) על ידי הוספת 1.75 גרם של אבקת κ-carrageenan לתוך 500 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, pH 7.4) בתוך בקבוק זכוכית של 1,000 מ"ל.
  2. הכניסו מוט מערבל מגנטי בקוטר 70 מ"מ לתוך בקבוק הזכוכית כדי לערבב את התערובת המימית. הדקו את פקק בקבוק הזכוכית ואז שחררו אותו בחצי סיבוב.
  3. הכניסו את בקבוק הזכוכית לאמבט מים בטמפרטורה של 70 מעלות וחממו אותו. הפעילו את המערבל המגנטי במהירות של 300 סל"ד, הניחו את הבקבוק וערבבו עד להמסה מוחלטת של הפולימר.
  4. קח בקבוק זכוכית נוסף ומניחים אותו autoclave לעיקור, פועל ב 121 ° C במשך 30 דקות.
  5. לאחר שהמעקר בלחץ גבוה מתקרר ל-80°C, הוציאו את הבקבוק מהמעקר והעבירו אותו לשולחן העבודה הנקי במיוחד להמשך טיפול.
  6. סננו את תמיסת κ-קרגינן המומסת לחלוטין לתוך בקבוק הזכוכית המעוקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    הערה: בצע סינון מהיר כאשר התמיסה חמה כדי למנוע מ-κ-carrageenan להתקרר ולחסום את המסנן.
  7. אחסנו את תמיסת κ-carrageenan בטמפרטורה של 4°C כדי לגרום לג'לציה מוצלבת של קטיון למשך 12 שעות.
  8. טחינה מכנית של הידרוג'ל κ-carrageenan באמצעות מערבל מגנטי 60 מ"מ עם מהירות ערבוב של 1200 סל"ד ב 25 ° C עד שהוא הופך בהצלחה למצב נוזלי, לוקח בערך 60 דקות.
    הערה: יש לאחסן את ההידרוג'לים κ-קרגינן בין 25-37°C כדי למנוע ג'לציה בטמפרטורות נמוכות או המסה בטמפרטורות גבוהות.

2. הכנת ביודיו מרוכב ג'לטין מתקרילט/משי פיברואין מתקרילט

  1. הכן ביודיו מרוכב על-ידי שילוב של 10% (wt/vol) ג'לטין מתקרילט (GelMA) ו-6% (wt/vol) משי פיברואין מתקרילט (SFMA) בתמיסת PBS (pH 7.4). שקלו 2.0 גרם של GelMA ו-1.2 גרם של אבקות SFMA בנפרד.
  2. הוסיפו באיטיות את האבקות לשני צינורות צנטריפוגות של 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של תמיסת PBS בנפרד לצינורות הצנטריפוגות של 50 מ"ל.
  3. הוסיפו מערבל מגנטי בקוטר 10 מ"מ לכל אחד מהם וערבבו וחממו ללא הרף באמבט מים בטמפרטורה של 45°C. הניחו לאבקות GelMA ו-SFMA להתמוסס לחלוטין, תוך כ-30 דקות.
  4. ערבבו את תמיסות GelMA ו-SFMA בנפח שווה תחת ערבוב מתמשך בטמפרטורה של 45°C. סנן את הדיו הביולוגי ללא הפרדות צבע באמצעות מסנן בגודל נקבוביות של 100 מיקרומטר.
  5. יש לעקר את הדיו הביולוגי GelMA/SFMA המרוכב באמצעות קרינת UV בארון בטיחות ביולוגית למשך 12 שעות.
    הערה: הכינו את הדיו הביולוגי והשתמשו בו באופן מיידי כדי למנוע ג'לציה מוקדמת מדי של SFMA באמצעות הרכבה עצמית.

