פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לגילוי כמותי של נזקי חמצון בתאי MCF-7 בטכנולוגיית ELISA.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות הרמה של 8-oxo-dG באמצעות בדיקת ELISA להערכת נזק חמצוני לדנ"א בתאי MCF-7
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בסיס 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) הוא הצורה השלטת של נזק חמצוני DNA נפוץ. פגיעה בדנ"א משפיעה עמוקות על ביטוי גנים ומשמשת גורם מרכזי בגירוי הפרעות נוירודגנרטיביות, סרטן והזדקנות. לכן, לכימות מדויק של 8-oxoG יש משמעות קלינית בחקירת מתודולוגיות זיהוי נזקי DNA. עם זאת, כיום, הגישות הקיימות לזיהוי 8-oxoG מציבות אתגרים במונחים של נוחות, תועלתיות, מחיר סביר ורגישות מוגברת. השתמשנו בטכניקת ELISA (Marketing), שיטה קולורימטרית יעילה ומהירה ביותר, כדי לזהות שינויים בתכולת 8-oxo-dG בדגימות תאים MCF-7 שעוררו בריכוזים שונים של מי חמצן (H2O2). קבענו את הריכוז של H2O2 שגרם לנזק חמצוני בתאי MCF-7 על ידי זיהוי ערך IC50 שלו בתאי MCF-7. לאחר מכן, טיפלנו בתאי MCF-7 עם 0, 0.25 ו-0.75 mM H2O2 במשך 12 שעות וחילצנו 8-oxo-dG מהתאים. לבסוף, הדגימות היו חשופות ELISA. לאחר סדרה של שלבים, כולל פיזור לוחות, שטיפה, דגירה, התפתחות צבע, סיום התגובה ואיסוף נתונים, זיהינו בהצלחה שינויים בתכולת 8-oxo-dG בתאי MCF-7 המושרים על ידי H2O2. באמצעות מאמצים כאלה, אנו שואפים לבסס שיטה להערכת מידת הנזק החמצוני של דנ"א בתוך דגימות תאים, ובכך לקדם את הפיתוח של גישות יעילות ונוחות יותר לזיהוי נזק לדנ"א. מאמץ זה צפוי לתרום תרומה משמעותית לחקר ניתוחים אסוציאטיביים בין נזק חמצוני לדנ"א לבין תחומים שונים, כולל מחקר קליני על מחלות ואיתור חומרים רעילים.
מבוא
נזק חמצוני לדנ"א הוא תוצאה של חוסר איזון בין יצירת מיני חמצן תגובתי (ROS) לבין מערכת ההגנה נוגדת החמצון התאית1. זה בעיקר כרוך חמצון של DNA purine ו pyrimidine בסיסים 2,3. שינוי חמצוני זה של בסיסי דנ"א לא רק פוגע בשלמות הגנום, אלא גם מקיף מגוון רחב של בעיות פתולוגיות, כולל סרטן, מחלות נוירודגנרטיביות ומחלות לב וכלי דם 4,5. בסיס הגואנין בדנ"א הוא בעל פוטנציאל החיזור הנמוך ביותר והוא הרגיש ביותר לחמצון6. לכן, 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) משמש כסמן עיקרי להערכת מידת הנזק החמצוני לדנ"א
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בנייתמודל נזק חמצוני של DNA המושרה H2O2 בתאי MCF-7
- שחזור תאי MCF-7
- העבירו את הצינור הקריוגני של תרבית התא, המכיל 3.5 x 106 תאי MCF-7 ומאוחסן במקרר -80°C, במהירות לקופסת קצף המכילה חנקן נוזלי. שלפו את הצינור בעזרת מלקחיים והניחו אותו באמבט מים בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך כדקה אחת כדי להפשיר את התאים המשומרים.
הערה: במהלך תהליך ההפשרה באמבט מים, נערו את התאים לסירוגין כדי להבטיח חימום אחיד של הקריוביאלי. - מניחים את הקריוביאל בצנטריפוגה ובצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 150 x גרם למשך 5 דקות.
- השתמש פיפטה כדי להשליך את supernatant מן צינור אחסון ק....
