חקר ההשפעות של מזהמים סביבתיים בשאיפה על תפקוד חוש הריח בעכברים

סיכום

מאמר זה מספק תיאור מפורט של מבחן המזון הקבור וניסוי אפליית ריח חברתי כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה למזהמים סביבתיים בשאיפה על תפקוד חוש הריח בעכברים.

תקציר

פגיעה בחוש הריח היא בעיה משמעותית בבריאות הציבור ומנבאת באופן עצמאי את הסיכון למחלות נוירודגנרטיביות. חשיפה למזהמים סביבתיים בשאיפה עלולה לפגוע בחוש הריח; לפיכך, יש צורך דחוף בשיטות להערכת ההשפעות של חשיפה למזהמים סביבתיים בשאיפה על חוש הריח. עכברים הם מודלים אידיאליים לניסויי ריח בגלל מערכת חוש הריח המפותחת שלהם והמאפיינים ההתנהגותיים שלהם. כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה למזהמים סביבתיים בשאיפה על תפקוד חוש הריח בעכברים, מסופק מבחן מזון קבור מפורט וניסוי אפליית ריח חברתי, כולל הכנת הניסוי, הבחירה וההקמה של מתקני ניסוי, תהליך הבדיקה ומדדי הזמן. בינתיים, ציוד למדידת זמן, פרטים מבצעיים וסביבת הניסוי נדונים כדי להבטיח את הצלחת הניסוי. אבץ גופרתי משמש כטיפול כדי להדגים את ההיתכנות של הגישה הניסויית. הפרוטוקול מספק תהליך תפעולי פשוט וברור להערכת ההשפעות של מזהמים סביבתיים בשאיפה על תפקוד חוש הריח בעכברים.

מבוא

פגיעה בחוש הריח התגלתה כדאגה ראויה לציון לבריאות הציבור, והיא קשורה באופן עצמאי לסיכון מוגבר למחלות נוירודגנרטיביות. מצב זה יכול להשפיע לרעה על הרווחה הכללית, לתרום להתפתחות תסמיני דיכאון, ולגרום לירידה באיכות החיים. השפעתה נצפית באופן בולט בשינוי תפיסת מזון, הפרעה בתקשורת חברתית ורגשות שליליים מוגברים¹. גורמים שונים, כולל מחלת סינונסל, זיהום בדרכי הנשימה העליונות ופגיעה מוחית טראומטית, נחשבו כתורמים לפגיעה בחוש הריח בבני אדם². יש לציין כי מזהמים סביבתיים נשאפים כגון PM2.5, המוערכים בטווח שבין 2% ל -16%, נכנסים לגוף דרך אוויר השראה, חוצים את חלל האף, ומגיעים לאזורים ספציפיים ייעודיים לחוש הריח שם הם שוקעים 3,4,5,6,7. ממצאים אחרונים מצביעים על כך שמזהמים סביבתיים הניתנים לשאיפה, כולל PM2.5 ואמוניה, אכן יכולים לפגוע בנוירונים חושי הריח ^8,9,10. עם זאת, נדרש אימות נוסף כדי לוודא אם נזק כזה מוביל ישירות לתפקוד לקוי של חוש הריח. לפיכך, יש חשיבות מיוחדת להערכה מדוקדקת של ההשפעות של מזהמים סביבתיים הניתנים לשאיפה על תפקוד חוש הריח.

כיום, מעבדות מחקר רבות משתמשות בעכברים כמודל חלופי לבעלי חוליות לניסויים התנהגותיים שמטרתם להבין שינויים בתפקוד חוש הריח 11,12,13,14. עכברים נבחרו כמערכת המודל המועדפת לחקר תקשורת כימית של בעלי חוליות, והיא מפגינה רגישות יוצאת דופן לחוש הריח החיונית לליקוט מזון ולתקשורת חברתית¹⁵. יתר על כן, מערך הכלים המתפתח ללא הרף לתצפית והשפעה על התנהגות עכברים הפך מין זה למושך במיוחד למחקר על תפקוד חוש הריח¹⁶.

במחקר זה השתמשנו במבחן המזון הקבור ובניסוי אפליית הריח החברתי כדי להעריך פגיעה בחוש הריח במודל עכברי שנחשף למזהמים סביבתיים הניתנים לשאיפה. כדי לשפר את דיוק ההערכה, בחרנו בשיטה המייצגת ביותר להערכת תפקוד חוש הריח. שיפרנו שיטה זו באופן שיטתי כדי להבטיח פשטות ובהירות, מה שמאפשר לנו לאמוד ביעילות את מידת תפקוד לקוי של חוש הריח הנגרם על ידי מזהמים סביבתיים הניתנים לשאיפה.

פרוטוקול

השתמשנו בעכברי C57BL/6J זכרים (גיל: 6-8 שבועות; משקל: 20-22 גרם) לכל מבחני ההתנהגות. העכברים היו נתונים לתנאים יציבים (כלומר, טמפרטורה, 23 ± 1 מעלות צלזיוס; לחות, 55% ± 5%, ומחזור אור-חושך של 12/12 שעות עם אורות דולקים בשעה 7:00). כל מבחני ההתנהגות בוצעו בין השעות 10:00-17:00. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של הוועדה המקצועית לניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת צ'ינגדאו. לאחר תקופת הסתגלות של שבוע, כל העכברים נחשפו למזהמים סביבתיים הניתנים לשאיפה.

1. חשיפה למזהמים

1. מתן תוך אפי על ידי החדרה
   1. המסת מזהמים סביבתיים בשאיפה בתמיסת מלח 0.9%. יש להשתמש פעם אחת בתמיסת אבץ גופרתי 5%, אשר הוכחה כגורמת לתפקוד לקוי של חוש הריח¹⁷. עבור עכברי ביקורת, יש לתת 0.9% תמיסת מלח רגילה.
   2. להרדים את העכבר על ידי הזרקה intraperitoneal של 1% נתרן pentobarbital¹⁸ ולהעריך את עומק ההרדמה באמצעות רפלקס צביטת הבוהן. יש למרוח משחה וטרינרית על עיני העכבר כדי למנוע יובש. מקם את העכבר על גבו על משטח נוטה, כשהראש פונה כלפי מטה.
   3. באמצעות אקדח pipetting, לנהל 10 μL של הפתרון בנחיר אחד של העכבר, המאפשר באופן טבעי לשאוף את הפתרון לתוך חלל האף.
   4. כדי להבטיח את רווחתו של העכבר ולמנוע אי נוחות פוטנציאלית, חזור על השאיפה עבור הנחיר השני לאחר מרווח של 10 דקות.
   5. ב 3 ימים לאחר מתן intranasal על ידי החדרה בעכברים, לבצע את בדיקת המזון הקבור.

2. בדיקת מזון קבור

1. בצע מניעת מזון ב 18-24 שעות לפני הבדיקה על ידי הסרת כל כדורי צ'או מן הופר המזון של הכלוב הביתי. החליפו את חומרי המיטה לעכברים. אין להוציא את בקבוק המים.
2. סדר את שולחן הניתוחים כמתואר להלן.
   1. שעה לפני תחילת הבדיקה יש לקחת את הכלוב המכיל את העכברים לחדר ניתוח למנוחה.
   2. סדרו את חדר הניתוח בתקופה זו. השתמשו וסמנו כלובי עכברים שקופים בתקן PVC כ-A מכיוון שהם יוצרים סביבה מוכרת. השתמש וסמן את כלוב הבדיקה כ- B, שהוא כלוב סנאי שקוף בתקן PVC. סמן את הכלוב הנפוץ ששימש להצבת העכברים לאחר הניסוי ככלוב C.
   3. כסו את הכלובים A ו-B ב-3 ס"מ של חומר מצע ומדדו אותם בעזרת סרגל. סדרו את הכלובים זה לצד זה, במרחק של 0.5 מ' בין כל כלוב (איור 1).
   4. הגדירו את אזור הניסוי כאזור ברדיוס של 2 מ', כאשר המרכז הוא מרכז הכלובים. הגדירו את השטח שמחוץ לטווח של 2 מ' כאזור התצפית.
   5. יש להרחיק כלוב C וכלובים המכילים עכברים שלא נבדקו מאזור הניסוי ככל האפשר.
3. רשום את הזמן למציאת מזון כמתואר להלן.
   1. בחרו מיקום אקראי בכלוב B, קברו את המזון 1 ס"מ מתחת לפני השטח של המצעים והחליקו את פני המצעים.
   2. הכניסו את העכבר לכלוב A למשך 4 דקות. מעבירים את העכברים לכלוב B בסוף התזמון, מפעילים את מכשיר הווידאו וחוזרים לאזור התצפית.
   3. כאשר העכבר מרים את גוש המזון עם כפו הקדמית, עצור את הקלטת הווידאו. במקרים מסוימים, ניתן לראות עכברים אוכלים כשראשם כפוף מעל האוכל. התנהגות זו מעידה גם על הצלחת הניסוי, גם אם העכבר אינו מחזיק את המזון בכפו הקדמית.
   4. רשום נתונים. רשמו את הזמן מרגע המגע עם המחצלת בתחתית כלוב B ועד למציאת מזון לכל עכבר. אם העכברים לא מוצאים מזון לאחר 4 דקות, רשום את זמן החיפוש כזמן עיכוב של 240 שניות.
   5. שים את העכבר בכלוב C לאחר הבדיקה.
   6. מוציאים את המזון מכלוב B ומכניסים אותו לשקית אטומה. יש להחליף את המזון בכלוב B ולבדוק את העכבר הבא לאחר החלפת חומר המצעים, כמתואר להלן.
      1. עבור עכברים השוכנים באותו כלוב, בדקו עם אותו סט של חומרי מיטה בכלוב B. עבור עכברים בכלובים שונים, נקו את הכלוב באלכוהול והחליפו את חומרי המיטה.
   7. הוסיפו מזון ומים לעכברים לאחר הניסוי. בצע את ניסוי אפליית הריח החברתי יום אחד לאחר מכן.
      הערה: יש לעטות מסכות לאורך כל התהליך, ויש להחליף כפפות שקופות לאחר שכל עכבר מסיים את הניסוי כדי למנוע הצלבת ריח ככל האפשר. שמור על המשרעת של התנועות קטנה ככל האפשר כדי למנוע לחץ עכבר.

3. ניסוי אפליית ריח חברתי

1. איסוף שתן
   1. בנפרד לאסוף את השתן של עכברים זכרים בוגרים מינית ועכברים נקבות aliquot לתוך צינורות בכמויות שוות¹⁹. ארוז 2 מ"ל צינורות microcentrifuge עם 300 μL של שתן בכל צינור.
   2. אחסן את הדגימות ב -80 ° C עד לשימוש. נערו את הצינורות כדי לפזר את הדגימה באופן שווה לאחר ההפשרה. אין להפשיר ולהקפיא את הדגימה שוב ושוב.
2. סדר את שולחן הניתוחים כמתואר להלן.
   1. שעה לפני תחילת הבדיקה יש לקחת את הכלוב המכיל את העכברים לחדר ניתוח למנוחה.
   2. סידור חדר הניתוח בתקופה זו כמתואר בשלבים 2.2.2-2.2.5.
3. רשום את הזמן למציאת שתן כמתואר להלן.
   1. צור חריץ עם סרט סביב כל אחד משני הצדדים הרחבים של כלוב B גדול מספיק כדי להחזיק את צינור מיקרוצנטריפוגה המכיל 300 μL של שתן זכר ונקבה. הניחו את הצינורות והשאירו את שני כיסויי הצינור סגורים לעת עתה.
   2. הכניסו את העכבר לכלוב A וקבעו ספירה לאחור למשך 4 דקות. פתח את שני הצינורות של כלוב B בסוף התזמון.
   3. מעבירים את העכבר למיקום האמצעי של כלוב B, באותו מרחק משני הצינורות, ואז מפעילים את ציוד הקלטת הווידאו ונסוגו בעדינות ובאיטיות לאזור התצפית.
   4. כאשר העכבר מרחרח את דופן הצינור / הפה או אפילו בתוך הצינור, הצינור מריח בהצלחה. בשלב זה, לחץ על שעון העצר ורשום את השעה כזמן הריח של הצינור (M s), ולאחר מכן המשך להקליט את זמן המגורים (X s) עד שהעכבר יתרחק מהשפופרת.
   5. המשיכו לתזמן את הזמן ולרחרח את הצינור השני. כאשר העכבר מרחרח את דופן הצינור / הפה או אפילו בתוך הצינור, הצינור מריח בהצלחה. לחץ על הסטופר ורשום את הזמן שלקח להריח את הצינור השני (N s), ולאחר מכן המשך לתעד את זמן השהייה (Y s) עד שהעכבר מתרחק מהשפופרת.
   6. העבירו את העכבר לכלוב C בסוף הניסוי.
   7. החליפו את צינורות השתן ואת חומר המצע של כלוב B לאחר כל בדיקת עכבר. שים את שתן החולדה המשומש בשקית נקייה בהתאם למין.
   8. החליפו כפפות ובדקו את העכבר הבא כמתואר לעיל.
4. בצע את הניסוי במעבדה ללא ריח ברור. הימנעו ממוצרים אישיים הפולטים ריחות חזקים. יש ללבוש כפפות ומסכות לאורך כל ההליך כדי למנוע חציית ריח ככל האפשר. שמור על המשרעת של התנועות קטנה ככל האפשר כדי למנוע לחץ עכבר.

תוצאות

מזהמים סביבתיים הניתנים לשאיפה פוגעים בתפקוד חוש הריח בעכברים. אבץ אטמוספרי הנפלט ממשרפות וכלי רכב מנועי הוכח כמזהם בשאיפה שיכול לגרום לדלקת ריאות אלרגית²⁰. אבץ גופרתי נחשב לאחת התרכובות האופייניות הגורמות לתפקוד לקוי של חוש הריח²¹. לכן, אנו משתמשים באבץ גופרתי כטיפול לחשיפת עכברים על ידי החדרה תוך אפית ובדיקה באמצעות בדיקת המזון הקבור וניסוי אפליית ריח חברתי. במבחן קבורת המזון נדרשו יותר מ-240 שניות לעכברים שנחשפו לאבץ גופרתי למצוא את המזון בהשוואה לקבוצת הביקורת (

דיון

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים בסיסיים שנועדו להערכה מהירה של ליקוי חוש הריח בעכברים. מזהמים סביבתיים מגוונים הניתנים לשאיפה גורמים לרמות ברורות של תפקוד לקוי של חוש הריח בעכברים. מבחן המזון הקבור משמש להערכת היכולת לזהות ריחות נדיפים, ואילו ניסוי אפליית ריחות חברתיים מעריך את יכולתו של בעל החיים להבחין ולהבדיל בין ריחות חברתיים שונים. הפרוטוקול כאן משמש להערכת ההשפעות הרעילות של מזהמים סביבתיים על תפקוד חוש הריח.

מזהמים סביבתיים נשאפים, כולל אוזון, אמוניה ופליטת דיזל, הם בעלי ריחות שעשויים להשפי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.5-10 μ L  מיקרופיפטה מתכווננת	אפנדורף, גרמניה	3123000225	החדרה תוך-אפית
0.9% תמיסת מלח	Solarbio	7647-14-5	ממיסים מזהמים
אבץ גופרתי נטול מים	מקלין	7733-02-0	חשיפת עכברים
צינור צנטריפוגה (2 מ"ל)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	מקום שתן
איזון אלקטרוני	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	חומרי הרדמה ומזהמים משקל
GraphPad פריזמה	תוכנת GraphPad	8.0.1	ניתוח סטטיסטי
גלאי אבק כף יד	TSI  משולב	DuatTrak 8532	עכברים חשופים לשאיפה
ציוד הקלטת וידאו	אפל בע"מ.	אייפון 6s פלוס	זמן הפעילות של העכברים נרשם
מערבולת מערבולת	היימן קיילין-בל מעבדה אינסטרומנטס ושות'.	מערבולת-5	תמיסת ערבוב