3. אפיון ראולוגי של אמבט תרחיף תת-מיקרוג'ל κ -carrageenan

  1. הפעל והכן ציוד הקשור לריאולוגיה.
    1. הפעל את מדחס האוויר למשך 30 דקות וודא שהלחץ מגיע ל -30 psi. הסר את מהדק המסבים על ידי סיבוב מוט המשיכה נגד כיוון השעון. תקן את הכיסוי השחור למטה וסובב את ציר הידית בחלק העליון של המכשיר בכיוון השעון.
    2. הפעל את הרומטר ואפשר לו לאתחל. הפעל את מתג זרימת המים ואפשר לטמפרטורה להגיע ל -15 מעלות צלזיוס.
    3. פתח את תוכנת בקרת הראומטר כדי ליצור את החיבור המקוון.
  2. כייל את הריומטר והתקן את גיאומטריית הלוח המקבילי.
    1. בצע כיול מכשירים בתוכנת הבקרה, הכולל בעיקר התאמת נתיב האינרציה של מכשיר הכיול. התאימו גיאומטריית לוח מקביל בקוטר 40 מ"מ לקצה מוט הציור. החזק את לחצן הנעילה למשך 3 שניות כדי להזיז את פיר המנוע למצב הבית למיקום גיאומטריה עקבי.
    2. בחר את מנהל הכיול בתוכנת הבקרה ולאחר מכן לחץ על אינרציה, כיול חיכוך ומיפוי סיבוב כדי לכייל את גיאומטריית הלוח המקבילי.
  3. אפס את גובה מרווח הריומטר על ידי ביצוע הליך סטנדרטי של אפס מרווחים כדי להבטיח מדידה מדויקת.
  4. הגדר את שלבי הניסוי, כולל כבש זרימה הנע בין 0.01 ל- 1000 קצב גזירה של 1/s, טאטוא משרעת הנע בין 0.1% ל- 100% מאמץ ב- 10 rad/s, טאטוא זמן תנודה רב-שלבי הנמשך 60 שניות עם זנים מתחלפים של 1% ו- 100% ב- 10 rad/s, וטאטוא Peak Hold רב-שלבי הנמשך 120 שניות עם קצב גזירה לסירוגין של 0.1 1/s ו- 10 1/s.
  5. זרוק 2 מ"ל של מתלי 0.35% κ-carrageenan על לוח פלטייה של הרומטר.
  6. מקם את מרווח הגיאומטריה ל- 510 מיקרומטר והסר כל גלישה עודפת בקצה התקן המהדק. הגדר את מרווח הדגימה ל- 500 מיקרומטר כדי לאפשר לדגימה להתרחב מעט מעבר לקצה המהדק.
  7. ערוך ניסוי זרימה על-ידי בחירת כבש הזרימה מאפשרויות תכנון הניסוי.
    1. בחר את בדיקת רמפת הזרימה בתכנון הניסוי. הגדר את קצבי הגזירה מ- 0.001 ל- 10 1/s בטמפרטורה של 25 °C.
    2. בצע את שלב 3.5 ואת ניסוי כבש הזרימה במדגם הנוסף.
  8. בצע בדיקת Peak Hold מחזורית כדי להעריך את ביצועי ההתאוששות של החומר.
    1. בחר Peak Hold טאטא את תכנון הניסוי וקבע 5 ניסויים רצופים בזמן של 120 שניות ב- 25 ° C.
    2. הגדר את קצב הגזירה ל- 0.01 1/s עבור השלב הראשון, השלישי והחמישי ול- 10 1/s עבור השלבים השני והרביעי.
    3. הוסף מדגם חדש של 2 מ"ל. בצע את שלב 3.5 ואת מבחן ההתאוששות המחזורית.
  9. בצע ניתוח צמיגות כדי להעריך את המעבר הפוטנציאלי של ג'ל-סול של אמבט ההשעיה κ-carrageenan.
    1. בחר את מבחן טאטוא המשרעת בתכנון ניסיוני. הגדר את זן התנודה מ 0.1% ל 100% בטמפרטורה של 25 °C (75 °F). לחץ על התחל כדי לבצע את ניסוי ניקוי המשרעת במדגם הנוסף.
  10. בצע ניתוח מאמץ חלופי כדי להעריך את ביצועי ההתאוששות האלסטית של החומר.
    1. בחר זמן תנודה טאטא בעיצוב הניסוי וקבע 5 ניסויים רצופים עם זמן של 60 שניות ב 25 ° C.
    2. הגדר את המאמץ ל- 1% עבור הצעד הראשון, השלישי והחמישי ול- 100% עבור הצעד השני והרביעי.
    3. הוסף מדגם חדש של 2 מ"ל. בצע את שלב 3.5 ואת בדיקת ההתאוששות המחזורית הרציפה.
      הערה: נקו את לוחית הגיאומטריה ואת צלחת פלטייה לאחר כל ניסוי והוסיפו דגימה חדשה של 2 מ"ל.

