הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים

2.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66862

⸱

11 באוקטובר 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הקמנו בדיקת הרכבה מחדש של לוציפראז מפוצל כדי לפקח על המגעים האנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים. באמצעות בדיקה זו, אנו מתארים פרוטוקול למדידה כמותית של רמת הצימודים הבין-אברונים הללו בתאי HEK293T, בתנאי של טיפול כימי.

תקציר

אתרי מגע אנדופלסמיים בין רטיקולום למיטוכונדריה ממלאים תפקיד קריטי בבריאות התא ובהומאוסטזיס, כגון ויסות Ca2+ והומאוסטזיס שומנים, דינמיקה מיטוכונדריאלית, ביוגנזה אוטופגוזום ומיטופגוזום ואפופטוזיס. כישלון בשמירה על צימוד תקין בין ER למיטוכונדריה מעורב במחלות נוירודגנרטיביות רבות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת אמיוטרופית צידית ושיתוק ספסטי תורשתי. יש חשיבות רבה לחקור כיצד חוסר ויסות של מגעים מיטוכונדריאליים בחדר מיון יכול להוביל למוות של תאים, והאם תיקון מגעים אלה לרמה נורמלית יכול לשפר מצבים נוירודגנרטיביים. לפיכך, בדיקות משופרות המודדות את רמת המגעים הללו יכולות לסייע להאיר את המנגנונים הפתוגניים של מחלות אלה. בסופו של דבר, הקמת בדיקות פשוטות ואמינות תקל על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות. כאן אנו מתארים בדיקת פיצול-לוציפראז כדי למדוד כמותית את רמת המגעים של ER-מיטוכונדריה בתאים חיים. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי ללמוד את התפקיד הפתופיזיולוגי של מגעים אלה, כמו גם לזהות את המודולטורים שלהם בסינון בתפוקה גבוהה.

מבוא

יחסי הגומלין בין חדר המיון למיטוכונדריה חיוניים להומאוסטזיס תאי ולהישרדות 1,2,3,4. עדויות קודמות מצביעות על כך שכל סוג של הפרעה או חוסר ויסות באתרי הקשר של ER-מיטוכונדריה יכול לתרום למספר מחלות נוירודגנרטיביות, מטבוליות וכלי דם, כמו גם סרטן 5,6,7,8,9,10. לדוגמה, עלייה חריגה של ספיגת Ca2+ במיטוכונדריה יכולה להוביל למוות תאי על ידי פתיחת נקבוביות מעבר חדירות מיטוכונדריה, אשר נראות בדרך כלל במודלים מסוימים של מחלת אלצהיימר 5,11. באופן דומה, מגע מופחת של ER-מיטוכונדריה יכול לגרום לירידה בייצור ATP ולפגיעה בצריכת Ca2+, כפי שניתן לראות במודלים של טרשת אמיוטרופית צידית 5,11,12. ככל שמתבצעים מחקרים נוספים בתחום המגעים בין המיטוכונדריה ל-ER, מתגלים חלבונים וגנים נוספים הקשורים למחלה שעשויים להשפיע על מגעים אלה. למרות הידע והראיות הנוכחיים המציגים את תפקידם של אתרי הקשר בין המיטוכונדריה למיון, עדיין נדרשת עבודה רבה כדי להבהיר כיצד מגעים אלה עלולים להוביל לאובדן תפקוד תאי ובסופו של דבר למוות תאי.

פותחו שיטות שונות להערכת הקרבה של שני הממברנות, המורפולוגיה המבנית, והמרחק בין שני אתרי המגע עם אברונים 3,4,13. הגישות לניטור צימוד ER-מיטוכונדריה כוללות הדמיה מבוססת סמן פלואורסצנטי14,15, הדמיה מבוססת כתב FRET16, והדמיה מבוססת פלואורסצנטיות מפוצלת17,18, המשתמשות באפיפלואורסנציה ומיקרוסקופ קונפוקלי. מיקרוסקופיה ברזולוציית על וברזולוציה אטומית הם גם כלים רבי עוצמה להדמיה מדויקת של מגעים בין אברונים, אם כי השימוש בהם בניתוח אתרי מגע עדיין מוגבל מכיוון שהם דורשים מיקרוסקופים ייעודיים ביותר ומומחיות טכנית19. בנוסף, מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), וטכניקות EM אחרות כגון טומוגרפיית אלקטרונים (ET) ומיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים, משמשים בדרך כלל מכיוון שהם מספקים הדמיה אולטרה-מבנית ברזולוציה גבוהה של אתרי המגע, שלעתים קרובות בלתי אפשרי לחקור באמצעות גישות ניסיוניות אחרות 20,21,22. עם זאת, שיטות מבוססות EM אלה הן טכניקת תפוקה נמוכה מאוד שיכולה להיות מושפעת גם מהליכי קיבוע כימיים. לאחרונה, שיטות מבוססות תיוג קרבה שימשו לזיהוי אתרי מגע, כמו גם לזיהוי חלבונים חדשים באתר מגע. לדוגמה, בדיקת קשירת קרבה (PLA) שימשה לכימות קרבת אברונים23,24, בעוד שגרסה מתוקנת של בדיקת אסקורבט פרוקסידאז (APEX) שימשה לזיהוי חלבונים חדשים באתר מגע25,26. חשוב להכיר בכך שלכל השיטות הללו שתוארו לעיל יש חוזקות ומגבלות מהותיות בזיהוי המגעים בין האברונים. לפיכך, זיווג של טכניקות שונות נדרש כדי לקבל פרשנות יסודית של אתרי הקשר אברונים.

בעבר הקמנו את בדיקת ההרכבה מחדש split-Renilla luciferase 8 (split-Rluc assay) כדי לנטר את רמת המגעים של קרום המיטוכונדריה ER-מיטוכונדריה (איור 1A)24,26,27. בקצרה, כל חצי מפוצל של Renilla luciferase מצומד עם רצף מיקוד ER או מיטוכונדריה. כאשר מדביקים יחד, כל מחצית מפוצלת של האנזים מתבטאת במיון או בקרום המיטוכונדריאלי. כאשר חדר המיון והמיטוכונדריה ממוקמים בסמיכות זה לזה, החצאים המפוצלים מתאחדים ומרכיבים מחדש את כל האנזים עם פעילות לוציפראז. עבור המבנה split-Rluc, השתמשנו Renilla luciferase 8 (Rluc8) ב pBAD/Myc-His27 עבור התבנית הראשונית. אתר הפיצול (בין חומצות אמינו 91 ו-92) נקבע על סמך דיווחים קודמים27. עבור המחצית ה-N-terminal של ה-Rluc8, רצפי DNA עבור חומצות אמינו 1-91 של ה-Rluc8 אוחדו לקצה ה-3' של התג FLAG ולרצף מיקוד המיטוכונדריה AKAP1 של העכבר בווקטור PCDNA3.1 TOPO על ידי PCR27. עבור חצי מסוף C המיועד למיון, רצפי DNA המקודדים חומצות אמינו 92-311 אוחדו לקצה 5' של תג myc ולרצף הלוקליזציה של שמרים UBC6 ER. כאן, שדרגנו את מבנה הפלסמיד המפוצל Rלוק כך שחצאים מפוצלים של Renilla luciferase מבוטאים בווקטור יחיד (pCAG) תחת אותו מקדם ולאחר מכן נחתכים לשני מקטעים כאשר T2A, רצף פפטידי 2A המתבקע מעצמו מווירוס Thosea asigna, מוכנס בין שני החצאים המפוצלים (איור 1B). מפת הדנ"א של פלסמיד ורצפים מופיעים בקובץ משלים 1 ובאיור משלים S1. באמצעות מערכת זו, מדדנו את ההשפעות של שלושה כימיקלים (מעכבים GTPases המעורבים פילמור אקטין ) על מגעים ER-מיטוכונדריה. בדיקת לוק מפוצלת Rזו היא מערכת בדיקה פשוטה אך חזקה לסינון בתפוקה גבוהה עבור אפנן מגע בין אברונים24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תחזוקת תאים וזריעה (יום 1)

  1. שמור על HEK293T תאים במדיה של תרבית תאים המכילה את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) (בצלחות תרבית של 100 מ"מ) באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
  2. לפני שמתחילים, בדוק את מפגש הצלחת על ידי צפייה מתחת למיקרוסקופ. כאשר התאים מגיעים למפגש של 80-90% בקירוב, התכוננו לזרוע את התאים בצלחת תרבית של 6 בארות על ידי הסרת המדיה ושטיפה עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט של דולבקו (DPBS).
  3. הסר את DPBS מצלחת התרבית ולטפל בתאים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA פנול אדום. דוגרים במשך 3 דקות, ואז מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומוסיפים 9 מ"ל של מדיה תרבותית (DMEM עם 10% FBS) כדי לעצור את תגובת הטריפסין. יש לאט לאט פיפטה למעלה ולמטה כדי להבטיח שכל התאים שעדיין דבוקים לצלחת נעקרו ממקומם. העבר את מתלה התא לצינור 50 מ"ל.
  4. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את המדיה והשהה מחדש את כדורי התא עם 1 מ"ל של מדיה טרייה (DMEM + 10% FBS).
  5. לספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer.
    1. ודא פיזור אחיד של התאים על ידי ערבול עדין של הצינור. מיד להוציא 10 μL של השעיית התא ומניחים לתוך צינור microcentrifuge 1.7 מ"ל. הוסף 90 μL של מדיה לאותו צינור.
    2. לאחר ערבוב עדין של התאים והמדיה, יש לקחת את תרחיף התא ולמרוח 10 μL על כל אחד מתאי ההמוציטומטר על ידי פיפטציה עדינה מתחת לכיסוי.
    3. באמצעות מטרה של פי 10, מקדו את קווי הרשת של ההמוציטומטר תחת מיקרוסקופ. לאחר המיקוד, ספור את מספר התאים בקבוצה אחת של 16 ריבועים (4 x 4 ריבועים) באמצעות מונה ספירה ידנית. חזור על הפעולה עד שכל ארבע הקבוצות של 16 ריבועים נספרות.
    4. חשב את המספר הכולל של תאים/מ"ל על-ידי לקיחת ספירת התאים הממוצעת (מכל אחד מ-16 ריבועי פינה) והכפלתה ב- 105.
      הערה: במקום להשתמש בהמוציטומטר כדי לספור תאים, ניתן להשתמש במונה תאים אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.
  6. לאחר השלמת ספירת התאים, התכוננו לצלחת תאים בצלחת 6 בארות בצפיפות של 7.5 × 105 תאים/באר עם 2 מ"ל מדיה/באר. בצינור 50 מ"ל, להוסיף את נפח הדרוש של תאים יחד עם 13 מ"ל של מדיה. יש להוציא 2 מ"ל מתרחיף התאים המדולל לכל אחת מ-6 הבארות.
    1. לפני הציפוי, חשב את מספר התאים הדרוש עבור 7.5 × 105 תאים/באר באמצעות C1V1 = C2V2 כאשר C1 הוא ספירת התאים הראשונית (מספר התא/מ"ל), V1 הוא הנפח הדרוש מהשעיית התא הראשונית, C2 היא צפיפות תאי היעד הרצויה (מספר תא / מ"ל), ו-V2 הוא הנפח הסופי הדרוש לזריעת תאים.
  7. לאחר הניפוק, טפחו על הצלחת בעדינות מכל הצדדים כדי לפזר את התאים ולאחר מכן הניחו אותה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 למשך הלילה.

2. פוליאתילנימין (PEI) - טרנספקציה של תאים וזריעת תאים לאחר טרנספקציה (יום 2)

  1. מוציאים את צלחת 6 הקידוחים מהחממה ושואבים את אמצעי התרבות הקיימים מכל באר. הוסף 2 מ"ל של מדיה טרייה לכל באר.
  2. העבר את התאים עם DNA פלסמיד מפוצל Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry) מומס במאגר TE (pH 8.0).
    1. עבור כל באר, ערבבו את הדנ"א (750 ננוגרם) וה-PEI (יחס הדנ"א/PEI = 1:3) ב-200 מיקרו-ליטר DMEM בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.7 מ"ל. ערבלו במהירות את הדנ"א/PEI ברמה 8 במשך כ-2 שניות כדי להבטיח שהם יתערבבו היטב יחד ליצירת מורכבות. לאחר מכן, סובבו אותו במיני צנטריפוגה לזמן קצר (<3 שניות).
    2. תנו לתערובת הדנ"א/PEI לדגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ולאחר מכן הוסיפו את התערובת (על ידי הפלתה) לפני השטח של מצע התרבית בצלחת 6 בארות המכילה תאים. טפחו על הצלחת בעדינות (לפיזור אחיד של התערובת) ודגרו עליה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך 6 שעות.
  3. בזמן הדגירה, הכינו צלחת 96 בארות מצופות פולי-D-ליזין (PDL) על ידי הוספה ראשונה של 70 מיקרוליטר PDL (50 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS) לכל באר ודגירת באינקובטור לח ב-37°C עם 5%CO2 למשך שעה אחת לפחות. הסר את תמיסת PDL ולאחר מכן לשטוף כל באר 2x עם 100 μL של DPBS. בסוף הכביסה השנייה, ודא שכל ה- DPBS הנותרים הוסרו.
  4. ב 6 שעות לאחר transfection, להתכונן לזרוע את התאים transfected בצלחת מצופה PDL 96-well.
    1. הוציאו את צלחת 6 הקידוחים המכילה תאים נגועים מהאינקובטור, שאפו החוצה את התקשורת, ושטפו כל באר עם 2 מ"ל של DPBS. לאחר הסרת DPBS, להוסיף 350 μL של 0.05% Trypsin-EDTA פנול אדום לדגור במשך 1-2 דקות. כדי לעצור את תגובת הטריפסין, הוסף 1.7 מ"ל של מדיה לכל באר.
    2. לאחר העברת התאים יחד עם מדיה לצינור 50 מ"ל, סובבו את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות בצנטריפוגה שולחנית. שאפו את התקשורת והשעו מחדש את גלולת התא עם 1 מ"ל של מדיה טרייה. ספור את מספר התאים באמצעות המוציטומטר (כמתואר בשלב 1.5).
  5. זרעו את התאים בצלחת מצופה PDL של 96 בארות בצפיפות של 4 × 104 תאים/באר ב-100 מיקרוליטר של תרבית. לשם כך, בצינור 50 מ"ל, להוסיף את נפח התאים הדרוש (ראה להלן לחישוב) יחד עם נפח מתאים של מדיה (12 מ"ל נפח כולל). באמצעות פיפטה רב ערוצית, לחלק 100 μL של תרחיף התא המדולל לתוך כל אחת 96 בארות. לדגור על התאים במשך 18 שעות באינקובטור לח ב 37 ° C עם 5% CO2.
    1. חשב את מספר התאים הדרוש עבור 4 × 104 תאים/באר באמצעות C1V1 = C2V2 כאשר C1 הוא ספירת התאים הראשונית (מספר תא / מ"ל), V1 הוא הנפח הדרוש מהשעיית התא הראשונית, C2 הוא צפיפות תאי היעד הרצויה (מספר תא / מ"ל), ו- V2 הוא הנפח הסופי הדרוש לזריעת תאים.

3. טיפול כימי ובדיקת לוציפראז בתאים חיים (יום 3)

  1. בשפופרת מיקרופוגה של 1.7 מ"ל, הכינו את שלוש התמיסות הטריות של 50 מיקרומטר רוסין (50 מ"מ מלאי ב-DMSO), 25 מיקרומטר Ehop-016 (מלאי 25 מ"מ ב-DMSO) ו-50 מיקרומטר ZCL278 (50 מ"מ מלאי ב-DMSO) על ידי דילול כל תמיסת מלאי (50 מ"מ רוסין, 25 מ"מ Ehop-016 ו-50 מ"ל ZCL278; כולם ב-DMSO) בקנ"מ 1:1,000 בכמות הנדרשת (50 מיקרוליטר לבאר × מספר בארות) של מדיית תרבות. לכל תמיסה, הוסף מצע תא חי (מלאי 50 מילימטר ב- DMSO) עבור Renilla luciferase מדולל 1:2,000 לריכוז סופי של 25 מיקרומטר. כדי לייצר פתרונות ZCL278 של 0.5, 5 ו- 50 מיקרומטר, בצע דילולים סדרתיים באמצעות 50 מיקרומטר ZCL278 הראשוניים במדיה תרבותית.
    הערה: אם זמן הדגירה הכימית הרצוי הוא פחות מ 1-1.5 שעות, התאים יכולים להיות preincducated עם מצע תא חי (עבור Renilla luciferase) במשך 1-1.5 שעות לפני שהם מטופלים עם כל כימיקל. אנו מוסיפים כימיקלים ומצע תאים חיים בו-זמנית כדי למטב את הפרוטוקול לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה.
  2. מוציאים את המדיה מכל באר של צלחת 96 בארות המכילה תאים נגועים ומוסיפים 50 μL של תערובת מדיה כימית ומצע לכל באר.
  3. לאחר הדגירה על התאים במשך שעה, שעתיים או 5 שעות, מוציאים את צלחת התרבית מהאינקובטור, מעמיסים אותה על קורא לוחות ההארה ומודדים את עוצמת ההארה.
    1. לפני שתתחיל, ודא שקורא הלוחות מופעל. גש לתוכנת קורא לוחות המיקרו וצור קובץ חדש על-ידי לחיצה על הפעלה חדשה. הגדר את הטמפרטורה של קורא הלוחות ל- 37 ° C על ידי לחיצה על אינקובטור, בדיקת אפשרות הטמפרטורה והקלדת 37 ° C. תחת פריסת לוחות, בחר באפשרות לא ידוע וציין את הבארות למדידה על-ידי לחיצה וגרירה.
    2. תחת פרוטוקול, לחץ על Luminescence ושמור על הגדרות ברירת המחדל. לאחר סיום ההתקנה, טען את הצלחת עם המכסה לקורא הלוחות ובחר Run Plate In. נקישה התחל וחלון שמירת הקובץ יופיע. שמור את הקובץ בשולחן העבודה על-ידי שינוי שמו ולחיצה על שמור.
      הערה: ההארה תמשיך להיות מיוצרת במשך >24 שעות לאחר הוספת מצע התא החי.
  4. לאחר השלמת הקריאה, הסר את הלוח מקורא הלוחות ולאחר מכן לחץ על הפעל צלחת פנימה כדי להחזיר את הקורא פנימה. לאחר השלמתה, הניחו את הצלחת בחזרה באינקובטור הלח (37°C, 5% CO2) עד לקריאה הבאה.
  5. בסיום, העבר את נתוני ההארה לתוכנית גרפים כדי להתוות יחידת הארה יחסית (RLU) (ציר y) עבור כל משתנה (לדוגמה, כימיקלים או ריכוזים) (ציר x) ולנתח את הנתונים.

4. אימות של בדיקת split-Rluc בשיטות אחרות.

  1. בצע בדיקות אחרות כגון בדיקת קשירת קרבה (PLA), מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת וניטור ספיגת סידן מיטוכונדריאלי כדי לאמת את התוצאות שהתקבלו מבדיקת split-Rluc כפי שתואר קודם לכן24.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

השתמשנו בפרוטוקול שתואר לעיל כדי למדוד את רמת המגעים של ER-מיטוכונדריה עם הוספת שלוש תרכובות הידועות כמעכבות GTPases ספציפיים. CDC42, RHO ו-RAC הם GTPases המקדמים פילמור אקטין28 כאשר הם מופעלים ומעוכבים על ידי ZCL278, Rhosin ו-Ehop-016, בהתאמה24. HEK293T תאים שהודבקו ב-split-Rluc טופלו ב-DMSO (בקרה), ZCL278 (50 מיקרומטר), רוסין (50 מיקרומטר) או Ehop-016 (25 מיקרומטר) והודגרו במשך שעה, שעתיים ו-5 שעות. באמצעות קורא לוחות מדדנו את פעילות ה-split-R luc בנקודות זמן מוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השתמשנו בבדיקת הרכבה מחדש של split-Renilla luciferase 8 (split-Rluc assay) כדי לכמת את רמת הצימודים של ER-מיטוכונדריה. במחקר זה, שינינו את המבנה המקורי של split-Rluc24 על ידי יצירת וקטור יחיד, pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry, קידוד כל רכיב split-Rluc (MitoRlucN ו- RlucCER) ורצף פפטידי 2A מפוצל מנגיף Thosea asigna כדי להבטיח ביטוי ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

המחברים מודים לד"ר ג'פרי גולדן (המרכז הרפואי סידרס-סיני) על הסקירה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ (NINDS, R01NS113516).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.7 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה SafeSealSorenson16070
צלחת 6 בארות TC מטופלארה"ב ScientificCC7682-7506
10 מ"ל טיפים לפיפטה OneTipארה"ב מדעי1110-3700
10 μ טיפים לפיפטה L OneTipארה"ב מדעי1110-3700
20-200 μ L טיפים משופעים OneTipארה"ב סיינטיפיק1111-1210
50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילןפלקון352070
96 בארות סנפיר מדפי מיקרו-צינורותThermoFisher Scientific8770-11
96 בארות צלחת TC מטופל USA ScientificCC7682-7596
100 מ"מ x 20 מ"מ TC צלחת מטופלתUSA ScientificCC7682-3394
1250 μ L טיפים OneTipUSA Scientific1112-1720
צנטריפוגה 5910  Ri - צנטריפוגה בקירורEppendorf5943000131
דימתיל סולפוקסיד, נטול מים, ≥ 99.9%סיגמא-אולדריץ'276855-100 מ"ל
DMEM, גלוקוז גבוהThermoFisher Scientific11965092
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248מתמוסס ב-DMSO; יש לאחסן בטמפרטורה של -70 מעלות; C
EnduRen מצע תא חיPromegaE6481אחסן במחירים של -70 מעלות; C
Eppendorf 2-20 μ L פיפטהאפנדורף3123000039
מחקר אפנדורף פלוס 100-1000 μ L פיפטהEppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 ומיקרו; L pipetteEppendorf3123000020
Eppendorf Research בתוספת 12 ערוציםEppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μ L פיפטהאפנדורף 
3123000055 סרום בקר עוברי, אזורים מוסמכים ומאושרים על ידי USDAThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2  חממה, 184 ליטר, נירוסטה מלוטשתThermoFisher Scientific381
מונה ידייםSigma-AldrichHS6594
HEK 293T CellsATCCCRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, תא ספירה כפולהLW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE BufferThermoFisher Scientific8019005
מיקרוסקופZeissAxiovert 25 CFL
מיני צנטריפוגהבנצ'מרק מדעיC1012
מתלה רב צינורות עבור 50 מ"ל צינורות חרוטי, 15 מ"ל חרוטי ומיקרוצנטריפוגהBoekel Scientific120008
PEI MAX - Transfection כיתה ליניארי פוליאתילנימין הידרוכלוריד (MW 40,000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
פולי-D-ליזין הידרוברומידסיגמא-אולדריץ'P6407-5MG
רוזין הידרוכלורידביו-טקן טוקריס5003מתמוסס ב-DMSO; יש לאחסן בטמפרטורה של -70 מעלות; C
Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדוםThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX קורא מיקרו-פלטות מולטי-מודThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365רמה 8
VWR מערכת שאיבת ואקוםVWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794יש להמיס ב-DMSO; יש לאחסן בטמפרטורה של -70 מעלות; ג

מקורות

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בדיקת לוסיפראז מפוצלתמגעים בין הרשת האנדופלזמית למיטוכונדריהדימוי תאים חייםאתרי מגע ממברנתייםמחלות נוירודגנרטיביותסריקה בתוספת גבוההדינמיקה מיטוכונדריאליתהומאוסטזיס של סידןקורא לוחות לומינסצנציהתאי HEK293T
בדיקת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.