- העבירו את הצינור הקריוגני של תרבית התא, המכיל 3.5 x 106 תאי MCF-7 ומאוחסן במקרר -80°C, במהירות לקופסת קצף המכילה חנקן נוזלי. שלפו את הצינור בעזרת מלקחיים והניחו אותו באמבט מים בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס למשך כדקה אחת כדי להפשיר את התאים המשומרים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כפי שמודגם באיור 3, ציר ה-X מציין את הריכוז של H2O2 המופעל על תאי MCF-7, בעוד שציר ה-Y מציין את יכולת הקיום של התא. טיפול עם 0.75 mM במשך 12 שעות הפחית את הכדאיות של תאי MCF-7 ל 67%. במקביל לעלייה בריכוז, חלה ירידה משמעותית בכדאיות תאי MCF-7, במיוחד בריכוז של 1.5 מילימול, שם הכדאיות ירדה אל מתחת ל-3% (לוח 1). תוצאות הניסוי הצביעו על IC50 של 0.7655 מילימטר עבור תאי MCF-7.
בסדרת ניסויים זו, השתמשנו בטכניקת ELISA משופ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לפיתוח שיטות ELISA חשיבות רבה עבור מתודולוגיות קיימות וחדשות לזיהוי נזקי DNA. בהשוואה לטכניקות HPLC מסורתיות וספקטרומטריית מסות, גישה זו לא רק ידידותית למשתמש אלא גם מפגינה רגישות גבוהה ועונה על הדרישות של סינוןבתפוקה גבוהה 30. זה מאפשר ניטור של 8-oxo-dG במחקרי סינון מחלות בקנה מידה גדול, מה שמאפשר הבנה עמוקה יותר של הקשר בין סמן ביולוגי זה לבין מחלות שונות.
במהלך הליכי ניסוי, מספר צעדים קריטיים חיוניים כדי להבטיח את האמינות ואת יכולת השחזור של התוצאות. בתחילה, הניסוי ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי צוות המחקר החדשני של מכון ג'יאנגסו להשכלה גבוהה למדע וטכנולוגיה (2021), תוכנית מרכז המחקר הטכנולוגי ההנדסי של המכללה המקצועית ג'יאנגסו (2023), תוכנית טכנולוגית מפתח של פרויקטים טכנולוגיים לפרנסת אנשי סוג'ואו (SKY2021029), פרויקט פתוח של ג'יאנגסו ביובנק למשאבים קליניים (TC2021B009), פרויקט מעבדת מפתח המדינה לרפואת קרינה והגנה, אוניברסיטת סוצ'ו (GZK12023013), תוכניות של המכללה לבריאות מקצועית סוג'ואו (SZWZYTD202201), ופרויקט צ'ינג-לאן של מחוז ג'יאנגסו בסין (2021, 2022).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% טריפסין-EDTA(1x) | Gibco | 25200-072 | |
| ערכת ספירת תאים-8 | Dojindo | CK04 | |
| צלחת ספירת תאים | QiuJing | XB-K-25 | |
| CO2 חממה | תרמו | 51032872 | |
| DMEM בסיסי(1X) | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | PAN | ST30-3302 | |
| GraphPad Prism X9 | GraphPad תוכנה | לניתוח סטטיסטי תוכנת ניתוח סטטיסטי | |
| צנטריפוגה במהירות גבוהה | Thermo | 9AQ2861 | |
| אנושי 8-oxo-dG ELISA ערכת | Zcibio | ZC-55410 | |
| L-1000XLS+ פיפטות | Rainin | 17014382 | |
| L-20XLS + פיפטות | Rainin | 17014392 | |
| מיכל חנקן נוזלי | Mvecryoge | YDS-175-216 | |
| MCF-7 תא | BNCC | BNCC100137 | |
| פוטומטר מיקרופלייט Multiskan FC | תרמו | 1410101 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין, 100X | Beyotime | C0222 | |
| מיקרוסקופ תאים חיים משולש | מוטיק | 1.1001E+12 | |
| מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד | Haire | V118574 |
מקורות
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
- Cadet, J....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