4. הדפסת פיגומי הידרוג'ל ביומימטיים באמצעות מדפסת מיקרו-אקסטרוזיה בעיצוב מותאם אישית

  1. עצבו קוביות בפורמט STL באמצעות תוכנת גרפיקה תלת-ממדית והורידו מודלים דמויי רקמות ממסד הנתונים התלת-ממדי (www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).
    1. ייבא את המודלים בפורמט STL לתוכנת PANGO והזן את פרמטרי ההדפסה. הגדר את הקואורדינטות הספציפיות X, Y ו- Z של המודל במרחב תלת-ממדי, הזן את גודל קנה המידה הצפוי של המודל במילימטרים (מ"מ), התאם את הגודל ואת יחס קנה המידה של האובייקט על צירי X, Y ו- Z, והתאם את זווית הסיבוב של המודל במרחב לפי הצורך.
    2. הזן את קוטר חוט הלהט המשוער (בדרך כלל בסביבות 200-500 מיקרומטר עבור רוב הדיו הביולוגי) לשדה עובי השכבה כדי לקבוע את עובי ציר Z של כל שכבה. הגדר את מהירות ההדפסה בהתאם לעובי הקו הצפוי (כ- 10-90 מ"מ לשנייה) והגדר את צפיפות המילוי ל- 30%-80%.
    3. ייצא את הפרמטרים הסופיים כ- G-code לכרטיס SD.
  2. הפעל את המדפסת הביולוגית ואת משאבת המיקרו-אקסטרוזיה.
    1. הפעל את בקר משאבת המיקרו-אקסטרוזיה, בחר את מזרק הנפח המתאים (5 מ"ל), והגדר את קצב האקסטרוזיה על 0.08 מ"ל/דקה ואת משך האקסטרוזיה בתיאום עם זמן ההדפסה הרצוי המתקבל על ידי חלוקת נפח ההידרוג'ל בקצב האקסטרוזיה.
    2. הכנס את המזרק עם מחט בקוטר פנימי של 210 מיקרומטר לחריץ המזרק של המדפסת הביולוגית.
    3. כוונן את בקר המזרק כדי לוודא שהבוכנה של המזרק נמצאת במגע הדוק עם הבורג.
    4. הכניסו 3 מ"ל של אמבט תלוי לצלחת תרבית תאים בקוטר 35 מ"מ. מקם את המנה על הפלטפורמה בהתבסס על הגדרות הקוד וודא שראש ההדפסה נמצא 1 מ"מ מעל תחתית המנה.
      הערה: בצע בדיקה מקדימה כדי להבטיח את דיוק מיקומי הכלים בפלטפורמת ההדפסה במהלך ההדפסה.
    5. הכנס את כרטיס ה-SD המכיל את הקוד למדפסת הביולוגית התלת-ממדית, הפעל את קובץ הקוד, הפעל את המדפסת הביולוגית ולחץ על לחצן התחל בבקר.
  3. עיבוד המבנים
    1. חשוף את המבנה המודפס לאור כחול של 405 ננומטר למשך דקה אחת כדי להתחיל Photocrosslinking.
    2. הסר את ג'ל κ-carrageenan באמצעות פיפטה 1 מ"ל, ואחריו תוספת של 3 מ"ל של PBS (pH 7.4) לשטיפה והסרה לאחר מכן. חזור על תהליך זה לשטיפה יסודית.
      הערה: בצע את תהליך הכביסה בעדינות כדי למנוע נזק למבנים המודפסים.

5. הדפסה ביולוגית תלת-ממדית משובצת של אנלוגים לשכבת שריר הוושט

  1. תרבית ארנב תאי שריר חלק הוושט (eSMCs).
    1. התחל את התרבית בצלוחיות T75 עם 2 x 106 תאים באמצעות 15 מ"ל של מדיום DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    2. שמור על eSMCs ב 37 ° C באטמוספירה לחה של 5% CO2 ו 95% אוויר עד שהם מגיעים 80% מפגש.
  2. הכנת ביודיו של שכבת שריר הוושט
    1. שאפו את המדיום עם ההגעה למפגש ושטפו את eSMCs עם 5 מ"ל של 1x PBS.
    2. מוסיפים 2 מ"ל של 0.2% טריפסין-EDTA לבקבוק ודגרים במשך 2 דקות כדי לעכל את התאים. הקש על הבקבוק כדי לנתק את התאים מהקיר.
    3. לסיים את העיכול על ידי הוספת 2 מ"ל של DMEM ולהעביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. מדוד את צפיפות התא באמצעות מונה תאים עם 10 μL של השעיית תאים.
    4. צנטריפוגה במשקל 675 x גרם למשך 3 דקות, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא בביודיו GelMA/SFMA המרוכב (כפי שהוכן בשלב 2.1). התאם את ריכוז התאים הסופי כדי להשיג צפיפות של 10 x 106 תאים/מ"ל בדיו הביולוגי, ובכך למטב את התנאים ליישומי הדפסה ביולוגית תלת-ממדית הבאים.
  3. הכנת מדפסת ביולוגית תלת ממדית וחומרים נלווים
    1. Autoclave מכשירי ההדפסה החיוניים, כולל מחטי מזרק, מלקחיים, מערבל מגנטי ובקבוק זכוכית סיליקט 1000 מ"ל, בתנאי עיקור סטנדרטיים (121 ° C למשך 30 דקות) כדי להבטיח סביבה אספטית לתהליך ההדפסה.
    2. הכנס את המדפסת הביולוגית לארון בטיחות ביולוגית וחטא אותה באור אולטרה סגול (UV) למשך 30 דקות כדי לשמור על סטריליות.
    3. הכן 50 מ"ל של κ-קרגינן סטרילי ו-5 מ"ל של דיו מרוכב GelMA/SFMA סטרילי, כמתואר בשלב 1 ובשלב 2, בהתאמה.
    4. עצב את המודל, הגדר את הפרמטרים הרצויים והכן את המדפסת הביולוגית כמתואר בשלב 4.1.
  4. התחלת תהליך ההדפסה הביולוגית
    1. בצע את ההליכים המתוארים בשלבים 4.2 ו- 4.3 כדי להדפיס ביולוגית את שכבת שריר הוושט התלת-ממדית, ולאחר מכן שטיפה והחלפה של PBS.
    2. בצע הדפסת תאים בטכניקות סטריליות לאורך כל תהליך ההדפסה כדי למזער את הסיכון לזיהום תאים במבנה המודפס.
  5. תחליף בינוני לאחר הדפסה של תרבית תאים
    1. שאפו בזהירות את PBS והחליפו אותו ב-3 מ"ל DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. ודא שהמבנים המודפסים שקועים לחלוטין כדי לספק תנאי גידול תאים אופטימליים.
    2. לדגור על צלחת תרבית התאים המכילה את המבנים המודפסים באינקובטור המוגדר ל 37 ° C עם 5% CO2. החלף את מדיום תרבית התאים בתווך טרי מדי יום, באמצעות 3 מ"ל בכל פעם, ועקוב אחר מצב התאים בתוך המבנים באמצעות מיקרוסקופ אור.

6. הערכת הכדאיות של eSMCs בתוך המבנים המודפסים באמצעות צביעה של בדיקות חיות/מתות

  1. הסר את מדיום תרבית התאים לאחר 5 שעות של דגירה ושטוף את המבנים עמוסי התאים עם PBS.
  2. הוסף 2 מ"ל של תמיסת יודיד calcein-AM/propidium סטנדרטית (1:1000) למבנים עמוסי התאים המודפסים ולדגור.
  3. שטפו את המבנים 3x עם PBS לאחר דגירה של 45 דקות ולאחר מכן הוסיפו מדיום תרבית תאים טרי.
  4. התבונן בתאים חיים ומתים וצלם תמונות פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM).

7. תצפית על eSMCs בתוך המבנים המודפסים באמצעות צביעת FITC-Phalloidin/DAPI

  1. צבעו את המבנים המודפסים באמצעות פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) המסומן כפלואידין (ירוק) עבור F-אקטין ו-4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, כחול) עבור גרעין לאחר 5 ימי דגירה.
  2. הכנת פתרון קיבוע
    1. שלב 4 מ"ל של PBS 1x עם 0.16 מ"ל של פרפורמלדהיד (PFA) בצינור פוליאתילן (PE) של 5 מ"ל, והשגת ריכוז סופי של 4%.
    2. הניחו את צלחת התרבית המכילה את המבנים המודפסים ביולוגית על משטח נקי. הסר את המדיום וכסה בעדינות את המבנים בתמיסת PFA, כדי להבטיח את טבילתם המלאה. הניחו לקיבוע להמשיך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפני השלכת התמיסה.
      הערה: טפל בנוזלים בזהירות במהלך תהליכי ההוספה וההסרה כדי לשמור על השלמות המבנית של המבנים המודפסים ביולוגית.
    3. הציגו 2.5 מ"ל של PBS 1x לצלחת התרבית, תוך השקעה מלאה של המבנים כדי להסיר ריאגנטים מכתימים שיורית.
  3. חדירות קרום התא
    1. גיבוש תמיסת טריטון X-100 0.5% על ידי הוספת 20 μL של Triton X-100 עד 4 מ"ל של 1x PBS בצינור PE של 5 מ"ל.
    2. יש לתת את תמיסת Triton X-100 למבנים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחדור לקרומי התא, ולאחר מכן להסיר את התמיסה.
    3. הציגו 2.5 מ"ל של PBS 1x לצלחת התרבית, תוך השקעה מלאה של המבנים כדי להסיר ריאגנטים מכתימים שיורית.
  4. חסימת כריכה לא ספציפית
    1. צור פתרון חסימת אלבומין בסרום בקר (BSA) 3% בצינור PE של 5 מ"ל על ידי הוספת 0.12 מ"ל BSA ל- 4 מ"ל של PBS 1x.
    2. הציגו את פתרון ה-BSA למבנים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסום אתרים לא ספציפיים, ולאחר מכן השליכו את התמיסה.
  5. צביעת אקטין עם FITC-Phalloidin
    1. הכינו תמיסת FITC-phalloidin 0.2% בצינור PE של 5 מ"ל עם 4 מ"ל של PBS 1x ו-8 מיקרוליטר של מגיב צביעה.
    2. טבלו את המבנים בתמיסה זו למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ולאחר מכן השליכו את התמיסה.
    3. הוסף 2.5 מ"ל של PBS 1x לצלחת התרבית, תוך השקעה מלאה של המבנים כדי להסיר ריאגנטים מכתימים שיורית.
  6. צביעה גרעינית עם DAPI
    1. החל 4 מ"ל של פתרון צביעה DAPI על המבנים, הבטחת כיסוי מלא.
    2. יש לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפני הסרת תמיסת DAPI.
  7. שטיפה סופית וטבילת PBS: הוסיפו 2.5 מ"ל של PBS 1x לצלחת התרבית, תוך השקעה מלאה של המבנים כדי להסיר ריאגנטים מכתימים שיוריים.
    הערה: הכינו מראש תמיסות צביעה וטפלו בהן בעדינות. בשום שלב אסור שהתאים יעברו התייבשות בתוך כלי התרבית.
  8. התבוננות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי: בדוק וצלם את המבנים המוכתמים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להעריך את צמיחת התאים, תוך הבטחת תיעוד מקיף של התוצאות.

