פרוטוקול זה מתאר את השיטה להפחתת הצריכה התזונתית של חומצה פולית או כולין בנקבות עכברות לפני ההריון במטרה לחקור את ההשפעה של תזונה אימהית על תוצאות בריאותיות של צאצאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שינוי רמות של חומצה פולית או כולין בתזונה אימהית כדי לחקור את ההשפעה של חוסרים על תוצאות בריאות הצאצאים
במאמר זה
סיכום
תקציר
תזונה אימהית במהלך ההריון וההנקה ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות העצבית של הצאצאים. מטבוליזם של פחמן אחד (1C), אשר מתרכז סביב חומצה פולית וכולין, כמו גם ויטמינים אחרים מקבוצת B, ממלא תפקיד מפתח במהלך סגירת הצינור העצבי של העובר המתפתח. עם זאת, ההשפעה של חסרים תזונתיים אימהיים אלה במהלך ההריון על התוצאות הבריאותיות של הצאצאים לאחר הלידה נותרה יחסית לא מוגדרת. יתר על כן, חוסרים תזונתיים אימהיים בחומצה פולית או בכולין עשויים להשפיע על תוצאות בריאותיות אחרות אצל צאצאים - מה שהופך את זה למודל בעל ערך. פרוטוקול זה נועד להתוות את ההליך לגרימת מחסור במטבוליזם של 1C בעכברות נקבות באמצעות שינויים תזונתיים. הנקבות נמצאות בדיאטה בעת הגמילה, עד גיל חודשיים, במשך 4-6 שבועות לפני ההזדווגות ונשארות בדיאטה לאורך כל ההריון וההנקה. צאצאים מנקבות אלה יכולים להיות מוערכים עבור תוצאות בריאותיות. ניתן להשתמש בנקבות מספר פעמים כדי ליצור צאצאים, וניתן לאסוף רקמות מנקבות כדי למדוד מדידות מטבוליטים של 1C. פרוטוקול זה מספק סקירה כללית של האופן שבו ניתן לגרום לחוסרים תזונתיים אימהיים בחומצה פולית או בכולין כדי לחקור את התוצאות הבריאותיות של צאצאים.
מבוא
תזונה אימהית במהלך ההריון וההנקה ממלאת תפקיד חיוני בהתפתחות הצאצאים. מטבוליזם של פחמן אחד (1C) הוא רשת מטבולית מרכזית המשלבת אותות תזונתיים עם ביוסינתזה, הומאוסטזיס חמצון-חיזור ואפיגנטיקה. חומצה פולית וכולין הם מרכיבים מרכזיים של 1C הממלאים תפקיד חשוב בסגירת הצינור העצבי. מומלץ לנשים ליטול תוספים עם חומצה פולית וכוליןבמהלך שנות הפוריות 1. בעוד התפקיד הקריטי של חומצה פולית בהתפתחות העובר נקבע בבירור, המנגנונים הבסיסיים המעורבים עדיין לא ברורים. נשים של הלידה מומלץ לקחת חומצה פולית לפני הכניסה להריון מאז סגירת הצינור העצבי מתרחשת בתוך השליש הראשון2. לאימהות בהריון עם מחסור בחומצה פולית או ברכיבים אחרים של 1C, כמו כולין, יש שכיחות גבוהה יותר של לידת צאצאים עם מומים בתעלה העצבית בשל הביקוש הגבוה לסינתזה של נוקלאוטידים ותהליכים אחרים הנדרשים בתקופת ההריון המוקדמת3.
ההשפעה ארוכת הטווח של תזונה אימהית לקויה בצריכת מטבוליזם של 1C על התוצאות הבריאותיות של הצאצאים אינה מובנת היטב. מחקרים מהמעבדות שלנו, כמו גם אחרים, הוכיחו כי תזונה אימהית החסרה בחומצה פולית או בכולין אכן משפיעה על תוצאות בריאותיות של צאצאים לאחר שבץ איסכמי באמצעות מודלים פרה-קליניים 4,5,6. ההשפעה של תזונה אימהית הוכחה גם במחקרים קליניים שבהם תוארו נפחי מוח קטנים יותר ורמות מתילציה משתנות7. תיאוריית המקורות ההתפתחותיים של בריאות ומחלות (DOHaD) מציעה כי מחלות כרוניות פוטנציאליות מתוכנתות ברחם 8,9, ותזונה אימהית ממלאת תפקיד חשוב.
פרוטוקול זה נועד להתוות את השיטה לשינוי הצריכה התזונתית של 1C בנקבות עכברות לפני ההריון, במטרה לבחון את השפעות תזונת האם על התוצאות הבריאותיות של הצאצאים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה אושר, וכל הנבדקים בבעלי חיים שימשו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מידווסטרן (פרוטוקול 2983). נקבות עכברי C57BL/6J, בנות חודשיים (משקל גוף, ~20 גרם), שימשו במחקר זה. באופן כללי, עכברים נקבות בגיל הפוריות ניתן להשתמש10. כדי להבטיח הימנעות מהשפעות המלטה, יש להשתמש במספר נקבות לכל דיאטה11. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנה ניסיונית
- להשיג חומצה פולית או דיאטה חסרה כולין מיצרני מזון מכרסמים מסחריים. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה מפורטת של מיקרו-חומרים מזינים ומאקרו, כולל הכמות המדויקת של חומצה פולית או כולין הדרושים בתזונה לקויה.
הערה: יש להזמין גם דיאטת בקרה מתאימה; הפרטים מפורטים בטבלה 1. דיאטות אלה התבססו על AIN93G והכילו את החומרים המזינים המומלצים למכרסמים10. - בשיתוף פעולה עם היצרן, לקבוע את הצביעה של הדיאטות, כמו זה יכול לעזור עם הפצה של דיאטות נכונות במהלך מחקרים ניסיוניים. במחקר זה נעשה שימוש בירוק עבור דיאטות עם מחסור בחומצה פולית, צהוב עבור כולין ולבן עבור דיאטת ביקורת. כולם ניתנים להבחנה בקלות.
הערה: אין הגבלות על צריכת המים. המים אינם מכילים חומצה פולית, כולין או מטבוליטים אחרים של 1C.
2. גרימת מחסור תזונתי בחומצה פולית או כולין
- לפני לשים את הנקבות על דיאטה, לשקול את כל החיות. זה ייקרא משקל הבסיס.
- בהתאם למערך כלוב המעבדה הספציפי (מאוורר או לא מאוורר, ראו טבלת חומרים), החליפו או מלאו את כדורי הדיאטה המיוחדים לכל כלוב מספר פעמים בשבוע. אין למלא את חישוקי המזון בכלוב יתר על המידה בדיאטות מיוחדות, שכן הדבר עלול להוביל להידרדרות הכדוריות ברגע שהן מתקשרות עם רוק מבעלי חיים ומתקלקלות לאורך זמן.
הערה: ודא שמלאי הדיאטה מאוחסן בהתאם להנחיות היצרן ונעשה בו שימוש לפני תאריך התפוגה. - שמרו על נקבות העכברים בתזונה במשך 4-6 שבועות לפני ההזדווגות.
- הכניסו את העכברים הזכרים לכלובים הנקביים לצורך הזדווגות. יש לוודא שהזכרים מוכנסים לכלובים נקביים לאחר שהנקבות היו בדיאטות מיוחדות במשך 4-6 שבועות לפחות. הכניסו זכר אחד לכלוב נקבה אחד למשך יום עד מספר ימים.
הערה: במחקר הנוכחי, זכרים הוחזקו עם הנקבות במשך כל תקופת הניסוי (~ 4 חודשים) כדי להגדיל את מספר הגורים שנוצרו מכיוון שהזדווגות בעכברים יכולה להתרחש לאחר הלידה12. נקבות לאחר גיל 6 חודשים לא שימשו למחקרים כלשהם. - בדוק את נקבות העכברים מדי יום עבור תקע copulatory, אשר מציין רבייה התרחשה.
- אספו את מדידות המשקל של נקבות העכברים מדי שבוע כדי לעקוב אחר בריאותן ומצב ההריון שלהן.
הערה: זה בטוח עבור נקבות להישמר על דיאטה להריון (~ 21 ימים) והנקה (~ 21 ימים). - כאשר הצאצאים נגמלים מהאם (~ 21 יום לאחר הלידה), הניחו אותם על תזונה עם חומצה פולית ומחסור בכולין, כמו גם דיאטת ביקורת. לקבלת פרטים, עיין בסעיף התוצאות.
