הכנת מיקרוספרות נתרן אלגינט צולבות עם יוני מתכת שונים בטכנולוגיית אלקטרוספריי מיקרופלואידית

סיכום

הפרוטוקול מתאר הכנה של מיקרוספרות נתרן אלגינט מוצלבות עם יוני מתכת שונים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי לתכנון נשאות תרופות. התכונות האנטי-מיקרוביאליות והשחרור האיטי של תרופות אלה נחקרו גם כן.

תקציר

מיקרוספרות הן חלקיקים בגודל מיקרומטרי שיכולים לטעון ולשחרר בהדרגה תרופות באמצעות אנקפסולציה פיזית או ספיחה על פני השטח ובתוך פולימרים. בתחום הביו-רפואה, מיקרוספרות הידרוג'ל נחקרו בהרחבה ליישומן כנשאיות תרופות בשל יכולתן להפחית את תדירות מתן התרופות, למזער תופעות לוואי ולשפר את היענות המטופלים. נתרן אלגינט (ALG) הוא פוליסכריד ליניארי טבעי עם שלושה קשרים גליקוזידים בעמוד השדרה. ישנן שתי קבוצות הידרוקסיל עזר נוכחים בכל אחד moieties של פולימר, אשר יש את המאפיינים של אלכוהול hydroxyl moiety. יחידות ה-ALG הסינתטיות יכולות לעבור תגובות כימיות צולבות עם יוני מתכת, וליצור מבנה רשת צולב של ערימות פולימרים, ובסופו של דבר ליצור הידרוג'ל. מיקרוספרות הידרוג'ל ניתן להכין באמצעות תהליך פשוט המערב את תכונות הקישור היוני של ALG. במחקר זה הכנו מיקרוספרות הידרוג'ל מבוססות ALG (ALGMS) באמצעות אסטרטגיית אלקטרודפוזיציה מיקרופלואידית. מיקרוספרות ההידרוג'ל שהוכנו היו בגודל אחיד ומפוזרות היטב, הודות לבקרה מדויקת של זרימת האלקטרופלואיד. ALGMS הצולבים עם יוני מתכת שונים הוכנו בטכניקת אלקטרוספריי מיקרופלואידית המשלבת שדה מיקרופלואידי ושדה חשמלי גבוה, ונחקרו תכונותיו האנטי-מיקרוביאליות, יכולת שחרור תרופות איטית ותאימות ביולוגית. טכנולוגיה זו טומנת בחובה הבטחה ליישום בפיתוח וייצור תרופות מתקדמות.

מבוא

מערכות אספקת תרופות הן מוקד מחקרי בתחום הנדסת ביו-רקמות, במטרה לשפר את יעילות ויעילות אספקת התרופות ולהפחית תגובות שליליות ותופעות לוואי¹. בין מערכות אלה, מיקרוספרות הידרוג'ל, המאופיינות בתאימות ביולוגית טובה, תכונות מכניות מתכווננות ופלסטיות פונקציונלית, הן אחד הכלים הנפוצים ביותר להעמסה ומשלוח של תרופות². הם יכולים לשמש הן לשחרור איטי ומבוקר של תרופות, לספק השפעות הגנה טובות לתרופות, להימנע או למזער השפעות לא ספציפיות של תרופות ברקמות אחרות, ולכוון משלוח תרופות למבני רקמות ספציפיים³. לכן, מיקרוספרות הידרוג'ל הפכו למערכת אספקת תרופות חדשה ויעילה, כאשר המחקר בתחום זה מתפתח בהדרגה⁴.

מיקרוספרות הידרוג'ל מסונתזות בדרך כלל מחומרים מתכלים, כולל פוליסכרידים, חלבונים ופולימרים טבעיים⁵. ביניהם, ALG הוא פוליסכריד תואם ביולוגית, מתכלה המופק מאצות חומות ימיות⁶. השרשרת המולקולרית שלו מכילה קבוצות הידרוקסיל וקרבוקסיל חופשיות שיכולות להצליב עם רוב הקטיונים הדו-ערכיים או הרב-ערכיים ליצירת מבנה הידרוג'ל בלתי מסיס במים עם רשת תלת ממדית⁵. מיקרוספרות הידרוג'ל שנוצרו על ידי ALG ניתן להמיר פוליאלקטרוליטים טעונים שלילית בתמיסות ניטרליות אלקליין. דחייה זו בין מטענים שליליים גורמת למיקרוספרות להתנפח, ומאפשרת שחרור של החומר הפעיל או התרופה העטופים. תכונות אלה הובילו להתייחסות למיקרוספרות ALG כנשאי תרופות מבטיחים הנמצאים בשימוש נרחב להעמסת תרופות ושחרור מבוקר⁷.

קיימות שיטות שונות להכנת מיקרוספרות הידרוג'ל. שיטות הכנה מסורתיות של ALGMS כוללות בדרך כלל את שיטת סול-ג'ל או שיטת תחליב-סול. שיטות אלה כוללות צעדים כגון משקעים, משקעים משותפים ותגובות ג'לציה כדי להשיג את מיקרוספרות המטרה⁸. בשנים האחרונות, עם ההתפתחות המתמדת של הטכנולוגיה המיקרופלואידית, שיטת האלקטרוספריי המיקרופלואידית הפכה בהדרגה לשיטת הכנה יעילה ומדויקת למיקרוספירה⁹. שיטה זו משתמשת בטכנולוגיה מיקרופלואידית כדי לרסס תמיסת פולימר באמצעות זרבובית מיקרו-עדינה כדי ליצור טיפות מיקרומטריות ומיקרוספרות במהלך תהליך הריפוי או הקישור הצולב,¹⁰. בהשוואה לשיטה המסורתית, אלקטרוספריי מיקרופלואידי מציע שליטה מדויקת בגודל חלקיקי המיקרספירה, ומורפולוגיה על ידי התאמת פרמטרים כגון קצב זרימת תמיסה, מתח וגודל זרבובית עדינה¹¹. הוא גם מאפשר הכנה רציפה במהירות גבוהה של מיקרוספרות, שיפור יעילות ההכנה ושמירה על תנאי תגובה מתונים. בנוסף, ALGMS יכול להיות מוכן להיות בעל פונקציות שונות, כגון תרופות שחרור מבוקר זרזים טעונים, המאפשר יישום קל שלהם בתחומים שונים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת מיקרוספרות ALG בשיטת אלקטרוספריי מיקרופלואידית. התהליך כולל העברת תמיסת ALG דרך מכשיר מיקרופלואידי וחשיפתה לאלקטרוספריי. הטיפות שהתקבלו נאספו בתמיסה שהכילה יוני מתכת שונים (Ca²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ ו-Fe³⁺) כדי ליזום את תגובת הקישור הצולב. תגובה זו משפרת את היציבות וההיצמדות של המיקרוספרות ומקנה להם פונקציות שונות. שיטה זו קלה לביצוע, והמיקרוספרות המסונתזות מציגות אחידות גודל טובה במורפולוגיה שלהן. נוסף על כך, חקרנו את הסגולות האנטי-בקטריאליות שלהם, את יכולת שחרור התרופות האיטי ואת התאימות הביולוגית. פרוטוקול זה יהיה שימושי להמשך פיתוח וייצור תרופות.

פרוטוקול

הדם ששימש בניסויים התקבל מנקבות עכברים בדרגת SPF BALB/c במשקל 20-25 גרם ובנות כ-7 שבועות. ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של מכללת ג'ג'יאנג שורן אישרה את כל הליכי הטיפול והניסויים בבעלי חיים.

1. הכנת פתרון

1. יש לשקול ALG ולהמיס במים טהורים במיוחד על ידי ערבוב באמבט מים בטמפרטורה של 50°C לקבלת תמיסת ALG של 2%.
2. הכן בנפרד חלק מסה עם 5% (או ריכוז המסה המולרית הוא 0.3 M) תמיסות של CaCl₂, FeCl₃, ZnSO₄ ו- CuSO₄ במים טהורים במיוחד. יוצקים כל תמיסה בנפרד לצלחת איסוף.

2. מכשיר אלקטרוספריי מיקרופלואידי

1. קחו צינור נימי זכוכית והניחו אותו מעל להבת ניפוח כדי להתרכך, ואז מתחו אותו לקטרים שונים (50 מיקרומטר-500 מיקרומטר). חתכו את החלקים העדינים עם חותך זכוכית ולטשו בעדינות את יציאת החוד עם נייר זכוכית סיליקון קרביד באיכות גבוהה. לאחר הניקוי, חברו את הקצה העבה של צינור הנימים לצינור ארוך ואת הקצה השני של הצינור למחט ניפוק ולמזרק בנפח 5 מ"ל (איור משלים 1).
   הערה: קשה להכניס קצוות חדים של חתכי צינור זכוכית לצינור; לכן, יש לעגל את ההפסקה בקצה הלהבה.
2. חבר את המזרק למשאבת המזרק המיקרופלואידית ואת צינור הנימים בקצה אחד למחזיק. חבר את תפס הקצה האדום במתח גבוה של ספק הכוח במתח גבוה למחט הניפוק של המזרק והנח את האטב הכסוף בנוזל האיסוף. תצורה זו יוצרת התקן אלקטרוספריי מיקרופלואידי פשוט (איור 1A).
   הערה: הנח את צינור הנימים בניצב לשולחן.

3. הכנת מיקרוספרות ALG

1. הניחו את כלי האיסוף הנפרדים המכילים יוני מתכת שונים ישירות מתחת לצינור הנימים. הפעל את משאבת המזרק המיקרופלואידית ובחר Fast Forward כדי להפעיל את הצינור עם ALG, ולאחר מכן הגדר את קצב הזרימה המתאים (2 מ"ל / שעה).
2. הפעל את מתג ההפעלה במתח גבוה וסובב את הידית כדי להגדיר את המתח המתאים (5-7 קילו וולט).
3. הוסיפו תמיסת 20 מ"ל לכל אחת מצלחות הפטרי בקוטר 90 מ"מ כדי לאסוף מיקרוספרות ALG ליצירת ALGMS מוצלבים עם יוני מתכת שונים (איור 1B).
4. ALG יוצרת מיקרוספרות תחת פעולת השדה החשמלי וכוח הכבידה בתמיסות איסוף יונים שונות תוך מספר שניות. שאפו את המיקרוספרות עם פיפטה מעוקרת והעבירו אותן לצינורות צנטריפוגות בודדות של 1.5 מ"ל כדי לקבל מיקרוספרות הידרוג'ל Zn²⁺, Ca²⁺, Cu²⁺ ו-Fe³⁺ -ALG (איור 1C). תייגו את הצינורות Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS ו-Fe-ALGMS.
   הערה: ניתן להשיג מיקרוספרות בקטרים שונים על ידי התאמת פרמטרים כגון מתח, קוטר קצה, קצב זרימה וריכוז תמיסה.
5. קח כמות קטנה של microspheres מוכנים, לפזר אותם באופן שווה ככל האפשר PBS, ומניחים אותם תחת מיקרוסקופ להדמיה.
6. נבחרו באופן אקראי 10 שדות תצפית באותה אצווה של מיקרוספרות, ייבאו את התמונות שיימדדו לתוכנת ImageJ, המירו את התמונות למצב גווני אפור מתאים, והשתמשו בטכנולוגיית פילוח הסף כדי להגדיר במדויק את שטח חלקיקי המטרה ולהתחיל את הפונקציה של ניתוח החלקיקים כך ש- ImageJ תוכל לזהות ולמדוד את חלקיקי המטרה. קבל נתונים על המיקרוספרות ולאחר מכן ייבא את הנתונים לתוכנת המקור לצורך ניתוח ומיפוי גודל חלקיקים.

4. בדיקת ביצועים מיקרוביאלית

1. הכינו תרחיפים של 5 מ"ל של Staphylococcus aureus (S. aureus) ו-Escherichia coli (E. coli) עם עכירות חיידקית התחלתית של 0.2 mcF באמצעות מדיום Luria-Bertani נוזלי (LB).
2. הוסף 10 מ"ל מכל תמיסה חיידקית ל -4 צינורות צנטריפוגות סטריליות בודדות של 15 מ"ל. לאחר מכן, הוסף 0.5 מ"ל של Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS ו- Fe-ALGMS ALG לכל צינור והנח אותם בשייקר בטמפרטורה קבועה ב- 37 ° C ו- 200 סל"ד למשך 12 שעות. הוסף כמות שווה של מלוחים לקבוצת הביקורת.
3. לדלל כל פתרון חיידקי ל 10⁵ פעמים עם מים סטריליים. השתמש חרוז זכוכית סטרילי כדי להפיץ 200 μL של תמיסה חיידקית על מדיום מוצק LB.
4. מורחים את התמיסה במהירות ובאופן שווה על צלחת הציפוי, תוך הימנעות קדימה ואחורה באותו אזור. לאחר מכן, מניחים את הצלחות באינקובטור ב 37 ° C במשך 12 שעות. התבוננו במושבות של קבוצות שונות.
   הערה: כל ההליכים האספטיים צריכים להתבצע ליד מנורת אלכוהול. עיקור כלי תרבית מיקרוביאליים, כלי חיסון ואמצעי תרבית.

5. בדיקות שחרור סמים

1. כדי להעריך את יכולת שחרור התרופה של מיקרוספרות שונות, השתמש באלבומין בסרום בקר (BSA) כתרופת מודל טעונה. הוסף 500 μL מכל מיקרוספירה (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ו- Fe-ALGMS) לתרחיף BSA של 1 מ"ג/מ"ל למשך 24 שעות.
2. לבדיקת שחרור התרופה, יש להוסיף כל דגימה רוויה ל-5.0 מ' של מלח חוצץ פוספט (PBS; pH 7.4), ולאחר מכן תסיסה במשך 15 דקות ב-37°C עם רעידות מתמשכות ב-80 סל"ד.
3. השתמש 100 μL של התמיסה ולהחליף את המדיום עם אחד טרי ב 1, 3, 6, 12, 24, 36, ו 48 שעות.
4. כמת את ריכוזי החלבון העל-טבעי בזמנים ספציפיים באמצעות ערכת BCA בהתאם להוראות היצרן. למדוד כמותית את התרופה המשתחררת על ידי סמן אנזים כדי לקבל את הספיגה המתאימה ולהמיר את הערך הנמדד לריכוז התרופה בפועל על פי עקומת התקן. חשב את קצב שחרור התרופה באמצעות הנוסחה הבאה:
   אחוז שחרור התרופה = (ריכוז התרופה המשתחררת בנקודת זמן מסוימת / ריכוז התרופה הראשונית) x 100%
5. במרווחי זמן קבועים, הסר נפח שווה של PBS מכל באר והחלף אותו בנפח שווה של מדיום טרי.

6. בדיקת המוליזה

1. הניחו את Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ו-Fe-ALGMS המוכנים ב-PBS ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37°C למשך 24 שעות כדי לגבש את תמיסת הדגירה.
2. קבל דם שלם מעכברי BALB/c בריאים על ידי פלבוטומיה עינית, שנאספו בצינורות נוגדי קרישה המכילים נתרן ציטראט. מערבולת וצנטריפוגה ב 1509 x גרם במשך 15 דקות כדי לקבל תאי דם אדומים.
3. שטפו את תאי הדם האדומים 2x-3x עם PBS והכינו תמיסת תאי דם אדומים 10% עם PBS.
4. הכנת ALGMS שונים: קח 500 μL מכל מיקרוספירה עבור קבוצת הניסוי, 1 מ"ל מים טהורים במיוחד (ddH₂O) עבור קבוצת הביקורת החיובית, ו 1 מ"ל של תמיסת PBS עבור קבוצת הביקורת השלילית ולערבב כל אחד עם 20 μL של תמיסת תאי דם.
5. לדגור על הדגימות ב 37 ° C במשך 4 שעות, צנטריפוגה ב 1509 x גרם, 15 דקות. שמור את supernatant בצד ולצלם את תאי הדם האדומים בכל קבוצה לאחר המוליזה.
6. ניקח את שיעור ההמוליזה של קבוצת הביקורת החיובית כ- 100% ואת קבוצת הביקורת השלילית כ- 0%. למדוד את ערכי הספיגה של הסופרנאטנטים בכל קבוצה ולחשב את קצב ההמוליזה באמצעות הנוסחה:
   המוליזה (%) = (ערכי ספיגה של הסופרנאטנטים של כל קבוצה-
   ערכי ספיגה של מים מזוקקים בלבד) / (ערכי ספיגה של קבוצת הביקורת החיובית- ערכי ספיגה של מים מזוקקים בלבד) x 100

7. בדיקת תאימות Cytobiocompatibility

1. שטפו את ה-ALGMS השונים 2x עם PBS והכניסו לצלחת פטרי של 5 מ"ל למשך 15 דקות והשליכו את הסופרנטנט.
2. בנפרד להוסיף ALGMS שונים ב 0.2 מ"ל בתווך תרבית מלאה (DMEM) המכיל 10% FBS, לדגור ב 37 ° C במשך 24 שעות, ולסנן את התמיסה כדי לקבל את leachate.
3. תרבית תאי NIH3T3 לצפיפות תאים של כ-70% בצלחות של 24 בארות, טפלת בתאי NIH3T3 בתמיסת שטיפה מיקרוספירית, והמשיכה לתרבית בתווך מלא למשך 24 שעות נוספות.
4. הסר את מדיום תרבית התאים ושטוף את התאים עם PBS.
5. הערך את כדאיות התא באמצעות בדיקת Calcein-AM/PI. קח 2.5 μL של פתרון Calcein-AM (4 mM) ו 12.5 μL של פתרון PI (2 mM) ולהוסיף אותם 5 מ"ל של 1x PBS ולערבב היטב כדי לקבל פתרון עבודה עם 2 μM Calcein-AM ו 5 μM PI.
6. הוסף את פתרון העבודה ללוחות תרבית תאים שנזרעו בעבר ב 500 μL לכל באר, לדגור ב 37 ° C תחת הגנת אור במשך 15 דקות, ולצפות ולצלם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הגדר שלושה עותקים משוכפלים עבור כל קבוצה.
7. חישוב כדאיות התא לפי הנוסחה הבאה:
   כדאיות התא (%) = מספר התאים ברי קיימא / (מספר התאים ברי קיימא + מספר התאים המתים)

תוצאות

אפיון ALGMS מוצלב עם יוני מתכת שונים
המורפולוגיה האופטית של Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ו-Fe-ALGMS מוצגת באיור 2, ומציגה ספריות טובה, משטח חלק, התפלגות גודל חלקיקים אחידה (איור משלים 2) וחד-פיזור מצוין. בהמשך ביצענו אפיון מיקרוסקופי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) וספקטרוסקופיית פיזור אנרגיה (EDS). כפי שניתן לראות באיור 3, המיקרוספרות היו בדרך כלל כדוריות עם מעוגלות מוגדרת היטב. פני השטח של Zn-ALGMS חולקו באופן לא אחיד, ונראו מחוספסים יותר עם קמטים רבים. ביצענו ספקטרוסקופיה של פיזור אנרגיה כדי לקבוע את התפלגות התוכן של יוני מתכת המעורבים בתגובת הקישור הצולבת בג'ל. יש לציין כי ניתן להתאים את גודל המיקרספירה, על ידי שינוי פרמטרים כגון מרחק האיסוף, ריכוז הג'ל ומתח השדה החשמלי¹². בפרוטוקול המתואר, על ידי התאמת הפרמטרים של המכשיר microfluidic ואת ריכוז הנוזל, חלקיקים בגדלים שונים ניתן להשיג בקלות על פי דרישות ספציפיות.

הערכת תכונות מיקרוביאליות
הערכנו את הקיבולת האנטי-מיקרוביאלית של מיקרוספרות שונות באמצעות שיטת הלוחות, כפי שמוצג באיור 4. מיקרוספרות שונות הציגו פעילות אנטיבקטריאלית נגד E. coli ו - S. aureus, כאשר Cu-ALGMS ו- Zn-ALGMS הראו את התכונות האנטיבקטריאליות החזקות ביותר. ניתן לייחס יעילות מוגברת זו לפעילות האנטי-מיקרוביאלית של מתכות, כלומר נחושת (Cu) ואבץ (Zn)¹³. Sukhodub et al. הראו כי Fe³⁺, Zn²⁺, Ca²⁺ ו- Cu²⁺ הציגו השפעות אנטיבקטריאליות סינרגטיות עם chitosan, בעוד הדגימות ללא chitosan לא הראו פעילות כזו, אימות ההשפעה האנטיבקטריאלית הסינרגיסטית של קומפלקסים שנוצרו¹⁴. התוצאות שהתקבלו תואמות מחקר זה, כאשר Cu-ALGMS ו- Zn-ALGMS עדיפים על מיקרוספרות הידרוג'ל אחרות בטיפול במחלות זיהומיות חיידקיות.

הערכה של תכונות שחרור סמים
ההערכה של שחרור התרופה ממיקרוספרות אלגינט הידרוג'ל מבוססות מתכת שונות באמצעות BSA כתרופת המודל חשפה הבדלים בפרופילי השחרור שלהם. (תרשים משלים 3). היונים הפגינו יכולת שחרור איטית טובה יותר של תרופות מאשר אלה של חומרים אחרים. קצב שחרור התרופות של Fe²⁺ היה מהיר יחסית לזה של שלושת היונים האחרים, בעוד שקצב שחרור התרופות של Ca²⁺ ו-Zn²⁺ היה איטי יחסית. תוצאות אלה מדגישות את ההבדלים בהשפעות של יונים שונים על שחרור תרופות. אנו משערים כי Fe²⁺ עשוי לתקשר עם התרופה או נקשר באופן שמקל על שחרורו, בעוד Ca²⁺ ו- Zn²⁺ נקשרים לתרופה בצורה הדוקה יותר, או שיש גורמים אחרים המגבילים את קצב השחרור. שחרור מתמשך זה של תרופות מהמיקרוספרות של הידרוג'ל עשוי להיות קשור לחוזק הקישור הצולב, בין המתכת לבין פוליסכריד האלגינט. בנוסף, ההבדל ביכולת הספיחה של מתכות שונות בהשוואה לזו של BSA תרם ככל הנראה להבדלים שנצפו ביכולות הפיגור בתרופות.

הערכת תאימות ביולוגית
תאימות ביולוגית טובה היא תנאי מוקדם עבור נשאי אספקת תרופות ביישומים קליניים. לכן, הערכנו את ההמותאימות של מיקרוספרות באמצעות בדיקת המוליזה חוץ גופית . השתמשנו במים טהורים כבקרה חיובית ובפתרון PBS כבקרה שלילית. תוצאות הניסוי מוצגות באיור משלים 4, וחושפות כי תאי הדם האדומים בתרחיף נותרו שלמים במגע עם מיקרוספרות שונות, מה שמצביע על המוליזה מינימלית על-ידי המיקרוספירות. תוצאות תאימות ציטוביוביולוגית הראו שהמיקרוספרות לא השפיעו על הפעילות התאית (איור משלים 5). תוצאות אלה הצביעו על כך שלמיקרוספרות יש תאימות תאי דם טובה.

איור 1: הכנת מיקרוספרות הידרוג'ל אלגינט. (A) התקנת טכנולוגיית אלקטרוספריי מיקרופלואידית. (B) התמונה בזמן אמת של תהליך התרסיס המיקרופלואידי. (C) המיקרוספרות Ca²⁺, Cu²⁺, Zⁿ²⁺ ו-Fe³⁺ אלגינט הידרוג'ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מיקרוגרף מיקרוספרות הידרוג'ל אלגינט. מיקרוגרף של (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS ו-(D) Fe-ALGMS ב-PBS (pH 7.4). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מיקרוסקופ אלקטרונים סורק וספקטרוסקופיית פיזור אנרגיה. התמונות מראות את האפיון של (A) Ca-ALGMS, (B) Cu-ALGMS, (C) Zn-ALGMS ו-(D) Fe-ALGMS עם i ו-ii לסריקת נתוני מיקרוסקופיה ו-iii-v לנתוני ספקטרוסקופיה. התמונות iii-v מציגות מיפוי EDS, שבו EDS בוחר פרצוף על משטח הדגימה לסריקה כדי לקבל מידע על התפלגות היסוד על פני כל האזור. מצב ניקוי מפה משמש ביישומים לניתוח קומפוזיציה, ניתוח אזור פאזה והתפלגות גודל חלקיקים של חומרים, כאשר כל אלמנט מיוצג בצבע שונה, כפי שמוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4. תכונות מיקרוביאליות של מיקרוספרות. (A) התכונות האנטי-מיקרוביאליות של הקבוצות נבדקו בשיטת מריחת החיידקים. (ב, ג) כימות תוצאות ספירת לוחות המריחה של החיידקים עבור כל קבוצה. דגימות הבקרה מראות מושבות הגדלות על מדיום LB ללא כל תוספת. המושבות היחסיות של החיידקים האחרים חושבו על ידי לקיחת ספירת השיבוטים של קבוצת הביקורת כ-100% ושימוש בה כנקודת בסיס. סרגל השגיאה: סטיית תקן, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: צינור זכוכית מחובר למזרק דרך צינור גומי ארוך. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: גודל חלקיקים. (A) Zn-ALGMS, (B) Ca-ALGMS, (C) Cu-ALGMS, (D) Fe-ALGMS. ריכוז מולארי של 5% שימש לכל הדגימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים 3: שחרור תרופות. עקומת שחרור התרופות של Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ו-Fe-ALGMS ב-PBS (pH 7.4). סרגל השגיאה: סטיית תקן, n = 3 לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 4: בדיקת המוליזה של Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS ו-Fe-ALGMS. PC (שליטה חיובית): ddH₂O; NC (שליטה שלילית): PBS. סרגל השגיאה: סטיית תקן, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 5: ציטוטוקסיות של מיקרוספרות מוצלבות עם יונים שונים. הערכת התאימות הביולוגית של Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS ו- Fe-ALGMS נעשתה. Calcein-AM/PI שימש לביצוע הבדיקה, ולתוצאות כאן, נבחרו באופן אקראי 5 שדות ראייה. ImageJ שימש לניתוח היחס בין תאי דם אדומים לתאים מתים כדי להשיג כדאיות תאים יחסית. 1. PC, שליטה חיובית, 2.NC, שליטה שלילית, 3. Zn-ALGMS, 4. Ca-ALGMS, 5. Cu-ALGMS, 6. Fe-ALGMS, סרגל השגיאה: סטיית תקן, n = 3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

בפרוטוקול זה אנו מציגים שיטה להכנת ALGMS המבוססת על טכנולוגיית אלקטרוספריי מיקרופלואידית. השיטה פשוטה לתפעול ומניבה מספר רב של מיקרוספרות בעלות מעוגלות אחידה וקוטר נשלט. גישה זו מציעה נוחות לחוקרים ויכולה לקדם את המחקר והיישום של מיקרוספרות הידרוג'ל. בנוסף, על ידי הצלבה עם יוני מתכת שונים, היציבות והביואקטיביות של ALGMS שופרו. בניסויים האנטי-מיקרוביאליים, Cu-ALGMS ו-Zn-ALGMS הדגימו השפעות מעכבות חיידקים משמעותיות.

מיקרוספרות הידרוג'ל הן מיקרו-מבנים גמישים עם פלסטיות מעולה, המאפשרים העברת תרופות יעילה באמצעות בחירת חומרים ספציפיים ועיצוב מבני. Alginate, פוליסכריד טבעי המיוצר בג'ל בתנאים קלים הוא תואם ביולוגית, מתכלה ואינו רעיל. מיקרוספרות נתרן אלגינט בקנה מידה מיקרוני נמצאות בשימוש נרחב בביוכימיה ובביו-רפואה, כולל מחקר פרמצבטי, אספקת תרופות והנדסת רקמות. יתרון מרכזי של מיקרוספרות נתרן אלגינט ביישומי העברת תרופות הוא יכולתן לשחרור תרופות מושהה, הבטחת שמירה על ריכוזים גבוהים של החומר הפרמצבטי הפעיל לאורך זמן^{ממושך 14}. ניסויי שחרור התרופות המושהה שלנו גילו כי ל- ALGMS עם קישורים צולבים יוניים שונים יש את היכולת לשמור על שחרור תרופות וניתן להשתמש בהם ליישומי העברת תרופות.

שיטות ייצור נפוצות עבור מיקרוספרות הידרוג'ל כוללות תחליב אצווה, קומינוציה מכנית, ליתוגרפיה, תחליב מיקרופלואידי ואלקטרוספריי ^8,15. היתרונות של תחליב אצווה ושיטות ריסוק מכניות טמונים בפשטות שיטת הייצור וביעילות התפוקה הגבוהה. עם זאת, קשה לשלוט בצורה של מיקרוספרות הידרוג'ל בודדות באמצעות שיטות אלה. פוטוליתוגרפיה כוללת מיקוד אור על לוח מסכה או תבנית כדי לרפא קישורים צולבים וליצור מיקרוספרות הידרוג'ל. עם זאת, יעילות הייצור של שיטה זו מושפעת בקלות על ידי צלחת המסכה, מקור האור והעובש. יתר על כן, שיטת תחליב מיקרופלואידית יכולה לשלוט טוב יותר בתהליך הדפוס של מיקרוספרות הידרוג'ל ולייצר מיקרוספרות הידרוג'ל עם צורות מוגדרות; עם זאת, יעילות הייצור שלה נמוכה¹⁶. בהשוואה לשיטות אלה, שיטת האלקטרוספריי המיקרופלואידית יכולה לייצר מיקרוספרות הידרוג'ל בגודל אחיד, צורה רגילה וגודל חלקיקים מתכוונן¹⁷. שלב המפתח בפרוטוקול זה הוא הכנת המיקרוספרות. הגודל והצורה של המיקרוספרות עשויים להשתנות בהתאם לשטוחות צינור הזכוכית, ערך המתח וקצב הזרימה¹⁸. ישנן גם כמה מגבלות בשימוש בטכנולוגיית אלקטרוספריי מיקרופלואידית להכנת מיקרוספירות, כגון הנטייה של מיקרו-ערוצים להיסתם והתשואה המוגבלת, התאימות המוגבלת של חומרים והקושי בהרחבת תהליכים, והקושי בבקרת תהליכים וניטור. זה מגביל את היישום הנרחב שלהם^{במידה מסוימת 19}.

לסיכום, טכנולוגיית אלקטרוספריי מיקרופלואידית היא שיטת הכנה מיקרוספרית בוגרת, המציעה את היתרון של סינתזה בצעד אחד. על ידי אופטימיזציה של הפרמטרים של גודל ערוץ הזרימה ושליטה על ריכוז החומר וקצב הזרימה, ניתן להשיג בקלות מיקרוספרות במורפולוגיות ובגדלים שונים. יש לציין כי התהליך כולל רק את הפאזה המימית ולא חומרים פעילי שטח נוספים, מה שהופך אותו לידידותי לסביבה ופשוט לתפעול, ומונע את הצורך בתהליכי שטיפה מורכבים. שיטה זו מספקת אסטרטגיה לייצור מיקרוספרות מחומרי הידרוג'ל בדומה לתהליך הג'לציה של אלגינט.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מסך רשת 120	Solarbio, סין	YA0946
מבער אלכוהול	Solarbio, סין	YA2320
עכברי BALB / c	Wukong Biotechnology, סין
מגיב בדיקת חומצה Bicinchoninic	Meilunbio, סין	MA0082
סרום בקר אלבומין	Lablead, סין	9048-46-8
CaCl2 & נ.ב.פ; אבקת	אלאדין, סין	10043-52-4
Calcein-AM / PI	Biosharp, סין	BL130A
צינורות צנטריפוגה	קורנינג, אמריקה	430290
CuSO4   אבקה	Jnxinyuehuagong, סין	7758-99-8
DMEM	Gibicol, סין	C11995500BT
FeCl3   אבקת	אלאדין, סין	7705-08-0
סרום בקר עוברי	HAKATA, סין	HN-FBS
צינורות זכוכית	Sartorius, גרמניה	CC0028
מיקרוסקופיה אור	Evidentscientific, יפן	BX53 (LED)
משאבת מזרק מיקרופלואידית	Longerpump, אנגליה	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte, סין	TCM-C752
צלחת פטרי	Thermofisher, אמריקה	150464
פוספט מאגר מלח	Thermofisher, אמריקה	3002
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק	Thermofisher, אמריקה	Axia ChemiSEM
נתרן אלגינט אבקה	Bjbalb, סין	Y13095
ZnSO4 אבקה	Jnxinyuehuagong, סין	7733-02-0