מאמר שיטה

טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66856

⸱

7 ביוני 2024

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

עבודה זו מסבירה כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות שיטה ביוליסטית. אנו גם מראים כיצד לבחור ולטהר את הטרנספורמנטים וכיצד להציג את המוטציה הרצויה במיקום המטרה בתוך הגנום המיטוכונדריאלי.

תקציר

שמרי אפייה Saccharomyces cerevisiae נמצאים בשימוש נרחב להבנת הביולוגיה של המיטוכונדריה מזה עשרות שנים. מודל זה סיפק ידע על מסלולים מיטוכונדריאליים חיוניים ושמורים בקרב איקריוטים, ומסלולים ספציפיים לפטריות או שמרים. אחת היכולות הרבות של S. cerevisiae היא היכולת לתמרן את הגנום המיטוכונדריאלי, אשר עד כה אפשרי רק ב - S. cerevisiae ובאצות החד-תאיות Chlamydomonas reinhardtii. השינוי הביולוגי של מיטוכונדריית שמרים מאפשר לנו להציג מוטציות מכוונות אתר, לבצע סידורים מחדש של גנים ולהציג כתבים. גישות אלה משמשות בעיקר להבנת המנגנונים של שני תהליכים מתואמים מאוד במיטוכונדריה: תרגום על ידי מיטוריבוזומים והרכבה של קומפלקסים נשימתיים וסינתאז ATP. עם זאת, טרנספורמציה מיטוכונדריאלית יכולה לשמש באופן פוטנציאלי לחקר מסלולים אחרים. בעבודה הנוכחית אנו מראים כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה, לבחור ולטהר את הטרנספורמציה המיועדת, ולהציג את המוטציה הרצויה בגנום המיטוכונדריאלי.

מבוא

שמרי Saccharomyces cerevisiae הם מודל מוכר המשמש לחקר ביוגנזה מיטוכונדריאלית. מכיוון ששמרים הם אורגניזם אנאירובי, פקולטטיבי, ניתן ללמוד בהרחבה את הסיבות וההשלכות של החדרת מוטציות הפוגעות בנשימה. בנוסף, אורגניזם זה בעל כלים גנטיים וביוכימיים ידידותיים לחקר מסלולים מיטוכונדריאליים. עם זאת, אחד המשאבים החזקים ביותר לחקור את מנגנוני הרכבת קומפלקס הנשימה וסינתזה של חלבון מיטוכונדריאלי הוא היכולת לשנות מיטוכונדריה ולשנות את הגנום של אברונים. בעבר, היה מועיל להכניס לדנ"א המיטוכונדריאלי (mtDNA) מוטציות נקודתיות או מחיקות/החדרות קטנות 1,2,3,4,5, למחוק גנים 6,7, לבצע סידורים מחדש של גנים 7,8, להוסיף אפיטופים לחלבונים מיטוכונדריאליים 9,10, להעביר גנים מהגרעין למיטוכונדריה11,12, ולהציג גנים כתבים כמו BarStar13, GFP14,15, luciferase16, ואת ARG8m17,18 הנפוץ ביותר. שינויים בגנום המיטוכונדריאלי אפשרו לנו לנתח ולזהות מנגנונים שאחרת היו קשים להבנה. לדוגמה, הגן ARG8m reporter שהוחדר למוקד COX1 בדנ"א המיטוכונדריאלי היה חיוני להבנה של-Mss51 יש תפקיד כפול בביוגנזה של Cox1. ראשית, הוא מפעיל תרגום של ה-mRNA COX1, ושנית, הוא מלווה הרכבהשל חלבון Cox1 החדש 7,19. עבודה זו מציגה שיטה מפורטת לשינוי מיטוכונדריה של S. cerevisiae. למרות שפרוטוקול השינוי המיטוכונדריאלי פורסם מוקדם יותר 16,20,21,22,23, גישה חזותית באמצעות וידאו חיונית כדי להבין ביסודיות את השלבים והפרטים השונים של השיטה. השיטה מורכבת משלבים שונים ומחולקת לארבעה שלבים כלליים:

דיאגרמת תהליך עריכת גנים; חלקיקי טונגסטן, ציפוי DNA, שלבי שילוב גנום מיטוכונדריאלי.
איור 1: סקירה כללית של תהליך הטרנספורמציה של המיטוכונדריה על-ידי הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה: 1) חלקיקי הטונגסטן מעוקרים ומוכנים לפני ציפוי הדנ"א. 2) שני פלסמידים שונים מואצים על פני השטח של WPs. האחד הוא פלסמיד חיידקי המכיל את המבנה שיופנה למטריצה המיטוכונדריאלית. השני הוא וקטור ביטוי שמרים גרעיניים הנושא סמן אוקסוטרופיה. 3) זן שמרים קולטני חסר DNA מיטוכונדריאלי (rho0) גדל על מקור פחמן מותסס כמו גלקטוז או רפינוז, אשר אינו מפעיל כל דיכוי גלוקוז של ביטוי גנים מיטוכונדריאליים34,35. התרבות מתפשטת על צלחות פטרי המכילות את אמצעי ההפצצה. 4) WPs המצופים בפלסמידים נורים לזן הקולטן על ידי הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה. 5) מושבות רו סינתטיות חיוביות המכילות את הפלסמיד המיטוכונדריאלי נבחרות על ידי הזדווגות לזן בודק. 6) המבנה המיטוכונדריאלי משולב בגנום המיטוכונדריאלי במקום הרצוי על ידי זיווג זן הרו הסינתטי (תורם) עם הזן המקבל בתהליך המכונה ציטודוקציה. 7) הקולטן החיובי, הזן הפלואידי הנושא את המבנה המיטוכונדריאלי נבחר ומטוהר במדיות שונות. קיצורים: WPs = חלקיקי טונגסטן; mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טרנספורמציה של תאים עם מבנה דנ"א שנועד להשתלב בגנום המיטוכונדריאלי (איור 1, שלבים 1-4)
למרות שניתן לשנות ישירות שמרים המכילים גנום מיטוכונדריאלי שלם (rho+), השינוי יעיל פי 10-20 אם התאים חסרים DNA מיטוכונדריאלי (rho0)24. חלקיקי טונגסטן (WPs) מצופים בשני פלסמידים שונים שיומרו במשותף. הראשון הוא וקטור ביטוי שמרים 2 μ הנושא סמן אוקסוטרופי, כגון LEU2 או URA3 (למשל, YEp351 או YEp352, בהתאמה). אם ההחדרה הביוליסטית של דנ"א לתאי השמרים מוצלחת, הטרנספורמנטים יגדלו על מדיום האוקסוטרופיה (כלומר, מדיום חסר לאוצין או אורציל). פלסמיד זה מועיל בביצוע הבחירה הראשונה של התאים שרכשו את הפלסמיד הגרעיני; אחרת, מספר המושבות שייווצרו ירווה את הצלחת. הפלסמיד השני הוא פלסמיד חיידקי (כגון pBluescript או דומה) המכיל את המבנה המיטוכונדריאלי המיועד להשתלב בגנום המיטוכונדריאלי. המבנה חייב להכיל לפחות 100 nt של רצפים מיטוכונדריאליים של 5' ו-3' עבור רקומבינציה עם האזור המיטוכונדריאלי המעניין. מניסיוננו, רצפי איגוף גדולים יותר נוטים יותר להשתלב מחדש בהצלחה עם מוקד המטרה בגנום המיטוכונדריאלי.

דוגמה ספציפית מוצגת באיור 225. בדוגמה זו, המטרה הייתה למחוק את האזור של הגן COX1 במיטוכונדריה המקודד עבור 15 חומצות האמינו האחרונות של החלבון המתאים (Cox1ΔC15) (איור 2A). הפלסמיד החיידקי הנושא את המוטציה COX1ΔC15 הכיל 395 nt ו-990 nt מהאזורים הלא מתורגמים 5' ו-3' של הגן, בהתאמה. הפלסמיד נגזר מ-pBluescript (pXPM61), ויחד עם 2 μ פלסמיד YEp352, הם קואצו על פני השטח של WPs (איור 2B). לאחר מכן הוכנסו ה-WPs באמצעות הפצצת מיקרו-קליעים לתוך הזן המקבל שנבחר (איור 2C). זן זה, הנקרא NAB6926, הוא זן MATa, rho0 הנושא את האללים kar1-1 ו - ade2 (חשיבותם של מאפיינים אלה תידון להלן). התאים היו מצופים על אמצעי הפצצה חסרי אורציל כדי לבחור את אלה שרכשו את 2 μ פלסמיד (איור 2C). תאים גודלו במשך 5-7 לילות ב 30 מעלות צלזיוס.

בחירת התאים שרכשו את פלסמיד החיידקים המכיל את המבנה המיטוכונדריאלי ואת פלסמיד הגרעין 2 μ הנושא את סמן האוקסוטרופיה (איור 1, שלב 5)
המושבות החיוביות ישמרו עותקים רבים של פלסמיד החיידקים במיטוכונדריה22 שלהן. מאחר שהתאים שעברו טרנספורמציה הם במקור rho0, אין רצפים מיטוכונדריאליים התומכים בתרגום המבנה המיטוכונדריאלי הקיים בפלסמיד; לפיכך, הגן המיטוכונדריאלי שעבר טרנספורמציה לא יבוא לידי ביטוי. יש צורך להזדווג עם טרנספורמטים עם זן בודק כדי לזהות את מושבות השמרים שרכשו את פלסמיד המיטוכונדריה. הגנום המיטוכונדריאלי של זן הבודק מכיל גרסה מוטנטית לא מתפקדת של הגן המעניין. לאחר ההזדווגות, המיטוכונדריה יתמזגו, והרצף המיטוכונדריאלי הכלול בפלסמיד שעבר טרנספורמציה יתמזג מחדש עם הגן המיטוכונדריאלי שעבר מוטציה מזן הבודק; כתוצאה מכך, ההתאוששות של הגן WT תחזור לתפקד. הדיפלואיד המתקבל יהיה בעל פנוטיפ חיובי הניתן לזיהוי (בדרך כלל היכולת לגדול בתווך נשימתי או בתווך חסר ארגינין). התאים החיוביים הנושאים את פלסמיד החיידקים במיטוכונדריה נקראים "תאי רו סינתטיים". בדוגמה הספציפית של איור 2D, תאי רו סינתטיים שנשאו את מבנה COX1ΔC15 (שנקרא XPM199) צופו מחדש על תווך חסר אורציל (זהו לוח האב שממנו טוהרו מושבות חיוביות). הם גם צופו בהעתק על מדשאה מזן בודק L4527, המכיל את המוטציה הלא פונקציונלית cox1D369N. לאחר הזדווגות של שני לילות, הגנום המיטוכונדריאלי של L45 ו-XPM199 התאחד מחדש, והתוצאה הייתה גן COX1 פונקציונלי; לכן, הדיפלואידים השיבו לעצמם את היכולת לגדול על אמצעי הנשימה. מצלחת המאסטר בחרנו את המושבות החיוביות. הם היו מפוספסים על לוחות חסרי אורציל, והבדיקות הסלקטיביות חזרו על עצמן כדי לקבל תאי רו סינתטיים טהורים (איור 2E). חשוב לציין כי לוחית הבדיקה מיועדת רק לזיהוי מושבות רו סינתטיות, ולא ניתן לשחזר מוטנטים מלוחות אלה.

שילוב המבנה בגנום המיטוכונדריאלי של הזן המיועד
שלב זה מושג על-ידי תהליך שנקרא ציטודוקציה28,29 (איור 1, שלב 6). בגישה זו, זן הרו הסינתטי (זן תורם) מזווג לזן המקבל המיועד מסוג ההזדווגות הנגדי. דרישה חיונית היא שלפחות אחד משני זני ההזדווגות יישא את מוטציית kar1-1 כדי לעכב היתוך גרעיני30. לפיכך, הזדווגות של שני התאים מייצרת זיגוטה דו-עינית (איור 3). הרשת המיטוכונדריאלית מתאי ההורים (תורם ומקבל) מתמזגת ומולקולות הדנ"א המיטוכונדריאלי משתלבות מחדש. הזיגוטה הדו-עינית מודגרת/משוחזרת כדי לאפשר ניצנים, אשר ייצרו תאים הפלואידים. הפלואידים האלה נושאים את הרקע הגרעיני של אחד מתאי ההורים. באופן דומה, הפלואידים יכולים לשאת את הדנ"א המיטוכונדריאלי מתא ההורים או מהדנ"א המיטוכונדריאלי המשולב מחדש. עם זאת, מוטציית kar1-1 אינה יעילה ב-100%, וכמה דיפלואידים אמיתיים ייווצרו במהלך ההזדווגות28,29. זן הרו הסינתטי (תורם, XPM199) נשא את האלל kar1-1 בדוגמה. כסמן סלקטיבי, היה לו אלל ade2, מה שהופך אותו לאוקסוטרופ עבור אדנין (איור 4). הזן המקבל היה XPM10, זן rho+ הנושא את המבנה cox1Δ::ARG8m, שבו הכתב ARG8m החליף את קודוני COX1 בגנום המיטוכונדריאלי7. התערובת של שתי תרביות התאים נוספה לצלחת YPD כטיפה כדי לאפשר הזדווגות. לאחר 3-5 שעות, התאים נצפו תחת מיקרוסקופ אור כדי לזהות היווצרות של שמוס (איור 3B), צורת תא שקשורה להזדווגות. לאחר זמן הדגירה/התאוששות, הזיגוטה הדו-גרעינית צופתה על תווך חסר אדנין כדי למנוע את צמיחת תאי התורם.

בחירת הזן הפלואידי הנושא את הגנום המיטוכונדריאלי המעניין (איור 1, שלב 7)
תערובת של תאים תורמים, מקבלים ודיפלואידים קיימת לאחר ציטודוקציה. לכן, לאחר הדגירה/התאוששות של הזיגוטה הדו-מינית, יש לגדל תאים במדיות סלקטיביות שונות כדי לזהות ולטהר את הפלואידים המעניינים. המדיה הסלקטיבית תלויה בגנוטיפים של התורם, בזנים המקבלים ובמבנה המיטוכונדריאלי המיועד. עם זאת, באופן כללי, הנימוקים לבחירת המדיה הסלקטיבית הם: i) לאחר הדגירה/התאוששות, תערובת הציטודוקציה גדלה על מדיום סלקטיבי שבו הזן ההורי התורם אינו יכול לגדול. בדוגמה הספציפית באיור 4A,B, התורם (זן רו סינתטי) נושא את אלל ade2 הלא פונקציונלי. לכן, תערובת cytoduction חייב להיות מודגר על צלחת בינונית חסר אדנין. זוהי צלחת המאסטר. ב) ברגע שהמושבות גדלות, צלחת המאסטר משוכפלת שוב על מדיום חסר אדנין (כדי ליצור צלחת מאסטר חדשה שממנה יטוהרו המושבות החיוביות המעניינות), ולאחר מכן, על מדיום שבו רק דיפלואידים יכולים לצמוח. זה הכרחי כדי למנוע טיהור נוסף בשוגג של מושבות דיפלואידיות. במקרה של הדוגמה מאיור 4C, רק דיפלואידים יכולים לגדול על מדיה חסרת לאוצין. iii) צלחת האב משוכפלת גם על מדיה שבה רק אותם הפלואידים המקבלים ששילבו את הדנ"א המיטוכונדריאלי של עניין יגדלו. בדוגמה של איור 4C, הפלואידים גדלים על מצע נשימתי המכיל אתנול/גליצרול כמקור פחמן, מאחר שהחלבון Cox1ΔC15 הוא פונקציונלי. זן rho+ שנוצר הנושא את mtDNA של עניין נקרא XPM20925. הזנים שבהם נעשה שימוש באיור 2 ובאיור 4 מפורטים בטבלה 1.

תהליך עריכת גנים של שמרים, תרשים עם mtDNA ו-COX1ΔC15, פלסמיד URA3, זן rho⁻ סינתטי.
איור 2: דיאגרמה המתארת דוגמה ספציפית של טרנספורמציה מיטוכונדריאלית ובחירה של תאי רו חיוביים. (A) השינוי המיועד של הגנום המיטוכונדריאלי היה מחיקה של האזור המקודד עבור 15 חומצות האמינו האחרונות של תת-היחידה Cox1 (Cox1ΔC15). (B) WPs צופו בשני פלסמידים כדי להפוך תאי שמרים. אחד מהם היה 2 μ פלסמיד Yep352 שכוון ובא לידי ביטוי בגרעין. השני היה פלסמיד pXPM61, המכיל את אלל COX1ΔC15 בתוספת 395 nt ו-990 nt של COX1 5' ו-3'-UTRs, בהתאמה. (C) WPs הוכנסו לתאים מהזן NAB69, אשר חסר DNA מיטוכונדריאלי (זן rho0). מושבות טרנספורמנטיות שהתקבלו מלוחות ההפצצה שוכפלו על תווך חסר אורציל, הסמן האוקסוטרופי של הפלסמיד הגרעיני YEp352. (D) כדי לבחור את מושבות הרו החיוביות, לוחית ה-URA שוכפלה על מדיה חסרת אורציל. זו הייתה צלחת המאסטר שממנה נקטפו ובודדו המושבות החיוביות. הוא שוכפל גם על לוחות עם מדיה עשירה (YPD) ומדשאה של זן טסטר. במהלך ההזדווגות, הדנ"א הרו-מיטוכונדריאלי הסינתטי שולב מחדש עם הדנ"א המיטוכונדריאלי מזן הבודק, L4527, הנושא מוטציה בגן COX1 (D369N). הדיפלואידים שגדלו על מצע הנשימה הכילו את הדנ"א שעבר טרנספורמציה. המושבות המקבילות נקטפו מצלחת המאסטר כדי לנוח ולטהר. כדי לסייע בזיהוי המושבות החיוביות בלוח האב לאורך כל ציפוי העתק, נעשו סימנים בטוש קבוע בשולי הלוחות (קווים ירוקים). (E) המושבות החיוביות שנבחרו הוחזרו על מדיום חסר אורציל. זו הייתה צלחת המאסטר החדשה. כמו ב-D, נערכו שני סבבי בדיקות נוספים לטיהור מושבות הרו הסינתטיות. קיצורים: WPs = חלקיקי טונגסטן; mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי; -URA/Sorb = חסר אורציל/ המכיל סורביטול; WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תהליך היתוך תאי שמרים; תרשים ותמונת מיקרוסקופ; העברת RHO+; שלבי הזדווגות; ביולוגיה תאית.
איור 3: דיאגרמה המתארת את הליך הציטודוקציה. (A) סקירה כללית של האופן שבו תאים מזדווגים במהלך ציטודוקציה. במהלך הציטודוקציה, המיטוכונדריה מהזנים התורם והמקבל מתמזגים כך שהדנ"א המיטוכונדריאלי משני הזנים משתלב מחדש. מאז היתוך גרעיני מופחת עקב מוטציה kar1-1 30, זיגוטות דו גרעיניות נוצרים. לאחר זמן דגירה/התאוששות מסוים, נבחרים ניצני הזיגוטה הדו-גרעיניים וקולטי הפלואידים המכילים את המוטציה המיטוכונדריאלית המיועדת. (B) הזדווגות של זן הרו הסינתטי (תורם) והזן המקבל באמצעות ציטודוקציה מאפשרת היווצרות של שמואים (חיצים אדומים), צורה אופיינית של שמרי הזדווגות. התמונה צולמה תחת מיקרוסקופ אור עם מטרה של 100x. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת הצלבה גנטית של שמרים המציגה את התורם XPM199 ואת המקבל XPM10, המדגישה ציפוי מאסטר ADE ותהליך גידול רקומביננטי לשילוב DNA.
איור 4: דיאגרמה המתארת דוגמה ספציפית של ציטודוקציה כדי לשלב את המוטציה COX1ΔC15 בגנום המיטוכונדריאלי. (A) תרביות נוזליות של זן הרו הסינתטי (תורם, XPM199) והזן המעניין (מקבל, XPM10) עורבבו כדי להזדווג. לאחר היווצרות שמו, התערובת נמצאה בתרבית נוזלית במשך 2-4 שעות. לאחר מכן, תערובת הציטודוקציה נמרחה על צלחת עם מדיום חסר אדנין כדי למנוע את צמיחת התאים התורמים. (B) ייצוג סכמטי של אירועי הרקומבינציה של הדנ"א המיטוכונדריאלי מהתורם (XPM199) ומהמקבל (XPM10) במהלך הציטודוקציה. (C) לוחית האב שוכפלה במדיה סלקטיבית שונה כדי לזהות ולטהר את אותם הפלואידים ששילבו את הגן המיטוכונדריאלי המיועד בדנ"א של האברון (XPM209)25. קיצורים: -ADE = חסר אדנין; -LEU = חסר לאוצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול

הערה: אנו ממליצים לבצע שש טרנספורמציות עבור כל מבנה מכיוון שיעילות הטרנספורמציה המיטוכונדריאלית היא בדרך כלל נמוכה. הרכב מצעי הגידול השונים מוצג בטבלה 2.

1. הכנת חלקיקי טונגסטן

  1. שקלו 30 מ"ג של חלקיקי טונגסטן 0.7 מיקרומטר (WPs, מיקרו-נשאים) במיקרו-צינור. הוסף 1.5 מ"ל של אתנול 70% (EtOH) לעיקור. מערבלים את WPs ולתת להם לנוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. צנטריפוגה ב 13,200 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את ה-WPs על ידי הוספת 1.5 מ"ל מים סטריליים לחלקיקים, ערבול שלהם וצנטריפוגה ב-13,200 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.
  3. הוסף 500 μL של גליצרול סטרילי 50% (הריכוז הסופי הוא 60 מיקרוגרם של WPs/μL).
    הערה: ניתן לאחסן WPs בטמפרטורה של -20°C למשך 6 חודשים לפחות. ממלאי זה, קח את הסכום הנדרש עבור שש טרנספורמציות (100 μL).

2. ציפוי DNA WPs

  1. הוסף 5 מיקרוגרם של 2 μ פלסמיד ו 15 מיקרוגרם של פלסמיד חיידקי המכיל את הרצף המיטוכונדריאלי למיקרו-צינור על קרח.
    הערה: הנפח הסופי לא יעלה על 50 μL כדי למנוע דילול נוסף של הריאגנטים הדרושים לציפוי DNA.
  2. הוסף 100 μL של תרחיף WP מערבולת עבור 5 s (6 מ"ג של WPs).
  3. הוסף 4 μL של 1 M זרע. מערבולת קצרה.
  4. הוסף 100 μL של 2.5 M CaCl2 קר כקרח, לזמן קצר מערבולת. לדגור על קרח במשך 10 דקות; מערבבים בקצרה את התערובת כל 3 דקות.
    הערה: פתרון CaCl2 מעוקר בסינון ואין לבצע בו אוטוקלאב.
  5. צנטריפוגו את ה-WPs למשך 30 שניות ב-13,200 × גרם ב-4°C והשליכו את הסופר-נטנט. שטפו את החלקיקים על ידי השעייתם מחדש בעדינות ב-200 מיקרוליטר של 100% EtOH ב-20°C-.
  6. צנטריפוגו את ה-WPs למשך 30 שניות ב-13,200 × גרם ב-4°C והשליכו את הסופר-נטנט. חזרו על הכביסה.
  7. להשעות מחדש את WPs ב 60-70 μL של טמפרטורת החדר 100% EtOH באמצעות קצה פיפטה; אין מערבולת.
    הערה: כדי להבטיח את איכות הפלסמידים, יש לבצע ציפוי DNA באותו יום של טרנספורמציה ביוליסטית.

3. הכנת חומר ביוליסטי

  1. לפני ההפצצה, יש לעקר שישה מחזיקי מקרו-נשאים (איור 5) באוטוקלאבה ולייבש אותם היטב. לחלופין, השרו אותם ב-EtOH ועיקרו אותם באמצעות להבה בעזרת מלקחיים. הניחו אותם על צלחת זכוכית סטרילית.
  2. במהלך משקעים בדנ"א (דגירה של 10 דקות על קרח בשלב 2.4), הכניסו שישה נשאי מאקרו (או דיסקים מעופפים) לכל אחד מששת מחזיקי המקרו-נשאים בעזרת מלקחיים סטריליים.
    הערה: אין לעקר את המקרו-נשאים.
  3. ערבבו את WPs מצופים DNA עם פיפטה. הוסף 10 μL של WPs לכל משטח מאקרו-נשא ופזר על פני כל המשטח עם קצה הפיפטה. במידת הצורך, הוסף כמה מיקרוליטרים נוספים של 100% EtOH למשטח המקרו-נשא כדי לבצע התפשטות אחידה של WPs. תן לתרחיף להתייבש בטמפרטורת החדר במשך ~ 20 דקות.

4. הכנת תאי שמרים וצלחות הפצצה

  1. חסן את זן קולטן rho0 על 2 מ"ל של תווך YPR (טבלה 2). גדל ללילה אחד ב 30 ° C בגלגל מסתובב.
  2. לדלל 300 μL של התרבית ב 30 מ"ל של מדיום YPR טרי. גדל ב 30 ° C ו 200 סל"ד על שייקר סיבובי במשך שני לילות עד התרבות רוויה.
  3. צנטריפוגה את תאי השמרים ב 600 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את תאי השמרים ב-600 מיקרוליטר של מדיום YPD (טבלה 2).
  4. בעזרת ידית זכוכית סטרילית, מורחים 100 μL של מתלה תאי השמרים על צלחת בינונית להפצצה מוצקה.
    הערה: אמצעי ההפצצה חייב להיות חסר את סמן הבחירה של פלסמיד 2 μ שישמש לטרנספורמציה.
  5. חזור על שלב 4.4 עבור חמשת הלוחות האחרים.
  6. יש לדגור במשך 1-3 שעות בטמפרטורת החדר לפני ההפצצה כדי להבטיח שהמדיום הנוזלי נספג לחלוטין על פני הצלחת.

5. יצירת זן רו סינתטי על ידי טרנספורמציה ביוליסטית

הערה: לפני שתתחיל, הקפד לקרוא את המדריך למשתמש עבור הציוד הביוליסטי . נתאר את פרוטוקול הציוד הנזכר (טבלת חומרים ואיור 5).

  1. נקה את התא של מערכת העברת חלקיקים ביולוגיים עם אתנול 70% כדי למנוע זיהום ולתת לו לעמוד לפחות 10 דקות. רגע לפני ההפצצה, נגבו את המשטח במגבת נייר נקייה.
  2. פתח את שסתומי מיכל ההליום כדי להגדיר סביב 2,000 psi.
  3. הפעל את הציוד והפעל את מקור הוואקום.
  4. באמצעות מלקחיים, הניחו את המקרו-נשא כשפניו כלפי מטה על מחזיק המקרו-נשא.
    הערה: אין להשתמש במסך העצירה שמגיע עם הציוד.
  5. הברג את מכסה המקרו-מוביל על גבי המקרו-מוביל. כל החלקים יחד מרכיבים את מערכת השיגור של המיקרו-נשאים (איור 5).
  6. מקם את מערכת שיגור המיקרו-נשא בתוך תא הוואקום ברמה החמישית מלמטה.
  7. הניחו את אחת הצלחות המכילות את מדשאה זן rho0 במפלס השני מתחתית החדר. ודא שהצלחת פונה כלפי מעלה ונמצאת ללא מכסה.
  8. באמצעות מלקחיים סטריליים, לשים דיסק קרע אחד על מכסה התומך. בורג את מכסה התמך על צינור התאוצה; ודא שמכסה התמך צמוד.
    הערה: אין לטפל בדיסקים שנקרעו עם איזופרופנול כפי שהוצע במדריך מכיוון שראינו כי יעילות הטרנספורמציה יורדת.
  9. סגור את דלת תא הוואקום.
  10. העבר את מתג ה-VAC/VENT/HOLD למצב VAC . כאשר מגיעים לשואב אבק של 25-28 אינץ' כספית , יש להחליף את מתג VAC/VENT/HOLD למצב HOLD .
    הערה: שימו לב כי ואקום בר השגה יכול להשתנות בהתאם לגובה פני הים. מצאנו הצלחה להגיע 25 inHg.
  11. לחץ על מתג FIRE כדי לצלם את WPs. המתן עד שהלחץ ייבנה בצינור התאוצה עד שיגיע ל- 1,300 psi כאשר דיסק הקרע יישבר וישמיע צליל פופ.
  12. מיד לאחר שדיסק הקרע נשבר, מתג ה-FIRE והוואקום משתחררים על-ידי שינוי מתג ה-VAC/VENT/HOLD למצב VENT .
  13. בזהירות, עם מלקחיים סטריליים, להסיר כל פסולת של דיסק קרע נוכח על פני השטח של הצלחת ולכסות את הצלחת עם המכסה שלה.
  14. חזור על ההליך עבור חמשת הלוחות הנותרים, והצבת דיסק קרע חדש ומוביל מאקרו בכל סיבוב.
  15. בסוף, סגור את השסתום הראשי של מיכל הליום.
  16. סגור את התא ובנה ואקום על-ידי העברת מתג VAC/VENT/HOLD למצב VAC . שחרר את המערכת מכל לחץ הליום על ידי לחיצה ושחרור של מתג FIRE מספר פעמים. חזור על הפעולה כשהדלת פתוחה.
  17. כבו את משאבת הוואקום ואת ציוד ההפצצה.
  18. נקו את מערכת המשלוחים עם 70% EtOH. לשטוף את תומך macrocarrier עם פתרון SDS 0.1%; יש לשטוף במים מזוקקים סטריליים ו-100% EtOH.

6. בחירת מושבת רו סינתטית

  1. לדגור על לוחות ההפצצה במשך 5-7 לילות ב 30 ° C.
    הערה: חשוב לבדוק את הצלחות מדי יום לזיהום. במידת הצורך, ניתן לחתוך את האזור המזוהם עם מרית סטרילית כדי למנוע זיהום נוסף.
  2. חסנו את זן הבודק מסוג ההזדווגות הנגדי ב-2 מ"ל של YPD בינוני למשך הלילה (ראו את הדוגמה הספציפית באיור 2D,E).
  3. יש לחסן 150 מיקרוליטר של תרבית הזן הבודק על צלחת YPD. בעזרת ידית זכוכית סטרילית, פזרו את הטסטר באופן שווה על משטח הצלחת. תנו לצלחת להתייבש לפחות 5 דקות.
  4. צור העתקים של לוחות ההפצצה באמצעות רפידות משכפלות קטיפה וחותמת משכפל.
    1. משוכפל על צלחת בינונית נשירה המתאימה לסמן אוקסוטרופיה פלסמיד 2 μ שעבר טרנספורמציה. הצמיחה לוקחת דגירה אחת של לילה ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף. צלחת זו היא צלחת המאסטר.
    2. משוכפל על צלחת YPD המכילה את הדשא של הבודק משלב 6.3. יש לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שני לילות. לאחר מכן, לשכפל צלחת זו על המדיום הסלקטיבי כדי לזהות את נוכחותו של הגן המיטוכונדריאלי של עניין, למשל, מדיום נשימה או מדיום חסר ארגינין, לדגור לילה ב 30 מעלות צלזיוס. רק התאים שהכילו את פלסמיד החיידקים הסינתטיים במיטוכונדריה יגדלו בתווך הסלקטיבי לאחר ההזדווגות עם זן הבודק.
  5. זהה על לוח האב (שלב 6.4.1) את המושבות המתאימות שצמחו בשלב 6.4.2.
    הערה: מכיוון שלוח ההפצצה (ולכן, צלחת המאסטר) עמוס במושבות טרנספורמטיביות, זה יכול להיות קשה לזהות את המושבות החיוביות שנצפו על לוח ההזדווגות של הבודק. מסיבה זו, מומלץ מאוד לצייר כמה קווים קטנים בכל צד של כל הלוחות עם טוש קבוע. ציירו קווים דומים על טבעת החותמת המשוכפלת. קווים אלה יסייעו בהכוונה ובאיתור מושבות חיוביות על לוח האב (ראו דוגמה באיור 2D).
  6. לטהר את המושבות החיוביות על ידי פסים מצלחת האב לצלחת נשירה סלקטיבית שנייה, כמו בשלב 6.4.1. לדגור במשך שני לילות ב 30 °C (75 °F).
    הערה: חיוני כי פסים מאפשרים צמיחה של מושבות בודדות כדי להבטיח מתח טהור.
  7. חזור על תהליך הבחירה (שלבים 6.2-6.5) כדי לאשר את נוכחותו של פלסמיד חיידקי במיטוכונדריה.
    הערה: בדרך כלל, ניתן לחזור על תהליך זה פעמיים נוספות כדי לבחור זני רו סינתטיים יציבים.
  8. לאחר שזן הרו הסינתטי שומר ביציבות על DNA הפלסמיד במיטוכונדריה, בחר 3-5 מושבות חיוביות שונות וחסן אותן ב -2 מ"ל של YPD. השתמש בתרבית זו כדי להכין מלאי קריוביאלי (על ידי ערבוב של 600 μL של תרבית ו 600 μL של 50% גליצרול כדי לשמר ב -70 ° C) ולהכניס את רצף פלסמיד לתוך mtDNA של עניין על ידי cytoduction (שלב 6.7).
    הערה: מאחר שאין לחץ סלקטיבי לשמירה על הפלסמיד שעבר טרנספורמציה במיטוכונדריה מזן הרו הסינתטי, הפלסמיד יכול ללכת לאיבוד בקלות. לכן, אנו ממליצים לבצע את הציטודוקציה בהקדם האפשרי.

7. שילוב המבנה הקיים בזן הרו הסינתטי באתר המטרה בגנום המיטוכונדריאלי על ידי ציטודוקציה

  1. חסן שתי צינוריות עם 3 מ"ל של מדיה YPD, אחת עם תאי התורם (תאי רו סינתטיים) ואחת עם התאים המקבלים (תאי שמרים שבהם צפויה הבנייה הסופית). לדגור לילה ב 30 °C (75 °F).
  2. מערבבים 750 μL של הזן התורם ו-250 μL של זן הקולטן במיקרו-צינורית סטרילית (יחס 3:1).
  3. צנטריפוגה את התערובת במשך דקה אחת ב 13,200 × גרם; השליכו את הסופר-נאנט. בעזרת קצה פיפטה 1 מ"ל עם קצה חתוך, לקחת טיפה אחת של גלולת התא ולהניח אותו על צלחת YPD. יש לדגור בטמפרטורה של 30°C למשך 2-4 שעות.
    הערה: כדי למנוע זיהום צולב, אין לשים יותר משני מתלים של תאים בלוח אחד (ראו את הדוגמה באיור 4A).
  4. קח כמות קטנה של תערובת התא, להשהות אותו מחדש ב 15 μL של מים סטריליים על מגלשה, ומניחים כיסוי להחליק. בדוק תחת מיקרוסקופ אור נוכחות של shmoos עם מטרה 40x או 100x; הצורה האופיינית הזו מופיעה כאשר קיימים שני סוגי הזדווגות (איור 3B).
  5. אם יש שמוס, יש להשהות כמות קטנה (~0.5 מ"מ3) ממסת התא ב-2 מ"ל של תווך YPD. יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורה של 30°C בגלגל מסתובב כדי לאפשר לזיגוטה הדו-גרעינית להתאושש.
  6. מערבבים ומדללים 10 μL של תרחיף התא ב 990 μL של מים סטריליים (דילול 1:100). השתמש בחרוזי זכוכית או בידית זכוכית סטרילית כדי לפזר 100 μL של דילול התא על מדיום נשירה שבו רק הזן המקבל (ודיפלואידים ספורדיים) גדלים. יש לדגור במשך 2-3 לילות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.
  7. שכפל את המושבות שנוצרו על המדיה הסלקטיבית הדרושה כפי שמוסבר במבוא (שלב 4; ראה איור 4C לדוגמה ספציפית).
  8. לאחר זיהוי מושבות חיוביות, החזירו אותן על אותה מדיה סלקטיבית כדי לטהר את הזן הפלואידי הנושא את mtDNA של עניין.
  9. בחר לפחות שתי מושבות חיוביות וגדל אותם על 2 מ"ל של YPD בינוני ב 30 ° C במשך הלילה. צור גיבוי קריוגני על ידי ערבוב 600 μL של 50% גליצרול עם 600 μL של תרבית YPD רוויה. יש לאחסן בטמפרטורה של -70°C.
  10. בודד DNA של הזנים המתקבלים31,32. להגביר את האזור הרצוי על ידי PCR ורצף כדי לאשר את נוכחותה של מוטציה מיטוכונדריאלית.
    הערה: כל מושבה חיובית היא שכפול טכני שיש לאשר באופן עצמאי כדי להבטיח את הרצף הנכון בגנום המיטוכונדריאלי.

תוצאות

חלק זה מציג כמה תוצאות מייצגות מהשלבים השונים של טרנספורמציה מיטוכונדריאלית. איור 6 מראה הליך הפצצה. תאי הרו הסינתטיים נשאו פלסמיד חיידקי עם הגן המדווח ARG8m, שיחליף את רצף הקידוד של גן מיטוכונדריאלי (איור 6A). לאחר ההפגזה, הלוח שוכפל על תווך חסר אורציל (-URA); זוהי צלחת האב (איור 6B). למושבות הגדלות יש את וקטור ביטוי השמרים עם סמן האוקסוטרופיה URA3 . על פי פרוטוקול סעיף 6, לוחית ההפצצה שוכפלה גם על תווך YPD שהכיל מדשאה מזן הבודק. במקרה זה, הזן הבודק הכיל אלל פגום של הגן ARG8m בגנום המיטוכונדריאלי (ARG8m-1)1. לאחר 2 לילות של דגירה, מדשאת הטסטר ותאי הטרנספורמציה הזדווגו, והמיטוכונדריה התמזגו. צלחת זו שוכפלה על מדיום חסר ארגינין. רק אותם דיפלואידים המכילים את הפלסמיד המיטוכונדריאלי הצליחו לגדול על תווך סלקטיבי זה מכיוון שהגן ARG8m הקיים בזן הרו הסינתטי החליף את ARG8m-1 הפגום מהגנום המיטוכונדריאלי של זן הבודק.

מספר המושבות החיוביות נע בדרך כלל בין אפס ל-20 בכל צלחת. בדוגמה הנוכחית, התקבלו ארבע מושבות רו-רו סינתטיות חיוביות, אשר טוהרו על ידי פסים עליהן על מדיום חסר אורציל. בסבב הראשון של הטיהור התקבלו מושבות שליליות רבות יחד עם המושבות החיוביות. עם זאת, לאחר שניים או שלושה סבבים של טיהור, ניתן לקבל את זן הרו הסינתטי החיובי הטהור. באיור 6C הראינו כמה מושבות רו סינתטיות חיוביות לאחר שלושה סבבים של טיהור ובדיקות. רוב המושבות מלוח המאסטר -URA חיוביות לבדיקת הבודק. מעניין, לא כל התאים של מושבה חיובית מכילים פלסמיד מיטוכונדריאלי, המציין כי פלסמיד שעבר טרנספורמציה אבד באוכלוסיית המושבה. תוצאה זו צפויה מכיוון שאין לחץ סלקטיבי לשמור על פלסמיד המיטוכונדריה, מה שהופך אותו ללא יציב. אולם זן רו סינתטי כמו אלה שמוצגים באיור 6C יכול להילקח קדימה לשלב הבא, ציטודוקציה (פרוטוקול סעיף 7), ולהשתמש בו להכנת מלאי לאחסון בטמפרטורה של -70°C. איור 6D מראה גם את הסבב השלישי של טיהור זן רו סינתטי. עם זאת, במקרה זה, מכיוון שהטרנספורמטים כמעט ולא הצליחו לשמור על הפלסמיד המיטוכונדריאלי, הם הושלכו.

תיארנו אסטרטגיה כללית אחת לבחירת מושבות רו סינתטיות חיוביות, המוצגת באיור 7A. במקרה זה, המבנה המיטוכונדריאלי שנמצא בתאי הרו הסינתטיים מכיל כמה מאות נוקלאוטידים שמשתלבים מחדש עם הדנ"א המיטוכונדריאלי מזן הבודק (לדוגמה, המבנה COX1ΔC15 בזן הרו הסינתטי מתמזג מחדש עם הגן cox1D369N שעבר מוטציה בדנ"א המיטוכונדריאלי של הבודק (איור 2D); או מבנה cox1Δ::ARG8m בזן הרו הסינתטי עם הגן ARG8 שעבר מוטציהm-1 בדנ"א המיטוכונדריאלי של הבודק (איור 6A). עם זאת, אם אין זמינות של זן בודק כדי לבחור את תאי הרו הסינתטיים החיוביים המעניינים, קיימת גישה עקיפה לבחור אותם33. במקרה זה, פלסמיד חיידקי חייב להכיל גם קטע של גן מיטוכונדריאלי, כמו COX2 או COX3. זן הבודק מכיל עותק לא פונקציונלי של הגן cox2 או cox3 במיטוכונדריה. בדוגמה הנתונה, הרצף של מקטע cox3 הקיים בפלסמיד החיידקי יכול להשלים את רצף cox3 הקיים במיטוכונדריה של הבודק, ולאחר רקומבינציה, לספק גן COX3 פונקציונלי. לאחר חציית תאי הרו הסינתטיים עם זן הבודק, דיפלואידים יכולים לנשום רק אם תאי הרו הסינתטיים מכילים את פלסמיד החיידקים בתוך המיטוכונדריה (איור 7B).

איור 8 מדגים את תהליך הציטודוקציה. הזנים התורם והמקבל מכילים לאוצין ואדנין אוקסוטרופיה, בהתאמה. לפיכך, לאחר ציטודוקציה, התערובת הייתה מצופה על מדיום חסר לאוצין, מה שמנע את צמיחת התאים התורמים. זוהי צלחת המאסטר. בשלב זה, רק הפלואידים עם הרקע הגרעיני של הזן המקבל ודיפלואידים ספורדיים יגדלו. כדי לשלול דיפלואידים, לוחית האב שוכפלה על מדיה חסרת אדנין, שבה רק דיפלואידים יכולים לגדול. בדוגמה זו, הדנ"א המיטוכונדריאלי שנוצר לאחר ציטודוקציה עובר מוטציה, וההפלואידים המיועדים אינם יכולים לגדול על אמצעי הנשימה של אתנול/גליצרול. לכן, יש לשכפל את צלחת המאסטר על לוחות YPD עם מדשאה של זן בודק. המיקום של דיפלואידים נשימה חיובית מציין אילו מושבות לטהר מהצלחת הראשית. שני סבבי טיהור נחוצים כדי להשיג את הזן הסופי, הטהור. האינטגרציה המיטוכונדריאלית מאוששת בדרך כלל על ידי הגברת PCR של האזור שמסביב של עניין וריצוף.

לבסוף, ניתן להחדיר גנים למוקד הספציפי בגנום המיטוכונדריאלי. לדוגמה, גנים מדווחים יכולים להיות מוחדרים בקצה 3' של רצף הקידוד של גן מיטוכונדריאלי או להחליף את אזור הקידוד של הגן המיטוכונדריאלי, בין אפשרויות אחרות (איור 9A). עם זאת, גנים יכולים להיות מוחדרים גם באתרים חוץ רחמיים בתוך אזורים לא מקודדים של הגנום המיטוכונדריאלי. האתר הנפוץ הוא 295 nt במעלה הזרם של קודון ההתחלה של הגן COX2 . השינוי באזור זה שאינו מקודד אינו מזיק13. כדי לבטא בהצלחה את הגן באתר החוץ רחמי, הוא חייב להיות מוקף על ידי מקדם מיטוכונדריאלי ו terminator. רצפי האיגוף של COX2 הם האופטימליים ביותר מאחר ש-COX2 הוא גן המיטוכונדריה עם הרצפים הלא מתורגמים הקצרים ביותר של 5' ו-3' (73 nt של 5' UTR ו-119 nt של 3' UTR) (איור 9B). עבור בנייה זו, פלסמיד חיידקי יש את המאפיינים הבאים: התבנית היא פלסמיד המכיל את אזור קידוד COX2 , עם 1120 nt במורד הזרם של קודון לעצור ו 670 nt במעלה הזרם של קודון להתחיל AUG , בשם pXPM5025. הגן המעניין מהונדס להיות מוקף על ידי 73 nt של COX2 5'-UTR ו 119 nt של COX2 3'-UTR. לאחר מכן, הוא הוכנס, כפי שצוין קודם לכן, ב-295 nt במעלה הזרם של קודון ההתחלה COX2 AUG, שהוא אזור שאינו מקודד (איור 9B). שימו לב שפלסמיד זה, וכתוצאה מכך, בגנום המיטוכונדריאלי המתקבל, COX2 5' ו- 3' UTR משוכפלים. לאחר הפצצת פלסמיד זה, תאי הרו הסינתטיים מזווגים לציטודוקציה עם זן קולטן בעל מחיקה נרחבת של אזור COX2 (אלל cox2-62 )1. במהלך הציטודוקציה, הפלסמיד המיטוכונדריאלי של זן הרו הסינתטי מתאחד מחדש עם הדנ"א המיטוכונדריאלי מהמקבל. הגנום המיטוכונדריאלי שנוצר הוא בעל מבנה חוץ רחמי וגן WT COX2 . לכן, המושבות החיוביות יוכלו לגדול בתווך נשימתי (איור 9B).

תרשים מערכת שיגור מיקרו-מובילים, הגדרת לחץ הליום, לוחית דגימה, צינור תאוצה.
איור 5: ייצוג סכמטי של ציוד הפצצה של מיקרו-קליע במהירות גבוהה. המעבדה שלנו משתמשת במערכת העברת חלקיקים Biolistic-PDS-1000/He (טבלה של חומרים). קיצור: WPs = חלקיקי טונגסטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת טרנספורמציה של שמרים ותוצאות צלחת פטרי המציגות פונקציונליות של גן ARG ב-mtDNA סינתטי.
איור 6: דוגמה ללוח טרנספורמציה של מיקרו-קליע במהירות גבוהה. (א,ב) לאחר ההפגזה, לוחות הודגרו במשך 5-7 לילות ב 30 מעלות צלזיוס. אם מזהם גדל (מסומן על ידי חץ כחול), ניתן לחתוך אותו עם מרית סטרילית. לאחר שכפול הלוחות על מדיום סמן הבחירה (-URA במקרה זה), הצלחת הראשית נבדקה גם לנוכחות פלסמיד המיטוכונדריה על ידי הזדווגות לזן בודק. במקרה זה, לזן הבודק יש את האלל הלא פונקציונלי ARG8m-1 1. לאחר הזדווגות של 2 לילות ושכפול הצלחת על תווך חסר ארגינין (-ARG), נוצרו ארבע מושבות חיוביות (מסומנות בחצים אדומים). (C) מושבות הרו הסינתטיות החיוביות טוהרו על ידי הנחתן על תווך -URA, ובדיקות העתק בוצעו כמתואר קודם לכן. לוחות אלה מייצגים את סבב הטיהור השלישי. (D) חלק ממושבות הרו הסינתטיות החיוביות איבדו את המבנה המיטוכונדריאלי. קיצורים: mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי; -URA = חסר אורציל; -ARG = חסר ארגינין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תרשים תהליך שילוב פלסמיד חיידקי; העברת גנים ל-mtDNA; מושג הנדסה גנטית.
איור 7: דיאגרמה המראה כיצד לבחור מושבות רו סינתטיות חיוביות לאחר הפצצה. (A) פלסמיד החיידקים מכיל גרסה לא מתפקדת של גן מיטוכונדריאלי. לצורך זיהוי, מושבות הרו הסינתטיות מזווגות לזן בודק המכיל מוטציה לא תפקודית אחרת של אותו גן בדנ"א המיטוכונדריאלי. לאחר ההזדווגות, mtDNA מוטנטי משתלב מחדש, וגן פונקציונלי ניתן לשחזר על ידי השלמה. כאן, הדיפלואיד גדל על מדיום סלקטיבי שבו לא זן הרו הסינתטי ולא הבודק יכולים לגדול. (B) במקרה זה, הפלסמיד מכיל רצף נוסף של גן מיטוכונדריאלי (כלומר, חתיכת COX3). לאחר הטרנספורמציה, הזן הסינתטי נבחר על ידי יכולתו להשלים מוטציה COX3 בזן הבודק, כך שרק הדיפלואידים יכולים לגדול על תווך סלקטיבי (כלומר, תווך נשימתי). שיטה זו שימושית אם זן בודק עבור הגן המעניין אינו זמין. איתור מושבות רו סינתטיות חיוביות במקרה זה הוא עקיף. קיצור: mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

ניסוי צלחת פטרי; תהליך ציטודוקציה; תצפית על גידול שמרים; הערכת העברה גנטית.
איור 8: דוגמה של ציטודוקציה לשילוב מבנה במוקד המטרה בדנ"א המיטוכונדריאלי. לאחר ההזדווגות וההתאוששות, התאים המעורבים והזיגוטים הדו-גרעיניים צופו על מדיום חסר לאוצין. במקרה זה, מכיוון שלזן התורם יש את האלל leu2,3-112, מדיום זה מונע את צמיחת התורם. לוח זה שוכפל על אותו תווך (צלחת מאסטר), בתווך שבו רק דיפלואידים יכולים לגדול (-ADE) ובתווך שבו המקבל עם המוטציה המיועדת יכול לגדול (חיצים אדומים). במקרה זה, לא התורם ולא תאי הקולטן יכולים לגדול על אמצעי הנשימה. רק הדיפלואיד שנוצר לאחר הזדווגות עם דשא של זן בודק יכול לגדול על מדיום נשימתי. מושבות דיפלואידיות נושמות אלה הן מדריך לבחירה וטיהור של המושבות החיוביות מהצלחת הראשית. קיצורים: -LEU = חסר לאוצין; -ADE = חסר אדנין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיאגרמת העברת גנים מיטוכונדריאלית עם תורם rho סינתטי לתהליך מקבל mtDNA.
איור 9: דיאגרמה המראה כיצד לשלב את המבנה המיטוכונדריאלי שעבר מוטציה (קיים בזן הרו הסינתטי) בזן המקבל. (A) בדוגמה זו, הזן המקבל נושא את הגן ARG8m reporter המחליף את הקודונים מהגן המעניין. ה-rho- DNA הסינתטי מכיל גרסה מוטנטית של גן זה. הפלסמיד והדנ"א המיטוכונדריאלי מתאחדים מחדש דרך אזורי האיגוף 5' ו-3', והכתב ARG8m מוחלף ברצף המוטציה של הגן המעניין. (B) גנים זרים יכולים להיות מוחדרים באופן אקטופי באזורים מסוימים של הגנום המיטוכונדריאלי 7,13,36. בדוגמה זו, גן יכול להיות מוצג במיקום 295 nt במעלה הזרם של הגן COX2. זהו אזור לא מקודד של mtDNA. גן זר מעניין מוקף על ידי 73 nt ו 119 nt של COX2 5' UTR ו 3' UTR, בהתאמה. מבנה זה מוכנס לפלסמיד המכיל את הגן COX2 בתוספת 670 nt ו- 1120 nt של אזורי UTR 5' ו- 3'. זן הרו הסינתטי (תורם) נושא מבנה זה במיטוכונדריה. במקרה זה, לזן המקבל (XPM13)7 יש מחיקה משמעותית של הגן cox2 (אלל cox2-62)1. לאחר ציטודוקציה, DNA מיטוכונדריאלי מהתורם והמקבל משתלב מחדש. הגן COX2 משוחזר, והגן המעניין מוחדר לאתר החוץ רחמי (295 nt במעלה הזרם של הגן COX2). קיצורים: mtDNA = DNA מיטוכונדריאלי; NT = נוקלאוטידים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

זן שמריםגנוטיפמספר נכס
צרפתMata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
NB71Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
XPM209Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
XPM13Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
L45Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)28

טבלה 1: דוגמאות לזני שמרים המשמשים בטרנספורמציה ביוליסטית וציטודוקציה.

מדיה צמיחהרכיבים
YPD2% גלוקוז, 2% בקטופפטון, 1% תמצית שמרים
YPR2% רפינוז, 2% בקטופפטון, 1% תמצית שמרים
YPEG*3% גליצרול, 3% אתנול*1, 2% בקטופפטון, 1% תמצית שמרים
מדיה נשמטת2% גלוקוז, 6.8% בסיס חנקן שמרים עם (NH4)2SO4, תערובת חומצות אמינו נשירה*2
תקשורת הפצצה5% גלוקוז, 6.8% בסיס חנקן שמרים עם (NH4)2SO4, 1 M סורביטול, תערובת חומצות אמינו נושרות*2,3.
*1 יש להוסיף אתנול לאחר החצייה כאשר המדיה חמה.
*2 כמות תערובת חומצות האמינו עשויה להשתנות בהתאם למלאי הזמין, או לכמות שצוינה על ידי היצרן.
*3 לאמצעי ההפצצה יש להוסיף את חומצות האמינו ובסיסי החנקן לפי הצורך, בהתאם לזן השמרים. ודא שההרכב ספציפי לאוקסוטרופיה על פלסמיד 2μL המשמש לבחירה.

טבלה 2: מצע גידול שמרים המשמש בפרוטוקול זה.

דיון

העבודה הנוכחית תיארה כיצד להפוך מיטוכונדריה מהשמרים S. cerevisiae בהצלחה. התהליך, מהפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה ועד לטיהור זן השמרים המיועד, אורך ~8-12 שבועות, תלוי בכמה סבבי טיהור של זן הרו הסינתטי הדרושים. חלק מהשלבים הקריטיים של השיטה הם כדלקמן. ראשית, ככל שאזורי האיגוף שנוספו סביב אתר המוטציה במבנה הגן המיטוכונדריאלי גדולים יותר, כך גדלה ההסתברות לשילוב מוצלח של מוטציית המטרה. הגודל המינימלי של אזורי האיגוף הוא ~ 100 nt; עם זאת, מומלץ מאוד להשתמש ביותר מ-500 NT בכל צד של המוטציה. שנית, בעת בחירת מושבות הרו הסינתטיות לאחר הטרנספורמציה, מומלץ שלא יתקיימו יותר מ 3-4 סבבי טיהור; אחרת, קיים סיכון גבוה שבסופו של דבר המבנה המיטוכונדריאלי יאבדו, מכיוון שאין לחץ סלקטיבי לשמור על הפלסמיד במיטוכונדריה. שלישית, כדי להימנע מפגיעה במשתמש או בציוד, עליך לקרוא בעיון את המדריך של מכונת ההפצצה לפני תחילת ההליך. ציוד זה עדין ומשתמש בלחץ גבוה ואקום.

מגבלה אחת של הליך זה היא שעד כה, רק שמרים והאצות הירוקות C. reinhardtii מועמדים לשנות מיטוכונדריה בשיטה זו. זה יהיה רלוונטי אם נוכל להציג מוטציות מכוונות אתר על הגנום המיטוכונדריאלי מאורגניזמים אחרים. מגבלה נוספת היא שזה מאתגר לשנות מבנים רבים ושונים באותו מפגש. מומלץ לבצע שש טרנספורמציות לכל קונסטרוקציה, שכל אחת מהן חייבת להיבדק, להיבחר ולהיטהר. התוצאה היא יותר מ-50 לוחות מדיה רק כדי לקבל מושבות רו טהורות של מוטציה מיטוכונדריאלית אחת.

למרות מגבלות אלה, היכולת לתפעל את הגנום המיטוכונדריאלי של שמרים תרמה באופן משמעותי להבנת מסלולים רבים של ביוגנזה של קומפלקסים נשימתיים. גישה זו יכולה לשמש להחדרת גנים מדווחים לניטור וכימות תרגום מיטוכונדריאלי 1,7,36,37, הפרעה לגנים מיטוכונדריאליים 38, זיהוי מלווי הרכבה של קומפלקסים נשימתיים39, הבנה טובה יותר של מנגנוני תרגום והרכבה מיטוכונדריאלית מצומדת 7,11,12,36ולחפש מדכאים כאשר עוקבים אחר ביטוי של גן מיטוכונדריאלי שעבר מוטציה40., עד כה, למרות שגישות מסוימות למניפולציה של הגנום המיטוכונדריאלי ביונקים דווחו מוקדם יותר41, לא קיימת שיטה נפוצה לשינוי דנ"א מיטוכונדריאלי עבור אורגניזמים אלה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

פרסום זה נתמך על ידי Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 ל-XP-M]. UPD הוא עמית CONAHCYT (CVU:883299). אנו רוצים להודות לד"ר אריאן מנדוזה-מרטינז על העזרה הטכנית עם תמונות מיקרוסקופ האור. רישיונות Biorender: DU26OMVLUU (איור 2); BK26TH9GXH (איור 3); GD26TH80R5 (איור 4); PU26THARYD (איור 7); ML26THAIFG (איור 9).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 מ"ל קצות פיפטהAxygenT-1000-B
1.5 מ"ל מיקרו-צינורAxygenMCT-150-C
10 μ קצות פיפטה LAxygenT-10-C
15 מ"ל צינור תחתון חרוטי  AxygenSCT-25ML-25-S
200 μ קצות פיפטה LAxygenT-200-Y
50 מ"ל תחתית חרוטית  צינורAxygenSCT-50ML-25-S
AfiIIניו אינגלנד BioLabsR0520S
AgaroseSeaKem50004
איזון אנליטיOHAUSARA520
אוטוקלאבTOMYES-315
בקטו אגרBD214010
Bacto peptoneBD211677
מחזיק מקרו-נשא ביוליזיטי BIO-RAD1652322
מבער בונסןVWR89038-528
סידן כלוריפישר סיינטיפיקC79-500
CSM -ADEFormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormedium
DCS0169 בקבוק זכוכית תרבותKIMAX KIMBLE25615
צינור זכוכית תרביתפיירקס9820
דקסטרוזBD215520
אתנולJT אופה 9000
מלקחייםMillipore620006
חרוזי זכוכיתסיגמאZ265926
ידית זכוכיתסיגמאS4647
גליצרולJT BAKER2136-01
מיכל הליום דרגה 5 (99.99%)--
HSTaq  ערכתPCR BIO
מיקרוצנטריפוגהאפנדורף022620100
NdeIניו אינגלנד BioLabsR0111L
שייקר אורביטליניו ברונסוויק מדעיNB-G25
צינורות PCRAxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM מערכת אספקת חלקיקים ביוליסטייםBIO-RAD165-2257
צלחות פטרי (100X10)BD252777
QIAprep Spin MiniprepQiagen27106
RaffinoseFormediumRAF03
פלטת העתקSciencewareZ363391
דיסקי קרע 1350 PsiBIO-RAD1652330
סורביטולסיגמאS7547
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseThermo ScientificEL0011
מסובב תרבית רקמותThermo Scientific88882015
מיקרו-נשאי טונגסטן M10BIO-RAD1652266
משאבת ואקום בקיבולת 100 ליטר לדקה-
רפידות קטיפהBel-ArtH37848-0002
וורטקס Scientifc IndustriesSI-0236
מקל אפליקטור עץPROMA1820060
BD212750
שמרים על בסיס חנקן ללא חומצות אמינוBD291920
תמצית שמרים

מקורות

  1. Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
  2. Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules. J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).
  3. Flores-Mireles, D., et al. The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly. Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).
  4. Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome. Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).
  5. García-Villegas, R., et al. The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria. J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).
  6. Rak, M., et al. Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology. J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).
  7. Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p. EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).
  8. Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs. EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).
  9. Saracco, S. A., Fox, T. D. Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane. Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).
  10. McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase. J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).
  11. Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).
  12. Franco, L. V. R., et al. Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase. Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).
  13. Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria. Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).
  14. Cohen, J. S., Fox, T. D. Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).
  15. Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
  16. Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast. STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).
  17. Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).
  18. Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation. Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).
  19. Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).
  20. Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria. Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).
  21. Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA. IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).
  22. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination. Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).
  23. Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun. Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).
  24. Bonnefoy, N., Fox, T. D. Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).
  25. Shingú-Vázquez, M., et al. The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria. J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).
  26. Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide. Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).
  27. Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase. Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).
  28. Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. Cytoduction and plasmiduction in yeast. Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).
  29. Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast. Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).
  30. Conde, J., Fink, G. R. A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).
  31. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  32. Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).
  33. Ding, M. G., et al. Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species. Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).
  34. Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions. Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).
  35. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).
  36. Gruschke, S., et al. The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria. J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).
  37. Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis. Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).
  38. Rak, M., Tzagoloff, A. F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).
  39. He, S., Fox, T. D. Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix. Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).
  40. Rak, M., et al. Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p. Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).
  41. Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. Mitochondrial genome engineering coming-of-age. Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Saccharomyces Cerevisiae
טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.