הערה: כאשר חוקרים את ההשפעה של תזונה אימהית על תוצאות בריאותיות של צאצאים, מומלץ לשים את הצאצאים על דיאטת ביקורת לאחר הגמילה. דיאטת הבקרה חייבת להכיל כמויות נאותות של ויטמינים וחומרים מזינים להישרדות. - בסוף המחקר (קביעת המשקולות השבועיות לניטור הבריאות הכללית של נשים המתחזקות בדיאטות עם חומצה פולית או מחסור בכולין), יש להרדים את האימהות באמצעות מנת יתר שלCO2 (מינון, תזוזה של 10%-30% נפח לדקה, בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות) ולאסוף את הרקמות (שלב 3) כדי לאשר ליקויים תזונתיים.
3. איסוף רקמות למדידות של 1C והמטבוליטים הקשורים
הערה: בעת המתת חסד של בעלי חיים, חשוב לוודא שבעלי החיים אינם מגיבים לצביטת בוהן. ברגע שבעלי החיים אינם מגיבים, דיסקציה של רקמות יכולה להתחיל. הרקמה שתינתח צריכה להיקבע מראש13,14, ולהכין חומרים. חומרים אלה כוללים צינורות לאחסון, כלי דיסקציה מתאימים, קרח יבש או חנקן נוזלי.
- לאסוף רקמות דם וכבד בהתאם לפרוטוקוליםשפורסמו בעבר 15,16.
- לאסוף ~ 500-1000 μL של דם באמצעות ניקוב לב בעקבות השלבים הבאים. לקבלת פרטים, עיין Parasuraman et al.17:
- בצע חתך בצורת V דרך העור ואת דופן הבטן. הזיזו את איברי הבטן הצידה והכניסו מחט דרך הסרעפת אל הלב כדי לאסוף את דגימת הדם.
- הכניסו את דגימות הדם לצינורות מצופים EDTA. ניתן להשאיר את הצינורית בטמפרטורת החדר עד לאיסוף כל הדגימות.
- סובב את דגימות הדם בצנטריפוגה ב 1000-2000 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C כדי לבודד את פלסמת הדם. לאסוף את הפלזמה לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל ולאחר מכן לאחסן אותו ב -80 ° C עד הניתוח.
- כדי להסיר את הכבד, פתח את הבטן ונתח את הכבד כולו בהתאם לפרוטוקול15 שפורסם בעבר.
- לאחר הסרת הכבד מחלל הגוף, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות יותר עם מספריים קטנים ומקפיאים אותם באמצעות קרח יבש או חנקן נוזלי.
הערה: ניתן למקם את חתיכות הרקמה הקפואות בצינור מיקרוצנטריפוגה קריוגני של 1.5 מ"ל ולשמור על טמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
- לאחר הסרת הכבד מחלל הגוף, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות יותר עם מספריים קטנים ומקפיאים אותם באמצעות קרח יבש או חנקן נוזלי.
- לאסוף ~ 500-1000 μL של דם באמצעות ניקוב לב בעקבות השלבים הבאים. לקבלת פרטים, עיין Parasuraman et al.17:
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המחקר התמקד בחקר ההשפעה של חוסרים תזונתיים אימהיים על חומצה פולית או כולין על התוצאות הבריאותיות של צאצאים. משקלים שבועיים נקבעו כדי לפקח על הבריאות הכללית של נשים שנשמרות על דיאטות עם חומצה פולית או מחסור בכולין. בעבודתנו הקודמת לא נצפו שינויים במשקל הגוף בין קבוצות תזונה אימהיות4. איור 1 מתאר את קו הבסיס ואת המשקולות השבועיות של נקבות שנשמרו על דיאטות ביקורת, כולין או מחסור בחומצה פולית במהלך ארבעת השבועות שקדמו להזדווגות (F (1.144,4.577) = 11.96, p
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במהלך יישום פרוטוקול זה במעבדות מחקר, ישנן מספר הערות חשובות שחוקרים צריכים לשקול לפני תחילת הניסויים. ראשית, בייצור דיאטה, יש לתת מספיק זמן אספקה לייצור הדיאטה לפני תחילת המחקר הניסיוני. זמני האספקה יכולים להשתנות מחברה לחברה, וגם משלוח הדיאטה צריך להילקח בחשבון. נקבות עכברים בגיל הפוריות (~ 2-2.5 חודשים) יכולות להיכנס לתזונה 4-6 שבועות לפני ההזדווגות 4,6,14. מחקרים קודמים השתמשו רק בעכברי C57Bl/6J<...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות 1.5 מ"ל | Eppendorf | ||
| C57BL/6 נקבות עכברים | צ'ארלס ריבר | 27 | ניתן לגדל גם בבית. |
| דיאטה חסרת כולין | Envigo | TD.06119 | |
| בקרת דיאטה | Envigo | TD.190790 | |
| צינורות | |||
| דיאטה חסרת חומצה פולית | Envigo | TD.01546 | |
| GraphPad פריזמה | https://www.graphpad.com/features | ||
| דיור למכרסמים | מוצרי מעבדה, LLC | One כלובמתלים מאווררים & כלובים | |
| כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם (LC-MS/MS) | SCIEX, Framingham, MA | 5500 QTrap | |
| כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד (UPLC) | שימדזו, קולומביה, מרילנד, ארה"ב | Nexera |
מקורות
- Van Gool, J. D., Hirche, H., Lax, H., De Schaepdrijver, L. Folic acid and primary prevention of neural tube defects: A review. Reprod Toxicol. 80, 73-84 (2018).
- Ali, S. A., Economides, D. L. Folic acid supplementation. Curr Opin Obstet Gynecol. 12 (6), 507-512 (2000).
- Osterhues, A., Ali, N. S., Michels, K. B. The role of folic acid fortification in neural tube defects: a review. Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (11), 575966(2013).
- Hurley, L. Maternal dietary deficiencies in folic acid and choline result in larger damage volume, reduced neuro-degeneration and -inflammation and changes in choline metabolites after ischemic stroke in middle-aged offspring. Nutrients. 15 (7), 1556(2023).
- Clementson, M. Maternal dietary deficiencies in folic acid or choline worsen stroke outcomes in adult male and female mouse offspring. Neural Regen Res. 18 (11), 2443-2448 (2023).
- Pull, K., et al. Impact of maternal dietary folic acid or choline dietary deficiencies on vascular function in young and middle-aged female mouse offspring after ischemic stroke. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (6), H1354-H1359 (2023).
- Virdi, S., Jadavji, N. M. The impact of maternal folates on brain development and function after birth. Metabolites. 12 (9), 8766(2022).
- Barker, D. J. P. Fetal nutrition and cardiovascular disease in later life. Br Med Bull. 53 (1), 96-108 (1997).
- Barker, D. J. P. Maternal nutrition, fetal nutrition, and disease in later life. Nutrition. 13 (9), 807-813 (1997).
- Jackson, S. J. Does age matter? The impact of rodent age on study outcomes. Lab Anim. 51 (2), 160-169 (2017).
- Jiménez, J. A., Zylka, M. J. Controlling litter effects to enhance rigor and reproducibility with rodent models of neurodevelopmental disorders. J Neurodev Disords. 13 (1), 2(2021).
- Breeding and Reproduction of Mice - All Other Pets. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/all-other-pets/mice/breeding-and-reproduction-of-mice 159-185 (2024).
- Jena, S., Chawla, S. The anatomy of the laboratory mouse. Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices. , 159-185 (2021).
- The anatomy of the laboratory mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/imageindex.shtml (2024).
- Mortimer, T., Welz, P. S., Benitah, S. A., Sassone-Corsi, P., Koronowski, K. B. Collecting mouse livers for transcriptome analysis of daily rhythms. STAR Protoc. 2 (2), 100539(2021).
- Aboghazleh, R. Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Parmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Jadavji, N. M., Deng, L., Malysheva, O. V., Caudill, M. A., Rozen, R. MTHFR deficiency or reduced intake of folate or choline in pregnant mice results in impaired short-term memory and increased apoptosis in the hippocampus of wild-type offspring. Neuroscience. 300, 1-9 (2015).
- Pickell, L., et al. High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice. Birth defects research. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 91 (1), 8-19 (2011).
- Mikael, L. G., Deng, L., Paul, L., Selhub, J., Rozen, R. Moderately high intake of folic acid has a negative impact on mouse embryonic development. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (1), 47-52 (2013).
- Mikael, L. G., Pancer, J., Wu, Q., Rozen, R. Disturbed one-carbon metabolism causing adverse reproductive outcomes in mice is associated with altered expression of apolipoprotein ai and inflammatory mediators. J Nutr. 142 (3), 411-418 (2012).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
