מאמר שיטה

פיתוח טיפולים קומבינטוריים לפגיעות בחוט השדרה באמצעות העברת תאי גזע

DOI:

10.3791/66872

⸱

7 ביוני 2024

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

מחברים מתאימים: Younghye Song <yhsong@uark.edu>

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, פותחו ואופיינו הידרוג'לים מרוכבים מחקי עצב שניתן להשתמש בהם כדי לחקור ולהפיק תועלת מההתנהגות הפרו-רגנרטיבית של תאי גזע שמקורם בשומן לתיקון פגיעות בחוט השדרה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פגיעה טראומטית בחוט השדרה (SCI) גורמת לגירעון תחושתי-מוטורי קבוע מתחת למקום הפגיעה. היא משפיעה על כרבע מיליון אנשים בארה"ב, והיא מייצגת דאגה לבריאות הציבור לאין שיעור. נערך מחקר כדי לספק טיפול יעיל; עם זאת, SCI עדיין נחשב חשוך מרפא בשל האופי המורכב של אתר הפציעה. נחקרו מגוון אסטרטגיות, כולל אספקת תרופות, השתלת תאים וביו-חומרים הניתנים להזרקה, אך אסטרטגיה אחת לבדה מגבילה את יעילותן להתחדשות. ככזה, טיפולים קומבינטוריים זכו לאחרונה לתשומת לב שיכולה להתמקד במאפיינים מרובי פנים של הפציעה. הוכח כי מטריצות חוץ-תאיות (ECM) עשויות להגביר את היעילות של השתלת תאים עבור SCI. לשם כך, הידרוג'לים תלת מימדיים המורכבים מחוטי שדרה נטולי תאים (dSCs) ועצבים סיאטיים (dSNs) פותחו ביחסים שונים ואופיינו. ניתוח היסטולוגי של dSCs ו-dSNs אישר את הסרת הרכיבים התאיים והגרעיניים, וארכיטקטורות רקמות מקומיות נשמרו לאחר דה-סלולריזציה. לאחר מכן, הידרוג'לים מרוכבים נוצרו ביחסים נפחיים שונים ועברו ניתוחים של קינטיקה של ג'לציה עכירות, תכונות מכניות וכדאיות תאי גזע משובצים שמקורם בשומן אנושי (hASC). לא נמצאו הבדלים משמעותיים בתכונות המכניות בין היחסים השונים של הידרוג'לים ומטריצות חוט השדרה נטולות תאים. ASCs אנושיים המוטבעים בג'לים נותרו ברי קיימא לאורך כל התרבית בת 14 הימים. מחקר זה מספק אמצעי ליצירת הידרוג'לים קומבינטוריים מהונדסי רקמות המציגים ECM ספציפי לעצב ותאי גזע מזנכימליים פרו-רגנרטיביים. פלטפורמה זו יכולה לספק תובנות חדשות לגבי אסטרטגיות נוירו-רגנרטיביות לאחר SCI עם חקירות עתידיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כ-296,000 אנשים סובלים מ-SCI טראומטי, ובכל שנה מתרחשים כ-18,000 מקרי SCI חדשים בארה"ב. SCI טראומטי נגרם בדרך כלל מנפילות, פצעי ירי, תאונות דרכים ופעילויות ספורטיביות ולעתים קרובות גורם לאובדן קבוע של תפקוד תחושתי-מוטורי מתחת למקום הפציעה. ההוצאות המשוערות לכל החיים לטיפול ב-SCI נעות בין מיליון לחמישה מיליון דולר לאדם עם תוחלת חיים נמוכה משמעותית1. עם זאת, SCI עדיין לא מובן היטב ובמידה רבה חשוך מרפא, בעיקר בשל השלכות פתופיזיולוגיות מורכבות לאחר הפציעה2. אסטרטגיות שונות נחקרו, כולל השתלת תאים ופיגומים מבוססי ביו-חומרים. בעוד שהשתלת תאים וביו-חומרים הוכיחה פוטנציאל, האופי הרב-גוני של SCI מצביע על כך שגישות קומבינטוריות עשויות להיות מועילות יותר3. כתוצאה מכך, אסטרטגיות קומבינטוריות רבות נחקרו והוכיחו יעילות טיפולית טובה יותר מאשר רכיבים בודדים. עם זאת, יש צורך במחקרים נוספים כדי לספק ביו-חומרים חדשים להעברת תאים ותרופות3.

גישה מבטיחה אחת לייצור הידרוג'לים טבעיים היא דה-סלולריזציה של רקמות. תהליך הדה-סלולריזציה משתמש בשיטות יוניות, לא יוניות, פיזיקליות וקומבינטוריות כדי להסיר את כל או רוב החומרים התאיים והגרעיניים תוך שמירה על רכיבי ECM. על ידי הסרת כל או רוב הרכיבים התאיים, הידרוג'לים שמקורם ב-ECM פחות מגיבים למארח לאחר ההשתלה/הזרקה4. ישנם מספר פרמטרים שיש למדוד על מנת להעריך את איכות הרקמות שעברו דה-סלולריזציה: הסרת תכולת תאים/גרעין, תכונות מכניות ושימור ECM. הקריטריונים הבאים נקבעו כדי למנוע תגובות חיסוניות שליליות: 1) פחות מ-50 ננוגרם DNA דו-גדילי (dsDNA) למ"ג משקל יבש של ECM, 2) פחות מ-200 bp אורך מקטע DNA, ו-3) כמעט או ללא חומר גרעיני גלוי מוכתם ב-4'6-diamidino-2-phenuylindole (DAPI)5. ניתן לכמת תכונות מכניות על ידי בדיקות מתיחה, דחיסה ו/או ריאולוגיות, והן צריכות להיות דומות לרקמה המקורית6. בנוסף, ניתן להעריך את שימור החלבון על ידי פרוטאומיקה או בדיקות כמותיות המתמקדות במרכיבים העיקריים של רקמות נטולות תאים, למשל, למינין, גליקוזאמינוגליקן (GAG) וכונדרואיטין סולפט פרוטאוגליקן (CSPG) לחוט השדרה 7,8. הידרוג'לים מאומתים שמקורם ב-ECM ניתנים להתאמה מחדש עם סוגים שונים של תאים כדי לסייע בטיפול מבוסס תאים9.

מגוון סוגי תאים, כגון תאי שוואן, תאי מעטפת ריח, תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח העצם (MSCs) ותאי גזע/אב עצביים, נחקרו לתיקון SCI 10,11,12. עם זאת, השימוש הקליני בתאים אלה מוגבל עקב חששות אתיים, אינטגרציה דלילה עם תאים/רקמות שכנות, מחסור במקורות רקמה לתפוקה גבוהה, חוסר יכולת להתחדש בעצמו ו/או יכולת שגשוג מוגבלת 13,14,15. בניגוד לסוגי תאים אלה, MSCs שמקורם בשומן אנושי (hASCs) הם מועמדים אטרקטיביים מכיוון שהם מבודדים בקלות בצורה זעיר פולשנית באמצעות ליפואספיראטים, וניתן להשיג מספר רב של תאים16. בנוסף, ל-hASCs יש את היכולת להפריש גורמי גדילה וציטוקינים בעלי פוטנציאל להגנה עצבית, אנגיוגנטית, ריפוי פצעים, התחדשות רקמות ודיכוי חיסוני 17,18,19,20,21.

כפי שתואר, נערכו מחקרים מרובים 22,23,24, ונלמד מהם הרבה, אך מאפיינים הטרוגניים של SCI הגבילו את יעילותם בקידום התאוששות תפקודית. ככזה, הוצעו גישות קומבינטוריות להגברת יעילות הטיפול ב-SCI. במחקר זה, הידרוג'לים מרוכבים פותחו על ידי שילוב של חוטי שדרה נטולי תאים ועצבים סיאטיים לתרבית hASC תלת מימדית (3D). דה-סלולריזציה מוצלחת אושרה על ידי ניתוחים היסטולוגיים ו-DNA, ויחסים שונים של הידרוג'לים מרוכבים עצביים אופיינו בקינטיקה של ג'לציה ובדיקות דחיסה. הכדאיות של hASCs בהידרוג'לים המרוכבים של העצבים נחקרה כדי להוכיח שניתן להשתמש בהידרוג'ל זה כפלטפורמה לתרבית תאים תלת מימדית.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות החזיר הושגו באופן מסחרי, כך שלא נדרש אישור של ועדת האתיקה של בעלי החיים.

1. דה-סלולריזציה של חוט השדרה החזירי (זמן משוער: 5 ימים)

הערה: בצע את הפירוק באמצעות פרוטוקולים שנקבעו בעבר עם שינויים25,26. כל ההליכים צריכים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית סטרילי בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. יש לסנן את כל התמיסות באופן סטרילי באמצעות מסנן בקבוק עליון (גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר) לבקבוקים שעברו חיטוי. הליכים שיבוצעו ב-37 מעלות צלזיוס יכולים להיעשות בתוך אינקובטור או תנור נקי המכוון ל-37 מעלות צלזיוס.

  1. הכנת פתרונות דה-סלולריזציה
    הערה: כל הפתרונות מחושבים עבור 1 ליטר. ייתכן שהמשתמשים יצטרכו להתאים את אמצעי האחסון הסופי הנדרש בהתאם לצרכים הניסיוניים שלהם.
    1. יש לדלל 500 מ"ל של 0.05% חומצה טריפסין/אתילנדיאמין-טטראצטית (EDTA) עם 500 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) כדי לייצר 0.025% טריפסין/EDTA.
    2. יש לדלל 300 מ"ל של 10% טריטון X-100 עם 700 מ"ל PBS כדי לייצר 3% טריטון X-100. מערבבים 0.56 גרם NaCl, 1.31 גרם NaH2PO4H2O, ו-10.85 גרם HNa2O4P·7H2O ב-1 ליטר מים נטולי יונים כדי ליצור 100 מ"מ Na/50 מ"מ מאגר פוס.
    3. מערבבים 32.4 גרם סוכרוז בליטר אחד של מים נטולי יונים להכנת סוכרוז של 1 M. יש לערבב 40 גרם נתרן דאוקסיכולאט (SD) ב-1 ליטר מים נטולי יונים כדי ליצור תמיסת SD של 4%. יש לדלל 6.7 מ"ל של 15% חומצה פראצטית עם 993.3 מ"ל של 4% אתנול.
  2. הכנת חוט שדרה חזירי
    הערה: חוטי השדרה נשלחו קפואים ללא כל תמיסה ונשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    1. יש להפשיר את חוט השדרה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר למשך 18-24 שעות לפני הסרת התאית. השתמש במספריים סטריליים כדי להסיר את הדורה מאטר בזהירות.
    2. חותכים את חוט השדרה לחתיכות קטנות (באורך של כ -1 ס"מ). מניחים חתיכה אחת בצינור של 15 מ"ל או מקסימום שלוש חתיכות בצינור של 50 מ"ל.
  3. דה-סלולריזציה של חוט השדרה
    הערה: לאחר כל שלב, תמיסות דה-סלולריזציה מוזגות ידנית לכוס גדולה להשלכה. ניתן להשתמש במסננת נירוסטה קטנה הניתנת לחיטוי כדי לסייע בהשלכת תמיסות דה-סלולריזציה מבלי לאבד את הרקמות הדרושות לכל שלב. חוט השדרה נסער ב-83 סל"ד אלא אם כן צוין אחרת.
    1. שטפו את חוט השדרה במים נטולי יונים למשך 18-24 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ו-60 סל"ד.
    2. שטפו את חוט השדרה עם 0.025% טריפסין/EDTA למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס ו-40 סל"ד. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה עם PBS למשך 15 דקות, פי 2.
    3. שטפו את חוט השדרה עם 3% Triton X-100 למשך שעתיים. שטפו את חוט השדרה עם מאגר פוס של 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות, פי 2.
    4. שטפו את חוט השדרה עם סוכרוז 1 M למשך שעה. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה במים נטולי יונים למשך שעה.
    5. שטפו את חוט השדרה עם 4% SD למשך שעתיים. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה עם מאגר פוס של 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות, פי 2.
    6. שוטפים את חוט השדרה עם 0.1% חומצה פראצטית באתנול 4% למשך 4 שעות. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה עם PBS למשך שעה.
    7. שטפו את חוט השדרה במים נטולי יונים למשך שעה, פי 2. לאחר מכן, שטפו את חוט השדרה עם PBS למשך שעה.
    8. ליופיליזציה של חוט השדרה בטמפרטורה של 0.01 מבר ו-56 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים ואחסון יבש עד לשימוש.

2. דה-סלולריזציה של עצב סיאטי חזירי (זמן משוער: 5 ימים)

הערה: בצע את הפירוק באמצעות פרוטוקול27 שהוקם קודם לכן. כל ההליכים צריכים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית סטרילי בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. יש לסנן את כל התמיסות באופן סטרילי באמצעות מסנן בקבוק עליון (גודל נקבוביות של 0.2 מיקרומטר) לבקבוקים שעברו חיטוי. הליכים שיבוצעו ב-37 מעלות צלזיוס יכולים להיעשות בתוך אינקובטור או תנור נקי המכוון ל-37 מעלות צלזיוס.

  1. הכנת פתרונות דה-סלולריזציה
    הערה: כל הפתרונות מחושבים עבור 1 ליטר. ייתכן שהמשתמשים יצטרכו להתאים את אמצעי האחסון הסופי הנדרש בהתאם לצרכים הניסיוניים שלהם.
    1. הכן 50 מ"מ Na/10 מ"מ מאגר פוס על ידי ערבוב של 1.86 גרם NaCl, 0.262 גרם של d NaH2PO4H2O, ו-2.17 גרם של HNa2O4P·7H2O ב-1 ליטר של מים נטולי יונים.
    2. הכן תמיסת 125 מ"מ סולפובטאין-10 (SB-10) על ידי ערבוב 38.4 גרם של SB-10 ב-1 ליטר של 50 מ"מ Na/10 מ"מ מאגר פוס.
    3. הכן תמיסת 3% SD/0.6 מ"מ סולפובטאין-16 (SB-16) על ידי ערבוב של 30 גרם SD ו-0.24 גרם SB-16 ב-1 ליטר של 50 מ"מ Na/10 מ"מ מאגר פוס.
  2. הכנת עצב סיאטי חזירי
    הערה: עצבים סיאטיים נשלחו קפואים עם PBS ונשמרו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    1. יש להפשיר את העצב הסיאטי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר 18-24 שעות לפני הפירוק.
    2. חותכים את העצב הסיאטי לחתיכות קטנות (באורך של כ -1 ס"מ). מניחים חתיכה אחת בצינור של 15 מ"ל או מקסימום שלוש חתיכות בצינור של 50 מ"ל.
  3. דה-סלולריזציה של העצב הסיאטי
    הערה: לאחר כל שלב, תמיסות דה-סלולריזציה מוזגות ידנית לכוס גדולה להשלכה, וניתן להשתמש במסננת נירוסטה קטנה הניתנת לחיטוי כדי לסייע בהשלכת תמיסות דה-סלולריזציה מבלי לאבד את הרקמות הדרושות לכל שלב. העצב הסיאטי נסער ב-15 סל"ד אלא אם כן צוין אחרת.
    1. שטפו את העצב הסיאטי במים נטולי יונים למשך 7 שעות. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 125 מ"מ סולפובטאין-10 (SB-10) במאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך 18 שעות.
    2. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 3% SD/0.6 מ"מ סולפובטאין-16 (SB-16) במאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך שעתיים.
    3. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס של 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות, פי 3. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 125 מ"מ SB-10 במאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך 7 שעות.
    4. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס 100 מ"מ Na/50 מ"מ למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 3% SD/0.6 mM SB-16 במאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך 1.5 שעות.
    5. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך 15 דקות, פי 3. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 75 U/mL של דאוקסיריבונוקלאז (DNase) למשך 3 שעות ללא תסיסה.
    6. שטפו את העצב הסיאטי עם מאגר פוס של 50 מ"מ Na/10 מ"מ למשך שעה, פי 3. לאחר מכן, שטפו את העצב הסיאטי עם 0.2 U/mL של כונדרואיטינאז ABC למשך 16 שעות ללא תסיסה ב-37 מעלות צלזיוס.
    7. שטפו את העצב הסיאטי עם PBS למשך 3 שעות, פי 3. ליופיליזציה של העצב הסיאטי ב-0.01 מבר ו-56 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים ואחסון יבש עד לשימוש.

3. עיכול רקמות נטולות תאים וייצור הידרוג'לים מרוכבים (זמן משוער: 4 ימים)

  1. קוצצים או טוחנים את הרקמות המפורקות לאבקה באמצעות מספריים או הומוגנייזר. עקרו את הכלים כדי לקצוץ או לטחון את הרקמות באמצעות חיטוי בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. שיטת תחמוצת האתילן ישימה גם היא.
  2. עיכול הרקמות בנפרד בתמיסת חומצה הידרוכלורית (HCl) של 0.01 N המכילה 1 מ"ג/מ"ל פפסין בריכוז של 15 מ"ג/מ"ל. המשקלים המשוערים של חוט השדרה והעצב הסיאטי הם 50-100 מ"ג ו-100-150 מ"ג ליחידה, בהתאמה.
  3. מניחים את הפס המגנטי ומערבבים ב-500 סל"ד ו-4 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים לפחות ליצירת תמיסות פרה-ג'ל.
  4. מערבבים פרג'ל עצב סיאטי וחוט שדרה ביחסים הנפחיים הבאים: 2:1, 1:1 ו-1:2. התאם את ה-pH 7.4 באמצעות 1 N נתרן הידרוקסיד (NaOH) ו-HCl ודלל לריכוז הרצוי באמצעות מדיה M199 ו-1x PBS. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    הערה: הוסף NaOH 1 μL בכל פעם. מדיית M199 יכולה לשמש כמחוון pH מכיוון שהיא הופכת לוורוד בהיר כאשר ה-pH הוא 7.4, אך יש להשתמש ברצועות pH כדי לאשר את רמת ה-pH.

4. אימות דה-סלולריזציה

  1. צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E; זמן משוער: 8 ימים)
    הערה: לאחר כל שלב שטיפה, התמיסות מוזגות ידנית לכוס גדולה שיש להשליך.
    1. תקן חוט שדרה טרי ונטול תאים ועצב סיאטי בפורמלדהיד 3.7% בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. מניחים חתיכה אחת בצינור של 15 מ"ל.
    2. הסר פורמלדהיד והניח את הרקמות בסוכרוז 10% למשך יום אחד. הסר 10% סוכרוז והניח את הרקמות ב-30% סוכרוז למשך 6 ימים.
    3. מלאו קריומולד בגודל מתאים בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) באמצע הדרך. הניחו את הרקמות נטולות התאים, כסו אותן ב-OCT ואפשרו להן לספוג את ה-OCT למשך יום אחד.
    4. לאחר יום אחד, הקפיאו את הרקמות למשך הלילה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. הקפאת הרקמות בעובי של 10 מיקרומטר באמצעות קריוסטט.
    5. יש לשטוף עם PBS 1x למשך 5 דקות, 2x. לאחר מכן, שטפו במי ברז למשך 5 דקות.
    6. מכתים בתמיסת המטוקסילין למשך דקה. יש לשטוף במי ברז למשך דקה אחת, 3 פעמים.
    7. מכתים בתמיסת אאוזין למשך דקה. שטפו עם 95% אתנול למשך דקה אחת, פעמיים ועם 100% אתנול למשך דקה אחת, פי 3.
    8. שוטפים עם קסילן למשך דקה, 2 דקות ולאחר מכן דקה אחת. תן לשקופיות להתייבש במשך 5 דקות.
    9. השתמש בצמר גפן כדי לטפטף 3-4 טיפות של תמיסת הרכבה של פוליסטירן קסילן (DPX) דיבוטילפתלט על המגלשות. הנח את פתקי הכיסוי על גבי שקופיות מכוסות DPX. תן למגלשות להתייבש למשך הלילה.
  2. ניתוח DNA (זמן משוער: שעה)
    1. שקלו רקמות נטולות תאים וליופיליזציה. לבודד ולכמת DNA באמצעות ערכות זמינות מסחרית בהתאם להוראות היצרן.

5. אפיון הידרוג'לים מרוכבים

  1. בדיקת עכירות ג'לציה (זמן משוער: 1 שעה)
    1. מניחים 100 מיקרוליטר של תמיסות פרה-ג'ל בכל באר של צלחת של 96 בארות על קרח. קרא ספיגה ב-405 ננומטר כל 2 דקות למשך 45 דקות באמצעות קורא צלחות.
    2. חשב ספיגה מנורמלת באמצעות המשוואה הבאה:
      (ספיגה- ספיגה ראשונית) / (ספיגה מקסימלית -ספיגה ראשונית)
    3. חשב את שיפוע העקומה ואת הזמן להשגת 50% ו-95% ג'לציה, t1/2 ו-t95, בהתאמה.
  2. בדיקת דחיסה (זמן משוער: דקה אחת לכל הידרוג'ל)
    1. ייצור הידרוג'לים מרוכבים בריכוז של 12 מ"ג/מ"ל בקוטר 8 מ"מ וגובה 2 מ"מ.
    2. השתמש בריאומטר כדי לדחוס את הדגימות בעומס של 250 N בין לוחות מקבילים מנירוסטה בקצב מתח של 10% מגובה הדגימה/דקה. התוכנה המספקת קריאות ריאומטר תספק עקומת מתח-מתח על ידי הפעלת הכוח ומדידת המתח עד שההידרוג'לים נשברים.
    3. חשב את המודול של יאנג מהשיפוע של האזור הליניארי של עקומות המתח-מתח.

6. תרבית תלת מימדית של ASCs אנושיים בהידרוג'לים מרוכבים עצביים

  1. הכנת פלטפורמה תלת מימדית (תלת מימד) (זמן משוער: 3 שעות)
    1. פרוסת סיליקון חרוטה עם פוטו-רזיסט SU-8 ליצירת דפוסים מעגליים בעומק של 200 מיקרומטר וקוטר 4 מ"מ.
    2. מערבבים בסיס פולידימתילסילוקסן (PDMS) וחומר ריפוי ביחס של 10:1. יוצקים את התערובת על פרוסת הסיליקון ומניחים לה לשבת במשך 20 דקות כדי להסיר את כל הבועות הנובעות מערבוב בסיס ה-PDMS וחומר הריפוי.
    3. מכניסים לתנור ומרפאים במשך שעתיים בחום של 70 מעלות צלזיוס. הסר את יריעת ה-PDMS המתרפאת ונקב החוצה באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר 8 מ"מ כדי ליצור מיקרו-בארות PDMS.
    4. הניחו מיקרו-בארות בצלחת של 96 בארות והכניסו את צלחת הבאר למנקה פלזמה אוויר כדי לעקר מיקרו-בארות PDMS.
    5. פונקציונליזציה של מיקרו-בארות PDMS עם 1% פוליאתילן (PEI) ו-0.1% גלוטראלדהיד (GA) למשך 10 דקות ו-20 דקות, בהתאמה. שוטפים מיקרובארות במים מזוקקים, פי 2.
  2. הכנת hASCs (זמן משוער: 7 ימים)
    1. תאי מעבר תרבית עבור 2-5 מעברים במצע הגדילה של hASCs (hASCs מדיה בסיסית בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין/סטרפטומיצין (Pen-strep)) עד להתלכדות. מעבר וחישוב מספר התאים באמצעות המציטומטר או מונה תאים.
  3. הידרוג'לים מרוכבים עצביים עמוסי ASC (זמן משוער: 2 שעות)
    1. מערבבים פרג'ל עצב סיאטי וחוט השדרה ביחס נפחי של 2:1, 1:1, 1:2, ומכינים הידרוג'ל לחוט השדרה בלבד מבלי לערבב שום פרג'ל עצב סיאטי.
    2. הוסף מדיית M199 והתאם את ה-pH 7.4 באמצעות 1 N NaOH ו-HCl. השהה מחדש את ה-hASCs עם מצע גידול בפרה-ג'ל בצפיפות של 1 x 106 תאים/מ"ל.
      הערה: כמות ה-M199 ותרחיף התאים צריכה להיות 10% מהפרגל.
    3. מדללים את הפרג'ל ל-12 מ"ג/מ"ל באמצעות 1x PBS. מניחים את הפרג'ל על מיקרו-בארות ומדגרים למשך 30 דקות. תרבית הידרוג'לים עמוסי ASC במצעי גידול hASCs.
  4. מבחן כדאיות התא (זמן משוער: 4 שעות ביום)
    1. הכן פתרונות בדיקת כדאיות באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
    2. שאיבה מדיה בימים 1, 4, 7 ו-14. מוסיפים מגיב לבארות ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות בהתאם להוראות היצרן.
    3. קרא פלואורסצנטיות בעירור/פליטה של 560/590 ננומטר באמצעות קורא צלחות. חשב את ההפרש באחוזים באמצעות המשוואה הבאה:
      [(דגימת פלואורסצנטיות - פלואורסצנטיריק) / פלואורסצנטיריק] x 100

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות נטולות תאים הוכנו באמצעות פרוטוקולים שנקבעו בעבר עם שינויים קלים26,27. לאחר דה-סלולריזציה, ליופיליזציה ועיכול, יוצרו הידרוג'לים מרוכבים עצביים ביחסים של SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 והידרוג'לים לחוט השדרה בלבד (איור 1). הסרת רכיבים גרעיניים אושרה על ידי צביעת H&E (איור 2A). כדי להעריך כמותית את הדה-סלולריזציה, נמדד DNA שיורי בתוך ECM. תכולת ה-dsDNA ברקמה היבשה הטרייה הייתה 132.6 ±-21.3 ננוגרם dsDNA/מ"ג, בעוד שפרנכימת חוט השדרה הטרייה ונטולת התאים הכילה 22.6 ±-8.3 ננוגרם dsDNA/מ"ג רקמה יבשה ו-23.74 ±-6.69 ננוגרם dsDNA/מ"ג רקמה יבשה, בהתאמה (איור 2B). הוא הצביע על כך שיש להסיר את הדורה מאטר לפני הדה-סלולריזציה. כמות ה-dsDNA של עצב סיאטי טרי ונטול תאים הייתה 222.5 ±-42.65 ו-0.63 ננוגרם dsDNA/מ"ג רקמה יבשה, בהתאמה (איור 2C).

קינטיקה של ג'לציה של הידרוג'לים מרוכבים עצביים הוערכה כדי לקבוע את מהירות הג'לציה (S) ואת הזמנים להגיע ל-50% ו-95% מהעכירות הסופית (t1/2 ו-t95). קינטיקה של הג'לציה הראתה צורה סיגמואידית עבור כל קבוצות ההידרוג'ל (איור 3A). מהירות הג'לציה (S) בכל קבוצות ההידרוג'ל לא הייתה שונה באופן משמעותי זו מזו. הזמן הנדרש כדי להגיע למחצית העכירות הסופית, t1/2, היה 11.32 ± 0.57 דקות, 13.33 ± 0.6 דקות ו-15.7 ± 0.92 דקות, ו-17.23 ± 1.13 דקות עבור הידרוג'לים SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 וחוט השדרה בלבד, בהתאמה. הזמן הנדרש כדי להגיע ל-95% מהעכירות הסופית, t95, היה 13.8 ±-0.83 דקות, 15.53 ±-0.83 דקות, 18.38 ±-0.79 דקות ו-19.62 ±-1.27 עבור הידרוג'לים של SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 וחוט השדרה בלבד, בהתאמה. תוצאות אלו מצביעות על כך שהידרוג'לים עם יותר תכולת עצב סיאטית מגיעים למצב יציב מהר יותר, ועצב סיאטי ECM עשוי לקדם הרכבת הידרוג'ל. תוצאת בדיקת הדחיסה הראתה מגמה שהידרוג'לים עם יותר תכולת חוט השדרה מספקים נוקשות מוגברת; עם זאת, זה לא היה שונה באופן משמעותי בכל היחסים השונים של הידרוג'לים מרוכבים (איור 3B).

לבסוף, כדי לקבוע את כדאיות התאים של hASCs בכל קבוצות ההידרוג'ל, תרביות תלת מימד הוקמו באמצעות מיקרו-בארות PDMS מיקרו-מפוברקות, כפי שמוצג באיור 4. לאורך 14 הימים, כדאיות ASC נמדדה באמצעות מבחן מטבולי קולורימטרי ופלואורסצנטי מבוסס תרבית תאים זמין מסחרית, כאשר ההבדלים באחוזים מהקריאות חושבו בארבע נקודות זמן שונות: יום 1, יום 4, יום 7 ויום 14 (איור 5). ערך ההפרש באחוזים גדל ככל שנקודות הזמן גדלו, וזה של הידרוג'ל חוט השדרה בלבד היה נמוך משאר הקבוצות בימים 1, 4 ו-14. יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שכדאיות hASC עלתה לאורך תקופת התרבית עקב התפשטות התאים ועלייה בפעילות המטבולית של התאים.

figure-results-1
איור 1: ייצור הידרוג'לים מרוכבים עצביים. חוטי השדרה החזיריים והעצבים הסיאטיים עברו דה-סלולריזציה, ליופיליזציה ועוכלו כדי להשיג תמיסות פרה-ג'ל. תמיסות פרג'ל לעצב הסיאטי וחוט השדרה עורבבו ביחס של 2:1, 1:1 ו-1:2, והוכן גם פרג'ל לחוט השדרה בלבד. כל תמיסות הפרה-ג'ל הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס כדי ליצור הידרוג'לים מרוכבים עצביים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אימות של דה-סלולריזציה. (A) צביעת H&E של חוטי שדרה חזיריים טריים ונטולי תאים ועצבים סיאטיים. חצים מצביעים על נוכחות של תאים ברקמות. פסי קנה מידה = 1 מ"מ לתמונות בתצוגה רחבה ו-500 מיקרומטר לתמונות זום אין (200 מיקרומטר רק לתמונות עצב סיאטי נטול תאים עם זום-אין). (B) ניתוח דנ"א של דורה-מאטר טרי, פרנכימה וחוט שדרה נטול תאים (n=10, 16 ו-6, בהתאמה). (C) ניתוח DNA של עצבים סיאטיים טריים ונטולי תאים (n=8 ו-3, בהתאמה). קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. הניתוח הסטטיסטי נעשה באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן פוסט-הוק של טוקי עבור (B) ומבחן t עבור (C). קיצורים: ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אפיונים של הידרוג'לים מרוכבים עצביים. (A) ספיגה מנורמלת של הידרוג'לים מרוכבים עצביים (n = 5). (B) מודול יאנג של חוט שדרה נטול תאים והידרוג'לים מרוכבים עצביים (n = 4 עבור חוט שדרה נטול תאים ו-3 עבור כל קבוצת הידרוג'ל מרוכב, בהתאמה). קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. הניתוח הסטטיסטי נעשה באמצעות ANOVA חד כיווני עם מבחן הפוסט-הוק של טוקי. קיצורים: ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תמונה סכמטית של תרבית תלת מימדית. (A) מיקרו-בארות PDMS יוצרו על פרוסת סיליקון מצופה SU-8. כל מיקרווול נוקב החוצה באמצעות אגרוף ביופסיה של 8 מ"מ. (B) חוט שדרה ועצב סיאטי נטולי תאים ביחסים שונים, התאימו את ה-pH ל-7.4, השעו מחדש עם hASCs, הניחו את הפרג'ל על מיקרווול ודגרו במשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. אנא לחצו כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5
איור 5: בדיקת כדאיות תאים. ההבדל באחוזים של hASCs שגודלו בהידרוג'לים מרוכבים עצביים בימים 1, 4, 7 ו-14 (n = 3). קווי שגיאה מייצגים סטיות תקן. הניתוח הסטטיסטי נעשה באמצעות ANOVA חד כיווני עם מבחן הפוסט-הוק של טוקי. * עמ<0.05; ** עמ<0.01; עמ<0.005; עמ<0.001; נ"ס: לא משמעותי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדעה הרווחת היא כי הפתופיזיולוגיה של SCI היא מורכבת ורבת פנים. למרות שטיפולים בודדים כגון השתלת תאים, אספקת תרופות וביו-חומרים סיפקו תובנות חשובות לגבי SCI, האופי המורכב של SCI עשוי להגביל את יעילותם האישית 28,29,30,31. לכן, המאמצים לפתח טיפולים קומבינטוריים יעילים גברו. ההידרוג'לים המרוכבים של העצבים המתוארים במחקר זה עשויים לשמש ככלי אספקה יעיל לתאים או לתרופות. בכל הנוגע לתאים, ASCs הם אחד המועמדים המבטיחים להשתלת תאים. ASCs מפרישים גורמים אימונומודולטוריים כגון אינטרלוקין-10 (IL-10) וגורם גדילה טרנספורמטיבי בטא (TGF-β) כמו גם גורמים נוירוטרופיים כגון גורם גדילה עצבי (NGF), גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF), גורם נוירוטרופי שמקורו בגליה (GDNF) ונוירוטרופין-3 (NT-3) המובילים לצמיחת נויריט מוגברת של גרעיני שורש הגב במבחנה והתאוששות תפקוד in vivo 17,19,32,33, 34. ASCs שסופקו בתמיסות מימיות קידמו התאוששות תפקודית לאחר SCI בחולדות ובבני אדם; עם זאת, אתגרים בתיווך הגירה, בידול, הישרדות ובידול של ASCs צוינו 35,36,37. בנוסף, ישנם דיווחים סותרים על הפוטנציאל הגידולי של ASCs מושתלים; בעוד שמחקרים מסוימים הצביעו על כך ש-ASCs עשויים לתרום לשגשוג וגרורות של סוגים שונים של סרטן, מחקרים אחרים הראו גם פוטנציאל אנטי-גידולי 38,39,40,41 לפיכך, יש לחקור פרופיל בטיחות ארוך טווח של ASCs בהידרוג'לים מרוכבים עצביים בעתיד. כאן, חוטי שדרה ועצבים סיאטיים נטולי תאים נחקרו בנפרד לתיקון SCI.

חוטי שדרה נטולי תאים הוזרקו למודל חולדה של SCI ועוררו צמיחה אקסונלית לתוך הנגע והתאוששות תפקודית מוגברת; עם זאת, עקב התדרדרות מהירה, נוצרה ציסטה, וההחלמה פחתה לאחר 4-8 שבועות של טיפול4, 42. הידרוג'ל עצב סיאטי א-תאי הוזרק לחולדות SCI וקידם התחדשות עצבית, אך יעילות ההידרוג'ל הייתה מוגבלת עקב פירוק מהיר24. לכן, גישות קומבינטוריות המשתמשות ברקמות נטולות תאים זכו לאחרונה לתשומת לב. דווח כי הידרוג'לים של חוט השדרה שעברו דה-סלולריזציה קידמו התפשטות של תאי גזע עצביים/תאי אב, נדידה והתמיינות לתאי עצב4. זה גם הקל על צמיחת נויריט תלת מימדית מתאי נוירובלסטומה N1E-115, מה שמצביע על כך שההידרוג'לים של חוט השדרה המפורק עשויים להיות פיגום אטרקטיבי לקידום התחדשות אקסונלית26. עצבים סיאטיים נטולי תאים נחקרו עם אנקפסולציה של שוואן והראו פוטנציאל להשתלת עצב לאחר SCI43. יחד, שילוב של חוטי שדרה נטולי תאים ועצבים סיאטיים צפוי לקדם הן התחדשות אקסונלית והן שיקום רקמות. המחקר הנוכחי גם אינו כולל הערכת ההשפעות הטיפוליות של הידרוג'לים עצביים עמוסי ASC. לכן, חיוני להעריך פוטנציאל התחדשות, כגון השפעות פרו-אנגיוגניות ונוירוטרופיות, של הפלטפורמה באמצעות מחקרי מבחנה ו-in vivo . בנוסף, ניתן ליישם בקלות הידרוג'לים מרוכבים עצביים כדי לעטוף סוגי תאים אחרים, כגון תאי שוואן, תאי גזע חוש הריח ותאי גזע עצביים, כדי לשפר את היעילות הטיפולית של השתלת תאים. זה יהיה מסקרן לחקור את הבטיחות והיעילות של סוגי תאים שונים בתוך ההידרוג'ל המרוכב העצבי בשלבים שונים של SCI.

אחד השלבים הקריטיים ביצירת הידרוג'לים מרוכבים הוא הכנת כמות מספקת של רקמות, במיוחד חוטי השדרה. התשואה של חוט השדרה המפורק נמוכה משמעותית, כפי שצוין בפרוטוקול (50-100 מ"ג חתיכת חוט שדרה ו-100-150 מ"ג חתיכת עצב סיאטית); לפיכך, לא מומלץ לקצור או להשיג חוטי שדרה מבעלי חיים קטנים כמו עכברים וחולדות. לפחות בעלי חיים בגודל בינוני, כמו ארנבות, מוצע להשיג כמות משמעותית של מטריצות חוט השדרה. כמו כן, חשוב לבדוק את ה-pH בעת עיכול רקמות נטולות תאים מכיוון שהוספת רקמה יכולה להעביר את ה-pH מעבר לטווח הפעלת הפפסין הנדרש, שהוא בסביבות 1.5-2. זמני התסיסה לדסלולריזציה של חוט השדרה ארוכים יותר מהשיטה שנקבעה בעבר26 מכיוון שמהירות התסיסה איטית יותר בפרוטוקול הנוכחי. המסובב המשמש בפרוטוקול זה מציע עד 83 סל"ד, בעוד שמקסימום 200 סל"ד שימש בשיטות שנקבעו בעבר. לכן, זמני התסיסה הוגדלו פעמיים כדי לשטוף היטב את כל הפסולת התאית. כדי להבטיח שכל פתרונות הדה-סלולריזציה יוכלו לחדור לרקמות ולשטוף את כל התוכן התאי והגרעיני, יש לייעל את זמני התסיסה והמהירות באמצעות היסטולוגיה או ניתוח DNA בצד המשתמש. מוצע כי היחס בין הרקמות לתמיסת הדה-סלולריזציה יהיה מינימום של 1:15 [w/v]. רקמות נטולות תאים בפרוטוקול26 שנקבע קודם לכן עוכלו/ערבבו בטמפרטורת החדר; עם זאת, בפרוטוקול זה, הם עוכלו עם מוט מגנטי על צלחת ערבוב ב-4 מעלות צלזיוס ו-500 סל"ד למשך 4 ימים. מנוע צלחת הערבוב יכול לייצר חום ולהכניס אותו לתמיסת הפרג'ל. לכן, מומלץ לעכל בטמפרטורות נמוכות או להשתמש בצלחת ערבוב הניתנת לבקרת טמפרטורה.

כפי שצוין בניתוח דנ"א (איור 2B), זה קריטי להסיר את הדורה מאטר של חוט השדרה מאחר שכמות משמעותית של דנ"א יכולה להימצא בתוך הדורה מאטר. Dura mater, בניגוד לפרנכימה של חוט השדרה, מורכב מרקמה סיבית; לכן, יש להשתמש בשיטות שונות של דה-סלולריזציה כפי שתועדו בעבר44,45. צביעת H&E וניתוח DNA של רקמות נטולות תאים שימשו כדי לאמת את היעילות של תהליך הדה-סלולריזציה. יש לעמוד בקריטריונים הבאים כדי להגשים את המטרות של דה-סלולריזציה מוצלחת: 1. פחות מ-50 ננוגרם dsDNA/מ"ג משקל יבש של ECM, 2. פחות מ-200 bp אורך מקטע DNA, 3. מחסור בחומר גרעיני בקטעי רקמה או H&E5. ניתוח איכותני של צביעת H&E לאחר דה-סלולריזציה הראה חוסר צביעת גרעינים, מה שמרמז על הסרה מוצלחת של תאים. בנוסף, רכיבים של ECM, כגון קולגן וחלבוני מטריצה אחרים, נשמרו, ועוצמת הצביעה הופחתה לאחר דה-סלולריזציה, מה שמשקף את הסרת החומר התאי. לאחר הדה-סלולריזציה, תכולת ה-DNA הייתה 0.63 ננוגרם בעצב הסיאטי ו-23.74 ±-6.69 ננוגרם בחוט השדרה לכל מ"ג משקל יבש של ECM, שהוא מתחת לסף המקובל ליישום in vivo.

יש לתכנן בקפידה מדידות ריאולוגיות של הידרוג'לים מרוכבים, שכן לא ניתן להשתמש בריאומטרים בעלי כוח דחיסה גבוה או בודקי מתיחה כדי לנתח את התכונות המכניות של חומרים רכים כגון הידרוג'לים מרוכבים עצביים שנוצרו במחקר זה. דגימות ייקרעו/ייקרעו כאשר הן נאחזות בבודק המתיחה, ודחיסה בעוצמה גבוהה לא תספק נתונים רגישים מספיק לניתוח. במחקר זה נעשה שימוש בריאומטר בעל כוח דחיסה של 250 N, ומומלץ למצוא מכשיר בעל כוח דומה או מתאים למטרות המשתמשים. כחלופה, מדידות ריאולוגיות שונות, כגון מדידת גזירה תנודתית, עשויות לסייע בקביעת מודולי אחסון ואובדן. תכונות מכניות מופחתות לאחר דה-סלולריזציה מהוות מגבלה במחקר זה. למרות שהמודול של יאנג של כל קבוצות ההידרוג'ל דומה לזה של חוט השדרה הנטול תאים, הוא שונה באופן משמעותי מחוטי שדרה טריים (נתונים לא מוצגים). תאי גזע עצביים ו-MSCs שגודלו על חומרים רכים יחסית הראו התמיינות עצבית מוגברת וביטוי טובולין β-III,בהתאמה 46,47. עם זאת, ניתן לחזק או להצליב את החומרים המפורקים עם חומרים אחרים כגון אלגינט, פולי (אתילן גליקול), ג'נפין וגלוטרלדהיד 48,49,50,51. יהיה צורך באופטימיזציה כדי להבטיח שאסטרטגיות אלה לשיפור התכונות המכניות של ההידרוג'לים לא ישפיעו על התנהגות התא או הכדאיות.

ניתן להבחין בשונות מאצווה לאצווה של הידרוג'לים מרוכבים עצביים בין היתר בשל הבדלים בגיל, מין, משקל ומין של בעלי חיים. שימוש מבוקר ועקבי באותו סוג של בעלי חיים עשוי לעזור להפחית את השונות. איגום דגימות רקמה מבעלי חיים שונים יכול גם לעזור להפחית את השונות בין קבוצות52. אחד האתגרים הפוטנציאליים לתרגום מחקר זה ליישומים קליניים הוא מדרגיות. התשואה הנמוכה של דה-סלולריזציה של חוט השדרה תעכב את הייצור של כמות גדולה של רקמות נטולות תאים. יהיה צורך לפתח / לבצע אופטימיזציה של שיטות חדשות כדי ליצור רקמות נוספות, או שניתן יהיה לפרק את הדורה מאטר יחד כדי להגדיל את התפוקה לאחר דה-סלולריזציה. אתגר פוטנציאלי נוסף הוא אישור רגולטורי. בארה"ב, ה-FDA אחראי לאישור רגולטורי של טיפולים מבוססי תאים53. הרשות הרגולטורית של הרפובליקה של קוריאה אישרה את כניסתו לשוק של CARTISTEM, שהוא מוצר מבוסס MSC המורכב מ-MSCs שמקורם בדם טבורי אלוגני ו-4% הידרוג'ל היאלורונאט לטיפול בפגמים בסחוס הברך54. מקרים תקדימיים כמו אלה עשויים לעזור לייעל את תהליך הבדיקה הרגולטורית על ידי מתן נתוני בטיחות ויעילות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן PhRMA והמכונים הלאומיים לבריאות באמצעות הפרס מספר P20GM139768 ו-R15NS121884 שהוענקו ל-YS. אנו רוצים להודות לד"ר קארטיק בלצ'נדרן ולד"ר ראג' ראו במחלקה להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת ארקנסו על שאפשרו לנו להשתמש בציוד שלהם. כמו כן, אנו רוצים להודות לד"ר ג'ין-וו קים ולמר פטריק קוצ'ווארה מהמחלקה להנדסה ביולוגית וחקלאית באוניברסיטת ארקנסו על מתן הכשרה בנושא ריאומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-(Decyldimethylammonio)מלח פנימי סולפונאט פרופאןסיגמא-אלדריץ'D4266בשימוש במהלך דה-תאים של עצב סיאטיק, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)סולפונאט פרופאןסיגמא-אלדריץ'H6883בשימוש במהלך דה-תאים של עצב סיאטיק, SB-16
ריאגנט AlamarBlueפישר סיינטיפיקDAL1100שימש במהלך בדיקת עמידות תא AlamaBlue
כונדרויטינאז ABCסיגמא-אלדריץ'C3667בשימוש במהלך דה-תאים של עצב סיאטי
קריוסטטלייקהCM1860
דאוקסיריבנוקלאזסיגמא-אלדריץ'D4263בשימוש במהלך דה-תאים של עצב סיאטי
די-נתרן מימן פוספט הפטהידראטVWRBDH9296כימי ל-100 mM Na/50 mM phos ובופ של 50 mM Na/10 mM
DNeasy Blood & ערכת טישוקיאגן69506בשימוש במהלך ניתוח DNA
Dpx Mountant להיסטולוגיה, מדיום הרכבה על סליידסיגמא-אלדריץ'6522שימשו במהלך H&, צביעת E
אאוסיןסיגמא-אלדריץ'HT110216שימשו במהלך H&, צביעת E
אתנולVWR89125-172
פורמלדהידסיגמא-אלדריץ'252549שימשו במהלך H&, צביעת E
גלוטראלדהיד (ג'ורג'יה)סיגמא-אלדריץ'G6257בשימוש במהלך פונקציונליזציה של פני שטח ב-PDMS
מדיה צמיחה hASCלונזהPT-4505משמש לגידול hASCs, המכיל סרום עוברי ופניצילין/סטרפטומיצין
המטוקסיליןVWR26041-06שימשו במהלך H&, צביעת E
תאי גזע אנושיים שמקורם בשומןלונזהPT-5006
חומצה כלורית (HCl)סיגמא-אלדריץ'320331משמש לעיכול רקמות דה-סלולריזיות ולהתאמת תמיסות פרה-ג'ל
מדיה M199סיגמא-אלדריץ'M0650משמש לדילול פרה-ג'לים לריכוז הרצוי
תרכובת חיתוך אופטימליתTissue-Tek4583
פפסיןסיגמא-אלדריץ'P7000משמש לעיכול רקמות מפורקות תאים
חומצה פראצטיתסמטת המעבדהPAA1001בשימוש במהלך דה-סלולריזציה של חוט השדרה
סליין עם בופר זרחן (PBS)VWR97062-948
קורא לוחותביו-טק אינסטרומנטססינרג'י Mx
פוליאתילנאמין (PEI)סיגמא-אלדריץ'181978בשימוש במהלך פונקציונליזציה של פני שטח ב-PDMS
עצב סיאטי חזיריTissue Source LLCחזירים חיים, ללא מידע מזוהה וללא פרטי מעקב
חוט שדרה חזיריTissue Source LLCחזירים חיים, ללא מידע מזוהה וללא פרטי מעקב
מערכת QuantiFluor dsDNAפרומגהE2670משמש לניתוח תכולת ה-DNA
ריאומטרTA אינסטרומנטסDHR 2
רוטטור מחוספסגלאס-קו099A RD4512בשימוש במהלך דה-סלולריזציה של חוט השדרה
נתרן כלוריד (NaCl)VWRBDH9286כימי ל-100 mM Na/50 mM phos ובופ של 50 mM Na/10 mM
נתרן דאוקסיכולאטסיגמא-אלדריץ'D6750
נתרן דיהידרוגן פוספט מונוהידראטVWRBDH9298כימי ל-100 mM Na/50 mM phos ובופ של 50 mM Na/10 mM
תמיסת נתרן הידרוקסיד (NaOH)סיגמא-אלדריץ'415443משמש לכוונון תמיסות Pregels
SU-8קיאקו הקדיש חומריםSU8-100משמש לציפוי וייפר סיליקון
סוקרוזהסיגמא-אלדריץ'S8501בשימוש במהלך דה-סלולריזציה של חוט השדרה
ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184דאו1317318פולידימתילקסילוקסן (PDMS) בסיס וסוכן ריפוי
טריטון X-100סיגמא-אלדריץ'X100בשימוש במהלך דה-סלולריזציה של חוט השדרה
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדוםתרמו פישר25300062משמש במהלך עבודת hASC ובמהלך דה-תאים של חוט השדרה
סיבוב אקדח צינורותתרמו פישר88881001בשימוש במהלך דה-תאים של עצב סיאטי
קסילןVWRMK866816שימשו במהלך H&, צביעת E

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. National Spinal Cord Injury Statistical Center. , Univ. of Alabama at Birmingham. Birmingham, AL. (2017).
  2. Anjum, A., et al. Spinal cord injury: Pathophysiology, multimolecular interactions, and underlying recovery mechanisms. Int J Mol Sci. 21 (20), 1-35 (2020).
  3. Führmann, T., Anandakumaran, P. N., Shoichet, M. S. Combinatorial therapies after spinal cord injury: How can biomaterials help. Adv Healthcare Mater. 6 (10), 1-21 (2017).
  4. Xu, Y., et al. Understanding the role of tissue-specific decellularized spinal cord matrix hydrogel for neural stem/progenitor cell microenvironment reconstruction and spinal cord injury. Biomaterials. 268, November 2020 120596(2021).
  5. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  6. Franko, R., et al. Mechanical properties of native and decellularized reproductive tissues: insights for tissue engineering strategies. Sci Rep. 14 (1), 1-14 (2024).
  7. Rowlands, D., Sugahara, K., Kwok, J. C. F. Glycosaminoglycans and glycomimetics in the central nervous system. Molecules. 20 (3), 3527-3548 (2015).
  8. Silver, D. J., Silver, J. Contributions of chondroitin sulfate proteoglycans to neurodevelopment, injury, and cancer. Curr Opinion Neurobiol. 27, 171-178 (2014).
  9. Porzionato, A., et al. Tissue-engineered grafts from human decellularized extracellular matrices: A systematic review and future perspectives. Int J Mol Sci. 19 (12), 4117(2018).
  10. Deng, L. X., et al. A novel growth-promoting pathway formed by GDNFoverexpressing Schwann cells promotes propriospinal axonal regeneration, synapse formation, and partial recovery of function after spinal cord injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  11. Tabakow, P., et al. Transplantation of autologous olfactory ensheathing cells in complete human spinal cord injury. Cell Transpl. 22 (9), 1591-1612 (2013).
  12. Hawryluk, G. W. J., et al. An in vivo characterization of trophic factor production following neural precursor cell or bone marrow stromal cell transplantation for spinal cord injury. Stem Cells Dev. 21 (12), 2222-2238 (2012).
  13. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  14. Mackay-Sim, A., et al. Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: A 3-year clinical trial. Brain. 131 (9), 2376-2386 (2008).
  15. Suzuki, H., et al. Current concepts of neural stem/progenitor cell therapy for chronic spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 15, 794692(2022).
  16. Kokai, L. E., Marra, K., Rubin, J. P. Adipose stem cells: Biology and clinical applications for tissue repair and regeneration. Trans Res. 163 (4), 399-408 (2014).
  17. Kingham, P. J., Kolar, M. K., Novikova, L. N., Novikov, L. N., Wiberg, M. Stimulating the neurotrophic and angiogenic properties of human adipose-derived stem cells enhances nerve repair. Stem Cells Dev. 23 (7), 741-754 (2014).
  18. Song, Y. H., Shon, S. H., Shan, M., Stroock, A. D., Fischbach, C. Adipose-derived stem cells increase angiogenesis through matrix metalloproteinase-dependent collagen remodeling. Integr Biol (United Kingdom). 8 (2), 205-215 (2016).
  19. Ribeiro, C. A., et al. The secretome of stem cells isolated from the adipose tissue and Wharton jelly acts differently on central nervous system derived cell populations. Stem Cell Res Ther. 3 (3), 18(2012).
  20. Salgado, J. B. O. G., et al. Adipose tissue derived stem cells secretome: Soluble factors and their roles in regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 5 (2), 103-110 (2010).
  21. Kapur, S. K., Katz, A. J. Review of the adipose derived stem cell secretome. Biochimie. 95 (12), 2222-2228 (2013).
  22. Xu, X. M., Chen, A., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  23. Guest, J. D., et al. Influence of IN-1 antibody and acidic FGF-fibrin glue on the response of injured corticospinal tract axons to human Schwann cell grafts. J Neurosci Res. 50 (5), 888-905 (1997).
  24. Cornelison, R. C., et al. Injectable hydrogels of optimized acellular nerve for injection in the injured spinal cord. Biomed. Mater. 13 (3), 034110(2018).
  25. Crapo, P. M., et al. Biologic scaffolds composed of central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 33 (13), 3539-3547 (2012).
  26. Medberry, C. J., et al. Hydrogels derived from central nervous system extracellular matrix. Biomaterials. 34 (4), 1033-1040 (2013).
  27. McCrary, M. W., et al. Novel sodium deoxycholate-based chemical decellularization method for peripheral nerve. Tissue Eng Part C. 26 (1), 23-36 (2020).
  28. Shahemi, N. H., et al. Application of conductive hydrogels on spinal cord injury repair: A Review. ACS Biomater Sci Eng. 9 (7), 4045-4085 (2023).
  29. Huang, L. Y., et al. Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on bone marrow mesenchymal stem cells: Advances and challenges. World J Stem Cells. 15 (5), 385-399 (2023).
  30. Chakraborty, A., Ciciriello, A. J., Dumont, C. M., Pearson, R. M. Nanoparticle-based delivery to treat spinal cord injury - a mini- review. AAPS PharmSciTech. 22 (3), 101(2022).
  31. Upadhyay, R. K. Drug delivery systems, CNS protection, and the blood brain barrier. BioMed Res Int. , d869269(2014).
  32. Liu, G., et al. Transplantation of adipose-derived stem cells for peripheral nerve repair. Int J Mol Med. 28 (4), 565-572 (2011).
  33. Sun, T., et al. Adipose-derived stem cells in immune-related skin disease: a review of current research and underlying mechanisms. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 1-14 (2024).
  34. Lewis, M., et al. Materials today bio neuro-regenerative behavior of adipose-derived stem cells in aligned collagen I hydrogels. Mater Today Bio. 22, 100762(2023).
  35. Thuret, S., Moon, L. D. F., Gage, F. H. Therapeutic interventions after spinal cord injury. Nat Rev Neurosci. 7 (8), 628-643 (2006).
  36. Ohta, Y., et al. Intravenous infusion of adipose-derived stem/stromal cells improves functional recovery of rats with spinal cord injury. Cytotherapy. 19 (7), 839-848 (2017).
  37. Hur, J. W., et al. Intrathecal transplantation of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells for treating spinal cord injury: A human trial. J Spinal Cord Med. 39 (6), 655-664 (2016).
  38. Muehlberg, F. L., et al. Tissue-resident stem cells promote breast cancer growth and metastasis. Carcinogenesis. 30 (4), 589-597 (2009).
  39. Ji, S. Q., et al. Adipose tissue-derived stem cells promote pancreatic cancer cell proliferation and invasion. Brazilian J Med Biol Res. 46 (9), 758-764 (2013).
  40. Zhu, Y., et al. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia. 23 (5), 925-933 (2009).
  41. Cousin, B., et al. Adult stromal cells derived from human adipose tissue provoke pancreatic cancer cell death both in vitro and in vivo. PLoS ONE. 4 (7), 31-34 (2009).
  42. Tukmachev, D., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. 22 (3-4), 306-317 (2016).
  43. Bousalis, D., et al. Decellularized peripheral nerve as an injectable delivery vehicle for neural applications. Biomed Mater Res Part A. 110, 595-611 (2022).
  44. Sharma, A., Liao, J., Williams, L. N. Structure and mechanics of native and decellularized porcine cranial dura mater. Eng. 4 (2), 205-213 (2023).
  45. Ozudogru, E., et al. Decellularized spinal cord meninges extracellular matrix hydrogel that supports neurogenic differentiation and vascular structure formation. J Tissue Eng Regen Med. 15 (11), 948-963 (2021).
  46. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  47. Saha, K., et al. Substrate modulus directs neural stem cell behavior. Biophys J. 95 (9), 4426-4438 (2008).
  48. Jiang, T., et al. Preparation and characterization of genipin-crosslinked rat acellular spinal cord scaffolds. Mater Sci Eng C. 33 (6), 3514-3521 (2013).
  49. Gao, S., et al. Comparison of glutaraldehyde and carbodiimides to crosslink tissue engineering scaffolds fabricated by decellularized porcine menisci. Mater Sci Eng C. 71, 891-900 (2017).
  50. Zhou, J., et al. Tissue engineering of heart valves: PEGylation of decellularized porcine aortic valve as a scaffold for in vitro recellularization. BioMe Eng Onl. 12 (1), 1-12 (2013).
  51. Sun, D., et al. Novel decellularized liver matrix-alginate hybrid gel beads for the 3D culture of hepatocellular carcinoma cells. Int J Biol Macromol. 109, 1154-1163 (2018).
  52. Gaetani, R., et al. Evaluation of different decellularization orotocols on the generation of pancreas-derived hydrogels. Tiss Engi C. 24 (12), 697-708 (2018).
  53. Mendicino, M., Fan, Y., Griffin, D., Gunter, K. C., Nichols, K. Current state of U.S. Food and Drug Administration regulation for cellular and gene therapy products: potential cures on the horizon. Cytotherapy. 21 (7), 699-724 (2019).
  54. Lim, H. C., et al. Allogeneic umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell implantation versus microfracture for large, full-thickness cartilage defects in older patients: A multicenter randomized clinical trial and extended 5-year clinical follow-up. Ortho J Sports Med. 9 (1), 1-15 (2021).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים