מאמר שיטה

כימות הרמה של 8-oxo-dG באמצעות בדיקת ELISA להערכת נזק חמצוני לדנ"א בתאי MCF-7

DOI:

10.3791/66888

⸱

24 במאי 2024

 ,  ,  , 
1Suzhou Key Laboratory of Medical Biotechnology, Suzhou Vocational Health College, 2Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 3Department of Thyroid and Breast Surgery, Wuzhong People’s Hospital of Suzhou City

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לגילוי כמותי של נזקי חמצון בתאי MCF-7 בטכנולוגיית ELISA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בסיס 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) הוא הצורה השלטת של נזק חמצוני DNA נפוץ. פגיעה בדנ"א משפיעה עמוקות על ביטוי גנים ומשמשת גורם מרכזי בגירוי הפרעות נוירודגנרטיביות, סרטן והזדקנות. לכן, לכימות מדויק של 8-oxoG יש משמעות קלינית בחקירת מתודולוגיות זיהוי נזקי DNA. עם זאת, כיום, הגישות הקיימות לזיהוי 8-oxoG מציבות אתגרים במונחים של נוחות, תועלתיות, מחיר סביר ורגישות מוגברת. השתמשנו בטכניקת ELISA (Marketing), שיטה קולורימטרית יעילה ומהירה ביותר, כדי לזהות שינויים בתכולת 8-oxo-dG בדגימות תאים MCF-7 שעוררו בריכוזים שונים של מי חמצן (H2O2). קבענו את הריכוז של H2O2 שגרם לנזק חמצוני בתאי MCF-7 על ידי זיהוי ערך IC50 שלו בתאי MCF-7. לאחר מכן, טיפלנו בתאי MCF-7 עם 0, 0.25 ו-0.75 mM H2O2 במשך 12 שעות וחילצנו 8-oxo-dG מהתאים. לבסוף, הדגימות היו חשופות ELISA. לאחר סדרה של שלבים, כולל פיזור לוחות, שטיפה, דגירה, התפתחות צבע, סיום התגובה ואיסוף נתונים, זיהינו בהצלחה שינויים בתכולת 8-oxo-dG בתאי MCF-7 המושרים על ידי H2O2. באמצעות מאמצים כאלה, אנו שואפים לבסס שיטה להערכת מידת הנזק החמצוני של דנ"א בתוך דגימות תאים, ובכך לקדם את הפיתוח של גישות יעילות ונוחות יותר לזיהוי נזק לדנ"א. מאמץ זה צפוי לתרום תרומה משמעותית לחקר ניתוחים אסוציאטיביים בין נזק חמצוני לדנ"א לבין תחומים שונים, כולל מחקר קליני על מחלות ואיתור חומרים רעילים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נזק חמצוני לדנ"א הוא תוצאה של חוסר איזון בין יצירת מיני חמצן תגובתי (ROS) לבין מערכת ההגנה נוגדת החמצון התאית1. זה בעיקר כרוך חמצון של DNA purine ו pyrimidine בסיסים 2,3. שינוי חמצוני זה של בסיסי דנ"א לא רק פוגע בשלמות הגנום, אלא גם מקיף מגוון רחב של בעיות פתולוגיות, כולל סרטן, מחלות נוירודגנרטיביות ומחלות לב וכלי דם 4,5. בסיס הגואנין בדנ"א הוא בעל פוטנציאל החיזור הנמוך ביותר והוא הרגיש ביותר לחמצון6. לכן, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) משמש כסמן עיקרי להערכת מידת הנזק החמצוני לדנ"א 7,8. הכימות המדויק של 8-oxo-dG הפך לנושא קריטי בטיפול בהיבטים שונים של הופעת מחלות, התקדמות והערכת נטל חמצון רב-גורמי9.

השיטות המסורתיות לגילוי 8-oxo-dG, כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ECD), ספקטרומטריית מסות וטכניקות מיקוף קשורות, מציגות רגישות גבוהה וספציפיות 10,11,12. עם זאת, טכניקות אלה לעתים קרובות יש דרישות תפעוליות מורכבות ועלויות גבוהות, אשר מעכבים את היישום הנרחב שלהם ואת המעשיות בניתוח מדגם תפוקה גבוהה. עם ההתקדמות המתמדת של המדע והטכנולוגיה, התפתחו מגוון שיטות חדשות, יעילות ומדויקות. היישום של טכנולוגיות חדשות אלה מאפשר לנו לכמת את רמת 8-oxo-dG בצורה מדויקת יותר ומספק כלים חזקים יותר למחקר מעמיק של הקשר בין עקה חמצונית ומחלות. לדוגמה, חוקרים יישמו טכנולוגיית ננו-נקבוביות כדי לזהות ולרצף כמותית DNA13, לזהות סוגי נזק לדנ"א באמצעות אסטרטגיית ריצוף קוד14 בלחיצה אחת, לפתח שיטות ריצוף בתפוקה גבוהה וליצור ביו-חיישנים מבוססי 8-oxoG על ידי שילוב ביוטין-סטרפטאבידין עם ELISA15. ביניהם, ELISA, עם היתרונות המוכרים שלה במונחים של ספציפיות, סינון תפוקה גבוהה, ועלות, הוא אחד הפתרונות האידיאליים עבור זיהוי 8-oxo-dG. לכן, חיוני לפתח שיטה בעלת תפוקה גבוהה, רגישה מאוד, נוחה ומהירה לזיהוי 8-oxo-dG.

טכניקת בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), שפותחה בשנת 197116, התקדמה במהירות במהלך 50 השנים האחרונות והפכה כעת לאחת משיטות הזיהוי הנפוצות ביותר בתחומי הביולוגיה והרפואה 17,18,19. טכנולוגיית ELISA מפגינה רגישות וספציפיות גבוהות, בעלת זמן תגובה קצר וקלה לשימוש, מה שהופך אותה לבחירה מוכרת עבור בדיקות דגימה בקנה מידה גדול וניתוח תפוקה גבוהה20. כתוצאה מכך, ELISA נמצא בשימוש נרחב לניתוח כמותי או כמותי למחצה של תרכובות, חלבונים, נוגדנים או מולקולות בתוך תאים 21,22,23. לדוגמה, נעשה בו שימוש בזיהוי סמנים ביולוגיים הקשורים למחלות שונות, שאריות תרופות וביומולקולות24. ניתן לסווג את ELISAs לארבעה סוגים עיקריים בהתבסס על תכנון ניסויי ועקרונות25. שיטות אלה כוללות ELISA ישיר, ELISA עקיף, סנדוויץ' ELISAותחרותי ELISA 26,27. מבין אלה, סנדוויץ' ELISA, המשתמש בשני נוגדנים ספציפיים, אחד ללכידת מולקולת המטרה והשני לזיהוי, נבחר למחקר במאמר זה. העיקרון הניסיוני של סנדוויץ 'ELISA הוא כדלקמן: ראשית, נוגדן מסוים משותק בבארות של microplate כדי ללכוד את הניתוח של עניין. לאחר הוספת התקן או הדגימה, ניתוח המטרה נקשר לנוגדן המשותק. לאחר מכן, נוגדן מסומן המזהה אפיטופ שונה על האנטיגן מתווסף, ויוצר מבנה כריך. לאחר הסרת נוגדנים לא קשורים, מתווסף מצע. תחת הפעולה הקטליטית של הנוגדן המשני, מתרחשת תגובת צבע, ועוצמת הצבע מתואמת באופן חיובי עם ריכוז המטרה האנליטית בדגימה. לבסוף, הצפיפות האופטית (OD) נמדדה כדי לקבוע את ריכוז הדגימה. לסנדוויץ' ELISA יתרונות של רגישות מוגברת וספציפיות לדגימות מטרה, מה שהופך אותו מתאים לאיתור ריכוזים נמוכים של אנליטות מטרה ודגימות מורכבות28. בנוסף, ניתן לכמת את התוצאות המתקבלות לניתוח נוסף. גורמים אלה הופכים את סנדוויץ' ELISA לשיטת זיהוי נפוצה הן במחקר מדעי והן במעבדות קליניות29.

מחקר זה נועד לזהות כמותית 8-oxo-dG בתאי MCF-7 כדי לקבוע את מידת הנזק החמצוני לדנ"א בתאים. מחקר זה מורכב משני חלקים עיקריים: בניית מודל נזק חמצוני לדנ"א תאי MCF-7 וגילוי 8-oxo-dG באמצעות ELISA. ראשית, תאי MCF-7 גודלו בתרבית חוץ גופית וטופלו בריכוזים שונים של H2O2 לפרקי זמן שונים. כדאיות התא הוערכה באמצעות בדיקת CCK-8 כדי לקבוע את ריכוז המעכב החצי מקסימלי (IC50) של H2O2 בתאי MCF-7. בהתבסס על ערכי IC50 , נבחרו זמן טיפול H2O2 מתאים וריכוז אינדוקציה. כדי לחלץ דגימות של תאי MCF-7 שניזוקו על ידי חמצון, דגימות תאים וסופרנאטנטים התקבלו ונוספו לבארות מקושרות אנזימים שצופו בעבר בנוגדנים 8-oxo-dG. 8-oxo-dG הקיים בדגימה ייקשר לנוגדנים הקשורים לנשא השלב המוצק. לאחר מכן, נוספו נוגדנים 8-oxo-dG המסומנים בפרוקסידז חזרת. תערובת התגובה הודגרה בטמפרטורה קבועה כדי להבטיח קשירה מלאה של הדגימה והנוגדן. האנזים הלא קשור הוסר על ידי שטיפה, ואז נוסף המצע הקולרימטרי, שהפיק צבע כחול. תחת פעולה של חומצה, הפתרון הפך צהוב. לבסוף, ערך OD של דגימות באר התגובה נמדד ב 450 ננומטר, והריכוז של 8-oxo-dG בדגימה היה פרופורציונלי לערך OD. על ידי יצירת עקומה סטנדרטית, ניתן לחשב את הריכוז של 8-oxo-dG במדגם.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בנייתמודל נזק חמצוני של DNA המושרה H2O2 בתאי MCF-7

  1. שחזור תאי MCF-7
    1. העבירו את הצינור הקריוגני של תרבית התא, המכיל 3.5 x 106 תאי MCF-7 ומאוחסן במקרר -80°C, במהירות לקופסת קצף המכילה חנקן נוזלי. שלפו את הצינור בעזרת מלקחיים והניחו אותו באמבט מים בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך כדקה אחת כדי להפשיר את התאים המשומרים.
      הערה: במהלך תהליך ההפשרה באמבט מים, נערו את התאים לסירוגין כדי להבטיח חימום אחיד של הקריוביאלי.
    2. מניחים את הקריוביאל בצנטריפוגה ובצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 150 x גרם למשך 5 דקות.
    3. השתמש פיפטה כדי להשליך את supernatant מן צינור אחסון קריוגני ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום תרבית שלם. מערבבים היטב ומעבירים לצלחת תרבית של 10 מ"מ, משלימים 7 מ"ל נוספים של מדיום תרבית שלם.
    4. נערו את צלחת התרבית בתבנית קרוסקרוס כדי להבטיח ערבוב אחיד, ותרביתו באינקובטור CO2 בטמפרטורה של 37°C, עם 5% CO2.
      הערה: מדיום התרבית המלא מורכב ממדיום תרבית DMEM בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין וסטרפטומיצין.
  2. הערכת כדאיות התא
    1. בחר תאי MCF-7 בשלב הגידול הלוגריתמי עם מצב תאי טוב עבור הניסוי. במהלך שלב הגידול הלוגריתמי, תאים בדרך כלל מציגים מחזור חלוקה קצר יותר ותדירות גבוהה של חלוקת תאים.
      1. התבוננו במורפולוגיה ובקצב הצמיחה של תאי MCF באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. כאשר התאים מציגים מורפולוגיה חד-שכבתית אחידה וצפופה, וניכרת התפשטות תאים, ניתן לקבוע כי התאים נמצאים למעשה בשלב הגידול הלוגריתמי.
    2. שטיפת תאים: השתמש פיפטה כדי להסיר את מדיום התרבית מצלחת התרבית, הוסף 1 מ"ל של חיץ PBS כדי לשטוף את התאים, ולאחר מכן השליך את PBS.
    3. ניתוק תאים: מוסיפים 1 מ"ל טריפסין כדי לשטוף את התאים, ממתינים כדקה עד שטריפסין מנתק לחלוטין את התאים מצלחת התרבית. טפחו בעדינות על מנת התרבות; תצפית על תנועת התא
      בגיליונות מציין ניתוק תאים יסודי.
    4. סיום ניתוק התא וספירת תאים: יש להוסיף 8 מ"ל של מדיום תרבית שלם כדי לסיים את הניתוק, יש להוסיף בעדינות תאי פיפטה ולקבוע את ריכוז תרחיף התא באמצעות מכשיר ספירת תאים.
      הערה: ודא שתרחיף התאים הומוגני לפני הספירה על-ידי פיטום עדין למעלה ולמטה.
    5. זריעת תאים: התאימו את תרחיף התאים המדולל כדי להשיג צפיפות תאים של 5,000 תאים לכל 100 מיקרוליטר. חסנו את תרחיף התא ל-21 בארות של צלחת בת 96 בארות באמצעות אקדח פיפטה, תוך חלוקת 100 מיקרוליטר לכל באר. הוסף 100 μL של חיץ PBS לבארות שמסביב של בארות הזרעים כדי למנוע אידוי יתר של מדיום התרבות.
    6. הכנת מדיום המכיל H2O2: בחר 9 בארות על צלחת תרבית תאים של 12 בארות והקצה תוויות המבוססות על שיפוע ריכוזי H2O2 (0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 מילימול). הוסף 720 μL של תווך שלם לבארות המסומנות כ- 2.0 mM ו- 1.5 mM והוסף 360 μL של תווך שלם לבארות הנותרות.
      1. באמצעות פיפטה, לחלק 1.63 μL ו 1.22 μL של 3% H2O2 מגיב לתוך בארות מסומן כמו 2.0 mM ו 1.5 mM, בהתאמה. ערבבו היטב את התמיסה ביסודיות. באמצעות פיפטה, להעביר 360 μL של 2.0 mM H2O2 לתוך המסומן היטב 1.0 mM ולערבב; לאחר מכן, להעביר 360 μL של 1.0 mM H2O2 לתוך מסומן היטב 0.5 mM ולערבב; ולבסוף להעביר 360 μL של 0.5 mM H2O2 לתוך מסומן היטב 0.25 mM. פיפטה 360 μL של 1.5 mM H2O2 לתוך המסומן היטב 0.75 mM כדי לדלל ולהשיג את הריכוז הרצוי. (איור 1).
        הערה: ודא כי פתרון מלאי H2O2 בפיפטה מועבר לחלוטין לתוך הבארות כדי למנוע כל פתרון שיורית. הקפידו על ערבוב יסודי של התמיסות לפני שממשיכים בדילול.
    7. דגירה: לאחר כ-24 שעות של זריעת תאים, השתמשו בפיפטה כדי להסיר את מדיום התרבית מהצלחת בעלת 96 הקידוחים לאחר שהתאים נצמדו למשטחים. בהתאם לשיפוע הריכוז, הוסף את המדיום המכיל H2O2 המתאים לכל באר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור למשך 12 שעות.
    8. הוספת מגיב CCK-8: לאחר תקופת הטיפול המיועדת של 12 שעות, השתמש בפיפט כדי להסיר את מדיום התרבית מהצלחת בת 96 הקידוחים, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום תרבית שלם ו- 10 מיקרוליטר של מגיב CCK-8 לכל באר, וכלול שלוש בארות בקרה ריקות. לדגור את הצלחת ב 37 ° C במשך 2 שעות.
      הערה: במהלך תהליך הוספת הדגימות, הימנע מהיווצרות בועות כדי למנוע הפרעה לקריאת הערך OD.
    9. מדידת בליעה: מוציאים את הצלחת בעלת 96 הקידוחים מהאינקובטור, מודדים את הבליעה באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-צלחות ומקליטים את התוצאות.
    10. על פי נוסחת החישוב IC50 ,
      שיעור עיכוב (%) = (OD של קבוצת ניסוי סמים ממוצע OD של חור בקרת סמים)/ (OD ממוצע של חור בקרת התא - OD ממוצע של חור בקרת סמים) x 100%
      חישוב התוצאות כאחוז ספיגה בתרביות ביקורת.
    11. ייבא את נתוני הניסוי המעובדים לתוכנת ניתוח סטטיסטי, בחר את סוג הניתוח רגרסיה לא ליניארית, בנה את המודל הלוגיסטי בן ארבעת הפרמטרים והמשך ללחוץ על לחצן התאם עקומה להתאמת עקומה. לאחר תהליך ההתאמה, התוכנה תחשב באופן אוטומטי את ערך IC50 .
  3. H2O ניסוי חמצון תאי MCF-7 המושרהעל ידי 2
    1. אחזר תאי MCF-7 בשלב הגידול הלוגריתמי עם מצב תאים טוב לניסויים.
    2. לשטוף, לבצע ניתוק תאים, לסיים את הניתוק, ולספור את התאים (עיין בשלב 1.2 עבור שיטות ספציפיות).
    3. זריעת תאים: התאם את צפיפות תרחיף התא ל 1 x 106 תאים לכל מנה, עם 4 מ"ל של התרחיף לכל צלחת בקוטר 6 ס"מ.
    4. סמן שני צינורות מיקרוצנטריפוגות 5 מ"ל כ- 0.25 mM ו- 0.75 mM 3% H2O2. הוסף 4 מ"ל של מדיום מלא לכל צינור, ולאחר מכן הוסף 1.13 μL ו 3.40 μL של 3% H2O2, בהתאמה. נערו בעדינות את הצינורות כדי להבטיח ערבוב יסודי. החליפו את מדיום התרבית בשלוש המנות בתווך שלם המכיל ריכוזים H2O2 של 0, 0.25 ו-0.75 מילימול.
    5. לדגור על התרביות: להחזיר את המנות לחממה למשך 12 שעות.

2. הכנת דגימות סלולריות והכנת ריאגנטים ELISA

  1. איסוף דגימות תמצית תאים
    1. איסוף דגימות: השליכו תרבית תאים MCF-7, שטפו, ביצעו ניתוק תאים, סיימו את הניתוק ואספו תאים. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל.
    2. צנטריפוגה: צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות כדי לאסוף את גלולת התא. הוסף 200 μL של PBS כדי להשעות מחדש כל דגימת תא ולשבש תאים על ידי מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים. צנטריפוגה את התא ליזט ב 1,500 x גרם במשך 10 דקות ולהשתמש פיפטה לאסוף את supernatant לניתוח.
      הערה: כאשר כמות התא נמוכה, הפחת את נפח PBS המשמש להשעיה. דגימות ניתן לאחסן ב 4 °C עד 1 שבוע אם ניתוח מיידי אינו אפשרי. לאחסון לטווח ארוך, יש לרכז את הדגימות על בסיס כמויות חד-פעמיות ולאחסן אותן בטמפרטורה של -80°C כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
  2. הכנת ריאגנטים של ELISA
    1. הפשרת ריאגנטים: אפשר לריאגנטים של ELISA, כולל יריעות אטימה, לוחות מצופים מראש, תקנים, מדלל דגימה, נוגדן זיהוי-HRP, מצע כרומוגן, תמיסת עצירה, חיץ שטיפה מרוכז (20x) ודגימות הבדיקה להגיע לטמפרטורת החדר (18-25 מעלות צלזיוס) למשך 20 דקות לפני תחילת הבדיקה. פתח מראש את קורא ELISA 15 דקות לפני השימוש.
    2. הכנת חיץ שטיפה: חשב את הנפח הנדרש של חיץ כביסה מדולל, ולאחר מכן דלל חיץ כביסה מרוכז פי 20 במים מזוקקים או נטולי יונים, לתמיסת עבודה אחת. החזירו את מאגר הכביסה המרוכז שלא נעשה בו שימוש למקרר בטמפרטורה של 4°C.
      הערה: יש להכין את חיץ הכביסה טרי לפני השימוש. אם יש גבישים במאגר הכביסה המרוכז המאוחסן במקרר, אפשרו לו להגיע לטמפרטורת החדר ונערו אותו בעדינות עד שהגבישים יתמוססו לחלוטין לפני השימוש.
    3. הכנת תקן
      1. הכינו תמיסות עבודה של דגימות סטנדרטיות בריכוזים של 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ו-40 ננוגרם/מ"ל, בהתאמה. כדי להבטיח את דיוק תוצאות הניסוי, ערבבו בזהירות את הדגימות הסטנדרטיות למעלה ולמטה לפני השימוש כדי למנוע היווצרות בועות במהלך תהליך ההמסה.

3. ניסוי ELISA

  1. ציפוי לוחות: תכנן מראש את המספר הכולל של בארות עבור תקנים, דוגמאות ובקרות ריקות והוציא את רצועות הצלחת הנדרשות. הוסף 50 μL של תמיסת עבודה סטנדרטית ודגימות גילוי עם ריכוזים שונים לבארות התגובה. לבצע תקנים בטריפליקטים ולהימנע מהוספת דגימות כלשהן לבארות הריקות/בקרה25.
    הערה: שלבי הניסוי של בדיקת ELISA מוצגים באופן סכמטי באיור 2. אם ריכוז הדגימה חורג מטווח האיתור, יש לדלל את הדגימה במדלל הדגימה לפני הדגימה. בעת הוספת דוגמאות, להוסיף אותם לתחתית הצלחת, הימנעות לגעת קירות הבאר, בעדינות לנער כדי לערבב, ולמנוע היווצרות של בועות. כדי להבטיח את דיוק הניסוי, יש להשלים כל תוספת דגימה תוך 10 דקות.
  2. דגירה: למעט הבארות הריקות, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של נוגדן זיהוי מצומד של חזרת פרוקסידאז (HRP) לכל באר תגובה, לאטום את הבארות עם אטם פלטות, ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 60 דקות באינקובטור טמפרטורה קבועה.
  3. שטיפה: יש להשליך את הנוזל, לנער את הנוזל שבבארות הצלחת, לייבש בטפיחות קלות על נייר סופג, להוסיף 350 מיקרוליטר של חיץ כביסה לכל תגובה, לתת לו לעמוד למשך 1-2 דקות ולאחר מכן להשליך את מאגר הכביסה. חזרו על תהליך הכביסה 5x.
    הערה: שטיפה יסודית היא חיונית מכיוון שהיא משפיעה ישירות על דיוק תוצאות הניסוי. ודאו שמאגר הכביסה מנער לחלוטין לאחר כל כביסה. נגבו בזהירות שאריות בתחתית הצלחת לאחר הכביסה, כדי למנוע פגיעה במדידת הספיגה.
  4. תגובת צבע: הוסיפו 50 μL של מצע A ו-50 μL של מצע B לכל תגובה היטב, אטמו את הצלחת ודגרו ב-37°C בחושך למשך 15 דקות.
    הערה: לאחר הוספת מגיב הצבע, שימו לב מיד לשינוי הצבע בבארות התגובה. אם הצבע כהה מדי, הוסף את תמיסת העצירה כדי לסיים את התגובה מוקדם יותר.
  5. לסיים את התגובה ולמדוד את הספיגה: הוסף 50 μL של תמיסת עצירה לכל תגובה היטב, ומיד למדוד את ערך OD באורך גל 450 ננומטר עם קורא ELISA (בתוך 15 דקות).
  6. ניתוח נתונים: ייבא את נתוני הניסוי המעובדים לתוכנת הניתוח הסטטיסטי, בחר את סוג הניתוח רגרסיה ליניארית. בנה עקומת כיול על-ידי התוויית ריכוז התקנים על ציר X כנגד ערכי הצפיפות האופטית (OD) בציר Y. השתמש בעקומת הכיול שנקבעה כדי לוודא את הריכוז של 8-oxo-dG הקיים בדגימות. בנה מודל מתמטי לוגיסטי והמשך ללחוץ על לחצן התאם עקומה להתאמת עקומה. לאחר תהליך ההתאמה, התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את העקומה הסטנדרטית ואת ערך P.
    הערה: לא ניתן לעשות שימוש חוזר בעקומה הסטנדרטית ויש לקבוע אותה מחדש עבור כל ניסוי.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כפי שמודגם באיור 3, ציר ה-X מציין את הריכוז של H2O2 המופעל על תאי MCF-7, בעוד שציר ה-Y מציין את יכולת הקיום של התא. טיפול עם 0.75 mM במשך 12 שעות הפחית את הכדאיות של תאי MCF-7 ל 67%. במקביל לעלייה בריכוז, חלה ירידה משמעותית בכדאיות תאי MCF-7, במיוחד בריכוז של 1.5 מילימול, שם הכדאיות ירדה אל מתחת ל-3% (לוח 1). תוצאות הניסוי הצביעו על IC50 של 0.7655 מילימטר עבור תאי MCF-7.

בסדרת ניסויים זו, השתמשנו בטכניקת ELISA משופרת לכימות רמות 8-oxo-dG. באמצעות ניתוח נתונים, משוואת הרגרסיה של העקומה הסטנדרטית היא:

Y = 23.66 × X + 0.07038.

כפי שמתואר באיור 4A, עקומת הכיול הדגימה ליניאריות גבוהה (R²=0.978), ואיור 4B מראה שהיחסים בין הריכוזים שנמדדו של 8-oxo-dG בדגימות לבין הכמויות הנוספות התואמות שלהם היו מתואמים מאוד, מה שמצביע על דיוק טוב (מקדם השונות היה פחות מ-5%). יתר על כן, העקביות של התוצאות המתקבלות על פני מספר עותקים משוכפלים מצביעה על האמינות והשכפול של שיטת הניסוי.

לסיכום, נתוני הניסוי מצביעים על כך ששיטת ELISA הממוטבת שלנו מסוגלת לזהות בהצלחה תנודות ברמות 8-oxo-dG בתנאים מבוקרים היטב. יש לכך השלכות משמעותיות על יישומים עתידיים של טכניקה זו במגוון רחב יותר של סוגי דגימות לניטור נזק לדנ"א שנגרם על ידי עקה חמצונית. למרות מגבלות מסוימות, סיכויי השיטה ליישום נראים מבטיחים עם אופטימיזציה של תנאי הניסוי.

figure-results-1
איור 1: הכנת דילולים H2O2 . התרשים הסכמטי משרטט את השיטה להכנת דילולי מי חמצן (H2O2), הכוללת שילוב קפדני של תמיסות והעברה מדויקת של ריכוזי H2O2 מגוונים לצינורות המסומנים כ- 1.0 mM, 0.5 mM ו- 0.25 mM בהתאמה. ריכוז המטרה מושג על ידי העברת 1.5 mM H2O2 לתוך הצינור המיועד 0.75 mM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA) לזיהוי אנטיגן. איור סכמטי זה מתאר את השלבים הרציפים של בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) לזיהוי אנטיגן: חיבור דגימה והכנה ריקה; דגירה של אנטיגן המסומנת על-ידי תוכנית המענה ההומניטרי; כביסה והכנת צלחת; תוספת מצע ודגירה; סיום תגובה ומדידת צפיפות אופטית (OD). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: H2O2 עיכב את התפשטות תאי MCF-7. כדאיות התא הוערכה על ידי בדיקת CCK-8 שטופלה בריכוזים שונים של H2O2 (0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5 או 2.0 מילימול) במשך 12 שעות ו- IC50 חושב עבור המצב שצוין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: ניתוח כמותי של 8-oxo-dG בתאי MCF-7 לאחר טיפול H2O2 . (A) עקומה סטנדרטית ELISA עבור 8-oxo-dG. מתאר את הקשר בין ריכוזים ידועים של 8-oxo-dG (1.25, 2.5, 5, 10, 20 ו-40 ננוגרם/מ"ל) לבין ערכי הספיגה שלהם. משוואת הרגרסיה של העקומה הסטנדרטית היא Y = 23.66 × X + 0.07038. (n=3, R2=0.978). (B) ריכוז 8-oxo-dG בתאי H2O2-treated MCF-7. הגרף מציג את הרמות של 8-oxo-dG בתאי MCF-7 הנתונים לריכוזים שונים של H2O2 (0, 0.25 ו-0.75 מילימול). כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע ± SE (שגיאת תקן) משלושה ניסויים עצמאיים (n=3), הממחישה את ההשפעה של עקה חמצונית על נזק לדנ"א. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטר
ריכוז H2O2 , mM00.250.50.7512
כדאיות תאי MCF-7, %10082.881.3761.0713.42.77

טבלה 1: כדאיות התא של תאי MCF-7 שטופלו בתאי H2O2.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לפיתוח שיטות ELISA חשיבות רבה עבור מתודולוגיות קיימות וחדשות לזיהוי נזקי DNA. בהשוואה לטכניקות HPLC מסורתיות וספקטרומטריית מסות, גישה זו לא רק ידידותית למשתמש אלא גם מפגינה רגישות גבוהה ועונה על הדרישות של סינוןבתפוקה גבוהה 30. זה מאפשר ניטור של 8-oxo-dG במחקרי סינון מחלות בקנה מידה גדול, מה שמאפשר הבנה עמוקה יותר של הקשר בין סמן ביולוגי זה לבין מחלות שונות.

במהלך הליכי ניסוי, מספר צעדים קריטיים חיוניים כדי להבטיח את האמינות ואת יכולת השחזור של התוצאות. בתחילה, הניסוי העריך במיומנות את הרגישות של תאי MCF-7 ל- H2O2, עם ערך IC50 של 0.7655 מילימטר ב- 12 שעות, תוך הדגשת רמת הסבילות של תאי MCF-7. לתוצאה זו חשיבות מדעית רבה להבנת מנגנוני ההגנה נוגדי החמצון של תאי MCF-7 והישרדותם תחת עקה חמצונית, תוך מתן אינדיקטור ייחוס חשוב לסינון עתידי של תרופות נוגדות חמצון או מנגנוני טיפול קשורים31. יתר על כן, הבחירה וההתאמה של נוגדנים 8-oxo-dG חיונית לזיהוי ELISA ומשפיעה ישירות על הספציפיות והרגישות של מערכת הזיהוי ELISA. בנוסף, אופטימיזציה של אסטרטגיית הגברת האות ושלבי עיבוד הדגימה הם גורמים חשובים המשפיעים על דיוק האיתור. מצאנו כי שימוש במערכת תגובת מצע יציבה יכול להפחית שגיאות רקע ולהגדיל את טווח הרגישות של זיהוי.

במהלך תהליך הניסוי, בעיות טכניות כגון נוגדנים לא יציבים, תנודות אותות, ותגובתיות צולבת של מגיבים עשויים להתרחש. כדי לטפל בבעיות אלה, אימצנו פרוטוקול ניסויי יציב יותר, שכלל שימוש בממיסים יציבים של נוגדנים לשיפור יציבות הנוגדנים ואופטימיזציה והתאמה של תנאי ניסוי. בנוסף, כדי לטפל בשגיאה הנגרמת על-ידי תנודות אותות, תיקננו את הניסוי באמצעות דגימות סטנדרטיות של 8-oxo-dG כדי להבטיח עקביות של התוצאות.

באשר למגבלות שיטת הניסוי, למרות ש- ELISA מספקת גישה בעלת תפוקה גבוהה, היא עדיין עשויה להיות מוגבלת על ידי כיסוי הנוגדנים הספציפי ותגובתיות צולבת בלתי נמנעת של המצע32. לכן, ייתכן שיידרשו שלבי טיהור דגימה או עיבוד מקדים נוספים עבור דגימות מורכבות. יתר על כן, איתור דגימות עם ריכוזים נמוכים יותר עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת של פעילות הנוגדנים כדי לעמוד בדרישות המחקר.

לסיכום, לשיטת הזיהוי ELISA עבור 8-oxo-dG יש השלכות חשובות על תחומי מחקר ספציפיים. יש לו ערך יישומי פוטנציאלי בניטור סביבתי, הערכת סיכוני מחלות ואבחון מוקדם ומספק גישת זיהוי חדשה עבור 8-oxo-dG בחקלאות, בטיחות מזון וסינון תרופות33. לדוגמה, בניטור ביולוגי סביבתי, זיהוי של עקה חמצונית בדנ"א הנגרמת על ידי רעלנים סביבתיים באורגניזמים יכול לסייע בזיהוי סיכונים פוטנציאליים בזמן34. בעתיד, עם אופטימיזציה נוספת של טכנולוגיית הזיהוי ויישומה במספר דיסציפלינות, שיטה זו צפויה למלא תפקיד קריטי יותר במחקר מדעי החיים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי צוות המחקר החדשני של מכון ג'יאנגסו להשכלה גבוהה למדע וטכנולוגיה (2021), תוכנית מרכז המחקר הטכנולוגי ההנדסי של המכללה המקצועית ג'יאנגסו (2023), תוכנית טכנולוגית מפתח של פרויקטים טכנולוגיים לפרנסת אנשי סוג'ואו (SKY2021029), פרויקט פתוח של ג'יאנגסו ביובנק למשאבים קליניים (TC2021B009), פרויקט מעבדת מפתח המדינה לרפואת קרינה והגנה, אוניברסיטת סוצ'ו (GZK12023013), תוכניות של המכללה לבריאות מקצועית סוג'ואו (SZWZYTD202201), ופרויקט צ'ינג-לאן של מחוז ג'יאנגסו בסין (2021, 2022).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25% טריפסין-EDTA(1x)Gibco25200-072
ערכת ספירת תאים-8DojindoCK04
צלחת ספירת תאיםQiuJingXB-K-25
CO2 חממהתרמו51032872
DMEM בסיסי(1X)GibcoC11995500BT
FBSPANST30-3302
GraphPad Prism X9GraphPad תוכנהלניתוח סטטיסטי תוכנת ניתוח סטטיסטי
צנטריפוגה במהירות גבוההThermo  9AQ2861
אנושי 8-oxo-dG ELISA ערכתZcibioZC-55410
L-1000XLS+ פיפטותRainin17014382
L-20XLS + פיפטותRainin17014392
מיכל חנקן נוזליMvecryogeYDS-175-216
MCF-7 תאBNCCBNCC100137
פוטומטר מיקרופלייט Multiskan FCתרמו1410101
PBSSolarbioP1020
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100XBeyotimeC0222
מיקרוסקופ תאים חיים משולשמוטיק1.1001E+12
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחדHaireV118574

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
  3. Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med. 107, 13-34 (2017).
  4. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  5. Jaruga, P., Dizdaroglu, M. Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells. Nucleic Acids Res. 24 (8), 1389-1394 (1996).
  6. Fleming, A. M., Burrows, C. J. Chemistry of ROS-mediated oxidation to the guanine base in DNA and its biological consequences. Int J Radiat Biol. 98 (3), 452-460 (2022).
  7. Delaney, S., Jarem, D. A., Volle, C. B., Yennie, C. J. Chemical and biological consequences of oxidatively damaged guanine in DNA. Free Radic Res. 46 (4), 420-441 (2012).
  8. Wang, B., et al. Cross-sectional and longitudinal associations of acrolein exposure with pulmonary function alteration: Assessing the potential roles of oxidative DNA damage, inflammation, and pulmonary epithelium injury in a general adult population. Environ Int. 167, 107401(2022).
  9. Chiorcea-Paquim, A. M. 8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanosine biomarkers of oxidative DNA damage: A review on HPLC-ECD determination. Molecules. 27 (5), (2022).
  10. He, L., Liu, X. L., Zhang, J. J. Simultaneous quantification of urinary 6-sulfatoxymelatonin and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1095, 119-126 (2018).
  11. Lam, P. M., et al. Rapid measurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in human biological matrices using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Free Radic Biol Med. 52 (10), 2057-2063 (2012).
  12. Machella, N., Regoli, F., Santella, R. M. Immunofluorescent detection of 8-oxo-DG and pah bulky adducts in fish liver and mussel digestive gland. Aquat Toxicol. 71 (4), 335-343 (2005).
  13. An, N., Fleming, A. M., White, H. S., Burrows, C. J. Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence. ACS Nano. 9 (4), 4296-4307 (2015).
  14. Xiao, S., Fleming, A. M., Burrows, C. J. Sequencing for oxidative DNA damage at single-nucleotide resolution with click-code-seq v2.0. Chem Commun (Camb). 59 (58), 8997-9000 (2023).
  15. Kong, W., Ji, Y., Zhu, X., Dai, X., You, C. Development and application of a chemical labeling-based biosensing assay for rapid detection of 8-oxoguanine and its repair in vitro and in human cells. Chinese J Chem. 40 (19), 2329-2334 (2022).
  16. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin g. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  17. Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: Immunoassays in DNA damage and instability detection. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4689-4704 (2019).
  18. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. J Invest Dermatol. 133 (9), e12(2013).
  19. Ahirwar, R., Bhattacharya, A., Kumar, S. Unveiling the underpinnings of various non-conventional ELISA variants: A review article. Expert Rev Mol Diagn. 22 (7), 761-774 (2022).
  20. Li, D., et al. Magnetic nanochains-based dynamic elisa for rapid and ultrasensitive detection of acute myocardial infarction biomarkers. Anal Chim Acta. 1166, 338567(2021).
  21. Tabatabaei, M. S., Islam, R., Ahmed, M. Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-pcr assays: A review. Anal Chim Acta. 1143, 250-266 (2021).
  22. Berlina, A. N., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B. ELISA and lateral flow immunoassay for the detection of food colorants: State of the art. Crit Rev Anal Chem. 49 (3), 209-223 (2019).
  23. Amber, K. T., Bloom, R., Hertl, M. A systematic review with pooled analysis of clinical presentation and immunodiagnostic testing in mucous membrane pemphigoid: Association of anti-laminin-332 IGG with oropharyngeal involvement and the usefulness of ELISA. J Eur Acad Dermatol Venereol. 30 (1), 72-77 (2016).
  24. Gervay, J., Mcreynolds, K. D. Utilization of elisa technology to measure biological activities of carbohydrates relevant in disease status. Curr Med Chem. 6 (2), 129-153 (1999).
  25. Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2508, 115-134 (2022).
  26. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  27. Hayrapetyan, H., Tran, T., Tellez-Corrales, E., Madiraju, C. Enzyme-linked immunosorbent assay: Types and applications. Methods Mol Biol. 2612, 1-17 (2023).
  28. Eldahshoury, M. K., Hurley, I. P. Direct sandwich ELISA to detect the adulteration of human breast milk by cow milk. J Dairy Sci. 106 (9), 5908-5915 (2023).
  29. Tsumuraya, T., Hirama, M. Rationally designed synthetic haptens to generate anti-ciguatoxin monoclonal antibodies, and development of a practical sandwich ELISA to detect ciguatoxins. Toxins (Basel). 11 (9), 533(2019).
  30. Ito, E., Iha, K., Yoshimura, T., Nakaishi, K., Watabe, S. Early diagnosis with ultrasensitive elisa). Adv Clin Chem. 101, 121-133 (2021).
  31. Larsson, P., Parris, T. Z. Optimization of cell viability assays for drug sensitivity screens. Methods Mol Biol. 2644, 287-302 (2023).
  32. Gunawardana, C. G., Diamandis, E. P. High throughput proteomic strategies for identifying tumour-associated antigens. Cancer Lett. 249 (1), 110-119 (2007).
  33. Zhang, S., et al. Development of a das-ELISA for gyrovirus homsa1 prevalence survey in chickens and wild birds in China. Vet Sci. 10 (5), 312(2023).
  34. Li, Y., Sun, J., Shang, H. Effect of hogg1 expression level on oxidative DNA damage among workers exposed to nickel in stainless steel production environment. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 32 (8), 578-581 (2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

8 Oxo dGDNASandwich ELISADNA

מאמרים קשורים