הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מיקום פריאורביטלי של בדיקת דופלר לייזר לניטור זרימת דם מוחית לפני חסימת עורק מוחי אמצעי במודלים של מכרסמים

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66839

⸱

22 בנובמבר 2024

 ,  ,  , 
1College of Nursing, University of Arizona, 2Department of Surgery, College of Medicine, University of Arizona

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

כאן מוצג הליך כירורגי זעיר פולשני, הכולל הנחת בדיקת דופלר לייזר על הגולגולת מעל האזור הדיסטלי של עורק המוח האמצעי (MCA), מיקום פריאורביטלי המתאים לחולדות ועכברים, כדי להעריך את זרימת הדם במהלך חסימת MCA חולפת.

תקציר

חסימת עורק מוחי אמצעי (MCAO) היא שיטת תקן הזהב למידול פרה-קליני של שבץ איסכמי במכרסמים. עם זאת, חסימה מוצלחת אינה מובטחת אפילו על ידי הידיים הכירורגיות המיומנות ביותר. טעויות מתרחשות בעיקר כאשר חוט הלהט אינו ממוקם בעומק הנכון וכוללות מקרים של אי אוטם או ניקוב כלי דם, אשר יכול לגרום למוות. מד זרימה דופלר לייזר (LDF) היא טכניקה אמינה המספקת משוב בזמן אמת על זרימת דם מוחית אזורית (CBF) במהלך הליך MCAO. כאן אנו מדגימים טכניקה מהירה למיקום פריאורביטלי של גשושית דופלר לייזר למדידת CBF הן בעכברים והן בחולדות. הרציונל שלנו היה לפשט את יישום LDF, לעודד שימוש נרחב לשיפור אמינות הניתוח. הטכניקה מבטלת את הצורך בדילול גולגולת ובציוד מיוחד, עם מיקום באזור הפריאורביטלי ולא במיקום גבי, מה שמקדם יעילות וקלות אימוץ. הפרוטוקול המתואר כאן כולל תכשירים טרום ניתוחיים, מיקום בדיקת דופלר פריאורביטלית וטיפול לאחר ניתוח. התוצאות המייצגות כוללות תיאורים חזותיים של אלמנטים פרוצדורליים יחד עם מעקב LDF מייצג הממחיש ניתוחי MCAO מוצלחים, עם מקרים של מיקום חוטים לא מוצלח המוביל לסיבוכים. הפרוטוקול מדגים LDF באישור מיקום נכון של חוטי הלהט ומציע הליך פשוט בהשוואה לשיטות חלופיות.

מבוא

שיטת חסימת עורק המוח האמצעי (MCAO) נמצאת בשימוש נרחב במכרסמים מאז הוצגה לקהילה המדעית ליישום בחולדות בשנת 19861 עם הסתגלות לונגה שתוארה בשנת 19902, והתאמות לעכברים זמן קצר לאחרמכן 3. אף על פי שלא תואר בפרסום של לונגה, השימוש באות זרימה דופלר לייזר (LDF) כדי לאשר את מיקום חוט הלהט תואר עד מהרה בספרות4. העסקת LDF במהלך הליך MCAO מוצגת באופן בולט בספרות, אך מוגדרת כשלב אופציונלי בהליכים האופרטיביים הסטנדרטיים (SOPs) הנוכחיים של רשתות הערכה פרה-קליניות לשבץ מוחי (SPAN)5.

השימוש ב- LDF מאשר מיקום חוטים נכון במהלך הליך MCAO, ולכן תורם לקפדנות תכנון המחקר ולתוצאות הבאות, במיוחד בניסויים שנועדו לחקור את יעילות התרופה. שימוש ב-LDF מפחית טעויות כירורגיות הנובעות ממיקום שגוי של חוט הלהט, מה שגורם למצב דיכוטומי של היעדר פציעה כאשר חוט הלהט אינו ממוקם מספיק רחוק או מוות של בעלי חיים עקב ניקוב כלי הדם המתרחש כאשר חוט הלהט מוכנס רחוק מדי. מצד שני, השימוש ב- LDF אינו קשור לשונות בגודל אוטם שנצפתה בדרך כלל לאחר הליך MCAO6. השימוש ב-LDF בהליך MCAO עשוי להיתפס כקשה ומכביד, במיוחד בחולדות, מכיוון שהגולגולת עבה יותר מאשר בעכברים ועשויה לדרוש דילול גולגולת לפני מיקום LDF 7,8. כמו כן, מיקום הבדיקה הגבית מתואר לעתים קרובות עם פרוטוקולים מסוימים הדורשים ציוד מיוחד או הכנה 7,8,9. עם כל אחד מהחסמים הללו, יישום של LDF כדי לאשר מיקום נימה לא יכול להתקיים.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את המיקום של בדיקת דופלר לייזר בגולגולת ומעל האזור הדיסטלי של עורק המוח האמצעי - מיקום פריאורביטלי - להערכת זרימת הדם במהלך הליך MCAO הן בעכברים והן בחולדות. הרציונל שלנו היה לפתח הליך שיש לו יתרונות מרובים על פני כמה שיטות שדווחו בספרות 7,8,9,10 בכך שהוא זעיר פולשני, מהיר, ואינו דורש דילול גולגולת או ציוד מיוחד מעבר לבדיקת דופלר לייזר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עכברים בוגרים וחולדות שימשו להמחשת פרוטוקול זה (25 גרם, C57BL/6J, מעבדות ג'קסון; 250 גרם, Sprague Dawley, Envigo). הטיפול בבעלי חיים וההליכים הניסיוניים בוצעו באישור ובהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אריזונה, חוקים לאומיים, ועל פי עקרונות הטיפול בחיות מעבדה11. חולדות ועכברים שוכנו עם לוח זמנים של 12 שעות אור / חושך (7 בבוקר - 7 בערב) עם מזון ומים זמינים עד ליברטום.

1. הכנה טרום ניתוחית

הערה: בדרך כלל, ניתוח MCAO במכרסם מבוצע כניתוח הישרדות, המחייב שימוש בטכניקה כירורגית אספטית או בטיפים בלבד, כמתואר בפרוטוקול IACUC ספציפי למוסד. במקרה זה, המנתח משתמש בטכניקת טיפים בלבד עם מכשירים מעוקרים ואספקה.

  1. יש לחטא את משטח העבודה הכירורגי בחומר חיטוי מסחרי ולהכין חבילות כירורגיות סטריליות של מכשירים, וילונות, גזה, מטושים, תפרים ולהבי אזמל על ידי אוטוקלאבינג. שמור על תנאים סטריליים במהלך ניתוח הישרדות על פי טכניקות שאושרו על ידי IACUC, כגון כיסוי ידיות מיקרוסקופ וגרירה באמצעות ניילון נצמד באיכות מזון.
  2. השתמש במעקר חרוזים יבש של נביטה כדי לעקר מחדש כלי ניתוח בין הליכים אם מתבצעים ניתוחי מכרסמים מרובים במהלך פגישה אחת.
  3. הכניסו את החולדה או העכבר לתא אינדוקציה והכניסו להרדמה עם איזופלורן 3%-5% (1 ליטר/דקה באמצעות תערובת משולבת של 80% אוויר ו-20% חמצן).
  4. העבר את בעל החיים מהחדר לספסל ולקונוס האף להרדמה (עכבר: 0.5 ליטר / דקה 80% / 20% תערובת חמצן / אוויר; חולדה: 1.5 ליטר / דקה 80% / 20% תערובת חמצן / אוויר). יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים ולגלח בזהירות את הרווח בין האוזן לארובת העין בצד ניתוח MCAO (בדרך כלל הימני), כדי לא לחתוך עור באמצעות קוצץ. בחולדה, כאשר היא מגולחת, גומת השפם תיראה בערך באמצע הדרך בין ארובת העין לאוזן. המשך לגלח אזורים לפי הצורך עבור הליך MCAO9 (לא במסגרת מאמר זה).
  5. החזירו את בעל החיים לחדר לפי הצורך או העבירו אותו לקונוס אף על שולחן הניתוחים המוכן שחומם ל -37 מעלות צלזיוס. הכנס מדחום רקטלי. יש להחזיק את בעל החיים בערך ב 36 ° C ± 1 ° C לאורך כל ההליך ועל פי פרוטוקול IACUC מאושר.
  6. החל betadine על צמר גפן לחטא את העור, מסתחרר החוצה ממרכז האזור הכירורגי. נגבו עם פד להכנת אלכוהול. חזור על שני השלבים במשך שלושה מחזורים בסך הכל. יש לוודא הרדמה נאותה ולהעריך כל 15 דקות במהלך ההליך באמצעות רפלוקס צביטת הבוהן.

2. מיקום גשושית דופלר פריאורביטלית

  1. בעזרת מספריים קטנים, בצעו חתך אנכי (עכבר: ~0.5 ס"מ; חולדה: ~0.7 ס"מ) בין זווית העין לקפל האוזן, כפי שמוצג באיור 2A (עכבר) ובאיור 3A (חולדה) כדי לחשוף סופר פאצ'יה ואת השריר שמתחתיה.
    הערה: יש לטפל בכאב לפני הניתוח בהתאם לאישור פרוטוקול IACUC.
  2. בעזרת מלקחיים חדים ומספריים מעוקלים, חותכים בזהירות דרך שכבת השריר עד שמגיעים לגולגולת. הגולגולת תהיה שטוחה וקשה לגעת בה עם קצה המלקחיים. זהו החלון שבו תשב גשושית דופלר הלייזר, כפי שניתן לראות באיור 2B.
  3. השתמשו בכלי מלקחיים כדי לקרוש דם עולה, להרחיב את החלון ולהבטיח את המסלול לגולגולת.
  4. ברגע שהחלון פתוח, כתם עם צמר גפן כדי להסיר דם עודף לפי הצורך.
    הניחו את העכבר או החולדה במצב שכיבה.
  5. השתמש במלקחיים כדי למשוך כל עור או רקמה והנח את גשושית דופלר בחלון הפריאורביטלי כך שהיא תפגע בגולגולת בניצב ללא עור או שריר נוכחים כדי לעכב את אות הלייזר. האזור הזה נמצא מעל ה-MCA הדיסטלי כפי שמודגם באיור 1A,B. אבטח את מיקום הבדיקה באמצעות סרט מעבדה. בפרוטוקול זה מתואר השימוש בבדיקה ישרה.
    הערה: אנו מכירים בכך שפרוטוקולי הניתוח ישתנו בין המעבדות. בספרות (כאשר מדווחים), חלקם טוחנים את הגולגולת דק, ואחרים לא9. זה יכול להיות בגלל שהגולגולת דקה יותר באזור הפריאורביטלי, אבל זו רק ספקולציה. מניסיוננו, מיקום ישיר ללא טחינה יכול להיות מושג בעכברים וחולדות והוא מודגם בפרוטוקול זה.
  6. נטרו את קריאות זרימת הדם היחסיות על הצג באמצעות תוכנה מתאימה (איור 2D, איור 3C,D). קריאות LDF ישתנו. עם זאת, הטווח האופטימלי לזיהוי טיפות זרימת דם הוא >200 יחידות זילוח (PU).
  7. המשך לניתוח MCAO9 (לא במסגרת מאמר זה). במהלך ניתוח MCAO, בדוק מיקום הבדיקה על ידי קשירה קצרה של עורק התרדמה המשותף, אשר אמור לגרום לירידה פתאומית בזרימת הדם (~ 50%).

3. הסרת בדיקת דופלר וטיפול לאחר הניתוח

  1. בסיום ה-MCAO או בכל פעם שמדדי זרימת הדם הושלמו, יש להסיר את בדיקת דופלר הלייזר מחלון הניתוח. בדיקת דופלר בדרך כלל נשארת במקומה למשך ניתוח MCAO בעכבר מכיוון שזמני איסכמיה הם לעתים קרובות פחות מ -90 דקות. מצד שני, בהליך MCAO של חולדה, ניתן להסיר את בדיקת דופלר לאחר מיקום חוט הלהט ובמהלך איסכמיה (בדרך כלל > 90 דקות) ולאחר מכן להציב שוב בחלון הפריאורביטלי כדי לאשר זילוח על ידי חזרה על שלבים 2.6 ו -2.7.
    הערה: ניתן לראות מעקב רציף טיפוסי של LDF מה-MCAO של העכבר באיור 4A. עקבות LDF אופייניים מהליך MCAO של חולדה מודגמים באיור 4B.
  2. יש להזריק חומר הרדמה מקומי המאושר על ידי IACUC באופן תת-עורי לאורך אתר החתך הפוטנציאלי.
  3. סגור את העור עם 1-2 תפרים באמצעות קשר כירורגי סטנדרטי עם חוט תפר נספג או דבק כירורגי, על פי פרוטוקול IACUC מאושר. טיפול בכאב לאחר ניתוח על פי אישור פרוטוקול IACUC (למשל bupivacaine HCL 0.5% ולידוקאין 2%, פעם אחת חתך תוך כדי עכברים וחולדות). אין להשאיר בעלי חיים ללא השגחה עד שהם מסוגלים לשמור על עצם החזה, ואין להחזיר בעלי חיים לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המיקום של גשושית דופלר לייזר באזור MCA מתואר באופן חזותי באיור 1, המציע תמונה של כלי הדם ומשמש כמדריך חזותי מנקודת מבט של קשת וגב. איור 2 מסכם את השלבים הקריטיים למיקום ותוצאות של גשושית דופלר לייזר בעכבר. איור 2A מציג תמונה של עכבר מורדם ומוכן עם סימון מקווקו באתר החתך האנכי הדרוש למיקום גשושית דופלר לייזר לאחר מכן. החלון הפריאורביטלי לגולגולת מומחש באיור 2B.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

MCAO הוא הליך תקן הזהב למידול חסימת עורק מוחי ורפרפוזיה במכרסמים והיה אבן הפינה של מחקר שבץ פרה-קליני, המאפשר השראת איסכמיה מוקדית במכרסמים כדי לחקות פתופיזיולוגיה של שבץ אנושי. זהו הליך כירורגי קפדני עם שונות משמעותית בין המנתחים ואפילו תוך מנתח. אמנם אין ראיות לכך שיישום LDF מפחית את השונות, אך הוא עשוי לשפר את הקפדנות המדעית ואת תוצאות המחקר בעיצובים מסוימים. זה מושג מכיוון ש- LDF מאמת את מיקום הנימה ומספק מידע בזמן אמת על CBF במהלך הניתוח, המאשר אם התרחשה חסימה של ה- MCA. כ-75% ממחקר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי NINDS 1R41NS124450. Biorender: KT26JWLYF6

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מספריים קפיציים מעוקליםCastroviejo1501710
מלקחיים #5כלי מדע עדינים11250-20
מלקחיים #5/45כלי מדע עדין1151-35
Forcepts כלי קוטריהConmedM18019-01
קלטת מעבדהתיוג פישרברנד15-950
צג דופלר לייזרמור אינסטרומנטס תוכנת MOORVMS-LDF
LDF Perisoftעבור Windows או moorSOFTNA
קוצץ עכברPhilips NorelcoMG7910
Periflux System 4000, בדיקה 407Perimedכבר לא זמין
עטיפת פלסטיקGladPress n seal
קוצץ עכברושאוסטרA5 או דומה
הרדמה מכרסמים קטניםJD רפואיבהזמנה
מספריים קטניםexcelta362 Sissors או מערכת
עם בדיקהבקר PhysitempTCAT-2AC
סרט ציוד מותאמת אישית מוניטור טמפרטורה דומה

מקורות

  1. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese J Stroke. 20 (1), 84-91 (1986).
  2. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84(1989).
  3. Hata, R., et al. A reproducible model of middle cerebral artery occlusion in mice: hemodynamic, biochemical, and magnetic resonance imaging. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (4), 367-375 (1998).
  4. Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J Cereb Blood Flow Metab. 9 (5), 589-596 (1989).
  5. Lyden, P. D., et al. The stroke preclinical assessment network: Rationale, design, feasibility, and stage 1 results. Stroke. 53 (5), 1802-1812 (2022).
  6. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Effect of laser Doppler flowmetry and occlusion time on outcome variability and mortality in rat middle cerebral artery occlusion: inconclusive results. BMC Neurosci. 19 (1), 24(2018).
  7. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  8. Watcharotayangul, J., et al. Post-ischemic vascular adhesion protein-1 inhibition provides neuroprotection in a rat temporary middle cerebral artery occlusion model. J Neurochem. 123 Suppl 2 (Suppl 2), 116-124 (2012).
  9. Beretta, S., et al. Optimized system for cerebral perfusion monitoring in the rat stroke model of intraluminal middle cerebral artery occlusion. J Vis Exp. (72), e50214(2013).
  10. Ritter, L. S., Stempel, K. M., Coull, B. M., McDonagh, P. F. Leukocyte-platelet aggregates in rat peripheral blood after ischemic stroke and reperfusion. Biol Res Nursing. 6 (4), 281(2005).
  11. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.. , 8th ed., The National Academies Press. Washington, DC, USA. (2011).
  12. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Sci Rep. 6, (2016).
  13. Morais, A., et al. Embracing heterogeneity in the multicenter stroke preclinical assessment network (SPAN) trial. Stroke. 54 (2), 620-631 (2023).
  14. Ström, J. O., Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Method parameters' impact on mortality and variability in rat stroke experiments: a meta-analysis. BMC Neurosci. 14, 41(2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66839

גלה מאמרים נוספים

מדדי זרימה בשיטת לייזר דופלרהצבת פרובה פרי-אורביתמודל של שבץ איסכמימודל שבץ במכרסמיםהצבת פילמנטכימות מיקרוגליהפגיעה מרפרפוזיהפרוטוקול ניתוח לשבץ
מיקום פריאורביטלי של בדיקת דופלר לייזר לניטור זרימת דם מוחית לפני חסימת עורק מוחי אמצעי במודלים של מכרסמים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.