8. הערכת התפשטות eSMCs בתוך המבנים המודפסים באמצעות בדיקת CCK-8

  1. הסר את מדיום התרבות מהמבנים בימים 7 ו -14. שטפו את המבנים עם PBS כדי להסיר שאריות תאים בינוניים ומנותקים.
  2. הוסף פתרון CCK-8 לכל מבנה בהתאם להוראות היצרן. ודא שהנפח של פתרון CCK-8 מספיק כדי לכסות כל מבנה לחלוטין.
  3. לדגור על המבנים עם תמיסת CCK-8 ב 37 ° C במשך 2 שעות. לאחר הדגירה, מעבירים בזהירות את הסופרנאטנט לצלחת חדשה בת 96 בארות.
  4. מדוד את הספיגה ב- 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-לוחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אמבט הג'ל הגרגירי κ-carrageenan נוצר על ידי פירוק מכני של הידרוג'לים בתפזורת לתרחיף ג'ל חלקיקי. המחקר האחרון הראה כי חלקיקי κ-קרגינן הציגו קוטר ממוצע של כ-642 ±-65 ננומטר עם מורפולוגיות אחידות ב-1000 סל"ד של ערבוב מכני15, קטן משמעותית מממדי המיקרו-ג'לים שדווחו בעבר בספרות 16,17,18. זמני שבירה ארוכים יותר ומהירויות גדולות יותר יוצרים גדלים קטנים יותר של מיקרו-חלקיקים, עם זמן מיזוג של 60 ד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הכנת אמבטיות תרחיף תת-מיקרוג'ל κ-carrageenan לשימוש בהדפסה ביולוגית היא תהליך מתוזמר בקפידה הכולל מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח שהמדיום המתקבל יציג את התכונות הרצויות לתמיכה בדיו ביולוגי. בתחילה, פתרון κ-carrageenan מוכן על ידי המסת אבקת κ-carrageenan במים deionized בטמפרטורות גבוהות, יצירת תערובת הומוגנית. ריכוז התמיסה הוא המפתח ויש לייעל אותו לג'לציה שלאחר מכן. 0.3-0.6% (WT/VOL) κ-Carrageenan הפגין ביצועים מצוינים בהדפסה ביולוגית מש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין עניין כלכלי בתוצרים המתוארים בכתב יד זה.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי קרן נינגבו למדעי הטבע (2022J121, 2023J159), פרויקט מפתח של הקרן למדעי הטבע של העיר נינגבו (2021J256), הקרן הפתוחה של מעבדת מפתח המדינה להנדסה מולקולרית של פולימרים (אוניברסיטת פודאן) (K2024-35), ומעבדת מפתח לרפואה מדויקת למחלות טרשת עורקים במחוז ג'ג'יאנג, סין (2022E10026). תודה על התמיכה הטכנית על ידי מתקני הליבה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת נינגבו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדפסת ביולוגית תלת מימדיתמעוצבת
4',6-Diamidino-2-PhenylindoleSolarbio Life ScienceC0065מוכן לשימוש
405 ננומטר אור UVEFLXY-WJ01
מונה תאיםקורנינגCyto smart 6749
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליLeicaSTELLARIS 5
DMEM גלוקוז גבוהVivaCellC3113-0500גלוקוז גבוה, עם נתרן פירובט ו-L-גלוטמין
ריאומטר סיבובי דינמיTA InstrumentDiscovery HR-20
תאי שריר חלק בוושטמסופק על ידי המחלקה לביולוגיה של התא ורפואה רגנרטיבית, המרכז למדעי הבריאות, אוניברסיטתתאים ראשוניים מוושט הארנב
סרום בקרעוברי UEF9070L
פלואורסצאין איזותיוציאנט עם תווית פלואידיןSolarbio Life ScienceCA1610300T
ג'לטין מתאקרילטEFLEFL-GM-6060% החלפה
k-carrageenanAladdinC121013-100 גרםריאגנט כיתה
ליתיום פניל (2,4,6-trimethylbenzoyl) פוספינאטאלאדיןL157759-1 גרם365 ~ 405 ננומטר
ערכת Live-DeadbeyotimeC2015M
קורא מיקרופלייטפוטנובPT-3502B
ParaformaldehydeSolarbio Life ScienceP1110 4%
פניצילין/סטרפטומיציןSolarbio Life ScienceMA0110100 וחריף;
פוספט חוצץמלח VivaCellC3580-0500pH 7.2-7.4
משי פיברואין מתאקרילטEFLEFL-SilMA-00139% החלפה טריטון
X-100Solarbio Life ScienceT8200
טריפסין-EDTAVivaCellC100C10.25%, ללא פנול אדום
בהתאמה אישית נינגבו

מקורות

  1. Xu, X., et al. Biodegradable engineered fiber scaffolds fabricated by electrospinning for periodontal tissue regeneration. J Biomater Appl. 36 (1), 55-75 (2021).
  2. Amann, E., et al. A graded, porous composite of natural biopolymers and octacalcium phosphate guides osteochondral differentiation of stem cells. Adv Healthcare Mater. 10 (6), e2001692(2021).
  3. Afjoul, H., et al. Freeze-gelled alginate/gelatin scaffolds for wound healing applications: An in vitro, in vivo study. Mater Sci Eng C. 113, 110957(2020).
  4. Hasanzadeh, R., et al. Biocompatible tissue-engineered scaffold polymers for 3D printing and its application for 4D printing. Chem Eng J. 476, 146616(2023).
  5. Fu, L., et al. Cartilage-like protein hydrogels engineered via entanglement. Nature. 618 (7966), 740-747 (2023).
  6. Bertsch, P., et al. Self-healing injectable hydrogels for tissue regeneration. Chem Rev. 123 (2), 834-873 (2023).
  7. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  8. Wang, S., et al. 3d bioprinting of neurovascular tissue modeling with collagen-based low-viscosity composites. Adv Healthcare Mater. 12 (25), e2300004(2023).
  9. Sreepadmanabh, M., et al. Jammed microgel growth medium prepared by flash-solidification of agarose for 3d cell culture and 3d bioprinting. Biomed Mater. 18 (4), 045011(2023).
  10. Zeng, J., et al. Comparative analysis of the residues of granular support bath materials on printed structures in embedded extrusion printing. Biofabrication. 15 (3), 035013(2023).
  11. Terpstra, M. L., et al. Bioink with cartilage-derived extracellular matrix microfibers enables spatial control of vascular capillary formation in bioprinted constructs. Biofabrication. 14 (3), 034104(2022).
  12. Compaan, A. M., et al. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Appl Mater Inter. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  13. Compaan, A. M., Song, K., Chai, W., Huang, Y. Cross-linkable microgel composite matrix bath for embedded bioprinting of perfusable tissue constructs and sculpting of solid objects. ACS Appl Mater Inter. 12 (7), 7855-7868 (2020).
  14. Zhang, H., et al. Direct 3D printed biomimetic scaffolds based on hydrogel microparticles for cell spheroid growth. Adv Funct Mater. 30 (13), 1910573(2020).
  15. Zhang, H., et al. Cation-crosslinked κ-carrageenan sub-microgel medium for high-quality embedded bioprinting. Biofabrication. 16, 025009(2024).
  16. Lee, A., et al. 3d bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  17. Yao, J., et al. Slightly photo-crosslinked chitosan/silk fibroin hydrogel adhesives with hemostasis and anti-inflammation for pro-healing cyclophosphamide-induced hemorrhagic cystitis. Mater Today Bio. 25, 100947(2024).
  18. Senior, J. J., et al. Agarose fluid gels formed by shear processing during gelation for suspended 3d bioprinting. J Vis Exp. (195), e64458(2023).
  19. Roche, C. D., et al. durability, contractility and vascular network formation in 3d bioprinted cardiac endothelial cells using alginate-gelatin hydrogels. Front Bioeng Biotech. 9, 63657(2021).
  20. Wang, D., et al. Microfluidic bioprinting of tough hydrogel-based vascular conduits for functional blood vessels. Sci Adv. 8 (43), eabq6900 (2022).
  21. Shao, L., Hou, R. X., Zhu, Y. B., Yao, Y. D. Pre-shear bioprinting of highly oriented porous hydrogel microfibers to construct anisotropic tissues. Biomater Sci. 9 (20), 6763-6771 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מיקרוג'לים של קפא-קראגינןהדפסה ביומטרית בתלת-ממדהנדסת רקמותאמבט הידרוג'ל גרנולריהשקעת דיו ביולוגיריסוק מכנידיו ביולוגי עמוס תאיםקשר צולב פוטוכימי
הדפסה ביולוגית משובצת של מבנים דמויי רקמות באמצעות מדיום תת-מיקרוג'ל κ-Carrageenan
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.