מאמר שיטה

קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66854

⸱

28 ביוני 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק טכניקה לקציר ולתרבית גנגליון שורש גבי (DRG) שנשתל מחולדות בוגרות מסוג Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC).

תקציר

התכונה העצבית ההיקפית הנפוצה ביותר של כאב היא סף גירוי נמוך יותר או רגישות יתר של עצבים סופניים מגרעיני השורש הגבי (DRG). אחת הסיבות המוצעות לרגישות יתר זו קשורה לאינטראקציה בין תאי מערכת החיסון ברקמה ההיקפית לבין תאי עצב. מודלים במבחנה סיפקו ידע בסיסי בהבנת האופן שבו מנגנונים אלה גורמים לרגישות יתר של nociceptor. עם זאת, מודלים במבחנה מתמודדים עם האתגר של תרגום יעילות לבני אדם. כדי להתמודד עם אתגר זה, פותח מודל מבחנה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ואנטומית לתרבית של גרעיני שורש גבי שלמים (DRGs) בשלושה תאים מבודדים בצלחת בת 48 בארות. DRG ראשוניים נקצרים מחולדות בוגרות של Sprague Dawley לאחר המתת חסד הומנית. שורשי עצב עודפים נחתכים, וה- DRG נחתך לגדלים המתאימים לתרבית. לאחר מכן מגדלים DRG בהידרוג'לים טבעיים, המאפשרים צמיחה חזקה בכל התאים. מערכת מרובת תאים זו מציעה בידוד אנטומי רלוונטי של גופי תאי DRG מתאי עצב, סוגי תאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ותכונות מכניות כדי לחקור את יחסי הגומלין בין תאים עצביים וחיסוניים. לפיכך, פלטפורמת תרבות זו מספקת כלי רב ערך לחקירת אסטרטגיות בידוד טיפוליות, מה שמוביל בסופו של דבר לגישת סינון משופרת לחיזוי כאב.

מבוא

כאב כרוני הוא הגורם המוביל לנכות ולאובדן עבודה ברחבי העולם1. כאב כרוני משפיע על כ -20% מהמבוגרים ברחבי העולם ומטיל נטל חברתי וכלכלי משמעותי2, עם עלויות כוללות המוערכות בין 560 ל -635 מיליארד דולר מדי שנה בארצות הברית3.

התכונה ההיקפית העיקרית המוצגת על ידי חולי כאב כרוני היא סף גירוי נמוך יותר של עצבים, מה שמוביל לכך שמערכת העצבים מגיבה יותר לגירויים 4,5. סף הגירוי הנמוך יכול לגרום לתגובה כואבת לגירוי שלא היה כואב בעבר (אלודיניה) או לתגובה מוגברת לגירוי מכאיב (שיכוך יתר)6. לטיפולים הנוכחיים בכאב כרוני יש יעילות מוגבלת, וטיפולים שמצליחים במודלים של בעלי חיים נכשלים לעתים קרובות בניסויים בבני אדם בגלל הבדלים מכניסטיים בביטוי כאב7. מודלים במבחנה שיכולים לחקות בצורה מדויקת יותר מנגנוני רגישות היקפיים הם בעלי פוטנציאל להגדיל את התרגום של טיפולים חדשים 8,9. יתר על כן, על ידי מידול היבטים מרכזיים של עצבים רגישים במערכת תרבית, חוקרים יכולים לפתח הבנה עמוקה יותר של המנגנונים המניעים סף נמוך יותר ולזהות מטרות טיפוליות חדשות ההופכות אותם10.

האידיאל בפלטפורמות מבחנה או מערכות מיקרופיזיולוגיות ישלב הפרדה פיזית של נוירוטים דיסטליים וגרעיני שורש גביים (DRG), סביבה תאית תלת-ממדית (תלת-ממדית), ונוכחות של תאי תמיכה מקומיים לחיקוי קרוב של תנאי in vivo . עם זאת, מאמר שנערך לאחרונה על ידי Caparaso et al.11 מראה כי פלטפורמות התרבות DRG הנוכחיות חסרות אחת או יותר מתכונות מפתח אלה, מה שהופך אותם לבלתי מספיקים בשכפול בתנאי vivo . למרות שפלטפורמות אלה קלות להתקנה, הן אינן מחקות את הבסיס הביולוגי של רגישות היקפית ולכן עשויות שלא להיות מתורגמות ליעילות in vivo . כדי להתמודד עם מגבלה זו, פותח מודל במבחנה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לתרבית גרעיני שורש גבי (DRG) בתוך מטריצת הידרוג'ל עם שלושה תאים מבודדים המאפשרים בידוד נוזלי זמני של נוירוטים וגופי תאי DRG11. מודל זה מציע רלוונטיות פיזיולוגית ואנטומית כאחד, אשר יש פוטנציאל לחקור רגישות היקפית של נוירונים במבחנה.

העניין הגובר בשימוש בצמחי DRG בתרבית תלת-ממדית נובע מיכולתם להקל על צמיחה עצבית חזקה, המשמשת אינדיקטור עקיף לכדאיות DRG12. בעוד שצמחי DRG ראשוניים או עובריים משמשים בעיקר בפלטפורמות תרבית חוץ גופיות נוכחיות 13,14, שימוש בצמחים ממכרסמים בוגרים מספק מודל טוב יותר של פיזיולוגיה עצבית בוגרת, המחקה באופן הדוק את הפיזיולוגיה של DRG האנושי בהשוואה לצמחים ממכרסמים יילודים או עובריים15. Explant DRGs מתייחסים לשימור הרקמה התאית והמולקולרית של רקמת DRG טבעית, בעיקר על ידי שמירה על תאי תמיכה טבעיים שאינם עצביים. כאן, פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה לקציר ולתרבית של צמחי DRG מחולדות בוגרות של Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC) (איור 1).

