מאמר שיטה

סיכום פגיעה יאטרוגנית: טכניקת כריתה חשמלית למידול היצרות שופכה בחולדות

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66864

⸱

11 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University

במאמר זה

סיכום

במחקר זה, אנו מציגים מודל חולדה חדשני, יעיל ויציב של היצרות שופכה שנוצר באמצעות כריתה חשמלית של שופכת החולדה, המדמה ביעילות פגיעה יאטרוגנית שנצפתה במסגרות קליניות.

תקציר

היצרות שופכה (US) היא מצב קליני שכיח באורולוגיה, המאופיין בשכיחות גבוהה ותחלואה בכל הגילאים. הטיפולים הנוכחיים ל-US, כגון הרחבת שופכה וכריתת שופכה פנימית, אינם מצליחים לפתור את המצב באופן מלא וקשורים לשיעורים גבוהים של הישנות וסיבוכים.

בנוסף, הפתוגנזה של US אינה מובנת היטב. כדי לחקור את הפתוגנזה של US ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, חיוני להקים מודל חולדה סטנדרטי המשקף במדויק את הביטויים הקליניים. מחקר זה מתאר שיטה פשוטה וניתנת לחזרה להשראת US בחולדות באמצעות סכין חשמלית בתדר גבוה. השיטה כוללת ביצוע חתך אורכי כאשר הסכין החשמלית מכוונת למצב חיתוך מעורב חד קוטבי ב-4 וואט, מה שגורם לנזק משמעותי לשופכה. ניתוח היסטופתולוגי מראה עיבוי של האורותליום, הסתננות דלקתית וסיבי קולגן לא מאורגנים. מודל זה משכפל ביעילות פגיעה יאטרוגנית באמצעות כריתה חשמלית בשופכת החולדה. לסיכום, מחקר זה מבסס בהצלחה מודל חולדה חדש, יעיל ויציב של US המחקה מקרוב את התרחיש הקליני, ומספק כלי רב ערך למחקר נוסף על המנגנונים והטיפולים החדשים ל-US.

מבוא

היצרות השופכה (US) היא בין המצבים האורולוגיים העתיקים ביותר וממשיכה להיות נפוצה מאוד. נתונים עדכניים מצביעים על כך שיש בין 229 ל-627 מקרים של US לכל 100,000 גברים1. הסובלים מ-US חווים מגוון תסמינים כולל תסמינים בדרכי השתן התחתונות2, כאב3 והפרעות בתפקוד המיני4. קיימים מספר טיפולים רפואיים, כגון כריתת שופכה, ניתוח שופכה והרחבה5. עם זאת, טיפולים אלה מסובכים לעתים קרובות על ידי נושאים כמו דימום, זיהום ובריחת שתן, התורמים לנטל המחלה ומציגים שיעורים משתנים של הישנות 6,7. כתוצאה מכך, זיהוי הגישות הטיפוליות היעילות ביותר נותר אתגר קריטי המעסיק חוקרים וקלינאים.

US מאופיין בדרך כלל כהיצרות של השופכה הקדמית הנגרמת על ידי פיברוזיס וציקטריזציה של רירית השופכה ורקמת הספונגיוזום שמסביב8. למרות שכיחותו, הגורמים והמנגנונים העומדים בבסיס US אינם מובנים היטב, וחסרים מודלים מתאימים של בעלי חיים למחקר מעמיק. פגיעה יאטרוגנית, בעיקר מניתוח דרך השופכה, היא כיום הגורם המוביל ל-US, ומהווה 41% מהמקרים9. לכן, מודל אידיאלי של בעלי חיים למחקר בארה"ב צריך לשכפל במדויק פגיעות קליניות נפוצות, להפגין דמיון גנומי ופרוטאומי קרוב לבני אדם, ולהפגין יעילות ויציבות כאחד. מודל כזה יקל מאוד על חקירות מעמיקות יותר של הפתוגנזה של US ופיתוח טיפולים יעילים יותר.

כדי לחקור את התהליך והמנגנון הפתוגני של סוגים קליניים נפוצים, פותחו מודלים שונים של בעלי חיים באמצעות בעלי חיים גדולים כגון ארנבים10,11, כלבים12 וחזירים13,14 תוך שימוש בטכניקות כמו קרישה חשמלית, אלקטרו-כריתה15 והזרקות בלאומיצין16. עם זאת, מודלים אלה מתמודדים לעתים קרובות עם אתגרים עקב מגבלות גודל המדגם והבדלים גנטיים מבני אדם. בנוסף, יש לקחת בחשבון את העלות-תועלת של שימוש בבעלי חיים גדולים; למרות העלויות הגבוהות הכרוכות בטיפול יומיומי, בעלי חיים גדולים נושאים גם סיכונים משמעותיים לזיהום, המחייבים טיפול נרחב לאחר הניתוח והוצאות ניכרות. מתועד היטב כי מכרסמים חולקים מאפיינים פיזיולוגיים ופתולוגיים עם בני אדם במערכות איברים רבות. מחקר שנערך לאחרונה הראה הומולוגיה בין תאי דרכי השתן של בעלי חיים מכרסמים ובני אדם17. יתר על כן, עלויות הרכישה, הדיור והטיפול לאחר הניתוח בחולדות נמוכות משמעותית מאלו של בעלי חיים גדולים18. כתוצאה מכך, מודל עכברוש של ארה"ב נחשב מתאים; עם זאת, התפתחותם של מודלים כאלה בחולדות לא תוארה כראוי.

מחקרים קודמים השתמשו בכלים כירורגיים כגון להבים או מחטים כדי לגרום ל-US במודלים של חולדות19. גישה זו נקשרה לסיכונים כמו פגיעה בכלי הדם סביב השופכה, מה שמוביל לדימום משמעותי. האופי הסובייקטיבי של הליכים כירורגיים אלה יכול גם לגרום לשונות בהיקף הפגיעה המכנית, ללא קריטריונים כמותיים למודל, מה שעשוי להשפיע על הערכת תוצאות תיקון השופכה במחקרים טיפוליים עוקבים.

בהתחשב בשיקולים אלה, יש צורך ברור בפיתוח מודל חולדות אמריקאי נוסף. כדי לבסס מודל אמריקאי יעיל, חסכוני ויציב בחולדות, השתמשנו במכונת סכינים חשמלית בתדר גבוה במחקר שלנו. מודל זה יאפשר חקירות נוספות של מנגנוני US והערכה של גישות טיפוליות חדשות לפני המשך הניסויים הקליניים.

פרוטוקול

במחקר זה הועסקו עשרים חולדות ספראג-דולי זכרות בנות 6 חודשים, כל אחת במשקל 400-500 גרם. כל ההליכים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים המסונף החמישי של אוניברסיטת סון יאט-סן (מספר אישור: 00349). החיות שוכנו במתקן עם תנאי טמפרטורה ותאורה מבוקרים. מאפיין בסיסי של היצרות השופכה הוא התפתחות הצטלקות בתוך השופכה. בהתבסס על ציר הזמן שנקבע להיווצרות צלקת, המתרחשת בדרך כלל תוך 4 שבועות מהפציעה, ייעדנו את נוכחותה של רקמת צלקת ניכרת בשופכה בסימן 4 שבועות לאחר הניתוח כנקודת הסיום של הניסוי.

1. הכנת מכשירים כירורגיים

  1. הכן את החומרים הכירורגיים הבאים: קטטר מצופה טפלון (0.6 x 1 מ"מ), תפרים נספגים (6-0), מספריים לתפרים, מלקחיים לרקמות, צבת החזקת מחט, מלקחיים חלקים, יחידה אלקטרוכירורגית בתדר גבוה (איור 1), כולל הפאנל של הסכין החשמלית בתדר גבוה, סכין אלקטרוכירורגית אלקטרודה כירורגית בתדר גבוה והמוט המוליך האנאלי (ראה טבלת חומרים).
  2. נקו את אזור הניתוח עם מגבוני אלכוהול המכילים 75% אתנול.
  3. הכנה לשימוש בסכין חשמלית בתדר גבוה במצב חיתוך חשמלי חד קוטבי.
    1. חבר את הסכין החשמלית בתדר גבוה לאספקת החשמל הראשית של 220 וולט באמצעות כבל חשמל.
    2. הכנס את ידית הסכין המעוקרת הנשלטת ביד ואת המוט המוליך לשקעים שלהם (איור 1C).
      הערה: ודא שכל כבלי החשמל מחוברים היטב כדי לשמור על בטיחות הניתוח.

2. הכנת החיה

  1. משכו את הנתרן פנטוברביטל (60 מ"ג/ק"ג) למזרק.
  2. אבטח את החולדה על ידי אחיזת הזנב שלה ביד הדומיננטית והחזקת עור האוזניים והצוואר ביד הלא דומיננטית כדי להבטיח שהיא מקובעת היטב.
  3. חשפו את הבטן התחתונה של החולדה וחטאו את האזור באמצעות כדורי צמר גפן ספוגים באתנול 75%.
  4. הכנס את מחט המזרק כ-1-2 מ"מ ליד קו האמצע של הבטן התחתונה, וכוון אותה לחלל הבטן בזווית של 45 מעלות.
    הערה: תרגיש אובדן התנגדות כאשר המחט חודרת לצפק.
  5. משוך בעדינות את בוכנת המזרק לאחור כדי לוודא שאין דם או נוזל במזרק.
  6. יש להזריק לאט את הנתרן פנטוברביטל. משוך את המחט, השלם את ההזרקה וחטא את המקום שוב בכדורי צמר גפן ספוגים באתנול 75%.
  7. עקוב אחר קצב הנשימה של החולדה וצבט את כפה האחורית כדי לבדוק אם יש רפלקסים.
    הערה: ודא שהנשימה של החולדה יציבה ושהיא לא מראה רפלקסים לפני שתמשיך בניתוח.
  8. סוחטים את משחת האריתרומיצין וטובלים צמר גפן במשחה. מרחו את המשחה עם צמר גפן על קרניות שתי העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית במהלך ההליך.
  9. השתמש במכונת גילוח חשמלית כדי לגלח את הבטן התחתונה והפרינאום לאחר אישור ההרדמה.
  10. נגב שיער פזור מהאזור המגולח עם טישו רטוב במי מלח.
  11. חטאו את האזור על ידי ניגובו פעמיים עם ספוג גזה ספוג ביודופור כדי למזער גירוי בעור.
  12. הנח את החולדה המורדמת עמוק על כרית חימום המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס במצב שכיבה. הקפידו על סטריליות במהלך ההליכים הכירורגיים על ידי לבישת כפפות רפואיות.

3. הליך צנתור ופציעה בשופכה

  1. הכניסו את המוט המוליך לפי הטבעת של החולדה כדי ליצור מעגל יעיל בלולאה סגורה עבור מכונת הסכינים החשמלית בתדר גבוה (איור 2A).
  2. צנתר את השופכה של החולדה כדי לסייע במיקום ולספק תמיכה במהלך שלבי העיבוד של הניתוח.
    1. יש לשמן את קטטר השתן בשמן פרפין.
    2. חשוף את הפין על ידי סחיטת העור סביבו כדי לבלוט אותו מהבטן.
    3. יש לחטא את איבר המין של החולדה בעזרת ספוג גזה ספוג ביודופור.
    4. פתח בעדינות את פתח השופכה בעזרת מלקחיים חלקים והכנס את הקטטר המשומן לשופכה.
    5. הכנס בזהירות את הצנתר המצופה טפלון לשופכה בקצב התכווצות השופכה; הימנע מכל החדרה בכוח (איור 2B).
    6. אם נתקלים בהתנגדות, משכו בעדינות את הפין לכיוון הגחון כדי להתאים את זווית הכיפוף של הפין, והמשיכו לקדם את הקטטר לתוך שלפוחית השתן עד שהשתן יזרום החוצה (איור 2C).
    7. אשר צנתור מוצלח על ידי הקפדה על יצירת זווית של 45 מעלות עם הבטן (איור 2D).
  3. הפעל את מכונת הסכינים החשמלית בתדר גבוה, לחץ על הכפתורים של לוח הסכינים בתדר גבוה כדי לבחור את מצב החיתוך המעורב החד-קוטבי, והגדר את ההספק ל-4 וואט עבור השלבים הבאים של כריתה חשמלית של הפין שכבה אחר שכבה.
  4. יישר את החתך עם הצנתר. לחצו על הכפתור הצהוב על ידית הסכין האלקטרו-כירורגית ובצעו חתך לאורך קו סימון הצנתר מעור הפין לשכבה החיצונית של השופכה באמצעות הסכין החשמלית עד לחשיפת השופכה (איור 3A,B).
    הערה: הקפד ללחוץ על הכפתור הצהוב לכריתה חשמלית, ולא על הכפתור הכחול לקרישה חשמלית.
  5. המשיכו לבצע חתך אורכי של 0.5 ס"מ בשופכה בעזרת הסכין החשמלית, תוך הקפדה על קוטר רוחבי של 0.1 ס"מ, עד שהקטטר נראה לעין (איור 3C).
  6. לתפור את הפצע ואת העור השטחי שכבה אחר שכבה באמצעות תפרים נספגים (6-0) עם תפרים רציפים או קטועים (איור 3D,E).
  7. הסר את קטטר השופכה ומקם מחדש את הפין (איור 3F).
  8. כבה את הסכין החשמלית בתדר גבוה והסר את המוט המוליך מפי הטבעת של החולדה.
  9. נקו את חומרי הניתוח עם מגבוני אלכוהול (75% אתנול).

4. טיפול לאחר הניתוח

  1. הניחו את החולדה על כרית מחוממת (37 מעלות צלזיוס) ועקבו מקרוב אחר התאוששותה מההרדמה. שימו לב היטב למצבה הגופני של החולדה, כולל קצב הנשימה, טמפרטורת הגוף ורמת ההכרה.
    הערה: אין להחזיר את החולדה לכלוב שלה עד להחלמה מלאה.
  2. הכניסו את החולדות לכלוב נקי ומלאו את בקבוק המים במים עם מורפיום (0.4 מ"ג/ק"ג) לטיפול יומיומי בכאב לאחר ההחלמה.
  3. מתן תרופות נוגדות דלקת שאינן סטרואידיות (כגון קרפרופן, 0.5 מ"ג/ק"ג, זריקה תת עורית) להחלמה מלאה של החולדות מכאבים לאחר הניתוח.

5. הערכה היסטולוגית

  1. ארבעה שבועות לאחר הניתוח, הפעילו את רפלקס המיקטוריציה על ידי הרמת זנבות החולדות. הנח את החולדה בקופסת המתת חסד, פתח את שסתום צינור ההולכה CO2 והורד את החולדות באופן אנושי עם מנת יתר של CO2.
  2. כבה את השסתום לאחר שווידאת שהחולדה חסרת תנועה ואינה נושמת והתבוננת שהאישון מורחב. המשך להתבונן במצבה הגופני של החולדה במשך 2 דקות כדי לאשר שהמתת החסד הצליחה.
  3. הוציאו את החולדה מקופסת המתת החסד.
  4. נקו את אזור הניתוח וחומרי הניתוח עם מגבונים ספוגים באתנול 75%.
  5. נתח את הבטן כדי להתבונן במצב מילוי שלפוחית השתן ולקצור את כל השופכה.
  6. לאחר קציר השופכה מכניסים את החולדה לשקית איטום ומאחסנים אותה במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לעיבוד על ידי טכנאי מעבדה.
  7. להעריך מורפולוגית את ארה"ב לפתולוגיה גסה, תוך התמקדות בצבע והחלקות של הרקמה.
  8. צבעו את רקמת השופכה בהמטוקסילין ואאוזין (H&E) כדי להמחיש את מבנה הפצע ושכבת תאי השתן.
    1. טובלים את השקופיות בקסילן לדפרפיניזציה (2 x 5 דקות).
    2. לחות את השקופיות באתנול לפי הסדר (100% 1 x 3 דקות, 95% 1 x 3 דקות, 85% 1 x 3 דקות, 75% 1 x 3 דקות).
    3. שוטפים את המגלשות במים נטולי יונים (2 דקות).
    4. מכתים את השקופיות בהמטוקסילין (10 דקות).
    5. שוטפים את המגלשות במים נטולי יונים (5 דקות).
    6. הבדיל בין הדגימות עם תמיסת בידול (40 שניות).
    7. שטפו את המגלשות במים נטולי יונים (2 x 3 דקות).
    8. הכתים את השקופיות באאוזין (2 דקות).
    9. לחות מחדש את השקופיות באתנול בסדר (100% 1 x 3 שניות, 95% 1 x 3 שניות, 85% 1 x 3 שניות, 75% 1 x 3 שניות)
    10. טובלים את השקופיות ב-100% אתנול (דקה אחת) ושקופים את השקופיות עם קסילן (2 x 1 דקה).
    11. הוסף בלזם ניטרלי ואוטם עם הכיסוי.
  9. מרחו את כתם הטריכרום של מאסון על רקמת השופכה כדי להדגיש את מבנה סיבי הקולגן.
    1. טובלים את השקופיות בקסילן לדפרפיניזציה (2 x 5 דקות).
    2. לחות את השקופיות באתנול לפי הסדר (100% 1 x 3 דקות, 95% 1 x 3 דקות, 85% 1 x 3 דקות, 75% 1 x 3 דקות).
    3. שוטפים את המגלשות במים נטולי יונים (2 דקות).
    4. מכתימים את השקופיות בתמיסת המטוקסילין ברזל של וייגרט (5 דקות).
    5. שוטפים את המגלשות במים נטולי יונים (5 דקות).
    6. מכתים את השקופיות בביבריך סקרלט-חומצה פוקשין (5 דקות).
    7. שטפו את המגלשות במים נטולי יונים (2 x 3 דקות).
    8. מכתים את השקופיות בתמיסת חומצה פוספומוליבדית (5 דקות).
    9. יש להניח את השקופיות בתמיסת אנילין כחול (5 דקות). זרוק את התמיסה.
    10. שוטפים את המגלשות, מייבשים באמצעות אלכוהול ומנקים בקסילן.
    11. הוסף בלזם ניטרלי ואוטם עם הכיסוי.
  10. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדן TGF-β כדי להעריך את שכבת התאים האורותליים.
    1. הוסף את מאגר אחזור האנטיגן המתאים לסיר הלחץ. הנח את סיר הלחץ על משטח החימום והפעל אותו במלוא העוצמה.
    2. לאחר הרתיחה, העבירו את השקופיות ממי הברז לסיר הלחץ. העבירו מים קרים על הכיריים וחממו את המגלשות למשך 10 דקות.
    3. כבה את סיר הלחץ והסר את השקופיות. מצננים את השקופיות לטמפרטורת החדר.
    4. שוטפים את השקופיות בתמיסת PBS.
    5. סמן את שולי הדגימות בעט חוסם נוזלים.
    6. טבלו את השקופיות ב-PBS בתוספת 0.3% Triton X-100 למשך 30 דקות.
    7. שטפו את השקופיות ב-PBS עם תסיסה עדינה (2 x 5 דקות).
    8. חסום 10% סרום עיזים ב- PBS בטמפרטורת החדר (60 דקות).
    9. שאפו את המאגר החוסם ודגרו עם נוגדן ראשוני בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    10. שטפו את השקופיות עם 1x PBS (3 x 5 דקות).
    11. דגירה עם נוגדן משני המסומן בפלואורוכרום מדולל במאגר דילול נוגדנים.
    12. שטפו את השקופיות עם 1x PBS (3 x 3 דקות).
    13. הרכיב ואטום את המגלשות.
  11. סרוק דיגיטלית את השקופיות המוכתמות באמצעות אובייקט פי 40 בסורק שקופיות.
  12. נתח את התמונות ומדוד את עובי האורותליום באמצעות התוכנה המוזכרת (טבלת חומרים).
    1. פתח את התוכנה.
    2. לחץ על מחשב מקומי כדי לבחור את תמונות השקופיות המוכתמות.
    3. לחצו על 'מדוד מרחק ' כדי למדוד את עובי האורותליום.
    4. רשום את הנתונים על עובי האורותליום.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר במחקר זה ביסס בהצלחה היצרות שופכה יציבה בחולדות והוכיח יכולת שחזור גבוהה. משך הניתוחים הממוצע היה 20 דקות, ולא התעוררו בעיות טכניות במהלך ההליכים. דגימות שופכה נקטפו בהצלחה 4 שבועות לאחר ההליך.

בקבוצת הניסוי, שלפוחית השתן של החולדות הראתה סימנים של התנפחות יתר, בניגוד לקבוצת הביקורת שבה שלפוחית השתן הייתה ריקה (איור 4). תצפיות אלו מצביעות על ליקוי משמעותי בתפקוד ההתרוקנות של חולדות בעקבות המודלים הניסיוניים.

ארבעה שבועות לאחר הניתוח, אזורי הפצע התפתחו לרקמת צלקת לבנה שעווה הבולטת מפני השטח של השופכה (איור 5B), בעוד שחלקי השופכה בקבוצת הביקורת נראו חלקים ואדומים בהירים (איור 5A).

בדיקה היסטולוגית עם צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E) של השופכה הראתה עיבוי משמעותי של אורותל והצטברות לימפוציטים. בנוסף, צביעת מאסון זיהתה אזור אדמדם בולט של רקמת אפיתל השופכה ההיפרפלסטית והמטאפלסטית, המלווה בסיבי קולגן לא מסודרים (ראה איור משלים S1 לתמונות מפורטות של צביעת מאסון), המעיד על חריגות במבנה השריר החלק וסיבי הקולגן (איור 6).

ניתוח אימונופלואורסצנטי של קריוסקציות הראה עלייה ב-TGF-β ברקמת השופכה לאחר הניתוח (איור 7), מה שמצביע על כך שהיווצרות מבנה השופכה קשורה לביטוי מוגבר של TGF-β.

figure-results-1
איור 1: מכשירי מפתח ששימשו לביסוס המודל האמריקאי. (A) קטטר מצופה טפלון (0.6 x 1 מ"מ); (B) תפרים נספגים (6-0), מלקחיים לרקמות, צבת המחזיקה מחט ומלקחיים חלקים (משמאל לימין); (ג) עט אלקטרו-כירורגי בתדר גבוה ומוט מוליך אנאלי; (ד) הפאנל של הסכין החשמלית בתדר גבוה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: הכנות לניתוח. (A) לגלח את חצי הבטן התחתונה של החולדה ולחבר את מוט המוליך האנאלי. (ב-ד) המחיש את מיקום צנתר השופכה בתוך השופכה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תהליך האלקטרו-כריתה. (A) מראה יצירת חתך אורכי על עור הפין בגודל 0.8 ס"מ; (ב) חשיפת השופכה; (C) מפרט את החתך החשמלי דרך כל שכבות דופן השופכה עד שהקטטר בתוך השופכה נראה לעין. (ד,ה) מתאר את הסרת קטטר השופכה ומיקום מחדש של הפין. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: מצב המילוי של שלפוחית השתן בחולדות בתנאים אנטומיים. (A) כולל שלפוחית ריקה מחולדות בקבוצת הביקורת; (B) מראה שלפוחית שלפוחית מלאה יתר על המידה מחולדות בקבוצת הניסוי. שלפוחית השתן נמצאת בתוך קווי המתאר המקווקו האדומים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: ממצאים מקרוסקופיים של דגימות השופכה שנכרתו. (A) רקמת השופכה הרגילה. (B) רקמת הצלקת של השופכה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: תוצאות היסטולוגיה של דגימות השופכה. (A) רקמת שופכה מקבוצת הביקורת מוכתמת ב-H&E (הגדלה מקורית, פי 100). (B) צביעת הטריכרום של מאסון של מסת שופכה בהגדלה מקורית פי 100. (C) הגדלה ונתוני המדידה של עובי אורותליום תקין, שהוא 85.9 מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (D) מראה צביעת H&E של רקמת השופכה מקבוצת הניסוי בהגדלה מקורית פי 100. (E) מתאר את הצביעה הטריכרומית של מאסון של רקמת השופכה מקבוצת הניסוי, גם היא בהגדלה מקורית פי 100. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. (F) הגדלת צלקת השופכה ונתוני המדידה של אורותליום מעובה-231.2 מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: ממצאים אימונוהיסטוכימיים על דגימות שופכה שנכרתו. תיוג נוגדנים TGF-β מדגיש תאים אורותליים; פלואורסצנציה ירוקה נפלטת עם קשירת הנוגדן לתאים. (א-ג) הראה עוצמת אות נמוכה יותר בתאי אורותל של קבוצת הביקורת בהשוואה לעוצמת אות גבוהה יותר (D-F) בתאי אורותל בקבוצת הניסוי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: התמונה השלמה של צביעת מאסון של דגימות שופכה. (A) צביעת מאסון של קבוצת הביקורת; (B) צביעת מאסון של קבוצת הניסוי. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

ארה"ב מהווה נטל בריאותי משמעותי עם השפעה כלכלית משמעותית, המשפיעה לרעה על הרווחה הפסיכולוגית והפיזית20. עדיין יש צורך בטיפול שלא רק מרפא אותנו לחלוטין אלא גם מונע ביעילות את הישנותה.

במחקר זה, השתמשנו במודל חולדה כדי לפתח שיטה פשוטה וניתנת לשחזור לחיקוי פגיעה בשופכה בחולים, שלאחריה פגיעה בשופכה הנגרמת על ידי ניתוח דרך השופכה. חולדות מועדפות כמודלים של בעלי חיים מכיוון שהן חסכוניות, קלות לטיפול, מציעות חזרתיות ומספקות נתונים אמינים. למודל החולדה ששימש במחקר זה יש מספר יתרונות על פני מודלים אחרים: הוא נפוץ בניתוחי אומיקס שונים וקל לניהול. בנוסף, הדמיון בביטוי הגנים של תאי אפיתל בדרכי השתן בין מכרסמים לבני אדם הופך את מודל החולדות US למתאים במיוחד למחקרים מעמיקיםיותר 21.

כפי שניתן לראות באיור 7, TGF-β התבטא בכל מעגל השופכה הן בקבוצת הביקורת והן בקבוצת הניסוי, והביטוי של TGF-β בקבוצת הניסוי היה גבוה באופן ניכר מקבוצת הביקורת. עבודות קודמות תיעדו כי תאי האורותל המקומיים עוברים למעשה מעבר פנוטיפי למיופיברובלסטים לאחר הפגיעה, שהתהליך שלו מונע בעיקר על ידי TGF-β, אשר מפעיל השפעות משמעותיות על היווצרות צלקת על ידי ויסות ייצור ECM (מטריצה חוץ-תאית), אפנון חיסוני, התפשטות תאים, נדידה והתמיינות22,23. הממצאים שלנו מצביעים על כך שביטוי יתר של TGF-β עשוי לקדם היווצרות צלקת בשופכה, והפרשת TGF-β אינה מוגבלת לתאים השוכנים במשטח הפצע אלא דורשת השתתפות של השופכה כולה.

הקוטר הקטן והעקמומיות של שופכת החולדה הזכרית מציבים אתגרים באיתור שינויים באורודינמיקה לאחר המודל. יש מחסור במחקר על שיטות להערכת תפקוד השתן בחולדות זכרים. במחקר זה, השתמשנו בשיטות עקיפות כדי לצפות בשינויים בתפקוד השתן על ידי הערכת מצב מילוי שלפוחית השתן 4 שבועות לאחר הניתוח. עם גירוי רפלקס המיקטוריציה, התצפית על בטן החולדה המנותחת הראתה כי קבוצת הניסוי הפגינה מלאות מתמשכת בשלפוחית השתן, המעידה על ליקוי משמעותי בתפקוד ההתרוקנות לאחר המודל. ממצאים אלה עולים בקנה אחד עם הסימפטומים הקליניים של קשיי מתן שתן שחווים חולים עם היצרות שופכה24. עם זאת, פיתוח שיטות לביצוע מחקרים פיזיולוגיים על פרמטרים של שתן בחולדות זכרים, כגון תדירות התרוקנות, נפח ריקון ממוצע ויעילות התרוקנות, נותר אתגר.

בחירת המצבים והגדרות ההספק של סכינים חשמליות בתדר גבוה משפיעה באופן קריטי על מידת הפציעה בפרוצדורות כירורגיות. מחקר זה מציג טכניקה כירורגית המבטיחה רמת פציעה מתאימה, ורמה נאותה של הסכין החשמלית בתדר גבוה שהיא 4 וואט לפיתוח מודל אמריקאי בחולדות. השיטה הנפוצה ביותר בדגמי חולדות בארה"ב כוללת ביצוע חתכים עם מחט או אזמל25. עם זאת, שימוש באזמל נוטה להגביר את הסבירות לדימום מתמשך בשל המשטח החלק והקוטר הקטן של השופכה של החולדה, מה שעלול לפגוע בשוגג בכלי הדם שמסביב.

הסכין בתדר גבוה מציעה יתרון משמעותי בכך שהיא מספקת המוסטזיס בו זמנית באמצעות הפעלת זרם חשמלי יציב ומתכוונן על רקמות, מה שמשפר את היציבות והנוחות של ההליך. בנוסף, יכולת השליטה של הגדרת ההספק מאפשרת הערכה ניתנת לכימות של הנזק שנגרם.

פרוטוקול ניסוי אידיאלי ייצר באופן עקבי פצעי שופכה בגודל ועומק אחידים. במחקר זה, נבחר מצב החיתוך המעורב החד-קוטבי כדי לגרום לנזק לשופכה. בניגוד למצב האלקטרו-קואגולציה, הגורם בעיקר לנידוף של רכיבים נוזליים, ייבוש, קרישת רקמות ואיטום כלי דם ללא קרע ברקמות - מה שמוביל לצריבת רקמות והדבקה מהירה - מצב החיתוך מאפשר חתכים מדויקים שכבה אחר שכבה ברקמת הפין. בעוד שקרישה חשמלית שימשה בדרך כלל בדגמי ארנב בארה"ב ודורשת צעדים נוספים כגון הפרדת הפין מהרדיום וביצוע חתכים עם מכשירים כירורגיים אחרים26, מה שמגביר את סיכוני הטראומה והסיבוכים של בעלי חיים, מצב החיתוך המעורב החד-קוטבי מאפשר חתכים ישירים לתוך העורלה כדי לחשוף את השופכה. שיטה זו משפרת את היעילות התפעולית וממזערת את הטראומה לחיות הניסוי.

הגדרת הכוח במחקר הקודם לא צוינה בפירוט, מכיוון שהיא תלויה בדרך כלל במשקל חיות הניסוי ובאזור המגע בין הסכין האלקטרונית לרקמה. במחקר זה, נבדקי הניסוי היו חולדות SD בנות 6 חודשים במשקל של בין 400 גרם ל-500 גרם. בתנאים אלה, הגדרת ההספק האופטימלית נקבעה בין 4-7 וואט, מה שאפשר שליטה מדויקת על גודל ועומק החתך. אנו ממליצים למפעילים להתחיל עם הגדרת הספק נמוכה יותר בעת השימוש הראשון בסכין בתדר גבוה לפיתוח מודל החולדה האמריקאי, ולהתאים לפי הצורך כדי למצוא את הערך המתאים ביותר לתנאים שונים.

יתר על כן, שלב קריטי אחד הוא צנתור השופכה של החולדות לפני הניתוח. צנתור מוצלח מאושר כאשר הצנתר ממוקם כהלכה בשלפוחית השתן. למרות שהקטטר משמש כפיגום זמני, עליו לשמור על מיקום השופכה ולסייע בזיהוי אתר הניתוח. לשופכה של החולדה הזכר יש קוטר קטן יחסית, ויש מרווח מוגבל בין העורלה לרקמת הפין, מה שמקל על הכנסת הקטטר בטעות לפתח הלא נכון, מה שעלול לסבך את ההליכים הבאים. המיקום הנכון של הקטטר מאומת כאשר השתן זורם החוצה, מה שמצביע על כך שהוא נמצא היטב בתוך שלפוחית השתן. בנוסף, יש למקם את הפין המצונתר בזווית של 45 מעלות כדי לשפר את היציבות בתוך השופכה ולהקל על ההליך הכירורגי.

לסיכום, מחקר זה מדגים שיטה חדשנית, יעילה וחסכונית ביותר ליצירת מודל אמריקאי בחולדות. שיטה זו מאופיינת בפשטות, אחוזי הצלחה גבוהים ויציבות, ומציעה כלי רב ערך לבחינת מגוון רחב של טיפולים חדשניים להיצרות השופכה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (מס' 2019A1515012116 ומס' 2022A1515012559).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תפרים נספגים (6-0)KERONG COMPANYKR2230814
משטח ניתוח לבעלי חייםמסופק על ידי מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג להדמיה ביו-רפואיתNA
CaseViewer 2.43DHISTECH Ltd.
קרפרופןסיגמא-אולדריץ'MFCD00079028
CoraLite488-מצומד עיזים אנטי-ארנב IgG(H+L)ProteintechSA00013-2
H& ערכת כתמים EAbcamab150669
  יחידה אלקטרוכירורגית בתדר גבוהבייג'ינג Taktvoll Technology CompanyES-100v
Masson ערכת צביעהMerckHT15
צבת החזקת מחטRWD Life ScienceS15001-11
שמן פרפיןNA
NA מלקחיים חלקיםRWD Life ScienceF13019-12
נתרן פנטוברביטלמעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג להדמיה ביו-רפואיתNA
Sprague– חולדת Dawley מרכזבעלי חיים מעבדה רפואית גואנגדונגGDMLAC-035
מספריים תפריםRWD מדעי החייםS15001-11
קטטר מצופה טפלון (0.6 מ"מ x 1 מ"מ)חברת חומרים חדשים DGZFNA
TGF Beta 1 נוגדן פוליקלונליProteintech21898-1-AP
מספריים לרקמותRWD מדעי החייםS13029-14

מקורות

  1. Rourke, K. F., et al. Canadian Urological Association guideline on male urethral stricture. Cuaj-Can Urol Assoc. 14 (10), 305-316 (2020).
  2. Cotter, K. J., et al. Prevalence of post-micturition incontinence before and after anterior urethroplasty. J Urol. 200 (4), 843-847 (2018).
  3. Bertrand, L. A., et al. Lower urinary tract pain and anterior urethral stricture disease: Prevalence and effects of urethral reconstruction. J Urol. 193 (1), 184-189 (2015).
  4. Mondal, S., Bandyopadhyay, A., Mandal, M. M., Pal, D. K. Erectile dysfunction in anterior urethral strictures after urethroplasty with reference to vascular parameters. Med J Armed Forces India. 72 (4), 344-349 (2016).
  5. Campos-Juanatey, F., et al. European association of urology guidelines on urethral stricture disease (part 2): Diagnosis, perioperative management, and follow-up in males. Eur Urol. 80 (2), 201-212 (2021).
  6. Hoy, N. Y., Chapman, D. W., Dean, N., Rourke, K. F. Incidence and predictors of complications due to urethral stricture in patients awaiting urethroplasty. J Urol. 199 (3), 754-759 (2018).
  7. Anger, J. T., Buckley, J. C., Santucci, R. A., Elliott, S. P., Saigal, C. S. Trends in stricture management among male medicare beneficiaries: Underuse of urethroplasty. Urology. 77 (2), 481-485 (2011).
  8. Milenkovic, U., Albersen, M., Castiglione, F. The mechanisms and potential of stem cell therapy for penile fibrosis. Nat Rev Urol. 16 (2), 79-97 (2018).
  9. European Association of Urology. EAU guidelines on urethral-strictures. , Available from: https://uroweb.org/guidelines/urethral-strictures (2023).
  10. Faydacı, G., et al. Comparison of two experimental models for urethral stricture in the anterior urethra of the male rabbit. Urology. 80 (1), 225.e7-225.e11 (2012).
  11. Yang, M., et al. Urine-microenvironment-initiated composite hydrogel patch reconfiguration propels scarless memory repair and reinvigoration of the urethra. Adv Mater. 34 (14), 210952(2022).
  12. Orabi, H., Aboushwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: A preclinical study. Eur Urol. 63 (3), 531-538 (2013).
  13. Sievert, K. -D., et al. Introducing a large animal model to create urethral stricture similar to human stricture disease: A comparative experimental microscopic study. J Urol. 187 (3), 1101-1109 (2012).
  14. Sievert, K. -D., et al. Urethroplasty performed with an autologous urothelium-vegetated collagen fleece to treat urethral stricture in the minipig model. World J Urol. 38 (9), 2123-2131 (2019).
  15. Hu, W. -F., Li, C. -L., Zhang, H. -P., Li, T. -T., Zeng, X. -Y. An experimental model of urethral stricture in rabbits using holmium laser under urethroscopic direct visualization. Urol Int. 93 (1), 108-112 (2014).
  16. Hua, X., et al. An experimental model of anterior urethral stricture in rabbits with local injections of bleomycin. Urology. 116, 230.e9-230.e15 (2018).
  17. Strittmatter, F., et al. Expression of fatty acid amide hydrolase (faah) in human, mouse, and rat urinary bladder and effects of faah inhibition on bladder function in awake rats. Eur Urol. 61 (1), 98-106 (2012).
  18. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  19. Castiglione, F., et al. Adipose-derived stem cells counteract urethral stricture formation in rats. Eur Urol. 70 (6), 1032-1041 (2016).
  20. Cheng, X., et al. The changing trend in clinical characteristics and outcomes of male patients with urethral stricture over the past 10 years in China. Front Public Health. 9 (794451), 1-8 (2021).
  21. Yu, Z., et al. Single-cell transcriptomic map of the human and mouse bladders. J Am Soc Nephrol. 30 (11), 2159-2176 (2019).
  22. Lichtman, M. K., Otero-Vinas, M., Falanga, V. Transforming growth factor beta (tgf-β) isoforms in wound healing and fibrosis. Wound Repair Regen. 24 (2), 215-222 (2016).
  23. Tatler, A. L., Jenkins, G. Tgf-β activation and lung fibrosis. Proc Am Thorac Soc. 9 (3), 130-136 (2012).
  24. Palminteri, E., et al. Contemporary urethral stricture characteristics in the developed world. Urology. 81 (1), 191-197 (2013).
  25. Hedlund, P., Streng, T., Lee, T., Andersson, K. -E. Effects of tolterodine on afferent neurotransmission in normal and resiniferatoxin treated conscious rats. J Urol. 178 (1), 326-331 (2007).
  26. Yao, H. -J., et al. Three new experimental models of anterior urethral stricture in rabbits. Transl Androl Urol. 11 (6), 761-772 (2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים