הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל של פגיעה ריאתית חריפה בעקבות איסכמיה קרבית-רפרפוזיה על ידי הידוק צולב של אבי העורקים סופרה-צליאק בחולדות

926 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66896

⸱

15 באוגוסט 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מתאר מודל של פגיעה ריאתית חריפה בעקבות איסכמיה קרביים-רפרפוזיה במהלך הידוק צולב של אבי העורקים העל-צליאקי באמצעות לפרוטומיה בחולדות. זה מאפשר לחקור הן את ההשפעות הקליניות והביולוגיות של הידוק אבי העורקים והן את ההשפעה של איסכמיה-רפרפוזיה על איברים בסיסיים ופגיעות ריאות מרוחקות.

תקציר

ניתוח פתוח למפרצת אבי העורקים הבטני דורש הפרעה חולפת של זרימת הדם, הגורמת לאיסכמיה-רפרפוזיה של איברים במורד הזרם. עורקי כליה, מזנטרים וספלנצ'ניים עשויים להיות מעורבים. אף טיפול לא הוכח כיעיל במניעת פגיעה ריאתית מרחוק הנגרמת על ידי איסכמיה-רפרפוזיה לאחר הידוק אבי העורקים העל-צליאק. כדי לחקור את המסלולים הפתופיזיולוגיים של פגיעה ריאתית חריפה וטיפולים תרופתיים, פותח מודל ניסיוני של הידוק אבי העורקים בחולדות.

משככי כאבים תת עוריים עם בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) ניתנים לפני ההליך. הרדמה כללית עם אוורור ספונטני מושרית באמצעות גז הלוגן (איזופלורן 2.5%) באמצעות מסכה. לפרוטומיה קסיפו-ערווה מבוצעת על שולחן מחומם (הטמפרטורה מנוטרת תוך פי הטבעת). גוש הגסטרו-טחול והמעיים נסוגים לאגף ימין, והכבד מגויס לבטן העליונה. הסרעפת ועמודיה מזוהים כדי לאפשר שחרור שלב אחר שלב של אבי העורקים העל-צליאקי מהמעבר התוך-סרעפתי שלו. דיסקציה מתבצעת בעדינות כדי להשיג שליטה היקפית על אבי העורקים בין עמודי הסרעפת. תא המטען של הצליאק הבסיסי והעורק המזנטרי העליון מזוהים בקפידה. ניתן להשתמש במהדק מיקרו-וסקולרי לחסימת אבי העורקים מעל העורקים הקרביים. הידוק נכון מאומת על ידי היעדר פעימות אבי העורקים, הקשורה לחיוורון של המעי הדק. החולדה נשארת מורדמת לאורך כל תקופת האיסכמיה. בתום משך האיסכמיה, מסירים את המיקרו-מהדק, ובודקים את פעימות אבי העורקים, כמו גם צביעה מחדש של המעי. דופן הבטן נסגרת בתפר, ואחריה סוגרים את עור החולדה. בתום תקופת הרפרפוזיה, החיה מורדמת באותו אופן. הוא מורדם על ידי הוצאה במהלך דגימת דם, ולאחר מכן ניתן לאסוף את הריאה. ניתן להעריך פגיעה ריאתית באמצעות ניתוח גזי דם, גרבימטריית ריאות ובדיקה היסטולוגית. ניתן להשתמש בדגימות ריאה גם לניתוח RT-PCR וכתמים מערביים.

מבוא

מפרצת אבי העורקים היא התרחבות מוקדית וקבועה של אבי העורקים1. האבולוציה של מפרצת נוטה לכיוון קרע, הקשור לדימום מסיבי, הנושא תמותה משמעותית2. לכן, מוקד הטיפול הוא במניעת סיבוך דרמטי זה. מפרצת אבי העורקים היא לרוב אינפרא כלייתית וניתן לטפל בה באמצעות אנדופרוסטזה של אבי העורקים. אנדוגרפט אבי העורקים-דו-כסל הוא סטנט מסועף מכוסה המוחדר בצורה זעיר פולשנית דרך עורקי הירך בגישה מלעורית. טכניקה זו אינה דורשת הידוק אבי העורקים ונמנעת מגרימת איסכמיה קרבית. ניתן לבצע אותו בהרדמה מקומית. לעומת זאת, מפרצת אבי העורקים נרחבת יותר - כגון מפרצת בית החזה ומפרצת אבי העורקים הבטני המורכבת - מאתגרת יותר לטיפול בטכניקות אנדווסקולריות. זה נובע ממעורבות עורקי הכליה, העורק המזנטרי העליון ותא המטען הצליאק בתוך המקטע המפרצתי (איור 1). יש לשחזר את העורקים הקרביים העיקריים הללו בנוסף לאבי העורקים עצמו. הגישה האנדווסקולרית, הזעיר פולשנית, דורשת אפוא הליך מורכב יותר הכולל שימוש באנדוגרפים מסועפים ו/או מסועפים לשחזור עורק הקרביים. המגבלה העיקרית של השתלות אלה היא זמן הייצור הארוך - לעתים קרובות מספר חודשים - מה שהופך אותם ללא מתאימים לטיפול חירום. במקרים כאלה, תיקון כירורגי פתוח קונבנציונאלי נותר אפשרות ריאלית ואמינה.

הטיפול בתיקון פתוח דורש לפרוטומיה והידוק על-קרביים, כלומר איסכמיה ויסצרלית זמנית. שיעור הסיבוכים גבוה במהלך הטיפול במפרצות בית החזה הבטן הללו. התמותה נעה בין 5 ל-15%3. סיבוכים ריאתיים מתרחשים ב-60% וסיבוכים כלייתיים ב-40%4. סיבוכים אלה, הקשורים לתגובה דלקתית מערכתית, יכולים להתקדם לכשל רב-קרביים5. תמותה מורבי זו היא רב-גורמית, וכוללת תוקפנות כירורגית, הרדמה, שיכוך כאבים, וריאציות המודינמיות, הלם דימומי ותופעות איסכמיה-רפרפוזיה. תוקפנות כירורגית תורמת לביטוי סיבוכים, בין אם הגישה כוללת כריתת בית החזה, פרנוטומיה, לומבוטומיה או לפרוטומיה, על ידי שינוי מכניקת ההנשמה, עם פגיעה בתפקוד הסרעפתי6.

האיסכמיה הקרבית הזמנית משפיעה על איברים במורד הזרם, כולל מערכת העיכול, מערכת הספלנצ'נית, הכליות והגפיים התחתונות7. סיבוכים ריאתיים הם תופעות הלוואי השכיחות ביותר לאחר ניתוח אבי העורקים החזה-בטני. מקורם הוא רב-גורמי. הידוק אבי העורקים הסופרסליאקי אינו גורם ישירות לאיסכמיה-רפרפוזיה ריאתית. עם זאת, איסכמיה-רפרפוזיה של איברי הקרביים במורד הזרם מעוררת תגובה דלקתית מערכתית גדולה. ההשערה של קשר סיבתי בין איסכמיה קרביים-רפרפוזיה לבין התרחשות של פגיעה מרחוק - במיוחד נזק לריאות - נתמכת היטב. נראה כי תפקוד לקוי של אנדותל ריאתי, מרכיב קריטי בקרום המכתשית-נימי, הוא מרכזי בהתפתחות פגיעה ריאתית חריפה (ALI). תגובה דלקתית מערכתית מסיבית והפעלת נויטרופילים ממלאים תפקיד מרכזי בתהליך זה.

ALI מוגדר לעתים קרובות על סמך קריטריונים היסטולוגיים ולא על סמך הצגה קלינית. ALI מתייחס להפרעה דלקתית חריפה המאופיינת בהפרעה של מחסומי האנדותל והאפיתל הריאתיים. הממברנה המכתשית-נימית, היחידה התפקודית של הריאה, מורכבת משלושה מרכיבים: האנדותל המיקרו-וסקולרי, חלל הביניים והאפיתל המכתשית.

סימן היכר של ALI הוא חדירות מוגברת של מחסום זה, המונעת על ידי חדירת נויטרופילים ושחרור מתווכים פרו-דלקתיים ציטוטוקסיים. נזק אפיתל מכתשית מערב פנאומוציטים מסוג I וסוג II. תאים מסוג I, המכסים 95% משטח המכתשית, רגישים מאוד לפציעה וממלאים תפקיד מפתח בחילופי גזים. תאים מסוג II, רבים יותר אך מכסים שטח קטן יותר, חיוניים לייצור פעילי שטח, תיקון אפיתל והובלת יונים. לאחר פציעה, תאים מסוג II תורמים לשיקום שלמות המכתשית באמצעות יכולת ההתחדשות שלהם והתמיינות לתאים מסוג I.

מסלולי מוות תאים מרובים היו מעורבים בפגיעה באפיתל במהלך ALI, כאשר תאים מסוג I פגיעים במיוחד. בדרך כלל מעריכים את ALI על-ידי הערכת בצקת ריאות, עם או בלי מדדים של חדירות כלי דם כדי לשקף תפקוד לקוי של האנדותל.

מטרת מודל זה היא לחקור את הקשר בין איסכמיה-רפרפוזיה ויסצרלית לבין התפתחות פגיעה ריאתית מרוחקת, הן ברמה המטבולית והן ברמה המכאניסטית כפי שמוצג באיור 2. הקשר הספציפי הזה נותר מובן רק בחלקו. מודל ההידוק של אבי העורקים שלנו מייצג תרחיש איסכמיה-רפרפרופוזיה קרביים על אבי העורקים בריא, ללא נוכחות של מפרצת אבי העורקים הבטני בחולדה. מעל גזע הצליאק, אין ענפים עיקריים בבני אדם או בחולדות. אבי העורקים מעל רמה זו תואם את אבי העורקים העל-קליאק, המוליד רק ענפים קודקודיים קטנים המספקים את דופן בית החזה. לכן, אין הבדל משמעותי באנטומיה של כלי הדם העיקריים ברמה זו בין בני אדם לחולדות.

השימוש במודל זה מאפשר חקירה נרחבת. זה יעזור לזהות סמנים ביולוגיים מוקדמים בהתפתחות פגיעה ברקמות מרוחקות. בנוסף, מודל זה מאפשר לחקור מעכבים פוטנציאליים, כולל מעכבים של מתווכים במחזור הדם או מעכבים של פגיעות ספציפיות באיברים מרוחקים.

מודלים אחרים של איסכמיה-רפרפוזיה משמשים לחקר פציעות מרחוק. מודלים של איסכמיה-רפרפוזיה במוח, במעי ובכליות מיוצגים היטב 8,9,10. קיים מחקר מקיף על נזק ריאתי לאחר איסכמיה-רפרפוזיה במעי עקב חסימה חולפת של העורק המזנטרי העליון (SMA)11,12,13. משך האיסכמיה והרפרפוזיה משתנים ביותר, ונעים בין דקות למספר שעות14,15. הרציונל למשך האיסכמיה הוא לגרום לתוקפנות מספקת כדי לעורר תגובה משמעותית שתוביל להתרחשות של פציעות מרחוק. משך זמן קצר מדי של איסכמיה עשוי שלא לגרום לשינוי משמעותי במסלול המטבולי הנחקר. לגבי משך הרפרפוזיה, הרציונל טמון בהופעה מוקדמת של פציעות מרוחקות והאופי החולף הפוטנציאלי של שינויים פתופיזיולוגיים. משך הרפרפוזיה אידיאלי לא צריך להיות מוקדם מדי או מאוחר מדי כדי לאפיין פגיעה מטבולית כראוי.

הדגמים הם בעיקר במכרסמים. היתרונות של מכרסמים כוללים את גודלם הקטן, קלות התחזוקה, מחזור החיים הקצר והמשאבים הגנטיים השופעים16. השימוש בבעלי חיים גדולים כמו חזירים, כלבים או פרימטים לא נראה מוצדק בהיעדר יתרונות נוספים, מה שעולה בקנה אחד עם הכללים האתיים של ניסויים בבעלי חיים בנוגע לעידון. יתר על כן, בשל הדמיון האנטומי, הפיזיולוגי והגנטי שלהם לבני אדם, מכרסמים מאפשרים מחקרים תרגומיים16.

אחת המגבלות העיקריות של מודלים של הידוק SMA היא שבפרקטיקה הקלינית, לא ניתן לזהות את תחילת תקופת האיסכמיה של המעי. זה הופך את האקסטרפולציה למצבים קליניים אנושיים לבלתי ודאית יותר. לעומת זאת, במהלך ניתוח אבי העורקים המורכב, מזוהים בבירור תקופות האיסכמיה והרפרפוזיה של איברים שונים. יתר על כן, במהלך הידוק אבי העורקים העל-צליאק, כל הקרביים הבסיסיים נמצאים בתקופה איסכמית (מערכת העיכול, הכבד, הטחול, הכליות, איברי האגן והגפיים התחתונות). כל האיברים הללו עוברים את תופעת האיסכמיה-רפרפוזיה. לעומת זאת, מודלים של איסכמיה-רפרפוזיה המתמקדים באיבר ספציפי (מעי, כליה, כבד וכו '), מודלים של הידוק אבי העורקים ולכן של איסכמיה-רפרפוזיה של איברים מרובים עם פתופיזיולוגיה מטבולית נחקרים פחות. באופן דומה, פציעות מרוחקות כגון נגעים ריאתיים לאחר הידוק אבי העורקים נחקרות בצורה גרועה מבחינת חילוף החומרים17,18.

מודלים קיימים של הידוק אבי העורקים מתמקדים בעיקר בהידוק אבי העורקים הבטני מתחת לעורקי הכליה. המגבלה של מודל זה היא שהוא אינו גורם לאיסכמיה-רפרפוזיה קרבית. לכן, הוא אינו מאפשר להדגים קשר בין איסכמיה קרבית-רפרפוזיה לבין פציעות מרחוק פוטנציאליות18,19. חוץ מזה, אין מודל במבחנה המאפשר לחקור איסכמיה-רפרפוזיה באמצעות הידוק אבי העורקים, ולכן נותר צורך בניתוח באמצעות מודלים in vivo.

לכן, מודל ניסיוני זה של הידוק אבי העורקים העל-צליאקי בחולדות מאפשר חקירה מקיפה של המנגנונים הפתופיזיולוגיים והתערבויות פרמקולוגיות המכוונות לפגיעות ריאה מרוחקות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

יצירת מודל זה תואמת את ההנחיות לטיפול וניסויים בבעלי חיים, כמו גם את החקיקה הצרפתית והאירופית. מודל זה אומת במחקר ניסיוני בבעלי חיים שאושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה האזורית בנורמנדי, רואן, צרפת (n°APAFIS: #18974).

1. מודל בעלי חיים והתאקלמות

  1. תקופת הסתגלות למודל בעלי חיים
    הערה: המודל מקפיד על עקרונות העידון.
    1. בעלי חיים במתקנים לא צפופים למשך שבוע כדי לאפשר הסתגלות לפני הניתוח.
    2. שכן את החולדות שתיים בכל כלוב עם גישה אד ליביטום למים ומזון, שייבדקו מדי יום על ידי צוות מנוסה.
    3. בדוק את ניקיון המצעים (רצועות נייר) מדי יום והחלף באופן שיטתי על ידי צוות מנוסה פעמיים בשבוע או יותר במידת הצורך.
    4. לאחר תקופת התאקלמות של שבוע, שבמהלכה יהיה להם מגע יומיומי עם הנסיין וחשיפה למחזורי תאורה של 12 שעות, ההליכים יתקיימו בחדר נפרד ושקט עם אותו נסיין.
  2. מיני מודלים של בעלי חיים
    1. השתמש בחולדות וויסטאר או ספראג דולי זכר כדי להימנע מהשפעות הורמונליות, כגון אסטרדיול, בניתוח פיזיופתולוגיה של איסכמיה-רפרפוזיה קרבית ממתקן גידול מוסמךומוסמך 11,20.
    2. קבעו מראש את קבוצות הניסוי ואת מספר בעלי החיים בכל קבוצה.
    3. בחר את הגיל, חולדות בנות 6-10 שבועות (350 גרם) מומלצות לשימוש.

2. הרדמה ושיכוך כאבים

  1. משככי כאבים
    1. שקלו כל בעל חיים ביום ההליך.
    2. יש לתת בופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג) תת עורית בגובה העור האחורי של החולדה שעה אחת לפני ההליך למטרות משככי כאבים עם מחט 25 גרם ומזרק 2 מ"ל.
    3. יש למרוח ג'ל לידוקאין הידרוכלוריד 1% על עור הבטן ברמת חתך העור העתידי. העריכו מחדש את הכאב באופן קבוע (לפחות פעמיים ביום) לאחר הניתוח באמצעות סולם להערכת הבעות פנים של כאב בחולדה21.
    4. יש לתת במהלך 24 השעות הראשונות, זריקות תת עוריות שיטתיות של בופרנורפין (0.01 עד 0.05 מ"ג/ק"ג) כל 8 שעות.
    5. לאחר מכן, יש לתת זריקות בופרנורפין (0.01 עד 0.05 מ"ג/ק"ג) על סמך סולם כאבי הפנים של המרכז הלאומי להחלפה, עידון והפחתה של בעלי חיים במחקר, ולחזור על הפעולה כל 8 שעות במידת הצורך21.
  2. הרדמה כללית
    1. השתמש בגזים הלוגנים (איזופלורן) להרדמה כללית22.
    2. השתמש בתא מאוורר עם איזופלורן (5%) בקצב זרימת אוויר של 2 ליטר לדקה למשך 2 דקות לשלב האינדוקציה.
    3. לשמירה על ההרדמה, העבירו את החולדה למסכה מותאמת אישית לאוורור ספונטני עם איזופלורן (2-2.5%) בקצב זרימת אוויר של 2 ליטר לדקה לאורך כל הניתוח.
    4. נקה את דרכי הנשימה העליונות על ידי הזזת הלשון מחוץ לחלל הפה כדי לאפשר אוורור דרך המסכה.
    5. עקוב באופן רציף אחר עומק ההרדמה במהלך ההליך והתאם את ריכוז האיזופלורן לפי הצורך.

3. הנחת חולדה במהלך ההליך

  1. הנח את החולדה בשכיבה גבית כשהגפיים הקדמיות והאחוריות משותקות באמצעות סרט דבק, תוך כיבוד טווחי התנועה הפיזיולוגיים של המפרקים של החולדה.
  2. הניחו את החולדה על כרית חימום המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס עם ניטור טמפרטורת פי הטבעת.
  3. הגן על העיניים על ידי מריחת דקריוג'ל. לגלח את פרוות הבטן ולחטא היטב את הבטן בתמיסת פובידון-יוד.

4. הליך כירורגי

  1. מצב ההליך הכירורגי
    1. בצע את ההליך מתחת לזכוכית מגדלת מיקרו-כירורגית כדי להקל על תמרונים עדינים, אם כי זה לא הכרחי.
  2. החתך
    1. לאחר מישוש תהליך ה- xiphoid בגבול העליון של החתך, חתכו את העור במרכז הבטן, וחשפו את הלינאה אלבה של שרירי הבטן.
    2. חתך מרכזי של שריר הבטן בלינאה אלבה כדי למנוע דימום משרירי הבטן.
  3. אקספוזיציה תוך בטנית
    1. שמור על דופן הבטן משני הצדדים בעזרת מחזירים השומרים על עצמם.
    2. ודא היעדר חריגות (גידולים), גייס את הקרביים, הקיבה, הטחול והכבד לצד ימין של הבטן, ולאחר מכן חשוף את אבי העורקים העל-צליאק.
    3. שמר את כל הקרביים בתוך הבטן ככל האפשר על ידי קומפרס קטן מקופל לאורכו וספוג בתמיסת מלח חמה (37 מעלות צלזיוס).
    4. מכסים את כל הקרביים בקומפרס ספוג בתמיסת מלח המחוממת ל-37 מעלות צלזיוס, למניעת היפותרמיה והתייבשות.
  4. זיהוי כלי דם תוך-בטניים עיקריים
    1. לזהות את אבי העורקים העל-צליאקי על פי פעימותיו ומיקומו בין עמודי הסרעפת.
    2. שליטה באבי העורקים בין עמודי הסרעפת בדיסקציה עדינה וזהירה באמצעות אפליקטורים בעלי קצה כותנה וניתוח מלקחיים לשחרור אבי העורקים בצורה א-טראומטית ככל האפשר.
    3. הקף את אבי העורקים העל-צליאקי באמצעות תפר מונופילמנט 5-0 עם מלקחיים לכריתה.
    4. ודא את מקור תא המטען של הצליאק ואת העורק המזנטרי הבסיסי. משך ההליך הכירורגי הזה הוא 10 עד 15 דקות לחולדה.
    5. הזיהוי הבסיסי של הווריד הנבוב התחתון התת-כלייתי קל בשל השקיפות של הרטרופריטונאום.
    6. שחרר את הווריד הנבוב התחתון התת-כלייתי רק על פני השטח הקדמיים שלו, מה שמאפשר מתן תוך ורידי ישיר של כל חומר תרופתי.
  5. הזרקה תוך ורידית
    1. לשם כך, השתמש במחט 30 גרם להזרקה, והנח כמה מילימטרים של דחיסה המוסטטית כדי להשיג המוסטזיס.
    2. אם מבצעים התניה מוקדמת תרופתית, יש לתת את ההזרקה לפני הידוק אבי העורקים. לטיפול לאחר התנייה, יש לתת אותו במהלך או אחרי הידוק אבי העורקים.
    3. פרוטוקול זה חקר התניה מוקדמת פרמקולוגית, לכן יש לתת 5 דקות לפני הידוק אבי העורקים.
  6. התקופה האיסכמית
    1. מהדקים את אבי העורקים הצליאק בעזרת מהדק מיקרו-וסקולרי אטראומטי למשך כל התקופה האיסכמית של 40 דקות. ודא את יעילות המהדק על ידי היעלמות פעימות אבי העורקים הבסיסיות ושינוי צבע הקרביים והגפיים מספר פעמים במהלך ההידוק.
    2. סגור חלקית את הבטן עם שלושה תפרים נספגים פשוטים 5-0 קלועים כדי להגביל את אובדן המים והחום. מכסים את החתך הניתוחי בקומפרס סטרילי ספוג בתמיסת מלח חמה לכל משך האיסכמיה.
  7. תקופת ריפרפוזיה
    1. בתום התקופה האיסכמית יש לפתוח מחדש את הבטן ולחשוף את אבי העורקים באותו אופן שתואר קודם לכן.
    2. הסר את מהדק כלי הדם, וודא את חידוש פעימות אבי העורקים הבסיסיות ואת הצביעה מחדש של הקרביים והגפיים. תקופת הרפרפוזיה מתחילה מיד עם הסרת המיקרו-מהדק.
  8. בטן נסגרת
    1. החזירו את הקרביים למקומם המקורי, וסגרו את הבטן עם תפר נספג קלוע 5-0 על הלינאה אלבה והעור עם תפר נספג מונופילמנט 5-0.
  9. התעוררות בעלי חיים
    1. הנח את החולדה בתנוחת דקוביטוס לרוחב שמאל כדי למנוע דחיסת הווריד הנבוב התחתון על ידי המסה הקרבית וההקשר של היפווולמיה. הניחו את החולדה בכלוב בודד עם מנורת חום כדי לשמור על הטמפרטורה עד להתעוררות, כעשר דקות לאחר מכן.
  10. הרדמה כללית שנייה
    1. בתום תקופת הרפרפוזיה של 180 דקות, יש להרדים את החולדה באמצעות אותו הרדמה בגז דרך תא מאוורר עם איזופלורן (5%) בקצב זרימת אוויר של 2 ליטר לדקה למשך 2 דקות לשלב האינדוקציה.
    2. לשמירה על ההרדמה, העבירו את החולדה למסכה מותאמת אישית לאוורור ספונטני עם איזופלורן (2-2.5%) בקצב זרימת אוויר של 2 ליטר לדקה לאורך כל תקופת איסוף הרקמות.

5. דגימה

  1. דגימות דם
    1. אסוף דגימות דם באמצעות מחט 23-G ומזרק של 5 מ"ל על ידי ניקוב ישיר לתוך הווריד הנבוב התחתון מתחת לוורידי הכליה.
    2. השג המוסטזיס לאחר ניקוב על ידי מריחת חתיכה קטנה של דחיסה המוסטטית.
    3. השתמש בחלק קטן (100 מיקרוליטר) מסך הדם לגזים וניתוח דם סטנדרטי בכרטיס בדיקת טמפרטורת חדר יחיד.
    4. אוספים את שארית הדם המלא בצינור EDTA של 4 מ"ל, ומצנטריפוגה אותו בטמפרטורה של 1,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של +4 מעלות צלזיוס.
    5. הקפיאו את הפלזמה בצינורות קריו-צינורות בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
  2. דגימות רקמה
    1. דגימת רקמות
      1. אסוף דגימות רקמה (ריאות, מעי, כליות, כבד ולב) במהלך המתת חסד של בעל החיים. בצע המתת חסד על ידי דגימת דם המובילה להוצאה לאחר הרדמה כללית עם איזופלורן על פי אותו פרוטוקול שהוזכר קודם לכן.
      2. דרך הבטן הפתוחה, קצרו 50 מ"ג מכל רקמה: הקוטב העליון של הכליה השמאלית, אונת הכבד השמאלית והמעי הדק הדיסטלי 1 ס"מ לפני הצקום.
      3. לאחר מכן, בצע סטרנוטומיה חציונית במהירות כדי לזהות את הלב והריאות.
      4. שחרר את הריאה השמאלית מהרצועה שלה והסר אותה לחלוטין לניתוח היסטולוגי. שחרר את הריאה הרב-אונית הימנית מהרצועות שלה. הפרד את האונה הקדמית לניתוח חומצות גרעין וחלבון, אחסן את השאר בכוס עם סרום פיזיולוגי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות כדי לבצע לאחר מכן גרבימטריה.
      5. חלץ את הלב כגוש שלם עם חלקים של אבי העורקים, עורק הריאה ושני הווריד הנבוב. דגימו חתיכה מהחדר השמאלי לניתוחי חומצות גרעין וחלבון, אחסנו את השאר בכוס עם סרום פיזיולוגי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות כדי לבצע לאחר מכן גרבימטריה.
    2. ניתוח חומצות גרעין
      1. לניתוח חומצות גרעין, אסוף מיד חלק של 50 גרם רקמה. הקפיאו אותו בחנקן נוזלי ולאחר מכן אחסנו אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
      2. חלץ RNA כולל עם ריאגנט מוכן לשימוש לבידוד RNA כולל איכותי על פי פרוטוקול היצרן.
      3. קבע את ריכוז ה-RNA והטוהר בעזרת ספקטרופוטומטר. מדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות 2 מיקרוליטר של דגימה, עם 2 מיקרוליטר של מים נטולי RNase כהתייחסות ריקה. השתמש בספיגה ב-260 ננומטר כדי לקבוע את ריכוז ה-RNA.
        הערה: טוהר RNA מקובל הוגדר כיחס ספיגה של 260/280 ו-260/230 שנע בין 1.7 ל-2.0.
      4. השתמש ב-1 מיקרוגרם מכל דגימת RNA לשעתוק הפוך.
      5. למדוד את רמות ה-mRNA של ציטוקינים פרו-דלקתיים (IL-1beta, TNF-alpha, IL-6) והתייחסות פנימית (beta2-microglobulin), על ידי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR) במחזור בלוק תרמי מהיר, מבוסס צלחת עם יכולות זיהוי מקוונות משולבות בזמן אמת באמצעות תערובת תגובת התחלה חמה מוכנה לשימוש (פריימרים מפורטים בטבלה 1).
      6. חשב את רמת ה-mRNA היחסית בשיטת 2-ΔΔCT.
    3. ניתוח חלבונים
      1. לניתוח חלבון, הנח 50 מ"ג רקמה בצינור ליזינג של 2 מ"ל המכיל חמישים חרוזי קרמיקה של תחמוצת זירקוניום 2.8 מ"מ. שפופרת ליזינג זו מכילה 1 מ"ל של מאגר ליזה של בדיקת רדיו-אימונו-משקעים (RIPA) עם טבלית מעכב פרוטאז וטבליה מעכבת פוספטאז.
      2. חלץ חלבון מהדגימות על ידי הומוגניזציה על טחנת צינורות המעבדה עם 3 חזרות של בדיקת 5 שניות, ולאחר מכן תקופת מנוחה של 10 שניות.
      3. צנטריפוגה את הדגימות ב-10,000 גרם ב-+4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחסנו את הסופרנטנטים בקריו-צינורות ב-20 מעלות צלזיוס עד לניתוח.
      4. קבע את ריכוזי החלבון בשיטה מבוססת ברדפורד ושמור דגימות ב-80 מעלות צלזיוס.
      5. הפרד כמות שווה של חלבונים מכל דגימה באמצעות SDS-PAGE.
      6. העבירו חלבונים מופרדים על ממברנות ניטרוצלולוזה של 0.2 מיקרומטר.
      7. דגרו את הממברנה לאחר חסימה עם חלב יבש ללא שומן 5% TBS-Tween למשך שעה, עם נוגדן ראשוני כנגד החלבון הספציפי לבחירתכם. לדוגמה, כדי לחקור את הפרנאז, השתמש בנוגדנים ראשוניים רב-שבטיים של ארנב כנגד הפרנאז אנושי (דילול 1:2000) וחלבון בקרה כ-GAPDH, השתמש בנוגדנים ראשוניים חד-שבטיים של עזים כנגד GAPDH (דילול 1:5000) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
      8. שטפו את הכתמים שלוש פעמים עם מאגר TBST-Tween 0.1%.
      9. דגירה עם נוגדן משני מצומד HRP המכוון כנגד הנוגדן הראשוני בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה אחת בתמיסת חסימה. לדוגמה, כדי לחקור את הפרנאז, השתמש בעז נגד נוגדן משני של ארנב (דילול 1:5000) וכדי לחקור GAPDH, השתמש בארנב נגד נוגדן משני של עז (דילול 1:10000).
      10. זיהוי קומפלקסים חיסוניים באמצעות מערכת זיהוי כימילומינסנציה משופרת (ECL).
      11. נתח את הממברנות באמצעות תוכנה ייעודית לקביעת ערכי הצפיפות של רצועות היעד, תוך שימוש ב-GAPDH כבקרה פנימית. בצע ניתוח צפיפות של הלהקה המתאימה להפרנאז (50 kDa), ונרמל אותו לפס החלבון GAPDH (35 kDa) כדי לקבוע את עוצמת האות היחסית.
    4. ניתוח היסטולוגי
      1. לניתוח היסטולוגי, קח את הריאה היונילובר השמאלית בהילום, ולאחר מכן החדיר דרך הסימפונות הראשיים השמאליים תמיסת שימור בהקפאה באמצעות קטטר 16 G. מקפיאים אותו בחנקן נוזלי ומאחסנים אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    5. ניתוח גרבימטריה
      1. לאחר הדגימות לניתוח חומצות גרעין וחלבון, נתח את החלק הנותר של הלב והריאה הרב-אונית הימנית על ידי גרבימטריה, עם ייבוש בתנורים ב-70 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר ליחס המשקל הרטוב/יבש לספק אומדן של בצקת רקמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה נמצא בטוח, עם אובדן מינימלי של בעלי חיים (פחות מ-5%) במהלך הרדמה וניתוח, ויעיל לזירוז פגיעה ריאתית חריפה. הרדמה עם איזופלורן הייתה בטוחה יותר מקטמין בשילוב עם הרדמת קסילזין (אובדן של כ-15%), עם התעוררות מהירה והתאוששות טובה יותר של חולדות (נתונים לא מוצגים). כל בעלי החיים המורדמים הצליחו לעבור הידוק אבי העורקים בטוח ויעיל בשיטה זו. כל בעלי החיים (100%) עם הידוק יעיל של אבי העורקים שרדו את תקופות האיסכמיה והרפרפוזיה, בהתאמה, שנמשכו 40 דקות ו-3 שעות.

על פי פרוטוקול זה, ניתוח דגימות ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מודל כירורגי זה של הידוק צולב אבי העורקים מציע את היתרון בכך שהוא מאפשר ניתוח מקיף, הן מבוסס רקמות והן מבוסס פלזמה, של הפגיעה החריפה בריאותית בעקבות איסכמיה-רפרפוזיה קרבית. זה גם מספק את ההזדמנות לבדוק מולקולות פרמקולוגיות עם מתן תוך-צפק, אנטרלי או תוך ורידי לפני או אחרי התנייה.

אחד השלבים הקריטיים נותר הידוק אבי העורקים הסופרצליאק במהלך הניתוח. כאשר שולטים בו, ניתן לבצע שלב זה במהירות. עקומת הלמידה של הטכניקה תלולה: בדרך כלל נדרשים פחות משלושה הליכים כדי לרכו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.2 ומיקרו; m ממברנות ניטרוצלולוזה Trans-Blot Turbo Transfert Packביו-ראד16201500.2 ומיקרו; M ממברנות ניטרוצלולוזה חתוכות מראש
מזרק Luer Slip 1cc ללא מחטטרומוMDSS01SEמזרק Luer Slip 1cc ללא מחט
מזרק 2 סמ"ק Luer Slip ללא מחטבקטון דינקינסוןמזרק 2 סמ"ק Luer Slip ללא מחט
צינור 4 מ"ל EDTA BD K3 13 מ"מ x 75 מ"משואב אבק BDBD368860צינור EDTA 5 מ"ל BD K3 13 מ"מ x 75 מ"מ
5-0 תפר קלוע / ויקריל 5-0 (אתיקון) או נובוסין (ב. בראון)אתיקון - ג'ונסון אנד ג'ונסוןV7970Eויקריל 5-0 מחט נקודת התחדדות 1/2 עיגול 13 מ"מ אורך 45 ס"מ
5-0 תפר נספג מונופילמנט / Monocryil Poliglecaproneאתיקון - ג'ונסון אנד ג'ונסוןY493Gמחט 3/8 עיגול אורך 18 אינץ'
מזרק Luer Slip 5cc ללא מחטטרומוSS-05LE1מזרק Luer Slip 5cc ללא מחט
מהדק מיקרו-וסקולרי אטראומטי / מהדקי כלי חד פעמי לוורידAROSurgicalTKF-1-20 גרםמהדק מיקרו-וסקולרי אטראומטי לשימוש בוורידים על מנת להדק את אבי העורקים של החולדה
BD Microlance 3 23 גרם x 1 0.6 x 25 מ"משואב אבק BD300800BD Microlance 3 23 גרם x 1 0.6 x 25 מ"מ
BD Microlance 3 25 G x 5/8 0.5 x 16 מ"משואב אבק BD300600BD Microlance 3 25 G x 5/8 0.5 x 16 מ"מ
BD Microlance 3 30 גרם x 1/2 0.3 x 13 מ"משואב אבק BD304000BD Microlance 3 30 גרם x 1/2 0.3 x 13 מ"מ
בטא-אקטין InvitrogenCarlsbad, ארצות הברית15G5A11/E2
בדיקת חלבון בשיטה מבוססת ברדפורדBiorad, Marnes-la-Coquette, צרפת5000201
בופרנורפיןבופרנורפין
צנטריפוגטור סיגמא 3-30Sigma, גרמניה10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014צנטריפוגטור לאפנדורף
cOmplete מינירוש11836153001קוקטייל מעכב פרוטאז 25 טבליות
צמר גפן
דקריוגל /  ג'ל לעיניים Lubrithal 10 גרםמוצרים וטרינריים של Dechraקוד  ACL7376464ג'ל לעיניים Lubrithal 10 גרם
אזמל חד פעמיפאראמונטפ.ד.ס.11להב אזמל חד פעמי n° 11
צריבה חשמליתDentRMedEMB/87400עט המוסטטי עם טמפרטורת גובה
מערכת זיהוי ECL משופרתBiorad, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב1705060S
טחנת חרוזי פישרברנד 24פישר סיינטיפיק15515799משמש עבור  שחיקה, ליזה והומוגניזציה של דגימות ביולוגיות לפני מיצוי מולקולרי
ספוגיות גזה ראפין.010106ספוגיות גזה 
תוכנת ImageLabTMביורדבכונן USB או ברישיון
איזופלורן 5%איזופלורן 5%
ג'ל לידוקאין פרילוקאין 5% Aguettant, Lyon, צרפתג'ל לידוקאין פרילוקאין 5% 
מכשיר LightCycler 480Roche, Bâ le, שוויצרי5015243001מחזור תרמי
ג'ל סיכה סטרילי K-Y 82 גרםרקיט בנקיזרג'ל סיכה סטרילי K-Y 82 גרם
ננו-דרופ 2000TermoScientific, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"בND-2000ספקטרופוטומטר
פאהה פינס אנטומיהרטמן991063צבת אנטומית
פוססטופרוש4906837001מעכב פוספטאז 20 טבליות 
גבס/סרט דבקאנפור135320סרט דבק כירורגי/טיח
תמיסת פוביון-יוד / Vé té תמיסת דייןVé טוקינולתמיסת חיטוי לשימוש חיצוני
שפופרת ערכת ליזינג של Precellys הומוגניזציה של רקמות קשות CK28, ברטיןCK28שפופרת ערכת ליזינג של Precellys 
Prolè ne תפר פרוליפרופילןאתיקון - ג'ונסון אנד ג'ונסון7472HProlè ne 5-0 מחט מתחדדת חיתוך 3/8 עיגול 13 מ"מ אורך 75 ס"מ
צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"לאפנדורף.0030120086צינורות נעילה בטוחה 1.5 סמ"ק ללא צבע 1000 צינורות לצנטריפוגה
צינורות נעילה בטוחה 2 מ"לאפנדורף.0030120094צינורות נעילה בטוחה 2.0 סמ"ק ללא צבע 1000 צינורות לצנטריפוגה
צינורות נעילה בטוחה 5 מ"לאפנדורף.0030119401צינורות נעילה בטוחה 5.0 סמ"ק ללא צבע 200 צינורות לצנטריפוגה
תמיסת מלח NaCl 0,9%Aguettant, Lyon, צרפת600502תמיסת מלח 0.9% 500 מ"ל
דף SDSסיגמא-אלריך
קטטר סורפלאש IV 16 גרםטרומוSR*FF1651
סורג'יסלאתיקון - ג'ונסון אנד ג'ונסוןספוגיות המוסטטיות נספגות
סט תפרים n° 12הרטמן4701762סט תפרים סטרילי עם אלוף הדבקה, ציפורניים, צבת אדסון, מחזיק מחט
SYBR ירוק קיט רייקלר אור 480 SYBR ירוק I Masternרוש4707516001SYBR ירוק
TBST-Tween 0.1% מאגר סיגמא-אלריך
כרטיסי מבחן Epoc 24 כרטיסים 13 פרמטריםסימנס-בריאים
רקמות TEKסאקורה פיינטקפתרון שימור בהקפאה 
מגיב TRIzol Invitrogenתרמו פישר סיינטיפיק, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב15596026מגיב טריזול

מקורות

  1. Johnston, K. W., Rutherford, R. B., Tilson, M. D., Shah, D. M., Hollier, L., Stanley, J. C. Suggested standards for reporting on arterial aneurysms. Subcommittee on Reporting Standards for Arterial Aneurysms, Ad Hoc Committee on Reporting Standards, Society for Vascular Surgery and North American Chapter, International Society for Cardiovascular Surgery. J Vasc Surg. 13 (3), discussion 245-247 452-458 (1991).
  2. Johansen, K., Kohler, T. R., Nicholls, S. C., Zierler, R. E., Clowes, A. W., Kazmers, A. Ruptured abdominal aortic aneurysm: the Harborview experience. J Vasc Surg. 13 (2), 245-247 (1991).
  3. Cambria, R. P., Clouse, W. D., Davison, J. K., Dunn, P. F., Corey, M., Dorer, D. Thoracoabdominal aneurysm repair: Results with 337 operations performed over a 15-year interval. Ann Surgery. 236 (4), 471-479 (2002).
  4. Feezor, R. J., et al. Genomic and proteomic determinants of outcome in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. J Immunol. 172 (11), 7103-7109 (2004).
  5. Welborn, M. B., et al. The relationship between visceral ischemia, proinflammatory cytokines, and organ injury in patients undergoing thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Crit Care Med. 28 (9), 3191-3197 (2000).
  6. Money, S. R., et al. Risk of respiratory failure after repair of thoracoabdominal aortic aneurysms. Am J Surg. 168 (2), 152-155 (1994).
  7. Collange, O., et al. Compartmentalization of inflammatory response following gut ischemia reperfusion. Eur J Vasc Endovasc Surg. 49 (1), 60-65 (2015).
  8. Shi, Y., Han, L., Zhang, X., Xie, L., Pan, P., Chen, F. Selenium alleviates cerebral ischemia/reperfusion injury by regulating oxidative stress, mitochondrial fusion and ferroptosis. Neurochem Res. 47 (10), 2992-3002 (2022).
  9. Wang, Q., et al. Empagliflozin protects against renal ischemia/reperfusion injury in mice. Sci Rep. 12 (1), 19323(2022).
  10. Wu, M. -B., Ma, B., Zhang, T. -X., Zhao, K., Cui, S. -M., He, S. -C. Propofol improves intestinal ischemia-reperfusion injury in rats through NF-κB pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 24 (11), 6463-6469 (2020).
  11. Breithaupt-Faloppa, A. C., et al. Acute effects of estradiol on lung inflammation due to intestinal ischemic insult in male rats. Shock. 41 (3), 208-213 (2014).
  12. Klausner, J. M., et al. Thromboxane A2 mediates increased pulmonary microvascular permeability following limb ischemia. Circ Res. 64 (6), 1178-1189 (1989).
  13. James, I. A. O., Chen, C. -L., Huang, G., Zhang, H. -Y., Velten, M., Besner, G. E. HB-EGF protects the lungs after intestinal ischemia/reperfusion injury. J Surg Res. 163 (1), 86-95 (2010).
  14. Kannan, K. B., et al. Hypoxia-inducible factor plays a gut-injurious role in intestinal ischemia reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (5), G853-G861 (2011).
  15. Li, Y., et al. Enteral supplementation of alanyl-glutamine attenuates the up-regulation of beta-defensin-2 protein in lung injury induced by intestinal ischemia reperfusion in rats. Int J Surg. 12 (11), 1181-1186 (2014).
  16. Bryda, E. C. The mighty mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  17. Palmier, M., et al. A supraceliac aortic cross clamping model to explore remote lung injury and the endothelial glycocalyx. Ann Vasc Surg. 93, 18-28 (2022).
  18. Ak, E., Ak, K., Ustandag, U. V., Kervancioglu-Demirci, E., Emekli-Alturfan, E., Çetinel, S. Milrinone attenuates heart and lung remote injury after abdominal aortic cross-clamping. Ann Vasc Surg. 69, 391-399 (2020).
  19. Kurt, A., Kalkan, Y., Turut, H., Cure, M. C., Tumkaya, L., Cure, E. Topiramate reduces aortic cross-clamping-induced lung injury in male rats. Acta Medica (Hradec Kralove). 61 (4), 144-149 (2018).
  20. Fantozzi, E. T., et al. Estradiol mediates the long-lasting lung inflammation induced by intestinal ischemia and reperfusion. J Surg Res. 221, 1-7 (2018).
  21. Sotocina, S. G., et al. The Rat Grimace Scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Mol Pain. 7, 55(2011).
  22. Oh, S. S., Narver, H. L. Mouse and rat anesthesia and analgesia. Curr Protoc. 4 (2), e995(2024).
  23. Annecke, T., et al. Sevoflurane preserves the endothelial glycocalyx against ischaemia-reperfusion injury. Brit J Anaesth. 104 (4), 414-421 (2010).
  24. Pararajasingam, R., Weight, S. C., Bell, P. R. F., Nicholson, M. L., Sayers, R. D. Pulmonary nitric oxide metabolism following infrarenal aortic cross-clamp-induced ischaemia-reperfusion injury. Eur J Vasc Endovasc Surg. 19 (1), 47-51 (2000).
  25. Nielsen, V. G., Baird, M. S., McAdams, M. L., Freeman, B. A. Desflurane increases pulmonary alveolar-capillary membrane permeability after aortic occlusion-reperfusion in rabbits: evidence of oxidant-mediated lung injury. Anesthesiology. 88 (6), 1524-1534 (1998).
  26. Axon, R. N., Baird, M. S., Lang, J. D., Brix, A. E., Nielsen, V. G. PentaLyte decreases lung injury after aortic occlusion-reperfusion. Am J Respir Crit Care Med. 157 (6), 1982-1990 (1998).
  27. Fujimura, N., et al. Neutrophil elastase inhibitor improves survival rate after ischemia reperfusion injury caused by supravisceral aortic clamping in rats. J Surg Res. 180 (1), e31-e36 (2013).
  28. Spanos, K., et al. Transition from open repair to endovascular aneurysm repair for rupture aortic aneurysms throughout a 16-year period of time in a single tertiary center. Ann Vasc Surg. 100, 120-127 (2024).
  29. Hansen, L. W., et al. Sirtuin1 activator SRT1720 protects against organ injury induced by intestinal ischemia-reperfusion. Shock. 45 (4), 359-366 (2016).
  30. Thais Fantozzi, E., et al. Acute lung injury induced by intestinal ischemia and reperfusion is altered in obese female mice. Pulm Pharmacol Ther. 49, 54-59 (2018).
  31. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society Workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  32. Michel, J. -B., et al. Novel aspects of the pathogenesis of aneurysms of the abdominal aorta in humans. Cardiovasc Res. 90 (1), 18-27 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

מודל כירורגי בחולדהאאורטה סופרא-כאליאקיתדלקת ריאתיתאנליזת גזי דםהיסטולוגיה של הריאהבצקת ריאתיתחדירת נויטרופילים
מודל של פגיעה ריאתית חריפה בעקבות איסכמיה קרבית-רפרפוזיה על ידי הידוק צולב של אבי העורקים סופרה-צליאק בחולדות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.