יעילות הוכחה בתרבית DRGs מעמוד השדרה הצווארי, החזי והמותני ללא הבדלים ניכרים בצמיחת עצבים. עבור יישום זה, המטרה הייתה לעורר צמיחה עצבית לתוך התאים החיצוניים של המכשיר; לכן, מאמר זה לא הפלה בין רמות DRG. עם זאת, אם יש צורך בניסוי ספציפי, ניתן להתאים את רמת DRG כדי לענות על צרכי הנסיינים. כיום קיימים מודלים אחרים של תרביות ממודרות עבור תרבית תלת-ממדית של DRGs16, אולם התקנים אלה אינם מכילים תאי תמיכה מקומיים שאינם עצביים שהשתמרו, מה שעלול להגביל את התרגום. שימור המבנה הטבעי של תאי DRG שנקטפו חשוב מכיוון שהוא מבטיח את השמירה של תאי תמיכה שאינם עצביים, שהאינטראקציות שלהם עם נוירוני DRG חיוניות לשמירה על התכונות התפקודיות של נוירונים אלה. מספר מחקרים שיתפו תרבית DRGs מנותקים עם תאים עצביים שאינם ילידים כגון תאי Schwann כדי לקדם מיאלינציה של נוירונים 17,18,19.

פרוטוקול

קציר DRG בוצע בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת נברסקה-לינקולן. נקבות חולדות Sprague Dawley בנות 12 שבועות (~250 גרם) שימשו למחקר. פרטי בעלי החיים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. ייצור והרכבה של מכשירים מרובי תאים

  1. תכנון בעזרת מחשב והדפסה תלת מימדית של המכשיר הרב-תאי
    הערה: התקן MC מורכב משלושה תאים לבידוד של גופי תאי DRG ותאי עצב (איור 2A). התקן MC אינו זמין מסחרית; עם זאת, קובץ STL מסופק כאן (קובץ קידוד משלים 1) כדי לאפשר הדפסה תלת-ממדית. הדפסת הMC נמשכת יום אחד (1).
  2. העלה את קובץ STL של MC למדפסת תלת-ממד של שרף באמצעות תוכנה תואמת.
    הערה: החומר האידיאלי להדפסה הוא שרף בטמפרטורה גבוהה. יתרון מרכזי בשימוש בשרף בטמפרטורה גבוהה הוא שהוא תואם ביולוגית וניתן לבצע בו אוטוקלבים ולעשות בו שימוש חוזר. ניתן להשתמש גם במדפסת תלת-ממד לעיבוד אור דיגיטלי (DLP) או במדפסות תלת-ממד אחרות כדי להדפיס את ההתקן.
  3. העבר את המכשירים המודפסים לתמיסת כביסה למשך 30 דקות באיזופרופנול (>96%) כדי להסיר שאריות שרף מפני השטח של התקן MC המודפס.
  4. לאחר ריפוי המכשירים ב 80 ° C במשך 120 דקות באמצעות סוכן ריפוי זמין מסחרית (ראה טבלה של חומרים). סוכן הריפוי משפר את התכונות המכניות של מכשיר MC המודפס על ידי חשיפתו לטמפרטורה ו- UV.
  5. רפאו את מכשירי MC תרמית בתנור בטמפרטורה של 160°C למשך 180 דקות.
  6. לעקר את המכשירים באמצעות autoclave במשך 45 דקות על מחזור הכבידה.

2. הכנת הידרוג'ל

  1. לסנתז חומצה היאלורונית מתקרילט (MAHA, 85%-115% מתקרילציה) ולאפיין באמצעות פרוטוקול שתואר על ידי Seidlits et al.20.
    הערה: כדי לתמוך בצמיחה של DRGs, משתמשים בדרך כלל בהידרוג'לים משולשים המורכבים מחומצה היאלורונית מתאקרילט, קולגן מסוג I ולמינין. הממצאים מצביעים על כך ש-DRGs גדלים בדרך כלל ב-MAHA, בטווח של 1.25-2.5 מ"ג/מ"ל וקולגן בין 2.0-4.5 מ"ג/מ"ל. עבור למינין, נמצא כי 0.75 מ"ג / מ"ל מספיק כדי להבטיח צמיחה חזקה של DRGs. להלן מפורטות שיטות ליצירת ג'ל משולש עם 1.25 מ"ג/מ"ל MAHA, 4.5 מ"ג/מ"ל קולגן ו-0.75 מ"ג/מ"ל למינין. הכנת הידרוג'ל צריכה להיעשות בארון זרימה למינרי כדי לספק סביבת עבודה אספטית.

3. הכנת פתרון Photoinitiator

הערה: יש צורך בפוטו-יוזם כדי לחצות את ה-MAHA תחת אור UV. זה נפוץ באחוזים מ 0.3% ל 0.6%.

  1. הכן את תמיסת photoinitiator 3 ימים לפני הקציר DRG.
  2. חממו מראש את אמבט המים הסוניק ל -37 מעלות צלזיוס לפני הכנת תמיסת הפוטו-יוזם.
  3. עבודה עם הטכניקה הסטרילית במכסה מנוע זרימה, להכין 23.125 מ"ג / מ"ל סודיום ביקרבונט (NaHCO3) פתרון על ידי המסת NaHCO3 בתמיסת 5x Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)-HEPES.
  4. בבקבוקון זכוכית, יש לערבב פוטו-יוזם של 0.6% משקל/נפח (w/v) בתמיסת מלח סטרילית חוצצת פוספטים (PBS) של 20% vol/vol 1x ו-80% vol/vol 5X DMEM/HEPES.
  5. כדי להגן מפני אור, עטפו את בקבוקון הזכוכית ברדיד אלומיניום. עם זאת, הקפידו להסיר את רדיד האלומיניום לפני העברת הבקבוקון לאמבט המים הסוניק שחומם ל-37°C עם סוניקציה בין 30-40 דקות.
    הערה: תמיסת Photoinitiator חייבת להיות מוגנת מפני אור מכיוון שהיא יכולה להתפרק לרדיקלים ולהתחיל את תהליך הפילמור כאשר היא נחשפת לאור21.
  6. מסננים סטריליים את התמיסה עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר לתוך בקבוקון זכוכית סטרילית חדשה.

4. המסת חומצה היאלורונית מתקרילטית

  1. ממיסים את החומצה ההיאלורונית המתאקרילט (מוכנה בשלב 2) באותו יום שבו מכינים את תמיסת הפוטו-יוזם (שלב 3).
  2. הניחו את ה-MAHA הקפוא במייבש למשך 15 דקות כדי להגיע לטמפרטורת החדר.
  3. עבודה במכסה מנוע זרימה למינרית ושימוש בטכניקת השקילה הסטרילית, שוקלים את ה- MAHA הליופילי בבקבוקון זכוכית.
  4. הוסף את הנפח הדרוש של תמיסת פוטו-יוזם מסוננת ל- MAHA כדי להגיע לריכוז MAHA הרצוי. ריכוז הג'ל הסופי הנפוץ הוא 1.25 מ"ג/מ"ל MAHA ו-4.5 מ"ג/מ"ל קולגן.
  5. אוטמים את הפקק בסרט איטום מעבדה, עוטפים את בקבוקון הזכוכית ברדיד אלומיניום ומניחים אותו על צלחת שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר עד להמסה מלאה (בדרך כלל 3 ימים). מדי פעם, מערבלים את הפתרון כדי לפרק גושים גדולים של MAHA כדי להבטיח המסה אחידה של MAHA.

5. הרכבת מכשירים

  1. הכניסו את מכשיר ה-MC לצלחת בת 48 בארות יום לפני קציר ה-DRG.
  2. מרחו קו דק של ג'ל סיליקון בחריץ שמתחת להתקן MC (איור 2B) באמצעות מזרק 3 מ"ל. זה יעזור למכשיר להתחבר בבטחה לצלחת הבאר.
  3. בעזרת מלקחיים #3, הניחו בעדינות את מכשיר ה-MC לתוך הבאר של צלחת בעלת 48 בארות, כפי שמוצג באיור 2C.
    הערה: ניתן לשנות את גודל המכשיר כך שיתאים ליישום המיועד, וניתן להשתמש בצלחת בגודל שונה במידת הצורך. ניתן לעשות שימוש חוזר במכשירים. כדי לעשות שימוש חוזר, יש לשטוף את ההידרוג'ל בעדינות מכל המנהרות, ויש להשתמש בחריץ הטעינה מתחת למכשיר עם אתנול 70% עם תסיסה עדינה. לאחר השלמת פעולה זו, ניתן לבצע אוטומטית מחדש של מכשירים כדי לעקר אותם לפני השימוש.

6. הכנת בעלי חיים

  1. Autoclave כל כלי הנתיחה הדרושים לפני תחילת הקציר.
  2. השג חולדה בוגרת זכר או נקבה Sprague Dawley בגיל 12-20 שבועות. מין החולדה אינו משפיע על גדילת DRG.
  3. הרדימו את החולדה על פי פרוטוקול IACUC המאושר תוך שימוש במנת יתר שלCO2 כשיטה העיקרית להמתת חסד וניקוב פנאומוטורקס דו-צדדי כשיטה משנית להמתת חסד על פי הנחיות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית22.
  4. הניחו את החולדה על כרית תחתונה סטרילית על שולחן ניתוח עם הצד הגחוני כלפי מטה. רססו את הפרווה באתנול 70%.

7. קציר גרעיני שורש דורסלי (DRG)

  1. הכינו מצעי חיתוך המכילים 86% מצעי Neurobasal A, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS), 1% גלוטמין ו-2% B27 בתוספת 50x והעבירו לצלחת של 24 בארות. מדיה זו וצלחת באר זו ישמשו לאחסון זמני של DRG שנקטפו לפני הטמעתם בהידרוג'ל.
  2. יש ללבוש חלוק מעבדה, מסכה כירורגית, מכסה מנוע, משקפי בטיחות וכפפות.
  3. בעזרת מספריים גדולים וקהים לאף, חותכים דרך העור בבסיס עמוד השדרה הצווארי ולאחר מכן לאורך עמוד השדרה.
  4. כדי לנקז עוד יותר דם מתעלת עמוד השדרה, חתכו מתחת לשכמות ומטה דרך השריר כדי לקטוע כלי דם מרכזיים.
  5. השתמש במספריים גדולים וחדים כדי לחתוך את השריר מעמוד השדרה. נקה שריר רב ככל האפשר כדי לדמיין את עמוד השדרה.
  6. הסר את המקטעים הגביים והצדיים של החוליות. השתמשו ברונגר ישר ובמספריים חדים כדי להסיר את התהליכים הקוצניים והרוחביים של החוליות, החל מהקצה הצווארי ועד לקצה המותני.
  7. הסר את חוט השדרה. השתמש במספריים קטנים וחדים כדי לחתוך בזהירות את שורשי העצבים המחוברים ל- DRGs לאורך שני צידי חוט השדרה. חתכו את הקצה הצווארי של חוט השדרה והרימו בזהירות מתעלת עמוד השדרה בהדרגה, תוך חיתוך שורשי העצבים הנותרים המחוברים ל- DRGs.
    הערה: מיומנויות מוטוריות עדינות חיוניות כדי להבטיח שגוף DRG לא ייקטע בתהליך.
  8. כדי לחשוף DRGs, השתמש Rongeur מעוקל כדי להסיר יותר חלקים צדדיים של החוליות. משוך החוצה מקו האמצע, לסירוגין צדדים. היזהר לא לחתוך דרך גוף DRG שכן זה עלול לגרום נזק לגופי התא ואקסונים.
  9. באמצעות מלקחיים #3 ומספריים קפיציים ישרים, להסיר DRGs בין כל רמה של החוליות. אחזו בשורשי עצבי עמוד השדרה מה-DRG, שלפו אותם בזהירות מהכיס וחתכו דרך הקצה השני של עצב עמוד השדרה. היזהר לא לאחוז בגוף DRG ישירות.
  10. הניחו את ה-DRGs בבארות של צלחת בת 24 בארות (המכילה מדיית חיתוך, שלב 7.1) על קרח.
  11. לאחר איסוף כל ה- DRGs, נקה את סביבת העבודה, הכנס את הפגר לשקית אוטוקלאב, ואחסן/השליך אותו כראוי בהתאם לפרוטוקול IACUC.

8. חיתוך וחיתוך DRG

  1. מלאו צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ על ספסל נקי באמצעי חיתוך (שלב 7.1). הגדר את היקף הניתוח ואת מעקר חרוזי זכוכית ומקם ארגז כלים אוטומטי עם כלי חיתוך (#3 מלקחיים ומספריים קפיציים ישרים) ליד ההיקף.
  2. תחת טווח הניתוח, הסר רקמה עודפת סביב DRG וחתוך את שורשי העצבים הקרובים לגוף DRG (בדרך כלל מעט כהה יותר מהעצבים שמסביב).
  3. ממלאים צלחת פטרי שנייה בקוטר 60 מ"מ במדיה טרייה. תחת טווח הניתוח, חתכו את ה-DRG החתוך לכ-0.5 מ"מ (או בין 0.5 מ"מ ל-0.8 מ"מ). סרגל ממוקם מתחת לצלחת פטרי במהלך חיתוך כדי לקבל את הגודל המשוער הנכון של DRG חתוך.
  4. מעבירים DRG חתוך לצלחת טרייה של 24 בארות עם המדיה על קרח.
    הערה: חיתוך, חיתוך והטבעה של DRG צריכים להיעשות בארון זרימה למינרי כדי לספק סביבת עבודה אספטית. בהיעדר ארון זרימה למינרי, יש להקפיד על טכניקות אספטיות, עם מינימום ציוד מגן אישי מתאים (PPE) מומלץ (מעיל מעבדה, מסכות, משקפי מגן וכפפות) וכל הכלים מעוקרים לאורך התהליך כדי להפחית זיהום פוטנציאלי.

9. נטרול קולגן

  1. נטרלו את הקולגן באותו יום של קציר DRG לאחר חיתוך וחיתוך של DRGs.
  2. עבודה על קרח, פיפטה ~ 8.16% מים טהורים במיוחד, ~ 1.84% 1 M נתרן הידרוקסידי (NaOH), ~ 10% 10x PBS, ו~ 80% קולגן של נפח כולל של תמיסה לתוך בקבוקון זכוכית.
  3. ערבבו באיטיות בעזרת קצה פיפטה סטרילי בעל שימור נמוך לפיפטה קולגן (בדרך כלל מוסיפים אחרון) לתערובת. הקפידו לשמור את קצה הפיפטה בתמיסה בזמן הערבוב כדי למנוע יצירת בועות. בדוק את ה- pH של הקולגן המנוטרל באמצעות רצועות pH כדי להיות בטוח שהוא ~ 7.
    הערה: קולגן מנוטרל יכול להישמר על קרח במשך 2-3 שעות ללא ג'לינג; לכן, ייצור הידרוג'ל צריך להתבצע במהירות לאחר נטרול קולגן.

10. ייצור הידרוג'ל

  1. עבודה על קרח, פיפטה למינין (לריכוז סופי של 0.75 מ"ג/מ"ל) ו-1x PBS לתוך בקבוקון זכוכית.
  2. באמצעות קצוות פיפטה סטריליים בעלי שימור נמוך, פיפטה מנטרלת קולגן ותמיסת MAHA לתוך התערובת כדי להגיע לריכוז הרצוי.
  3. מערבבים לאט ובודקים את ה- pH של ההידרוג'ל המתקבל (צריך להיות ~ 7).

11. הטמעת DRG

  1. בצע הטבעה מרובת תאים.
    1. פיפטה 65.1 μL ו- 52.8 μL של הידרוג'ל מעורבב מראש לתוך תאי סומא ונוריט, בהתאמה.
      הערה: פעולה זו מניחה את השימוש במכשירי MC בלוח של 48 בארות. ניתן לשנות אמצעי אחסון אלה בהתאם לגודל התקן ה-MC שבו נעשה שימוש.
    2. הטמיעו בעדינות את ה-DRG החתוכים בתא הסומא (איור 2A), כדי לוודא שהם לא שורטים את תחתית צלחת הבאר. מקמו את ה-DRG באמצע כך שהנוירוטים יוכלו לגדול לתוך התאים הסמוכים דרך המנהרות.
    3. קישור תרמי של ההידרוג'ל באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בזמן שזה קורה, הפעל את מנורת UV כדי להתחמם.
    4. לאחר crosslinking תרמי, UV crosslink הידרוג'ל במשך 90 s.
    5. הוסף את מצע הגידול DRG להידרוג'ל ול- DRG ובצע שינוי מדיה מלא לאחר שעה כדי למנוע עקבות פוטו-יוזם שלא הגיבו או נותרו שנשארים במדיה.
    6. בצע החלפת חצי מדיה כל 3 ימים ועקוב אחר צמיחת DRGs על ידי צפייה מתחת למיקרוסקופ.
    7. לאחר ~4 שבועות, כאשר נוירוטים של DRG מתחילים לגדול (איור 3A), לכדו תמונות באמצעות מצלמת הלוח הפלואורסצנטי וכמתו את אורך תאי העצב באמצעות FIJI (ImageJ).

12. בקרת הטמעת DRG

  1. פיפטה 250 μL של הידרוג'ל בצלחת 48 בארות (ללא MC).
  2. מניחים בעדינות את ה-DRG החתוך במרכז הבאר ובמחצית הדרך למטה לתוך ההידרוג'ל, ומוודאים שהוא לא שורט את תחתית צלחת הבאר.
  3. קישור תרמי של ההידרוג'ל באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. UV crosslink הידרוג'ל במשך 90 s.
  5. הוסף מצע גידול DRG להידרוג'ל ול- DRG ובצע החלפת מדיה מלאה לאחר שעה.
  6. בצע החלפת חצי מדיה כל 3 ימים ועקוב אחר צמיחת DRG על ידי צפייה בו תחת המיקרוסקופ.
  7. לאחר ~4 שבועות, כאשר נוירוטים של DRG מתחילים לגדול (איור 3B), צלמו תמונות באמצעות מצלמת הלוח הפלואורסצנטי.
    הערה: כל מיקרוסקופ שדה בהיר יעבוד עבור הדמיה. מיקרוסקופ אוטומטי מבוסס לוחות הופך את התהליך הזה למהיר יותר. הטמעת בקרה בג'לים רגילים ללא המכשיר נעשית כדי להשוות את הצמיחה של נוירוטים DRG בתאים מרובים. ברגע שהמשתמשים מאמתים ש-DRGs גדלים באופן דומה ב-MC וב-Control Gels, ייתכן שהם לא יצטרכו לחזור על ג'ל הבקרה בכל פעם.

13. הדמיית DRG

  1. צלם תמונות בשדה בהיר בהגדלה של פי 4 באמצעות מצלמת לוח פלואורסצנטי בטווח מרחקי מוקד כדי להציג באופן חזותי את התקן DRG ו- MC כולו.
  2. התאם את הבהירות והניגודיות של התמונה כדי להקל על הצגת העצבים.
  3. שמור את התמונה כקובץ .tiff.

14. כימות נוירוט DRG

  1. הורד והתקן את FIJI (ImageJ).
  2. פתח את ImageJ. פתח את קובץ התמונה וודא שהקובץ מונוכרום.
  3. שפר את הניגודיות כך שהנוירוטים הקטנים ביותר גלויים. בצע פעולה זו על-ידי פתיחת אפשרות הבהירות והניגודיות באמצעות קיצור הדרך Ctrl+Shift+C.
  4. התאם את המחוונים של הבקר לפי הצורך כדי להמחיש את העצבים, ולחץ על החל לקבלת הבהירות והניגודיות הרצויות.
  5. פתח את נותב העצבים על ידי פתיחת תפריט התוספים , בחירת סגמנטציה ולחיצה על Simple Neurite Tracer.
  6. התחל מעקב חדש על ידי לחיצה על קצה אחד של הנוירוט ממש כנגד גוף DRG.
  7. לחץ על נקודה נוספת לאורך הנוריט כדי להוסיף עקבות עד למעקב אחר הנוריט מקצה לקצה. לחץ על סיום נתיב לאחר מעקב אחר הנוריט.
  8. המר את האורך העוקב ליחידות אמיתיות ושמור את התוצאות על-ידי העתקתן והדבקתן ב- Excel.
  9. השתמש בכלי הקו הישר ב- FIJI כדי לצייר קו באותו אורך כמו סרגל קנה המידה (מבלי להרפות מסוף השורה) ולהסתכל על ערך האורך הגלוי מתחת לסרגל הכלים. ערך האורך משמש להמרה.
  10. מדדו את אורכם של שישה תאי עצב ארוכים המשתרעים משני צידי DRG (איור 3C,D) וחשבו את האורך הממוצע של תאי העצב האלה כדי לתת אורך ממוצע מייצג של DRG, כפי שמוצג באיור 4.
    הערה: Immunostaining נבדק על צמחי DRG בג'לים רגילים כדי להראות נוכחות של תאי תמיכה שאינם עצביים7. DRGs קבועים ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) בטמפרטורת החדר, נשטפים שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 15 דקות, ומאוחסנים ב-1x PBS ב-4°C עד להצבעה חיסונית.
  11. עבור עציצים בהתקני MC, הסר את התקן MC ובצע את אותו תהליך המתואר לעיל7.

תוצאות

הפרוטוקול הנוכחי תיאר טכניקה לקציר ותרבית DRG מחולדות בוגרות של Sprague Dawley במכשיר רב-תאי (MC). כפי שניתן לראות באיור 1, DRG שנקצר מחולדות בוגרות נחתך ונחתך ל~0.5 מ"מ. לאחר מכן, ה-DRG החתוך והנחתך הוטמע בהידרוג'ל באזור הסומה של מכשיר MC (איור 2) וגודלו בתרבית במשך 27 יום לפני כימות הנוריט. DRG תורבת בג'ל רגיל כדי לשמש כבקרה. ריכוז פורמולציית ההידרוג'ל ששימשה לניסוי זה היה 4.5/1.25 מ"ג/מ"ל קולגן: MAHA. בימים 27 ו-21 עבור ג'לים רב-תאי וג'לים רגילים, בהתאמה, הייתה צמיחה חזקה של נוירוטים (איור 3). האורך הממוצע של נוירוטים ב-MC (894.22 מיקרומטר ±-308.75 מיקרומטר) היה דומה לאורך נוריט בג'ל רגיל של בקרה (864.26 מיקרומטר ± 362.84 מיקרומטר) (איור 4). זה מדגים את היכולת של מכשיר MC לתמוך בתרבית DRG ובצמיחת נוירוטים. אורכי העצבים כומתו באמצעות תוכנת ImageJ.

figure-results-1
איור 1: תרשים סכמטי המציג את הליך הניסוי. (A) קציר גרעיני שורש דורסלי (DRG) מחולדות בוגרות של Sprague Dawley. (B) גיזום וחיתוך של DRG שנקטף. (C) פורמולציית הידרוג'ל, הטמעת DRG ותרבית בהידרוג'ל בתוך MC המותאמים לצלחת בת 48 בארות. (D) גדילה של נוירוטים DRG לאחר 21-30 יום של תרבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הדפסה מרובת תאים עם שלושה תאים מבודדים, וניתן להשתמש בה בלוח של 48 בארות. (A) תמונה מייצגת המציגה את התצוגה העליונה של התקן MC המודפס מציגה את תאי DRG ו-neurite (קווים אדומים) ואת אזור ההטבעה DRG (ירוק). (B) מבט מהצד על MC. (C) תמונה של MC המותאמת ללוח של 48 בארות. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: גידול עצבים במכשיר רב-תאי (MC), ובקרה של ג'לים רגילים. (A) תמונה מייצגת המציגה צמיחה של נוירוריט עוקב במכשיר רב-תאי (MC) בשדה בהיר. (להלן) נוירוטים שגדלו דרך המנהרות של MC מסומנים בחצים. (B) תמונה של צמיחת נוירוריט בג'לים רגילים של בקרה (ללא MC). (C) תמונה מייצגת המראה מעקב אחר נוירוריטים של שנים-עשר נוירוטים ארוכים בג'ל רגיל בקרה (קווים סגולים). שישה נוירוטים ארוכים משני צידי DRG כומתו כדי לתת את אורך הנוריט הממוצע. התמונות צולמו באמצעות מצלמת לוח פלואורסצנטי בהגדלה של פי 4, ותאי עצב כומתו באמצעות FIJI (ImageJ). פסי קנה מידה = 1000 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: אורך עצב בתא רב-תאי (MC) בהשוואה לזה של ג'ל רגיל (PG). תרשים פיזור המציג אורכי עצבים בודדים עם אמצעים וסטיות תקן המיוצגות על ידי פסי שגיאה. אורך הנוירוט הממוצע ב-MC היה 1204.40 מיקרומטר ±-690.43 מיקרומטר (ממוצע ± SD) בהשוואה ל-864.26 מיקרומטר ±-362.84 מיקרומטר (ממוצע ± SD) בג'ל רגיל, מה שמצביע על MC התומך בצמיחת נוירוטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ קידוד משלים 1: קובץ STL של התקן רב-תאי (MC) שנוצר באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר שיטה לקציר DRG בוגרים של Sprague Dawley ולתרבית אותם בהידרוג'לים טבעיים תלת-ממדיים. בניגוד לשיטה זו, גישות אחרות לקצירת DRG מעכברים וחולדות כוללות בידוד עמוד השדרה. עמוד השדרה הנכרת נחתך בחצי, וחוט השדרה מוסר כדי לחשוף DRGs 23,24,25. נזק לחוט השדרה מגביל את אספקת הדם, מה שמשפיע על DRGs ונוירונים פנימיים26. זה מפחית את הפעילות של DRGs, מה שהופך את הגישות הכירורגיות מתאימות יותר. יתר על כן, מתוארת שיטה להדפסת תלת ממד של מכשיר MC חזק המאפשר תרבות רלוונטית פיזיולוגית של DRGs.

פרוטוקול זה מתווה שיטה לתרבית DRG במבחנה, תוך שימת דגש על חקר רגישות היקפית של נוירונים במודל רלוונטי אנטומית ופיזיולוגית. שיטת תרבית זו יכולה ליצור הפרדה פיזית של נוירוטים דיסטליים וגוף תא DRG בסביבה תלת-ממדית. התקן MC מחקה את הסביבה in vivo מאחר שצמחי DRG עם תאים נשמרים וניתן לגדל אותם בתרבית משותפת עם תאי גליה מקומיים. DRG explant מכיל תאים עצביים שאינם מקומיים, אשר ניתן לתרבית משותפת עם תאים אחרים כדי לחקות תנאים פיזיולוגיים. רלוונטיות פיזיולוגית זו מקדמת מחקרים על האופן שבו תאים שאינם עצביים מווסתים את פעילות הנוירונים ומסייעת בהבנת מנגנונים בסיסיים המעורבים בנוסיספציה. שילוב אינטראקציות לא-עצביות אלה אמור להניב תחזיות מדויקות יותר של תוצאות איתות תאי בהשוואה למודלים פשוטים של תרביות עם DRG מנותקים. נוכחותם של שני תאי עצב ממקסמת את הרלוונטיות הפיזיולוגית מכיוון שתאי DRG בודדים מעצבבים רקמות שונות in vivo. תכנון זה מאפשר טיפול בתא עצבי אחד בעוד השני משמש כבקרה. תאי בקרה וטיפול המחוברים לסומה יחיד יכולים לשמש לחקר השפעות צולבות, המחקים תנאי in vivo שבהם נוירוטים נמשכים מסומה אחת וחווים גירויים שונים כשהם מעצבבים רקמות שונות, מה שמספק תובנה לגבי דיבור צולב בין עצבים. אם מתרחש דיבור צולב בין נוירונים בתאים סמוכים, DRG לא מטופל יכול לשמש כבקרה אמיתית.

מכשיר זה יכול לשמש לבידוד טיפול או לחקר האינטראקציה בין נוירונים לבין DRG בהקשר של כאב. מאחר שניתן לטפל באופן סלקטיבי בנוירוטים דיסטליים בנפרד מ-DRG soma ומ-proximal neurites, מערכת זו יכולה לשמש לטיפולים היקפיים כגון טיפולים ממוקדים במפרקים, שבהם הקצה הסופי של נוירונים חושיים היקפיים מטופל ישירות.

יתרון מרכזי של מכשיר MC הוא ניסויי התפוקה הגבוהה על פני בארות מרובות של אותה צלחת, מכיוון שהתקן MC מתוכנן להתאים לצלחת של 48 בארות. יתרון נוסף של פלטפורמת המבחנה הוא היכולת לשנות את קשיחות ההידרוג'ל בתוך MC על ידי כוונון ריכוזי קולגן ו- MAHA כדי לחקות את התכונות של מיקרו-סביבות רקמה שונות. מגבלה אפשרית אחת של פרוטוקול זה היא שבידוד נוזלי בין תאי הסומה של הנוריט וה-DRG אינו אידיאלי לתרביות מעבר ל-72 שעות ללא שינוי מדיה. מחקר קודם אישר כי בידוד נוזלי נשמר בתאים עד 72 שעות ללא החלפת מדיה11. מחקרים קודמים הראו כי העלאת ריכוז החומצה ההיאלורונית משפרת באופן משמעותי את צפיפות הצלבת הקולגן, ובכך מגבילה את הדיפוזיביות של מקרומולקולות על פני מטריצת הידרוג'ל27. לכן, כדי לשפר את הבידוד הנוזלי עבור תרביות מעבר ל-72 שעות, ניתן להגדיל את ריכוז MAHA, כפי שהודגם במחקר של Caparaso et al.7, שבו עלייה ב-MAHA הביאה לשיפור הבידוד הנוזלי. הטמעת בקרה נעשית כדי להבטיח צמיחה דומה של נוירוטים DRG ב MC וג'ל רגיל. זאת כדי להבטיח של-MC לא תהיה השפעה על צמיחת DRG. לא מומלץ לחזור על הטמעת בקרה בכל ניסוי לאחר אימות צמיחת DRG ב-MC.

המחברים מכירים בכך שתאי DRG אנושיים גדולים יותר, מכילים יותר תאים, ויש להם פרופורציות שונות של תת-סוג נוירונים בהשוואה ל-DRGs28 של חולדות. השימוש במכרסמים הוא מגבלה של מחקר זה מבחינת תרגום למרפאה; עם זאת, מערכת זו יכולה להיות בעלת ערך כפלטפורמת סינון לזיהוי תרכובות המשפיעות על עוררות עצבית. אף על פי שיש הבדלים בהרכב בין DRG של מכרסמים לבין DRGs אנושיים, יש גם חפיפה גבוהה בתוך הפרוטאום בין DRG של חולדה לבין DRG אנושי29. חפיפה זו בפרוטאום - ונוכחותם של אותם תת-סוגים עצביים - מצביעה על כך שניתן להשתמש ב-DRG של החולדה כדי לסנן טיפולים ברמה גבוהה, וניתן לבצע בדיקות נוספות כדי לבחון אם שינויים ב-DRG של החולדה מיתרגמים באופן מכניסטי ל-DRG האנושי.

פלטפורמה זו מאפשרת גירוי פרמקולוגי ממוקד וחקר נוירונים או גופי תאים עם שליטה זמנית. שינויים בעוררות העצבית ובהעברת האותות ניתנים למדידה בקלות על ידי מניפולציה של נוירוטים או DRG. היכולת להעריך עוררות עצבית באמצעות הדמיית סידן בהידרוג'לים רגילים עם DRG explant הודגמה7. שיטות דומות ניתן להשתמש במכשיר MC כדי להעריך את ההתרגשות העצבית.

שיטה זו יכולה לשמש לחקר מצבי כאב שונים שבהם גירוי של נוירונים חושיים ראשוניים היקפיים הוא גורם מניע, כגון כאבי גב תחתון הקשורים לדיסק. בדיקת רגישות יתר של nociceptor יכולה להיות כלי מבטיח לגילוי תרופות חדשניות להפחתת רגישות יתר. להפחתת רגישות יתר יש פוטנציאל לתרגם קלינית להפחתת כאב. פלטפורמה זו יכולה לסנן תרופות בעלות תפוקה גבוהה כדי לזהות את המועמדים היעילים ביותר לאימות in vivo באמצעות מבחני התנהגות דמויי כאב.

גילויים

מחברי המחקר מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF (2152065) ופרס הקריירה של NSF (1846857). המחברים רוצים להודות לכל חברי מעבדת Wachs בהווה ובעבר על תרומתם לפרוטוקול זה. דיאגרמות באיור 1 נוצרו ב-Biorender.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#5 מלקחייםFine Science Tools11252-00לחיתוך וחיתוך DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (חיטוי)מוכן במעבדה7.3 - 7.5 pH
24 לוחות בארVWR82050-892לאחסון זמני של DRGs שנקטפו וחתוכים DRGs
3 מ"ל סטרילי, לשימוש חדפעמי BD309657
48 צלחותבאר גריינר ביו-וואן677180
60 מ"מ צלחת פטריפישר סיינטיפיקFB0875713Aלהחזיק מדיה לחיתוך וחיתוך
רדיד אלומיניוםפישרברנד01-213-104
B27 פלוס 50xThermoFisher17504044למדיה DRG
קולגן מסוג IIbidi50205
מעוקל פרידמן פירסון רונגורכלי מדע עדינים16221-14לדיסקציה
Dumont #3 מלקחייםFine Science Tools11293-00לדיסקציה
סרום בקר עוברי (FBS)ThermoFisher16000044למדיה DRG
FormCure Shape LabsForm
WashForm Labs Form Labsכדי לשטוף שרפים עודפים מ-MC
מעקר חרוזי זכוכיתFisher ScientificNC9531961
בקבוקוני זכוכית (8 מ"ל)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061עבור מדיה DRG
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
שרף V2 בטמפרטורה גבוההFormLabsFLHTAM02
מלח נתרן חומצה היאלורוניתMilliporeSigma53747משמש לייצור MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR& D Systems344600501
מספריים גדולים עם אף קההMilitexEG5-26לדיסקציה
מלקחיים גדולים (קצות משוננים)Militex9538797לדיסקציה
מספריים גדולים עם אף חדFine Science Tools14010-15לדיסקציה
קצות פיפטה עם שמירה נמוכהפישר סיינטיפיק02-707-017לפיפטינג קולגן ו
חומצה היאלורונית מתאקרילציה (MAHA)מוכן במעבדהN/A85 - 115% מתאקרילציה
גורם גדילה עצבי (NGF)R& D Systems556-NG-100למדיה DRG
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022למדיה DRG
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106של מדיה DRG
VWR InternationalBDH35309.606
קצות פיפטות (1000 ומיקרו; L)ארה"ב מדעית1111-2021
Preform 3.23.1 תוכנהFormslabלהעלאת קובץ STL
עכברושצ'ארלס ריבר
שרף מדפסת תלת מימדForm LabsForm 3Lהדפסת תלת מימד מכשיר MC מספריים
קטנים עם אף חדFine Science Tools14094-11לדיסקציה
נתרן ביקרבונטMilliporeSigmaS6014
ישרה כלימדע עדינים16004-16לדיסקציה
מספריים קפיציים בקצה ישרכלי מדע עדינים15024-10לדיסקציה
להב שכמה כירורגי (מס' 10)פישר סיינטיפיק22-079-690
מסנני מזרק, PES (0.22 ומיקרו; m)Celltreat229747
מספריים קפיצים זעיריםמכשירי דיוק בעולם14003לחיתוך וחיתוך DRG
מנורת UVAnalytik Jena ארה"בלהידרוג'ל פוטו-קרוסלינק (15 - 18 mW / cm2)
לרצועות בדיקת pH

מקורות

  1. Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015. Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).
  2. Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. Pain as a global public health priority. BMC Public Health. 11 (1), 770(2011).
  3. Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
  4. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  5. Im, H. J., et al. Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model. Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).
  6. Jensen, T. S., Finnerup, N. B. Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms. Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).
  7. Berge, O. G. Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain. Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).
  8. Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. Use of a capillary alginate gel (capgel™) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium. J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).
  9. Mohammed Izham, N. A., et al. Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies. Neurosci Res Notes. 5, 144(2022).
  10. Park, S. E., et al. A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system. NPG Asia Mater. 13 (1), 2(2021).
  11. Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).
  12. Krug, A. K., et al. Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants. Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).
  13. F, M., et al. Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture. J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).
  14. Spearman, B. S., et al. Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).
  15. Zhu, W., Oxford, G. S. Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor. Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).
  16. Van De Wijdeven, R., et al. Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip. Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).
  17. Chan, J. R., et al. NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes. Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).
  18. Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination. J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).
  19. Xiao, J., et al. BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons. J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).
  20. Seidlits, S. K., et al. The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation. Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).
  21. Tomal, W., Ortyl, J. Water-soluble photoinitiators in biomedical applications. Polymers. 12 (5), 1073(2020).
  22. Leary, S., et al. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. Veterinary Medical Association. , Schaumburg, Illinois. (2013).
  23. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Res Notes. 9 (1), 82(2016).
  24. Naveed, M., et al. Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition. Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212(2023).
  25. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
  26. Bai, X., et al. A high-resolution anatomical rat atlas. J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).
  27. Bian, L., et al. The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy. Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).
  28. Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. Human dorsal root ganglia. Front Cell Neurosci. 13, 271(2019).
  29. Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome. Scientific Rep. 8 (1), 13469(2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DRGImageJ
קציר, הטבעה וטיפוח של גרעיני שורש גבי בהתקנים מרובי תאים לחקר תכונות עצביות היקפיות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.