מאמר שיטה

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

DOI:

10.3791/66861

⸱

26 ביולי 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Multidisciplinary Brain Protection Program (MBPP), Department of Anesthesiology, Duke University Medical Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות, גישה נפוצה אחת היא לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון. כאן, שני פרוטוקולים פשוטים ויעילים ניתנים לבידוד תאי מערכת החיסון מרקמת המוח וממח עצם הגולגולת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראיות מצטברות מצביעות על כך שהתגובה החיסונית המופעלת על ידי הפרעות מוחיות (למשל, איסכמיה מוחית ואנצפלומיאליטיס אוטואימונית) מתרחשת לא רק במוח, אלא גם בגולגולת. צעד מפתח לקראת ניתוח שינויים באוכלוסיית תאי מערכת החיסון במוח ובמח עצם הגולגולת לאחר נזק מוחי (למשל, שבץ) הוא להשיג מספר מספיק של תאי חיסון איכותיים לניתוחים במורד הזרם. כאן, שני פרוטוקולים אופטימליים מסופקים לבידוד תאי מערכת החיסון מהמוח וממח עצם הגולגולת. היתרונות של שני הפרוטוקולים באים לידי ביטוי בפשטותם, במהירותם וביעילותם בהפקת כמות גדולה של תאי חיסון בני קיימא. תאים אלה עשויים להתאים למגוון יישומים במורד הזרם, כגון מיון תאים, ציטומטריית זרימה וניתוח תעתוק. כדי להדגים את יעילות הפרוטוקולים, בוצעו ניסויים אימונופנוטיפיים במוחות שבץ מוחי ובמח עצם גולגולת תקין באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה, והתוצאות תאמו את ממצאי המחקרים שפורסמו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המוח, המרכז המרכזי של מערכת העצבים, מוגן על ידי הגולגולת. מתחת לגולגולת שלוש שכבות של רקמת חיבור הידועות בשם קרומי המוח - דורה מאטר, מאטר ארכנואיד ופיה מאטר. נוזל מוחי שדרתי (CSF) מסתובב בחלל התת עכבישי בין המאטר הארכנואיד לבין פיאה מאטר, מרפד את המוח וגם מסלק פסולת דרך המערכת הגלימפטית 1,2. יחד, ארכיטקטורה ייחודית זו מספקת סביבה בטוחה ותומכת השומרת על יציבות המוח ומגינה עליו מפני פגיעה פוטנציאלית.

המוח נחשב כבר מזמן לחסינות-פריבילגית. עם זאת, רעיון זה נזנח חלקית מכיוון שראיות מצטברות מצביעות על כך שבנוסף לתאי מיקרוגליה בפרנכימה, גבולות המוח, כולל מקלעת הכורואיד וקרומי המוח, מארחים מערך מגוון של תאי חיסון3. תאים אלה ממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על הומאוסטזיס, שמירה על בריאות המוח וייזום התגובה החיסונית לפגיעה מוחית. יש לציין כי ממצאים אחרונים מצביעים על כך שהגולגולת מעורבת בחסינות קרומי המוח, ועשויה לתרום לתגובה החיסונית במוח לאחר פציעה. בשנת 2018, הריסון ועמיתיו גילו תגלית ראשונית של תעלות כלי דם ישירות המקשרות את מח עצם הגולגולת לקרומי המוח, ובכך ביססו נתיב אנטומי לנדידת לויקוציטים 4,5. מאוחר יותר, Cugurra et al. הראו כי תאים מיאלואידים רבים (למשל, מונוציטים ונויטרופילים) ותאי B בקרומי המוח אינם מקורם בדם6. באמצעות טכניקות כגון השתלת עצם קלבריה ומשטרי הקרנה סלקטיבית, המחברים סיפקו ראיות משכנעות לכך שמח עצם הגולגולת משמש כמקור מקומי לתאים מיאלואידים בקרומי המוח, כמו גם פרנכימה CNS לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית6. יתר על כן, מחקר אחר הציע כי תאי B של קרום המוח מסופקים כל הזמן על ידי מח עצםהגולגולת 7. לאחרונה, מבנה חדש, המכונה יציאת השרוול הארכנואידית (ACE), זוהה כשער ישיר בין הדורה מאטר למוח לסחר בתאי מערכת החיסון8.

