מאמר שיטה

זרימת עבודה מבוססת אינטרנט לבחירת משפרים ספציפיים לגנים ולרקמות

DOI:

10.3791/66840

⸱

18 ביולי 2025

 ,  ,  , 
1Department of Paediatrics, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 3Stem Cell Medicine Department, Murdoch Children's Research Institute, The Royal Children's Hospital, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine, reNEW Melbourne, Murdoch Children's Research Institute, 5Systems Biology Institute (SBI) Australia

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים זרימת עבודה ללא קידוד עבור ביולוגים לזיהוי משפרי גנים ספציפיים לרקמות באמצעות כלים מבוססי דפדפן בלבד. הפרוטוקול שלנו ממנף סימני היסטון ציבוריים H3K4me1/H3K27ac ונתוני Hi-C, ומאפשר לחוקרים ללא מומחיות בתכנות לגשת, לנתח ולזהות אלמנטים רגולטוריים פוטנציאליים הקשורים לגנים המעניינים שלהם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפרים הם אזורי DNA המווסתים את ביטוי הגנים. מוטציות בתוך משפרים עלולות לגרום לוויסות גנים לא תקין המוביל למחלות. לכן, זיהוי משפרים המווסתים את פעילות הגנים ברקמות ספציפיות הוא חיוני להבנת הבסיס הגנטי של המחלה. עם זאת, קשה לזהות משפרים מכיוון שהם אינם מקודדים חלבונים. בעוד שמאגרי משפרים וכלי זיהוי רבים זמינים, המורכבות של כלים אלה יכולה להוות אתגר עבור ביולוגים. כדי להקל על ביולוגים בשימוש במשאבים אלה, אנו מציגים פרוטוקול ידידותי לביולוגים (https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow) הממנף נתונים גנומיים מבוססי אינטרנט קיימים כגון סימני היסטון H3K4me1 ו-H3K27ac ונתוני ניתוח קונפורמציה של כרומטין (Hi-C) כדי לגלות משפרים הקשורים לגן מעניין (GoI) ברקמת מטרה שבה המשפר פעיל. פרוטוקול זה מבוסס אינטרנט לחלוטין ואינו דורש מיומנויות תכנות ממשתמשי הקצה. הדגמנו את התועלת של גישה זו על ידי אפיון משפרים מועמדים המווסתים את TBX5, גן קריטי להתפתחות הלב. פרוטוקול זה מקל על זיהוי משפרים הקשורים לגן זה בחדר השמאלי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

משפרים הם אזורי DNA שאינם מקודדים המווסתים את שעתוק הגנים, התפתחותם והתמיינות התאים 1,2. מוטציה של משפרים עלולה להוביל למחלות שונות, כולל הפרעות התפתחותיות, סרטן ומצבים גנטיים אחרים 3,4,5,6. לכן, הבנת משפרים היא בעלת חשיבות עליונה להבנת ביטוי גנים, מוטציות ומחלות.

כדי להבין כיצד משפרים מקיימים אינטראקציה עם גני היעד שלהם, חשוב לזהות את מיקומם בתוך הגנום. עם זאת, זיהוי מיקומי המשפרים אינו תמיד פשוט מכיוון שניתן למקם את המשפרים הן קרוב לאתר התחלת התמלול (TSS) והן הרבה יותר רחוק, המשתרעים על פני עשרות עד מאות קילובסיסים 2,7,8,9.

למרות מיקומם הגנומי הבלתי צפוי, המשפרים מראים חתימות ביוכימיות ומבניות מובהקות, המאפשרות לעקוב אחריהם באופן שיטתי. בדרך כלל, משפרים נוטים להיות מועשרים באזורים בין-גניים ואינטרוניים, כאשר מספר קטן נמצא בתוך אקסונים 2,8. לעתים קרובות הם מסומנים על ידי שינויים ספציפיים בהיסטון וקשירת גורמי שעתוק, המגדירים את תפקידיהם הרגולטוריים וקובעים את פעילותם המרחבית-זמנית על פני שלבי התפתחות ורקמות שונות10,11.

ChIP-seq משמש לזיהוי אתרי קשירת גורמי שעתוק (TFBS) וסימני שינוי היסטון, כגון סימן ההיכר של משפרים, H3K4me1, סימני משפר פעילים, סימני H3K27ac ו-H3K4me3, המועשרים באזורי מקדם 1,12,13,14,15. טכניקות לכידת קונפורמציה של כרומטין (3C) ונגזרותיהן, כגון 4C, 5C, Hi-C ו-ChIA-PET, משמשות למיפוי אינטראקציות פיזיות בין אזורים גנומיים מרוחקים. בעוד ש-3C מכוון לאינטראקציות ספציפיות ברקמות ספציפיות, Hi-C מציע ארכיטקטורה כלל-גנומית על פני סוגי תאים16,17.

בנוסף לשיטות הנוכחיות, פותחו גישות מיוחדות לאפיון משפרים, כולל מסדי נתונים של משפרים מאוגדים, כגון EnhancerAtlas או EnhancerFinder18,19. עם זאת, כלים אלה דורשים לעתים קרובות מהחוקרים לשלב מערכי נתונים מרובים כדי לחקור משפרים מרובים על פני רקמות רבות, מה שיכול להיות מכריע עבור ביולוגים ללא ניסיון בביואינפורמטיקה וכריית נתונים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ידידותי למשתמש לבחירת משפרים, המבוסס כולו על כלי אינטרנט קיימים. זה מאפשר לחוקרים לשאול גן מעניין (GoI) ולאחזר משפרים מתאימים. הפרוטוקול כאן בוחר משפרים על סמך קבוצה ספציפית של קריטריונים: שינויים בהיסטון, אינטראקציות כרומטין וספציפיות רקמות 1,12,13,14,15,16,17,20,21. משפרים הנמצאים בתוך אינטרונים נוטים יותר להראות פעילות ספציפית לרקמה בהשוואה למשפרים בין-גניים, הממוקמים באזורים הגנומיים בין גנים22. כדי להבטיח כיסוי מקיף של משפרים פעילים פוטנציאליים, הגדרנו את טווח החיפוש בין שני ממשלים שכנים כדי להגדיל את הסבירות ללכידת אלמנטים רגולטוריים הממוקמים מחוץ לגופי גנים. השתמשנו בסימן היכר אפיגנטי ספציפי למשפר, H3K4me1, ובסימן משפר פעיל, H3K27ac, כדי לרשום מועמדים למשפר. מועמדים אלה שוכללו לאחר מכן על סמך נתוני Hi-C, תוך שמירה על משפרים עם אינטראקציות פיזיות עם המקדם המתאים. פרוטוקול זה נועד להדריך ביולוגים בתהליך זיהוי המשפר באמצעות כלים מבוססי אינטרנט הזמינים לציבור בלבד. על ידי שילוב נתוני אינטראקציה אפיגנטיים וכרומטינים, הגישה המתוארת כאן מציעה מסגרת מעשית ליצירת השערות לגבי משפרים פוטנציאליים לאימות ניסיוני נוסף.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הדרכה שלב אחר שלב זמינה בכתובת https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow. הנתונים המשמשים בפרוטוקול מסוכמים בטבלה 1 ובטבלה 2. פתרון בעיות זמין בקובץ משלים 1.

1. איתור ממשלת ישראל (איור 1)

  1. פתח את דפדפן הגנום EnsEMBL (https://www.EnsEMBL.org).
  2. בחר את מכלול הגנום המתאים התואם את המין והגרסה.
  3. הזן את GoI בשדה החיפוש ולחץ על Go.
  4. בחר את הקישור למזהה הגן המתאים של EnsEMBL.
  5. לחץ על הקישור למציג הכרטיסייה אזור בפרטים , הממוקם מתחת לקטע הסיכום, כדי לנווט באזור המקיף את ממשלת ישראל.

2. הגדרת אזור זיהוי משפר (איור 2)

  1. זהה את שני הגנים השכנים של ממשלת ישראל כדי להגדיר את אזור הזיהוי. השתמש במסלול Gene Legend כדי לחפש את הגנים הללו, המובאים כאלמנטים חזותיים הקשורים ל-EnsEMBL/Havana הממוזגים במסלול Basic Gene Annotations from GENCODE . קבע את כיווניות ה-GoI על ידי סימני < ו- > על שם הגן המתאים במסלול GENCODE.
  2. לחצו וגררו לבחירת האזור הבין-גני בין גנים אלה, ולחצו על 'קפוץ לאזור בתיבה הנפתחת' כדי להציג את האזור שנבחר. הגדירו מחדש את אזור העניין בכל עת על ידי חזרה על שלב זה.
  3. (אופציונלי) התאימו אישית את התצוגה על ידי בחירה באפשרות הוספה/הסרה של רצועות בחלק העליון של מציג הרצועות. אפנון רמת הזום באמצעות פקדי הזום/ניווט מעל מציג הרצועות.

3. ניתוח סימני היסטון (איור 3)

  1. בסרגל הצידי של מציג הכרטיסיה אזור בפרטים , בחר קביעת תצורה של דף זה.
  2. בסרגל הצד של תצוגת הכרטיסייה Configure Region Image , תחת התפריט הנפתח Regulation , בחר Activity by Cell/ Tissue.
  3. השתמש בסרגל החיפוש של תאים/רקמות כדי לחפש ולבחור רקמות מעניינות. לחלופין, השתמש בסרגל הניווט האלפביתי מתחת לסרגל החיפוש כדי למצוא טישו מעניין.
  4. בחר את הכרטיסיה ניסויים , לצד תא/רקמה.
  5. בחר ב-H3K4me1 ו-H3K27ac כסמן של משפרים, וב-H3K4me3 כסמן של מקדמים.
  6. בחר קביעת תצורה של תצוגת רצועה.
  7. בחר הצג רצועות כדי להמחיש אזורים המסומנים ב-H3K4me1 באזור זיהוי המשפר ואזורים המסומנים ב-H3K4me3 במעלה הזרם של ה-GoI.
  8. עבור המועמדים לשיפור, אחזר את הקואורדינטות של האזורים הגנומיים המסומנים על ידי H3K4me1 בתוך אזורי הזיהוי המוגדרים על ידי לחיצה על האלמנטים הוויזואליים/תיבה הצבעוניים ברצועות H3K4me1 החדשות שנוספו. זה חושף את החלון הקופץ "Hists & Pols", המכיל מידע על המיקום הגנומי של היסוד בזוג בסיסים (bp).
    1. אחזר מועמדים לשיפור פעיל על ידי בחירת אזורי H3K4me1 שבהם האלמנטים הוויזואליים/קופסאות הצבעוניים של H3K4me1 ו-H3K27ac חופפים. הפירוט של רמת הזום עשוי להשפיע על מספר המועמדים לשיפור המוצגים במסלול זה.
    2. לחלופין, הגדר ידנית את אזורי העניין עבור כל תכונה גנומית על ידי לחיצה וגרירה על המסלול כדי לעטוף את פסגות הגרף תחת מסלול H3K4me1/H3K27ac. העתק את קואורדינטות המיקום הגנומי לקובץ טקסט ושמור כפורמט .bed .
  9. באופן דומה, עבור אזורי מקדם, שכפל את שלב 3.8 באמצעות מסלול H3K4me3, תוך התמקדות באזור במעלה הזרם של ה-GoI.

4. ניתוח לכידת קונפורמציה של כרומטין (Hi-C) (איור 4)

  1. גש לפורטל הנתונים של 4DN (https://data.4dnucleome.org/). בתרשים העמודות המוערם הראשי של דף הבית של 4DN (איור 5), ודא שערכות ניסויים נבחרו כציר Y, סוג הניסוי נבחר כציר ה-X והעלילה מקובצת לפי אורגניזם.
  2. לאורך ציר ה- X של תרשים העמודות הראשי, מצא את סרגל ה- Hi-C באתרו . לחץ על החלק של הסרגל המקובץ עבור ערכות ניסויים אנושיים ולאחר מכן לחץ על כפתור העיון בחלון הקופץ. סנן ערכות נתונים רלוונטיות באמצעות החלונית השמאלית.
  3. לחץ על הקישור בעמודת הכותרת של הביו-דגימה הרלוונטית לרקמה המעניינת.
  4. לחץ על חקר נתונים בכרטיסייה קבצים מעובדים כדי לחקור את מערך הנתונים Hi-C ביתר פירוט.
  5. הזן את הקואורדינטות של המקדם המזוהה ברקמה המעניינת (משלב 3.9) וסמן את האזור אופקית על ידי לחיצה ימנית על מפת החום (איור 4). הקווים שנוספו מבטיחים מעקב חזותי אחר אזור המקדם על פני מפת החום. הסר קווים מקריים על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על הקו ובחירת כלל אופקי/אנכי וסגירת סידרה.
  6. הזן את הקואורדינטות של כל משפרי הבקרה המאומתים בניסוי23 כדי לחשב את סף האינטראקציה על סמך המינימום שלהם. משפרי בקרה אלה אושרו בעבר לקיים אינטראקציה עם אזור המקדם, ומשמשים כאמות מידה להגדרת האינטראקציה המשמעותית המינימלית.
  7. הגדר את סף המקדם-משפר, באמצעות משפרי הבקרה, בהתבסס על ניקוד האינטראקציה הנמוך ביותר שאינו אפס בהתאם למקש הצבע בצד ימין של המטריצה.
  8. הזן את הקואורדינטות הגנומיות של כל האזורים הקשורים ל-H3K4me1 (משלב 3.8) וסמן אנכית על מפת החום Hi-C. זה מאפשר דפוס בדיקה צולבת, שבו ניתן לבחון את ההצטלבות בין משפרים המסומנים ב-H3K4me1 (אנכי) לאזור המקדם (אופקי) לאינטראקציות משמעותיות.
    1. לאחר מכן, סנן אזורים בעלי אינטראקציה חלשה על ידי השוואת ציוני האינטראקציה של אזורים המסומנים ב-H3K4me3 עם סף האינטראקציה (שלב 4.6).
    2. בחר את הקואורדינטות הגנומיות המציגות תדרי אינטראקציה גבוהים מהסף המוגדר במפת החום של פורטל 4DN. אזורים אלה מופיעים כאותות מרוכזים יותר (כהים יותר) במפת החום, למעט בפורמט BED.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להמחיש את השימוש בפרוטוקול המוצג, חקרנו את הגן TBX5 בלב האדם, וחקרנו משפרים הקשורים ל-TBX5 באמצעות זרימת העבודה המקיפה הכוללת נתוני H3K4me1, H3K27ac ו-Hi-C. TBX5 הוא גן התורם להתפתחות הגפיים והלב, כולל היווצרות ארבעת החדרים והפרדת מחיצה24. מוטציה בגן זה היא הגורם העיקרי לתסמונת הולט-אורם (HOS), הגורמת להפרעות בגפיים ולמחלת לב מולדת (CHD), כולל פגמים במחיצה24. המוטציה של משפרי לב הקשורים ל-TBX5 עשויה להשפיע באופן קריטי על CHD24. מחקר קודם גילה שלושה משפרי TBX5 ידועים ברקמה ספציפית ללב אנושי - כלומר "משפר 2", "משפר 9" ו"משפר 16" (קובץ משלים 2), שהוכחו כבעלי פנוטיפים השוואתיים בעכברים טרנסגניים23.

חקרנו אזורים מועשרים ב-H3K4me1 ו-H3K27ac בין RBM19 ל-TBX3, שהם שני גנים מאגפים במורד הזרם ובמעלה הזרם של TBX5 בבני אדם, כדי לאחזר משפרים משוערים בלוקוס TBX5 (איור 1 ואיור 2). כדי לזהות משפרים ספציפיים ללב, נבחרו תאי שריר הלב. האזורים המשוערים של משפר הלב TBX5 אוחזרו כקואורדינטות (chr12: התחלה-סוף), וזוהו 22 אזורים הקשורים ל-H3K4me1 ו-H3K27ac (איור 3 וקובץ משלים 3). משפרי לב משוערים TBX5 אוחזרו ממסד הנתונים הגנומי של EnsEMBL כדי להצליב נתוני Hi-C המוחזקים במסד הנתונים של 4DNucleome (איור 4). זה נעשה כדי לאמוד אינטראקציות אפשריות בין משפרים פוטנציאליים למקדם הלב TBX5 . בעקבות הפרוטוקול המתואר כאן, 21 מתוך 22 אזורים גנומיים אושרו לקיים אינטראקציה עם מקדם TBX5 (chr12: 114400143-114410103) בתאי שריר הלב (קובץ משלים 4). היה אזור אחד שלא הייתה לו אינטראקציה פיזית עם המקדם (איור 4, שלב 4.8). לבסוף, השווינו פרוטוקול זה עם משפרים מאומתים ביולוגית אלה ומסד הנתונים הנוכחי של משפרי לב, VISTA Cardiac Enhancers Browser, וחשפנו משפרים נוספים שאינם נלכדים כרגע על ידי מסד הנתונים25.

ביצענו השוואה צולבת של 21 משפרי TBX5 שאוחזרו על ידי הפרוטוקול המוצג כאן עם מסדי נתונים קיימים. אחזרנו 4 משפרי TBX5 מדפדפן משפר הלב של VISTA (קובץ משלים 5)25. מבין 4 משפרי הלב שזוהו על ידי VISTA, 3 משפרים, hs2329, mm1282 ו-m370 חפפו לאזורים שזוהו על ידי פרוטוקול זיהוי משפרים מבוסס אינטרנט זה (איור 5). כל אחד מהמשפרים החזויים שיתף גם את האזורים הגנומיים עם משפרים שאומתו בעבר בניסוי מ-Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) ו-Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), בעוד שהם לא הראו חפיפה עם Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). אחד המשפרים שזוהו על ידי VISTA, hs498 לא חפף לאף משפר חזוי על ידי פרוטוקול זה או המשפרים המאומתים בניסוי של Smemo et al.23 (איור 5), למרות שהאזור הראה חפיפה חלקית עם סימני H34Kme1 (איור 5). באופן דומה, משפר 9 לא חפף עם המשפרים החזויים על ידי צינור זה אלא היה קשור לסימני H3K4me1 (איור 5).

figure-results-1
איור 1: מדריך צעד-אחר-צעד לאיתור ה-GoI בדפדפן הגנום EnsEMBL. המשתמש פותח תחילה את דף הבית של EnsEMBL (1.1), בוחר את המין (אנושי) ומזין את הגן בשורת החיפוש (1.2-1.3). מרשימת התוצאות נבחר מזהה הגן המתאים (1.4), הפותח את דף סיכום הגנים. לאחר מכן המשתמש לוחץ על ההיפר-קישור Region in Detail (1.5) כדי לדמיין את האזור הגנומי המקיף את ה-GoI, כולל אלמנטים שכנים ותכונות רגולטוריות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הגדרת אזור זיהוי המשפר סביב ה-GoI באמצעות דפדפן הגנום EnsEMBL. כדי להגדיר את אזור זיהוי המשפר, זהה את שני הגנים השכנים המאגפים את ה-GoI באמצעות הערות הגנים הבסיסיות ממסלול GENCODE , שבו הגנים מוצגים כבלוקים צהובים כהים המסומנים בהערות EnsEMBL/Havana ממוזגות. כיוון השעתוק של כל גן מסומן על ידי ראשי חץ (< או >) ליד שם הגן (2.1). לבחירת האזור הבין-גני בין הגנים השכנים, לחצו וגררו לאזור העניין, ולאחר מכן בחרו 'קפוץ לאזור ' בתיבה הנפתחת כדי להגדיל את התצוגה (2.2). כדי להוסיף ביאורים רגולטוריים או משפרים, לחץ על הוספה/הסרה של רצועות (2.3). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תצורה של מסלולי שינוי היסטון באזור זיהוי המשפר באמצעות דפדפן הגנום EnsEMBL. בסרגל הכלים השמאלי, לחץ על הגדר דף זה (3.1) כדי לגשת ללוח תצורת המסלול ולנווט אל "פעילות לפי תא/רקמה" בסעיף הרגולציה (3.2). בכרטיסייה שנפתחה, בחר בסעיף "ניסויים" (3.3), והשתמש בסרגל החיפוש תא/רקמה כדי לאתר ולבחור את הרקמה המעניינת שלך (תא שריר לב) (3.4). בלוח סימני ההיסטון (3.5), הפעל את H3K4me1 ו-H3K27ac כסימני שיפור פעילים ואת H3K4me3 כסימן מקדם ולאחר מכן לחץ על "הגדר תצוגת מעקב" (3.6). לאחר אישור בחירות הרצועות, לחץ על "הצג רצועות" (3.7) כדי לחזור למציג הגנום. פסגות סימני היסטון מוצגות כעת באזור הזיהוי (3.8) כבלוקים צבעוניים מתחת לתווית הרקמה המתאימה (צהוב: H3K4me1, כחול: H3K27ac וכתום: H3K4me3). חלון קופץ "Hists & Pols" המכיל את הקואורדינטות הגנומיות של האזור בזוגות בסיסים (chr:start-end), שניתן להעתיק ולשמור לניתוח במורד הזרם. חלון קופץ "Hists & Pols" מופיע לאחר לחיצה על האלמנטים הצבעוניים ברצועה. החלון הקופץ מכיל את הקואורדינטות הגנומיות של האזור בזוגות בסיסים (למשל, chr12:11443450-114451611 עבור אזור המקדם), שניתן להעתיק ולשמור לניתוח במורד הזרם (3.8). כמו כן, כדי לחלץ משפרים מועמדים, תעדוף אזורים שבהם שיאי H3K4me1 ו-H3K27ac חופפים, כפי שמוצג על ידי יישור אנכי של פסגות ותיבות על פני מסלולים (3.9). ניתן לבחור אזורים חופפים ישירות על ידי לחיצה על התיבות שלהם או על ידי לחיצה ידנית וגרירה על פני הפסגות המיושרות כדי להגדיר אזור (למשל, chr12:114400143-114410103 עבור אזור מועמד פעיל). יש לשמור את הקואורדינטות המוצגות בחלון הקופץ בפורמט BED לצורך אימות או הדמיה במורד הזרם. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: הדמיה של אינטראקציות כרומטין מקדם-משפר באמצעות מפות חום Hi-C מפורטל נתוני ה-4D Nucleome. דף הבית של פורטל הנתונים של 4D Nucleome מציג תרשים עמודות מוערם המסכם את סוגי הניסויים הזמינים לפי אורגניזם. מערך הנתונים "Hi-C באתר " עבור דגימות אנושיות נבחר על ידי לחיצה על החלק המתאים בסרגל (4.1). מוצגת רשימה מסוננת של מערכי נתונים רלוונטיים; נבחר מערך נתונים Hi-C שמקורו בתאי H9 המובחנים למיובלסטים לבביים (4.2). מערך הנתונים שנבחר (4.3) נפתח בדפדפן HiGlass באמצעות כפתור Explore Data (4.4). אזור העניין הגנומי מוזן בתיבת הקואורדינטות (4.5), ומטריצת המגע מוצגת כמפת חום בקנה מידה צבעוני. צבעים כהים יותר (אדום עמוק עד שחור) מצביעים על תדר מגע כרומטין חזק יותר, בעוד שצבעים בהירים יותר (לבן עד כתום) מייצגים אינטראקציות חלשות יותר. כלל אופקי ממוקם בקואורדינטת המקדם, וכללים אנכיים משורטטים במיקומים של שלושה משפרי בקרה מאומתים בניסוי (4.6). צמתים אלה משמשים להגדרת סף אינטראקציה קפדני, שנקבע על ידי האות הנראה החזק ביותר (הצבע הכהה ביותר) מבין מגעי המקדם-משפר (4.7). כללים אנכיים נוספים משורטטים במיקומים של משפרים מועמדים המסומנים H3K27ac ו-H3K4me1 (משלב 3.8). מועמדים שהצטלבויות המקדם-משפר שלהם שוות או כהות יותר מהסף נשמרות, בעוד שאלה עם אותות חלשים יותר (ריבועים בצבע בהיר יותר) אינם נכללים (4.8). קואורדינטות שמורות מחולצות באופן ידני ונשמרות בפורמט BED לניתוחים במורד הזרם. (א. משפר 2, ב. משפר 9 וג. משפר 16) אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: תצוגת דפדפן גנומית של משפרי TBX5 חזויים בהשוואה למשפרי לב ומשפרי בקרה מאומתים על ידי VISTA. תמונות דפדפן גנום מציגות את טווח חיפוש המשפרים (שלב 2) המשווה משפרים חזויים שאוחזרו על ידי הפרוטוקול מבוסס האינטרנט (למטה) עם משפרים מאומתים על ידי VISTA (למעלה) ומשפרי בקרה מאומתים בניסוי (במרכז). הפאנל הראשי מציג את הלוקוס הגנומי המלא עם אלמנטים רגולטוריים מוערים, כולל פסגות H3K4me1 ספציפיות לתאי שריר הלב (צהוב), H3K27ac (כחול) ו-H3K4me3 (כתום). שלוש דמויות מוגדלות לוכדות את היישור בין המאוחזר על ידי הפרוטוקול, VISTA ומשפרי הבקרה. החפיפה עם משפרי בקרה מתוארת בתיבות אדומות. קואורדינטות עבור כל תת-אזור מוצגות בחלוניות הדפדפן התחתונות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: נתונים ששימשו במחקר. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

טבלה 2: כלים מבוססי אינטרנט ששימשו במחקר. אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.

קובץ משלים 1: הוראות לפתרון בעיות עבור דפדפן הגנום של EnsEMBL. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 2: קובץ BED בפורמט GRCh38, משפרי בקרת הלב TBX5 המאומתים בניסוי 23. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 3: קובץ BED בפורמט GRCh38, משפרי לב TBX5 שאוחזרו על ידי STEP3 מ-EnsEMBL. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 4: קובץ BED בפורמט GRCh38, משפרי לב TBX5 שאוחזרו על ידי STEP4 מ-EnsEMBL. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

קובץ משלים 5: קובץ BED בפורמט GRCh38, משפרי לב TBX5 שאוחזרו מדפדפן משפר הלב VISTA25. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מבוסס האינטרנט המתואר כאן מתפקד כזרימת עבודה לאחזור משפרים, ולא כחיזוי משפר. על ידי מינוף מערכי נתונים ספציפיים לרקמות הזמינים לציבור, שינויים בהיסטון (H3K4me1 ו-H3K27ac) ונתוני אינטראקציה Hi-C, הוא מצמצם משפרים פוטנציאליים הקשורים ל-GoI. בניגוד לכלי חיזוי חישוביים התלויים בלמידת מכונה או במודלים מבוססי רצף, הגישה שלנו מתמקדת באחזור משפרים המבוססים רק על נתונים ניסיוניים. הוראות פתרון הבעיות עבור דפדפן הגנום של EnsEMBL מסופקות בקובץ משלים 1.

זרימת עבודה זו משלבת אלמנטים מרכזיים כגון סימני היסטון ונתוני אינטראקציה של כרומטין, בדומה לשיטות מתקדמות כמו ChIA-PET ו-PLAC-seq, הממפות אינטראקציות משפר-מקדם ברמת דיוק גבוהה יותר10,11. עם זאת, שיטה זו מועילה כאשר טכניקות ניסוי ברזולוציה גבוהה אינן אפשריות, מכיוון שהפרוטוקול פחות עתיר משאבים וחוסך זמן משמעותי.

המגבלה העיקרית של הגישה שהוצגה לעיל היא התלות שלה בזמינות ובאיכות של מערכי נתונים קיימים, מה שעשוי להשפיע על דיוק האינטראקציות המאוחזרות. חקירת פעילות משפרת במהלך התפתחות הלב בהקשר של מוטציות גנטיות הקשורות ל-TBX5 דורשת רזולוציה ספציפית לרקמה. לניתוח כזה, רקמת לב עוברית תהיה המתאימה ביותר בהתחשב ברלוונטיות שלה לוויסות התפתחותי. עם זאת, אף מערכי נתונים עובריים שכללו את נתוני שינוי ההיסטון לא היו זמינים לציבור בזמן הניתוח. כדי להסביר זאת, שילוב משאבים חלופיים כגון ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 או EnhancerFinder יכול להרחיב את התועלת של הצינור על ידי מתן מערכי נתונים נוספים לזיהוי ואימות משפרים 18,19.

ב-TBX5 REPFIX, הניתוח המבוסס על H3K4me1 חשף 22 משפרים משוערים כנקודת התחלה למחקר נוסף. ניתוח ה-Hi-C שלאחר מכן הראה ש-21 מתוך 22 מועמדים לשיפור בהתבסס על סימני שינוי היסטון קודמים קיימו אינטראקציה עם מקדם TBX5 בתאי שריר הלב (איור 5). זה תומך באמינות הגישה המבוססת על סימני שינוי היסטון בחיזוי אזורי עניין.

בחרנו לא לתעדף שימור רצפים בין מינים בפרוטוקול זה, למרות שזהו קריטריון נפוץ לזיהוי משפרים. כפי שהוכח בעבר כפחות יעיל עבור משפרי רקמות או מינים ספציפיים, שרבים מהם אינם נשמרים היטב במהלך האבולוציה26. בהתחשב בכך, בחרנו להתמקד בסמנים מבוססי כרומטין המעידים באופן ישיר יותר על פעילות משפר תפקודי. עם זאת, שימור הרצף עדיין עשוי להיות בעל ערך בהקשרים ספציפיים, כגון חקר משפרים בעלי משמעות אבולוציונית. במקרה זה, ניתן להוסיף אותו כצעד אופציונלי למשתמשים המעוניינים באלמנטים רגולטוריים משומרים.

הפרוטוקול הוכיח את עצמו כיעיל באחזור של 21 משפרים ספציפיים ללב עבור הגן TBX5 מאתר EnsEMBL, שבעבר חמק מזיהוי על ידי פלטפורמה קיימת, VISTA Cardiac Enhancers Browser. למרות שהפרוטוקול המתואר כאן לא הצליח לאחזר את אחד המשפרים, hs498, מה שמרמז על אפשרות של מגבלה בזיהוי, הגישה חשפה כמה משפרים שלא זוהו על ידי דפדפן משפרי הלב של VISTA. עם זאת, יש צורך באימות נוסף של המשפרים שאוחזרו, מכיוון שהפרוטוקול מניב מספר גדול יותר של אזורים משוערים בהשוואה למסדי נתונים של VISTA שנאספו. ספירה גבוהה יותר זו מגדילה את הסיכון לתוצאות חיוביות כוזבות, ומספר גדול יותר של משפרים חזויים אינו מעיד בהכרח על שיפור הספציפיות או הרלוונטיות התפקודית. שילוב מערכי נתונים ניסיוניים נוספים או מבחנים פונקציונליים כגון ניתוח ביטוי גנים, הפרעה בקריספר או מבחני מדווח יהיה חיוני כדי לאשר את התוקף הביולוגי של מועמדים אלה כפי שבוצע ב-Smemoet al. מחקר23.

ההשוואה הצולבת עם שלושה משפרים שאומתו בניסוי הראתה חפיפה חלקית עם האזורים החזויים (איור 5). המשפר החזוי "e1" היה ממוקם בצורה רחבה יותר מאשר משפר 2 מאומת, בעוד ש-"e18" הראה חפיפה חלקית עם משפר 16 (איור 5). תוצאות אלה מצביעות על כך שגישה זו מזהה בהצלחה אזורים עם פעילות רגולטורית ידועה, אם כי הטווח הרחב יותר של המשפרים החזויים עשוי לשקף את הגמישות בגבולות המשפרים. משפרים מתפקדים לעתים קרובות כאלמנטים מודולריים, ופעילותם יכולה להיות תלויה בהקשר הכרומטין, סוג התא ותזמון ההתפתחות 2,27. לכן, אזורים חזויים עשויים לכלול את אתרי הליבה הפעילים עם רצפים סמוכים התורמים לתפקוד הרגולטורי, למרות הצורך באימות ניסיוני כדי לקבוע אילו חלקים מהתחזיות הרחבות הללו פעילים מבחינה תפקודית בהקשר ספציפי לרקמה או התפתחותית. בעוד שדפדפן משפר הלב של VISTA זיהה ארבעה אזורים בטווח המוגדר, רק משפר אחד, mm370, חופף חלקית למשפר מאומת בניסוי, משפר 16, במיוחד באזור המסומן על ידי H3K4me1 (איור 5)23. החלק הנותר של mm370, שאינו חופף למשפר 16, עשוי להצביע על תת-אזור לא מתפקד או לא פעיל של המשפר28,29.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מדווחים על ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת Ramialison (טרנסקריפטומיקה וביואינפורמטיקה, reNEW Bioinformatics Hub) על דיונים מועילים. MR ו-HTN נתמכים על ידי מענק רעיונות של NHMRC (APP1180905). אנו מודים לריצ'רד סאפרי על התמיכה. MR ממומן על ידי מלגת מנהיג העתיד של קרן הלב (107328). מימון תשתיות נוסף למכון המחקר לילדים מרדוק ניתן על ידי תוכנית התמיכה בתשתיות של המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של ממשלת אוסטרליה. המכון האוסטרלי לרפואה רגנרטיבית נתמך על ידי מענקים מממשלת מדינת ויקטוריה וממשלת אוסטרליה. המרכז לרפואת תאי גזע של קרן נובו נורדיסק נתמך על ידי מענקי קרן נובו נורדיסק (NNF21CC0073729).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
עמדת עבודה למחשבלא ישיםלא ישיםמחשב התומך בדפדפן אינטרנט, מערכת הפעלה Windows/Mac/Linux
פורטל הנתונים של 4DNפורטל הנתונים של 4DNhttps://data.4dnucleome.org/
גלקסיהגלקסיהhttps://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
גיטהאבגיטהאבhttps://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
ויסטה דפדפן משפר לב VISTAhttps://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barral, A., Déjardin, J. The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation. Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).
  3. Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease. Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).
  4. Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. Enhancer redundancy in development and disease. Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).
  5. Smith, E., Shilatifard, A. Enhancer biology and enhanceropathies. Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).
  6. Sur, I., Taipale, J. The role of enhancers in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).
  7. Panigrahi, A., O'Malley, B. W. Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown. Genome Biol. 22 (1), 108(2021).
  8. Bulger, M., Groudine, M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell. 144 (3), 327-339 (2011).
  9. Krivega, I., Dean, A. Enhancer and promoter interactions-long distance calls. Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).
  10. Zhang, Y., et al. Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations. Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).
  11. Fang, R., et al. Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq. Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).
  12. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
  13. Thurman, R. E., et al. The accessible chromatin landscape of the human genome. Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).
  14. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).
  15. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).
  16. Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes. Methods. 58 (3), 268-276 (2012).
  17. de Wit, E., de Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).
  18. Gao, T., Qian, J. EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).
  19. Erwin, G. D., et al. Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction. PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).
  20. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  21. Spicuglia, S., Vanhille, L. Chromatin signatures of active enhancers. Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).
  22. Borsari, B., et al. Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions. Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).
  23. Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease. Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).
  24. Boogerd, C. J., Evans, S. M. TBX5 and NuRD divide the heart. Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).
  25. Dickel, D. E., et al. Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers. Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).
  26. Pennacchio, L. A., Visel, A. Limits of sequence and functional conservation. Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).
  27. Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
  28. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  29. Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers. Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Enhancer IdentificationGene RegulationH3K4me1 MarkerH3K27ac MarkerChromatin ConformationHi C DataEnsembl Genome BrowserHeart Development

מאמרים קשורים