לממצאים מרגשים אלה יש השלכות חשובות על מקור החדירה של תאי מערכת החיסון למוח הפגוע (למשל, לאחר שבץ איסכמי). עדויות רבות מצביעות על כך שלאחר שבץ, תאי חיסון רבים חודרים למוח, מה שתורם הן לנזק מוחי חריף והן להתאוששות מוחית כרונית. הרעיון המקובל הוא שתאים אלה מזרימים לויקוציטים בדם החודרים למוח, מה שמתאפשר במידה רבה על ידי נזק למחסום הדם-מוח שנגרם כתוצאה משבץ. עם זאת, רעיון זה אותגר. במחקר אחד, תאי מערכת החיסון בגולגולת ובשוקה של עכברים תויגו באופן שונה, ולאחר 6 שעות לאחר שבץ נמצאה ירידה משמעותית גדולה יותר בנויטרופילים ומונוציטים בגולגולת לעומת . הטיביה, ונויטרופילים נוספים שמקורם בגולגולת היו נוכחים במוח האיסכמי. נתונים אלה מצביעים על כך שבשלב השבץ החריף, נויטרופילים במוח האיסכמי מקורם בעיקר במח עצםהגולגולת 4. מעניין, CSF עשוי להנחות הגירה זו. ואכן, שני דיווחים אחרונים הראו כי CSF יכול להעביר ישירות רמזי איתות מהמוח לתוך מח עצם הגולגולת דרך תעלות גולגולת, ולהורות נדידת תאים והמטופויזה במח עצם הגולגולת לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית 9,10.

לאור ממצאים עדכניים אלה, נעשה חשוב לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון הן במוח והן במוח עצם הגולגולת, כאשר חוקרים את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות. בחקירות כאלה, יש צורך במספר מספיק של תאי חיסון באיכות גבוהה לניתוחים במורד הזרם, כגון מיון תאים, ניתוח ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). כאן, המטרה הכוללת היא להציג שני הליכים אופטימליים להכנת תרחיפים חד-תאיים מרקמת המוח ומח עצם הגולגולת. חשוב לציין כי הקלבריה (עצם קדמית, עצם עורפית ועצמות קודקודיות) של הגולגולת משמשות בדרך כלל לחילוץ מח עצם, ומח עצם זה מכונה באופן ספציפי מח עצם גולגולת במהלך מחקר זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון דיוק (IACUC). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 זכרים (בני 3-4 חודשים; 22-28 גרם). פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. השעיה של תא בודד ממוח העכבר

הערה: איור 1 מדגים את הסקירה הכללית של פרוטוקול בידוד תאי המוח.

  1. להרדים, לבצע אינטובציה ולאבטח את העכבר, כפי שהודגם קודם לכן11.
  2. בצעו חתך בבטן העליונה דרך העור ושכבות השרירים שמתחתיו, וחתכו בזהירות דרך הסרעפת והצלעות כדי ליצור את הפתח לחלל בית החזה.
  3. ממלאים מזרק 30 מ"ל ב-PBS קר ומחברים אותו למחט הזילוח הקהה באמצעות צינורות סיליקון. הכנס בזהירות את מחט הזילוח לחדר השמאלי.
  4. בצע ניק קטן באטריום הימני כדי לאפשר ניקוז דם ולאחר מכן לנקב12 העכבר בקצב זרימה של ~ 10 מ"ל / דקה למשך 3-4 דקות.
    הערה: כדי לשפר את פינוי הדם במוח, ניתן לשקול להגדיל את נפח תמיסת הזילוח ולהוסיף הפרין.
  5. ערפו את ראשו של העכבר ובצעו חתך בקו האמצע דרך העור בחלק העליון של הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
  6. יש לגרד בזהירות כל רקמת חיבור מעל הגולגולת באמצעות מלקחיים קהים.
  7. השתמש מספריים דיסקציה חדה לחתוך בזהירות דרך תפרי הגולגולת לאורך קו האמצע משני הצדדים, יצירת דש.
  8. הרימו בעדינות את דש הגולגולת כדי לחשוף את המוח, והשתמשו במלקחיים קהים כדי להסיר בזהירות את המוח מחלל הגולגולת.
  9. טבלו את המוח בצלוחית פטרי המכילה PBS קר כקרח והסירו את כל רקמות קרום המוח שנותרו.
    הערה: כדי לשמר טוב יותר את יכולת הקיום של התא, מומלץ לבצע את כל השלבים הבאים על קרח או בטמפרטורה של 4°C.
  10. הניחו את המוח בתוך זכוכית מקוררת מראש של 15 מ"ל Dounce homogenizer המכילה 20 מ"ל (מוח שלם) או 12 מ"ל (חצי מוח) של חיץ HBSS עתיק כקרח.
  11. השתמש במזיק Dounce הרופף כדי לנתק בעדינות ובאיטיות את רקמת המוח עם כ 100-120 שבץ על קרח.
    הערה: שלב זה חיוני להשגת כמות גדולה של תאי מוח בריאים. שלב זה אורך כ-10 דקות. עצור הומוגניזציה כאשר לא נראים גושי רקמת מוח משמעותיים בתרחיף. בשלב זה, המזיק יכול בקלות לנוע למטה ללא כל כוח.
  12. סנן את תרחיף רקמת המוח שנוצר דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
  13. שטפו את צינור Dounce עם HBSS של 5 מ"ל, והמשיכו בסינון כדי למקסם את איסוף התאים.
  14. צנטריפוגה את מתלה הרקמה המסונן ב 550 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
  15. הסר את supernatant באמצעות שואב ואקום, והשהה מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של 30% צפיפות איזוטונית גרדיאנט פתרון.
    הערה: כדי ליצור 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 30%, ערבב 4.5 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות מלאי של 100%, 1.5 מ"ל של 10× PBS ו- 9 מ"ל של ddH2O.
  16. מעבירים את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ומוסיפים 9 מ"ל (מוח שלם) או 6 מ"ל (חצי מוח) של תמיסת שיפוע צפיפות של 30%.
  17. הפוך בעדינות את הצינור כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  18. מיד צנטריפוגה את הצינור ב 845 x g עם האצה ובלם להגדיר ברמה 3, במשך 20 דקות ב 4 ° C.
  19. מוציאים בעדינות את הצינור מהצנטריפוגה מבלי לרעוד, ושאפו בזהירות את שכבת המיאלין העליונה באמצעות קצה של 1 מ"ל המחובר לוואקום.
    הערה: חשוב ביותר לא להפריע לשכבה זו. כל שארית המיאלין עלולה להשפיע לרעה על בריאות התאים ולפגוע בניתוחים במורד הזרם.
  20. שאפו את הסופרנטנט, השאירו 1-2 מ"ל מאחור, והשעו מחדש את גלולת התא עם מינימום של 10 מ"ל HBSS קר.
  21. צנטריפוגה ב 550 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
  22. לשטוף פעם נוספת עם מינימום של 7 מ"ל של HBSS קר.
  23. הסר כמה שיותר מהסופרנאטנט, והשהה מחדש את התאים לניתוח ציטומטריית זרימה באמצעות 100-200 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה.
    הערה: מאגר FACS של ציטומטריית זרימה המשמש למחקר זה מכיל 0.5% BSA ו- 2 mM EDTA ב- 1× PBS. פלטה תחתונה V בעלת 96 בארות לצביעת תאים מומלצת כדי למזער את אובדן התאים במהלך שלבי הכביסה.
  24. ביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שנקבע במעבדות בודדות13.
    1. בקצרה, לערבב 80 μL של תרחיף התא עם 20 μL של תערובת נוגדנים בצלחת V-תחתית 96-באר לדגור במשך 25 דקות ב 4 ° C.
    2. יש לשטוף עם 200 μL של מאגר FACS ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים עם 100 μL של HBSS בתוספת מגיב צביעת כדאיות התא.
    3. לאחר דגירה של 15 דקות ב-4°C, יש לשטוף עם חיץ FACS ולהשהות מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר FACS לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה.

2. הכנת מח עצם חד תאי השעיה מ calvaria עכבר

הערה: איור 2 מתאר סקירה כללית של הליך בידוד מח עצם הגולגולת.

  1. נקב את העכבר כמתואר בשלב 1.4.
  2. ערפו את ראשו של העכבר ובצעו חתך עור בקו האמצע בקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
  3. חותכים דרך הגולגולת, מתחילים מהפורמן מגנום ונעים קדימה לאורך הצדדים הרוחביים של הקלבריה באמצעות מספריים חדים. לאחר מכן, להרים ולהסיר את calvaria.
    הערה: ניתן לקצור את המוח מאותו עכבר ולעבד אותו באמצעות שלב 1, המאפשר ניתוח של תאי מערכת החיסון הן מהמוח והן ממח עצם הגולגולת.
  4. מקלפים בזהירות את הדורה מאטר מהגולגולת תחת מיקרוסקופ מנתח באמצעות מלקחיים קהים.
    הערה: קל יותר להתחיל בשולי העצם העורפית, להתנתק לאט, ולהתקדם בהתמדה לכיוון האזור הקדמי, לעבוד פנימה.
  5. מניחים את calvaria בצלחת על קרח ולהשתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לשטוף את calvaria, הבטחת הסרת שאריות דם מפני השטח שלה.
  6. מעבירים את הקלבריה למאכל חדש עם PBS טרי וקר מספיק כדי לטבול את הקלבריה.
  7. השתמש מספריים סטריליים לחתוך את calvaria לתוך כ 3 מ"מ x 3 מ"מ רסיסים PBS קר.
    הערה: שיטות חיתוך עשויות להשפיע על היעילות של מיצוי מח עצם קלווריה. מומלץ להשתמש באותה שיטת חיתוך כדי למזער את השונות. חשוב גם לחתוך את התפרים. איור 2B מדגים גישה אחת.
  8. תקעו חור בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה של 500 מיקרוליטר באמצעות מחט של 18 גרם.
  9. הכנס צינור זה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 20 μL של PBS קר.
  10. מעבירים את שברי הקלבריה לצינור 500 μL.
    הערה: יש לארוז את שברי העצם באופן רופף כדי להגביר את יעילות החילוץ.
  11. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C.
    הערה: כדי למקסם את התאוששות התא, השתמש במחט 18 G כדי לערבב בעדינות את שברי הקלבריה, וחזור על שלב זה 1-2 פעמים נוספות.
  12. להשהות מחדש את תאי מח העצם calvaria שנאספו ב 500 μL של חיץ ליזה של תאי דם אדומים לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות.
  13. העבר את המתלה לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל PBS קר.
  14. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
  15. לשטוף פעם נוספת עם 5 מ"ל של PBS קר.
  16. השהה מחדש את גלולת התא במאגר מתאים. עבור ציטומטריית זרימה, אנו משתמשים בדרך כלל ב- 500 μL של מאגר FACS.
  17. לניתוח ציטומטריית זרימה, בצע ספירת תאים והשתמש בכ- 1 x 106 תאים לצביעת נוגדנים.
    הערה: הקפד לכלול את שלב חסימת Fc לפני צביעת נוגדנים13.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להכין תאי חיסון מרקמת המוח של עכבר, הפרוטוקול בדרך כלל מניב תאים עם כדאיות גבוהה (84.1% ± 2.3% [ממוצע ± SD]). כ 70%-80% של תאים אלה הם CD45 חיובי. במוח עכבר רגיל, כמעט כל תאי CD45+ הם מיקרוגליה (CD45 CD11b נמוך +), כצפוי. פרוטוקול זה שימש במעבדה ליישומים שונים, כולל ניתוח ציטומטריית זרימה, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) וניתוח scRNA-seq. לדוגמה, ניתוח ציטומטריית זרימה נערך במודל שבץ מוחי (איור 3). עכברים עברו מודל שבץ חולף, 30 דקות נימה באמצע חסימת עורק מוחי אמצעי (MCAO)14. ביום השלישי לאחר שבץ, תאים הוכנו ממוחות עכברים ונצבעו בסמנים נפוצים של תאי מערכת החיסון. אסטרטגיית הגאטינג מתוארת באיור 3A. בהתאם למחקר קודם13,15, נצפתה עלייה ניכרת בתאי CD45High בהמיספרה האיפסילטרלית (איור 3B,C), מה שמצביע על חדירה של תא החיסון למוח.

עבור פרוטוקול מח עצם הגולגולת, תפוקה משמעותית של תאי מח עצם גולגולת (סביב 2 x 106 תאים) הושגה באופן עקבי עם כדאיות מצוינת (93.8% ± 1.8% [ממוצע ± SD]). כצפוי, רוב התאים האלה הם CD45 חיובי. כדי להמחיש את התועלת של פרוטוקול זה, בוצע מחקר השוואתי כדי לאפיין את הרכב תאי החיסון הן בעצם הירך והן במח עצם הגולגולת של עכברים תמימים (איור 4). כפי שמתואר בחלקות המייצגות, הרכב תאי מערכת החיסון היה דומה בין עצם הירך למח עצם הגולגולת (איור 4A,B). באופן מעניין, נראה שתדירות הנויטרופילים גבוהה יותר בעצם הירך מאשר בעצם הגולגולת (איור 4C). עם זאת, ממצא זה דורש אימות נוסף, מכיוון שגודל המדגם היה קטן עבור מחקר פיילוט זה.

figure-results-1
איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול בידוד תאי המוח. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: פרוטוקול בידוד תאי מח עצם בגולגולת. (A) סקירה כללית של ההליך. (B) התבנית המומלצת לחיתוך גולגולת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת של תאי מערכת החיסון במוח השבץ. (A) דוגמה לאסטרטגיית ה-gating. החלקות מתארות את אוכלוסיות תאי החיסון הבאות: מיקרוגליה (CD45 CD11b נמוך+), תאי NK (CD45HighNK1.1+), נויטרופילים (CD45HighLy6G+), תאי T (CD45HighCD11b-CD3+) ותאי B (CD45HighCD11b-CD19+). דוגמה זו מייצגת ניתוח של תאי מערכת החיסון במוח בהמיספרה האיפסילטרלית ביום השלישי לאחר שבץ. (ב,ג) החדרת תאי מערכת החיסון למוח השבץ. עכברים זכרים צעירים היו נתונים לחסימת עורק מוחי אמצעי חולף (MCAO). ביום השלישי נאספו המוחות ופוצלו להמיספרה השמאלית (קונטרה-לטרלית) והימנית (איפסילטרלית). תאי המוח הוכנו על פי הפרוטוקול המתואר ולאחר מכן עברו ניתוח ציטומטריה של זרימה. חלקות מייצגות מדגימות חדירה מוגברת של תאי מערכת החיסון לחצי הכדור האיפסילטרלי (CD45High cells; ב). נתונים כמותיים מוצגים בגרפים של העמודות (C). מספרי התאים חושבו בהתבסס על ספירת התאים והנפח שנרשמו בנתוני ציטומטריית הזרימה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. *p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת של תאי מח עצם בגולגולת. לשם השוואה, נכלל ניתוח של תאי מח עצם מעצם הירך. החלקות מתארות את אוכלוסיות תאי החיסון הבאות: תאי NK (CD45++NK1.1+), נויטרופילים (CD45+CD11b+Ly6G+), תאי T (CD45+CD11b-CD3+) ותאי B (CD45+CD11b-CD19+). (A) חלקות מייצגות למח עצם הירך. (B) חלקות מייצגות למח עצם הגולגולת. (C) השוואה של הרכב תאי החיסון בין עצם הירך למח עצם הגולגולת. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. *p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מוצגים שני פרוטוקולים פשוטים אך יעילים לבידוד תאי מערכת החיסון מהמוח וממח עצם הגולגולת. פרוטוקולים אלה יכולים להניב באופן אמין כמות גדולה של תאי חיסון בני קיימא שעשויים להתאים ליישומים מגוונים במורד הזרם, במיוחד עבור ציטומטריית זרימה.

כדי לחקור דלקת עצבית בהפרעות מוח שונות, פרוטוקולים רבים לתכשירי תאי חיסון מהמוח נקבעו ושימשו במעבדות שונות 15,16,17. הגישות הנפוצות כוללות דיסוציאציה תאית מבוססת אנזימים ואחריה הפרדה הדרגתית. בדרך כלל, בפרוטוקולים אלה, רקמת המוח נטחנת ולאחר מכן מודגרת בתמיסת עיכול אנזימים המכילה גם collagenase וגם DNase במשך 30-60 דקות ב 37 ° C עם רעד עדין. לאחר העיכול, התאים עוברים דיסוציאציה נוספת בשיטה מכנית כגון פיפטינג או הומוגניזציה של Dounce. לאחר שהם עוברים דרך מסננת תאים (למשל, מסננת של 70 מיקרומטר), התאים עוברים צנטריפוגה הדרגתית (לעתים קרובות תמיסת שיפוע צפיפות של 30%/70%) כדי להסיר מיאלין, תאי דם אדומים ופסולת ולהעשיר לויקוציטים. עם זאת, גישה זו דורשת דגירה אנזימטית ממושכת ב 37 מעלות צלזיוס שעשויה לשנות באופן משמעותי את התמלול והפרוטאום של תאי מערכת החיסון במוח. ואכן, מחקר שיטתי הציע כי הגישה האנזימטית מציגה שינויים עמוקים בשעתוק ובפרוטיאוטיפ של תאי מוח ספציפיים18. זה יכול להוביל לממצאים בניתוחי שעתוק עוקבים כגון scRNA-seq. לעומת זאת, הפרוטוקול המדווח כאן משתמש בגישת דיסוציאציה מכנית בטמפרטורות קרות לאורך כל ההליך, ובכך מדכא את חילוף החומרים התאי. זה מבטיח שימור טוב יותר של מצב השעתוק והפרוטאומי, וממזער ממצאים פוטנציאליים. במהלך פיתוח הפרוטוקול, שמנו לב ששימוש בהומוגנייזר Dounce גדול להומוגניזציה של רקמת המוח הוא קריטי להשגת ספירת תאים גבוהה יותר עם מוות תאי נמוך יותר. סביר להניח כי במהלך הומוגניזציה של Dounce, נוכחות מסיבית של מטריצות חוץ-תאיות, פסולת תאים ורכיבים ציטופלזמיים רעילה לתאים. שימוש בכמות מופרזת של חיץ מסייע לדלל חומרים רעילים אלה, ובכך ממתן את ההשפעות המזיקות שלהם, מה שמוביל לקיום טוב יותר של התא. נתוני ציטומטריית הזרימה אישרו שיעור קיום משוער של 85% של תאי חיסון שהוכנו עם פרוטוקול זה. יתר על כן, ראוי לציין כי צנטריפוגה עם תמיסה שיפוע צפיפות של 30% בלבד מעשירה ביעילות את תאי החיסון במוח ומסירה מיאלין. זה יכול גם להפחית את עלות הכנת התא.

מחקרים על תאי מערכת החיסון במח עצם הגולגולת עדיין מוגבלים. שיטה נפוצה לבידוד תאים מקלבריום גולגולת העכבר כוללת חיתוך הגולגולת לחתיכות קטנות ולאחר מכן ריסוק מכני של החתיכות עם מזיק6. בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש בצנטריפוגה קצרה. שיטה זו לקוחה מפרוטוקול שפורסם להכנת מח עצם מעצם הירך ומטיביאס19. עבור עצמות ארוכות אלה, יש רק לחתוך קצה אחד של העצם כדי לאסוף את מח העצם על ידי צנטריפוגה. עבור הגולגולת, שלב זה משתנה על ידי חיתוך אותו למספר חתיכות קטנות כדי לפתוח את חלל המח. מומלץ להשתמש בתבנית עקבית לחיתוך הגולגולת על מנת לקבל ספירת תאים הניתנת לשחזור. יתר על כן, כדי למקסם את ההתאוששות של תאי מח העצם, חתיכות הגולגולת יכולות לעבור 2-3 סבבים של צנטריפוגה עם ערבוב בין כל צנטריפוגה.

לשני הפרוטוקולים יש מגבלות. ראשית, השימוש בצנטריפוגה של תמיסת שיפוע צפיפות של 30% עשוי שלא להסיר ביעילות את תאי הדם האדומים הנותרים במוח, מה שעלול להתרחש עקב זילוח חלקי. יתר על כן, אם מבנה המיאלין מווסת בתנאים מסוימים, תמיסת שיפוע צפיפות של 30% עשויה שלא להיות ריכוז אופטימלי להסרתם. במקרה זה, יש לקבוע ריכוז עבודה נוסף של פתרון שיפוע צפיפות. שנית, למרות שניתוח ציטומטריית זרימה מצביע על יכולת קיום טובה של תאי החיסון במוח באמצעות הפרוטוקול המתואר, עדיין יש להעריך אותו עבור יישומים אחרים, כגון ניתוח שעתוק שבו ניתן להשתמש באקטינומיצין D. שלישית, הקלבריה משמשת להכנת מח עצם הגולגולת. עם זאת, יש לציין כי תאים חיסוניים קיימים בחלקים רבים אחרים של הגולגולת. לבסוף, קרומי המוח, במיוחד הדורה מאטר, מכילים תאים חיסוניים מגוונים וממלאים תפקידים בהומאוסטזיס מוחי ובתפקוד לקוי20. לצורך ניתוח חיסוני של קרומי המוח, פרוטוקול שפורסם במקום אחר עשוי להיות מאומץ 17,21,22,23.

לסיכום, מתוארים שני פרוטוקולים חזקים לבידוד תאי מערכת החיסון הן ממוח העכבר והן מהגולגולת. פרוטוקולים אלה צפויים להיות שימושיים להשגת כמות גדולה של תאים באיכות גבוהה, המתאימים ליישומים שונים במורד הזרם.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לקתי גייג' על תרומתה המצוינת לעריכה. דמויות האיור נוצרו באמצעות BioRender.com. מחקר זה נתמך על ידי קרנות מהמחלקה להרדמה (המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק) ומענקים של NIH NS099590, HL157354 ו-NS127163.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-068
15 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide NeedleBD Biosciences305195
1x HBSSGibco14175-095
50 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339653
96-well V-bottom microplate SARSTEDT82.1583
AURORA  flow cytometerCytek bioscience
BSAFisherBP9706-100
CD11b-AF594BioLegend1012541:500 dilution
CD19-BV785BioLegend1155431:500 dilution
CD19-FITCBioLegend1155061:500 dilution
CD3-APCBioLegend1003121:500 dilution
CD3-PEBioLegend1002061:500 dilution
CD45-Alex 700BioLegend1031281:500 dilution
CD45-BV421Biolegend1031331:500 dilution
Cell Strainer 70 umAvantor732-2758
Dressing Forceps V. MuellerNL1410
EDTAInvitrogen15575-038
Fc BlockBiolegend1013201:100 dilution
ForcepsRobozRS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificN71671:500 dilution
Ly6G-BV421BioLegend1276281:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5BioLegend1276151:500 dilution
NK1.1-APC-cy7BioLegend1087231:500 dilution
Percoll (density gradient medium)Cytiva17089101
Phosphate buffer saline (10x)Gibco70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)BioLegend420302
ScissorsSKLAR64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL SizeDWK Life Sciences357544

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bohr, T., et al. The glymphatic system: Current understanding and modeling. iScience. 25 (9), 104987(2022).
  2. Jiang-Xie, L. F., et al. Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance. Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).
  3. Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases. Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).
  4. Herisson, F., et al. Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration. Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).
  5. Mazzitelli, J. A., et al. Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system. Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).
  6. Cugurra, A., et al. Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma. Science. 373 (6553), 7844(2021).
  7. Brioschi, S., et al. Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders. Science. 373 (6553), 9277(2021).
  8. Smyth, L. C. D., et al. Identification of direct connections between the dura and the brain. Nature. 627, 165-173 (2024).
  9. Mazzitelli, J. A., et al. Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels. Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).
  10. Pulous, F. E., et al. Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis. Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).
  11. Li, R., et al. Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation. J Vis Exp. (194), e65340(2023).
  12. Wang, W., et al. Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation. J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).
  13. Li, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke. J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).
  14. Wang, Y. C., et al. Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis. Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).
  15. Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain. J Vis Exp. (108), e53658(2016).
  16. Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
  17. Disano, K. D., et al. Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells. J Vis Exp. (159), e61166(2020).
  18. Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  19. Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).
  20. Su, Y., et al. Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights. J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).
  21. Niu, C., et al. Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis. STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).
  22. Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments. STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).
  23. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים