הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הבהרת #946;-1,3-גלוקנאז ופרוקסידז תכונות פיסיקוכימיות של מנגנון ההגנה על דופן תא החיטה מפני התפשטות Diuraphis noxia

1.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66903

⸱

26 ביולי 2024

 ,  ,  , 
1Carbohydrates and Enzymology Laboratory (CHEM-LAB), Department of Plant Sciences, University of the Free State, 2Faculty of Natural and Agricultural Sciences, Department of Plant Science, Botany, Plant Biochemistry and Physiology, University of the Free State, 3Agricultural Research Council - Small Grain Institute

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליכים המשמשים לחקר ואפיון אנזימים הקשורים לדופן התא, בעיקר β-1,3-גלוקנה ופרוקסידז, בצמחי חיטה. רמות הפעילות שלהם עולות במהלך אינטראקציה חיטה-RWA והם מעורבים בתגובת ההגנה של הצמח באמצעות חיזוק דופן התא, אשר מרתיע הזנת כנימות.

תקציר

צמחי חיטה שורצי כנימות חיטה רוסיות (RWA) גורמים לשרשרת של תגובות הגנה, כולל תגובות רגישות יתר (HR) ואינדוקציה של חלבונים הקשורים לפתוגנזה (PR), כגון β-1,3-גלוקנאז ופרוקסידז (POD). מחקר זה נועד לאפיין את התכונות הפיזיקוכימיות של POD ו- β-1,3-גלוקנאז הקשורים לדופן התא ולקבוע את הסינרגיזם שלהם על שינוי דופן התא במהלך אינטראקציה RWASA2-חיטה. זני Tugela-Dn1 הרגישים והעמידים Tugela-Dn5 העמידים הונבטו ונשתלו בתנאי חממה, הופרו 14 יום לאחר השתילה והושקו כל 3 ימים. הצמחים היו שורצים 20 פרטים פרתנוגנטיים של אותו שיבוט RWASA2 בשלב 3 העלים, והעלים נקטפו 1 עד 14 ימים לאחר ההתפשטות. נוזל השטיפה הבין-תאי (IWF) הופק באמצעות סינון ואקום ואוחסן בטמפרטורה של -20°C. שאריות העלים נמעכו לאבקה ושימשו לרכיבי דופן התא. פעילות ה-POD ואפיונו נקבעו באמצעות מצע גואיאקול 5 mM ו-H2O2, תוך ניטור השינוי בספיגה ב-470 ננומטר. פעילות β-1,3-גלוקנאז, pH ותנאים אופטימליים של טמפרטורה הודגמו על ידי מדידת סך כל הסוכרים המפזרים בהידרוליזה עם מגיב DNS באמצעות מצעים β-1,3-גלוקן ו-β-1,3-1,4-גלוקן, מדידת הספיגה ב-540 ננומטר ושימוש בעקומת תקן גלוקוז. ה- pH האופטימלי נקבע בין pH 4 ל -9, טמפרטורה אופטימלית בין 25 ל -50 ° C, ויציבות תרמית בין 30 ° C ל 70 ° C. ספציפיות מצע β-1,3-גלוקנה נקבעה ב 25 ° C ו 40 ° C באמצעות מצעי curdlan ושעורה β-1,3-1,4-גלוקן. בנוסף, אופן הפעולה β-1,3-גלוקנאז נקבע באמצעות למינריביוז ללמינריפנטאוז. תבניות המוצר של הידרוליזה אוליגוסכרידית נותחו באופן איכותי עם כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) ונותחו כמותית עם HPLC. השיטה המוצגת במחקר זה מדגימה גישה איתנה להשרצת חיטה עם RWA, מיצוי פרוקסידז ו- β-1,3-גלוקנאז מאזור דופן התא ואפיונם הביוכימי המקיף.

מבוא

כנימות חיטה רוסיות (RWA) שורצות חיטה ושעורה, וגורמות לאובדן יבול משמעותי או לירידה באיכות התבואה. חיטה מגיבה להתפשטות על ידי גרימת מספר תגובות הגנה, כולל העלאת רמות הפעילות של β-1,3-גלוקן ופרוקסידז בזנים העמידים, בעוד שזנים רגישים מפחיתים את הפעילות של אנזימים אלה בתקופת התפשטות מוקדמת 1,2,3,4. תפקידי המפתח של β-1,3-גלוקנאז ו-POD בצמח החיטה כללו ויסות הצטברות קלוזה בזני הזנים העמידים והחמצן הריאקטיבי (ROS) המרווה בדופן התא ובאזורים אפופלסטיים במהלך התפשטות RWA 1,3,5,6,7. Mafa et al.6 הראו כי היה מתאם חזק בין פעילות POD מוגברת לבין תכולת ליגנין מוגברת בזן החיטה העמיד על נגיעות RWASA2. בנוסף, תכולת ליגנין מוגברת הצביעה על כך שדופן התא של זן החיטה העמיד שורץ חוזקה, מה שהוביל להזנת RWA מופחתת.

רוב קבוצות החוקרים חילצו וחקרו אפופלסטיק β-1,3-גלוקנאז ו-POD במהלך האינטראקציה חיטה/שעורה-RWA; בנוסף, רוב המחקרים הללו טענו כי אנזימים אלה משפיעים על דופן התא של צמח החיטה שורץ RWA מבלי למדוד את נוכחות האנזים באזור דופן התא. רק מחקרים מעטים השתמשו בטכניקות מיקרוסקופיות כדי להראות כי רמות הפעילות של β-1,3-גלוקנאז היו קשורות לוויסות קלוזה 7,8,9 או חילצו רכיבים עיקריים של דופן התא כדי להדגים את המתאם בין פעילויות POD ושינוי דופן התא ב- 6,10 העמיד. היעדר חיטוט הקשר β-1,3-גלוקנאז ו-POD לדופן התא מצביע על הצורך בפיתוח שיטות שיאפשרו לחוקרים למדוד ישירות את האנזימים הקשורים לדופן התא.

השיטה הנוכחית מציעה כי יש צורך בהסרת הנוזל האפופלסטי מרקמת העלה לפני מיצוי האנזימים הקשורים לדופן התא. הליך המיצוי של נוזל אפופלסטי חייב להתבצע פעמיים מרקמת העלה, המשמשת לחילוץ האנזימים הקשורים לדופן התא. תהליך זה מפחית את הזיהום והבלבול של האנזימים האפופלסטיים עם אלה הנמצאים באזורי דופן התא. לכן, במחקר זה, חילצנו POD הקשור לדופן התא, β-1,3-גלוקנאז ו-β-גלוקנאז ספציפיים ל-MLG וביצענו את האפיון הביוכימי שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

המחקר נערך באישור ובאישור ועדת האתיקה למחקר סביבתי ובטיחותי של אוניברסיטת המדינה החופשית (UFS-ESD2022/0131/22). פרטי הריאגנטים והציוד כאן מפורטים בטבלת החומרים.

1. תנאי גידול הצמח

  1. להנביט 250 זרעים של כל זן חיטה, כלומר, טוגלה רגיש, Tugela-Dn1 עמיד בינוני, ו Tugela-Dn5 עמיד, בצלחות פטרי נפרדות.
  2. מוסיפים 5 מ"ל מים מזוקקים בכל צלחת פטרי, אוטמים בסרט פרפין ודגרים בתא הנביטה שנקבע על 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
  3. השתילו את הזרעים המובטים של כל זן בעציצים בקוטר 15 ס"מ המכילים אדמה 1:1 ואזוב כבול (15 צמחים לעציץ) בתנאי חממה מבוקרים.
  4. הגדר את משטרי הטמפרטורה ב 18 °C (75 °F) ו 24 °C (75 °F) במהלך הלילה והיום, בהתאמה.
  5. השקו את הצמחים כל 3 ימים באמצעות מי ברז וספקו להם 2 גרם / ליטר דשן 14 יום לאחר הנביטה.
  6. הניחו את הצמחים בכלובים עטופים ברשתות ואפשרו להם לגדול עד לשלב העלה השלישי 2,6 (עם ארבעה העתקים ביולוגיים של כל זן).

2. זני חיטה מתפשטים עם RWASA2

  1. שורץ זני חיטה Tugela, Tugela-Dn1 ו- Tugela-Dn5 עם RWASA2 על פי Jimoh et al.11 ו- Mohase ו- Taiwe12.
  2. שמור את הצמחים בשתי קבוצות נפרדות בכלובים; שורצים סט אחד עם 20 פרטים פרתנוגנטיים מאותו שיבוט RWASA2 לכל צמח בכל עציץ בתאי הגידול המכוסים ברשתות. שמור קבוצה נוספת של צמחי חיטה בחדר נפרד מתחת לתא הגידול עם רשתות נקיות והתייחס אליהם כאל בקרה.
    הערה: שמרו את שני הטיפולים בחדרים נפרדים וכסו את הצמחים בכלובים עטופים ברשתות. כמו כן, במקרה שבו שני ביוטיפים שונים של RWA משמשים במחקר, שמור את הצמחים שורצים ביוטיפ RWA אחד מאלה שורצים את הביוטיפ השני ככל האפשר או בחדרים נפרדים תחת תאי צמיחה מכוסים ברשתות כדי למנוע כל זיהום צולב אפשרי של RWASA2.
  3. לקטיף, בחרו את העלים השני והשלישי בשני משטרי זמן שונים, תקופת האכלה קצרת טווח (1, 2 ו-3 ימים) ותקופת האכלה ארוכת טווח (7 ו-14 ימים), ועטפו אותם במגבות נייר לחות.
  4. העבירו מיד את העלים שנקטפו לקופסה המכילה קרח כדי להפחית את חילוף החומרים של העלים לפני מיצוי נוזל השטיפה הבין-תאי (IWF).

3. מיצוי נוזל שטיפה בין-תאי (IWF) מהאפופלסט

  1. חותכים את העלים שנקטפו של כשלושה זני חיטה לחתיכות של 7 ס"מ.
  2. שטפו את חתיכות העלים פעמיים במים מזוקקים כדי להסיר כל זיהום ציטוסולי מהקצוות החתוכים 6,13.
  3. הכנס את חתיכות העלה לתוך צינור זכוכית עבה דופן ושקע את הדגימות בחיץ מיצוי (50 mM Tris-HCl, pH 7.8).
  4. יש למרוח חדירת ואקום למשך 5 דקות באמצעות משאבת סילון מים כדי לספוג עלים עם מאגר החילוץ.
  5. לאחר מכן, הוציאו את חתיכות העלים מצינור הזכוכית וייבשו אותן במגבת נייר.
  6. הכנס את חתיכות העלה המיובשות אנכית לצינורות צנטריפוגות מקוררים מראש המצוידים בדיסקים מחוררים ובצנטריפוגה במהירות של 500 x גרם למשך 10 דקות ב- 4 ° C.
  7. השתמש פיפטה 100 μL כדי לאסוף את supernatant לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל מקורר מראש.
  8. חזור על כל הליך המיצוי עם אותו חומר עלה.
  9. ערבבו את הסופרנאטנט שנאסף ואחסנו אותו בטמפרטורה של 20°C-.
    הערה: האליציטוטים הסופרנטנטיים מטופלים כמקור לתוכן אפופלסט או IWF. IWF לא היה בשימוש במחקר הנוכחי, אבל היה חשוב להסיר אותו מרקמות העלה לפני שחילצנו את דופן התא β-1,3-גלוקנאז ופרוקסידז (POD).

4. מיצוי דופן התא הקשור β-1,3-גלוקנאז ו-POD

הערה: שאריות העלים שנותרו לאחר מיצוי IWF שימשו לחילוץ חלבון דופן התא הכולל.

  1. מרסקים את שאריות העלה לאבקה דקה עם חנקן נוזלי בעזרת מכתש ומזיק.
  2. מעבירים כ-200 מ"ג מרקמת העלה האבקה למכתש המכיל 4 מ"ל של חיץ מיצוי (50 מ"מ נתרן פוספט עם 1% (w/v) פוליוויניל פוליפירולידון (PVPP); pH 5.0) ולאחר מכן טחינה עם מזיק לעיסה חלקה, המועברת לאחר מכן לצינורות מיקרוצנטריפוגה.
  3. לדגור על התערובת בצינורות מיקרוצנטריפוגות במשך 3 דקות על קרח ולאחר מכן צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
  4. אספו את הסופרנאטנט (סך תמציות החלבון) בצינורות מיקרוצנטריפוגות (אליציטוטים של 2 מ"ל) והשתמשו בו כמקור של β-1,3-גלוקנה ו-POD לכל המחקר.

5. קביעת תקן החלבון

  1. לקבוע את ריכוז החלבון הכולל של התמציות בעקבות שיטת ברדפורד14.
  2. הכינו את תמיסות אלבומין סרום הבקר (BSA) בריכוזים של 0.0 מ"ג/מ"ל, 0.1 מ"ג/מ"ל, 0.2 מ"ג/מ"ל, 0.3 מ"ג/מ"ל, 0.4 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל, 0.6 מ"ג/מ"ל, 0.7 מ"ג/מ"ל, 0.8 מ"ג/מ"ל, 0.9 מ"ג/מ"ל ו-1.0 מ"ג/מ"ל מומסים במאגר נתרן פוספט של 50 מילימטר כדי ליצור את תקן החלבון.
  3. הכן את התקן על ידי הוספת 10 μL של כל תמיסת BSA לתוך microplate 96-well עם 190 μL (0.25% v/v) של מגיב ברדפורד (ראה טבלה של חומרים).
  4. יש לדגור ב-25°C למשך 20 דקות ולמדוד את הספיגה ב-595 ננומטר באמצעות קורא המיקרו-צלחות ולהשתמש בערכי הספיגה כדי להכין את העקומה הסטנדרטית לכימות ריכוז החלבון.
  5. כימות ריכוז החלבונים
    1. הוסף 10 μL של האנזים המופק (שלב 4) לתוך microplate 96 באר עם 190 μL (0.25% v/v) של מגיב ברדפורד בטריפליקטים.
    2. יש לדגור בטמפרטורת החדר (25°C) למשך 20 דקות.
    3. מדוד את הספיגה ב- 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר עם קורא מיקרו-צלחות והשתמש בערכי הספיגה כדי לקבוע את ריכוז החלבון באמצעות BSA כתקן החלבון (שהוכן בשלב 5.4).

6. הכינו את תקן הגלוקוז לפעילות β-1,3-גלוקנאז

  1. הכינו את התמיסות הסטנדרטיות בריכוזים שבין 0.00 מ"ג/מ"ל ל-1.0 מ"ג/מ"ל (0.0 מ"ג/מ"ל, 0.1 מ"ג/מ"ל, 0.2 מ"ג/מ"ל, 0.3 מ"ג/מ"ל, 0.4 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל, 0.6 מ"ג/מ"ל, 0.7 מ"ג/מ"ל, 0.8 מ"ג/מ"ל, 0.9 מ"ג/מ"ל, 1.0 מ"ג/מ"ל) עם גלוקוז מומס במים מזוקקים.
  2. הוסף 300 μL של כל תמיסת גלוקוז ו- 600 μL של מגיב חומצה 3,5-Dinitrosalicylic (DNS) ביחס של 1:2 לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל ודגור על התגובות ב -100 ° C במשך 5 דקות (ראה טבלת חומרים עבור ריאגנטים DNS) (Miller et al.15).
  3. הניחו לתערובת להתקרר בטמפרטורת החדר לפני מדידת הספיגה ב-540 ננומטר באמצעות הספקטרופוטומטר.
  4. השתמש בערכי הספיגה הממוצעים כדי לפתח את העקומה הסטנדרטית לקביעת פעילות האנזים β-1,3-גלוקנאז.

7. קביעת בדיקת פעילות β-1,3-גלוקנה

הערה: פעילות האנזים של β-1,3-גלוקנאז הקשור לדופן התא המופק מטוגלה, Tugela-Dn1 ו-Tugela-Dn5 נקבעה על ידי כמות הסוכרים המפזרים הכוללת ששוחררו מהידרוליזה של 0.5% (w/v) β-1,3-1,4-glucan (MLG) ו-0.4% (w/v) β-1,3-glucan substrates בשיטה שונה כמתואר על-ידי Miller et al.15. תמיד לשמור את צינורות עם aliquots חלבון על הקרח. אם הדגימות הוקפאו, הפשירו אותן על קרח והמשיכו מיד לאחר ההפשרה.

  1. הוסף 200 μL של תמצית האנזים (לשמור על ריכוז החלבון בין 20 מיקרוגרם / מ"ל ל 90 מיקרוגרם / מ"ל בכל התגובות, אלא אם כן צוין אחרת) ו 300 μL של המצע מומס ב 50 mM נתרן ציטראט חיץ (pH 5.0) לתוך צינורות 1.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה.
    הערה: הפעל תגובה ריקה מקבילית ללא תמצית האנזים עבור כל הסובסטרטים (ריק ראשון), והאנזים ריק מורכב מתמצית אנזים ללא סובסטרט (ריק שני). הן המצע והן תמצית האנזים הוחלפו בחיץ בשחור הראשון והשני, בהתאמה.
  2. לדגור את התגובות ב 37 ° C במשך 24 שעות ולסיים את התגובה על ידי חימום ב 100 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  3. ערבבו 300 μL של supernatant עם מגיב DNS 600 μL (יחס של 1:2) לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים של 1.5 מ"ל והרתיחו ב-100°C למשך 5 דקות.
  4. אפשרו לתמיסה להתקרר לטמפרטורת החדר ומדדו את הספיגה ב-540 ננומטר באמצעות הספקטרופוטומטר.
    הערה: אם ריכוז הסוכרים המחזרים הכולל גבוה בתערובת, התוצאה תהיה תמיסה חומה כהה, שקשה לקרוא באמצעות הספקטרופוטומטר. לכן, דילול נוסף של הדגימות יש צורך לפני קריאת הספיגה.
  5. השתמש בעקומת תקן הגלוקוז שפותחה בשלב 6.4 לעיל כדי לקבוע את פעילות האנזים ביחידות SI של העקומה הסטנדרטית.
  6. כדי להמיר את הפעילות לפעילות ספציפית המתבטאת בחלבון μmol glucose/h/mg, השתמש במשוואה הבאה:
    פעילות ספציפית = [(פעילות אנזים/180.16)*1000]/זמן/ריכוז חלבון
    הערה: המרת פעילות האנזים במ"ג/מ"ל ל-g/mL; 180.16 גרם/מול הוא המשקל המולקולרי של גלוקוז, 1000 הוא גורם הממיר M למיקרומולות, הזמן הוא תקופת התגובה, וריכוז תמצית החלבון מיוצג במ"ג/מ"ל. יחידה אחת של פעילות β-1,3-גלוקנאז מוגדרת כ-1 μmol של גלוקוז המשתחרר מהמצע בתוך תקופת תגובה של שעה אחת.

8. קביעת פעילות פרוקסידז (POD)

הערה: פעילות הפרוקסידז הקשורה לדופן התא של זני חיטה Tugela, Tugela-Dn1 ו- Tugela-Dn5 נקבעה על ידי כימות היווצרות הטטרה-גואיאקול המיוצרת ליחידת זמן מגואיאקול16.

  1. הוסף 30 μL של תמצית האנזים, 30 μL 1% (v/v) H2O2, ו 970 μL של 5 mM guaiacol לתוך cuvettes ב 25 ° C.
    הערה: בצע את התגובה הריקה ללא תמצית האנזים (ריק ראשון), ועוד ריק עבור דגימות אנזים ללא סובסטרט (ריק שני). דגימות האנזים או הסובסטרט הוחלפו במאגר נתרן פוספט של 50 מילימטר בחסר הראשון והשני, בהתאמה.
  2. השתמש במצב הקינטי של הספקטרופוטומטר כדי לעקוב אחר השינוי בספיגה ב 470 ננומטר.
  3. קבעו את השיפוע שבו הגרף היה ליניארי והשתמשו בו כערך בליעה.
  4. חשב את הספיגה הממוצעת והשתמש בה בחישוב פעילות POD.
  5. חישוב פעילות peroxidase באמצעות מקדם ההכחדה המולרי של guaiacol (26.6 mM-1 cm-1) ולבטא את הפעילות בחלבון μmol tetra-guaiacol/min/mg.
  6. חישוב פעילות POD באמצעות המשוואה המשמשת את Mafa et al.6:
    פעילות תרמיל = [(ΔABS × DF) ÷ ריכוז חלבון] × 26.6 mM-1 cm-1 × 1 cm
    הערה: כאשר ΔABS = ספיגה ממוצעת; DF = גורם דילול; 26.6 mM-1 cm-1 = מקדם הכחדה של Guaiacol.

9. אפיון POD

הערה: בדיקות אפיון POD בוצעו באמצעות תמציות אנזימים של Tugela, Tugela-Dn1 ו-Tugela-Dn5 במשך 3 ימים לאחר ההתפשטות (dpi), בשיטות דומות המתוארות בשלב 8, עם שינויים קלים במאגרים ובטמפרטורות התגובה. דגימות האנזים נשמרו תמיד על קרח בזמן ביצוע הניסויים. הפעל את התגובות ב- quadruplicates עם תגובה ריקה מקבילה.

  1. לבדיקות pH אופטימליות, בצע את השלבים הבאים.
    1. ממיסים מצע גואיאקול במאגרי 50 mM (נתרן ציטראט, pH 4 ו-5), נתרן פוספט (pH 6 ו-7) ו-Tris-HCl (pH 8 ו-9) (ראו טבלת חומרים).
    2. הפעל את התגובות ב- 25 °C כמתואר בשלב 8.
  2. לבדיקות טמפרטורה מיטבית, בצע את השלבים הבאים.
    1. הפעל את התגובות ב 25 °C, 30 °C, 40 °C ו- 50 °C, בהתאמה.
    2. השתמש במצע guaiacol מומס במאגר pH 5 (pH אופטימלי) והפעל את התגובות כמתואר בשלב 8.
  3. עבור בדיקות יציבות תרמית, בצע את השלבים הבאים.
    1. לפני תחילת התגובות, לדגור על האנזים ב 37 ° C, 50 °C, ו 70 ° C במשך 30 דקות.
    2. הפעל את התגובות בהתאם לשיטות המתוארות בשלב 8 באמצעות מאגר נתרן ציטראט של 50 מילימטר (pH 5) וב- 40 ° C (טמפרטורה אופטימלית).

10. אפיון β-1,3-גלוקנאז

הערה: בצע את מבחני האפיון בהתאם לשיטה המתוארת בשלב 7 באמצעות 3 תמציות אנזים dpi, עם שינויים מסוימים במאגרים ובטמפרטורות התגובה. הפעל את התגובות בריבוע, עם תגובה ריקה מקבילה לכל מצע.

  1. עבור בדיקות pH אופטימליות, המשך באופן הבא:
    1. ממיסים MLG ומצעים β-1,3-גלוקן במאגרי 50 מילימטר (נתרן ציטראט, pH 4 ו-5), נתרן פוספט (pH 6 ו-7) ו-Tris-HCl (pH 8 ו-9).
    2. הפעל את התגובה כמתואר בשלב 7.
  2. עבור בדיקות טמפרטורה אופטימלית, המשך באופן הבא:
    1. הפעל את התגובות ב 25 °C, 30 °C, 40 °C ו- 50 °C, בהתאמה.
    2. השתמש במצעי MLG ו-β-1,3-גלוקן המומסים במאגר נתרן ציטראט של 50 מילימטר (pH 5) עם pH אופטימלי (המתקבל בשלב 10.1) והפעל את התגובות כמתואר בשלב 7.
  3. עבור בדיקות יציבות תרמית, בצע את הפעולות הבאות:
    1. לפני תחילת התגובות, לדגור על האנזים ב 37 ° C, 50 °C, ו 70 ° C במשך 30 דקות.
    2. הפעל את התגובות באמצעות מצעים מומסים במאגר נתרן ציטראט 50 מילימטר (pH 5) ודגר ב 25 ° C ו 40 ° C במשך 24 שעות.

11. הערכת מנגנון פעולה β-1,3-גלוקנאז על מצעים גלוקניים שונים

הערה: מצעי גלוקן מכילים את אותן שאריות גלוקוז בעמוד השדרה שלהם, אך הקשרים הגליקוזידים בין יחידות הגלוקופירנוז מגוונים ויכולים לקחת את כיוון α או β17. הקשרים הגליקוזידים יכולים להיווצר בין מספר אטומי פחמן של מולקולות גלוקוז, המגדירים את המבנה הכימי שלהם, למשל, β-1,3-גלוקן, β-1,4-גלוקן, ומעורב מקושר-β-1,3-1,4-גלוקן (MLG)18,19,20. מנגנון הפעולה β-1,3-גלוקנאז נקבע באמצעות דגימות RWASA2-infestated Tugela, Tugela-Dn1 ו-Tugela-Dn 5 (ממקורות אנזימים) והסובסטרטים הבאים β-1,3-גלוקן (CM-curdlan), MLG (משעורה) ו-β-1,4-גלוקן (AZO-CM-Cellulose). מנגנון הפעולה נקבע בתנאי בדיקה אופטימליים (25°C ו-40°C, pH 5.0), תוך שימוש ב-0.1% (w/v) β-1,4-גלוקן, 0.4% (w/v) β-1,3-גלוקן, או 0.5% (w/v) מצעי MLG.

  1. ממיסים את המצע במאגר נתרן ציטראט 50 מ"מ (pH 5).
  2. הוסף 200 μL של תמצית האנזים ו 300 μL של המצע לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל.
  3. לדגור את התגובות בשתי טמפרטורות נפרדות, 25 ° C ו 40 ° C במשך 8 שעות.
  4. סיום התגובות על ידי חימום ב 100 מעלות צלזיוס.
  5. צנטריפוגה את תערובת התגובה של β-1,3-גלוקן ו-MLG ב-10,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4°C והמשך כמתואר בשלב 7.3.
  6. עבור β-1,4-גלוקן, לאחר סיום התגובה ב 100 ° C, לדלל את התערובת עם 800 μL של אתנול מוחלט וצנטריפוגה ב 4 ° C במשך 10 דקות ב 10,000 x גרם.
  7. מעבירים את הסופרנאטנט לעקומות, מודדים את הספיגה ב-590 ננומטר בעזרת הספקטרופוטומטר, מחשבים את פעילות ה-β-1,3-גלוקנה על β-1,4-גלוקן באמצעות נוהל היצרן (ראו טבלת חומרים) ומבטאים את הפעילות בחלבון יחידות/מ"ג.

12. קביעת אופן פעולה β-1,3-גלוקנאז

הערה: טוגלה שורץ RWASA2, Tugela-Dn1 ו- Tugela-Dn5 המושרה β-1,3-גלוקנאז אופן הפעולה נבדק עם למינרין-אוליגוסכרידים (LAMs) עם מידת פילמור (DP) בין 5 ל -2. השתמש בכרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC), ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) וערכת גלוקוז אוקסידאז פרוקסידאז (GOPOD) כדי לקבוע את ה-DP הדרוש ל-β-1,3-גלוקנה כדי לבצע הידרוליזה של המצע. ה- TLC שימש לניתוח איכותני, וה- LC-MS שימש לניתוח כמותי, שקבע את ריכוז האוליגוסכרידים בהידרוליזה לאחר התגובה21.

  1. הכן את התגובות של מצב פעולה β-1,3-גלוקנאז
    הערה: הכינו את תמצית החלבון המרוכזת עם מסנן קרום ריכוז צנטריפוגות של 10 kDa וכך הכינו תמציות חלבון מרוכזות ולא מרוכזות שורצות RWASA2 לצורך הניסוי.
    1. לריכוז האנזימים המופקים מכל זן יש להעביר 5 מ"ל מהתמציות למסנני ממברנות ריכוז צנטריפוגות 10 kDa .
    2. צנטריפוגה את צינורות מסנן הממברנה המכילים תמצית ב 15,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
    3. ממיסים למינריפנטאוז (LAM5), למינריטרוז (LAM4), למינריטריוז (LAM3) ולמינריביוז (LAM2) (ראו טבלת חומרים) בנתרן ציטראט של 50 מילימטר (pH 5) לייצור 10 מ"ג/מ"ל.
    4. כדי להתחיל את התגובה, הוסף 20 μL של תמצית חלבון ו 40 μL של Laminaripentaose (LAM5), Laminaritetraose (LAM4), Laminaritriose (LAM3), ו Laminaribiose (LAM2).
    5. לדגור את התגובה ב 40 ° C במשך 16 שעות ולסיים על ידי רותחים ב 100 ° C במשך 5 דקות.
  2. ביצוע כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC)
    1. חותכים 4 לוחות סיליקה ל 10 ס"מ2 חתיכות ומציירים קו אחד על פני השטח של הצלחת, משאיר רווח של 1 ס"מ מתחתית קצה אחד.
    2. מסמנים את הנקודות מעבר לקו ומסמנים אותן לפי זנים שונים ו-DP של הלמינרין-אוליגוסכרידים, במרחק של 1 ס"מ זה מזה. יש ליטול 2 פלטות סיליקה לתמצית חלבון מרוכזת ואת 2 האחרות לתמציות לא מרוכזות.
    3. הוסיפו 3 מיקרוליטר מתערובות התגובה 3 עד 5 פעמים על הכתמים המסומנים המתאימים על צלחת הסיליקה ואפשרו לכתמים על הצלחת להתייבש לחלוטין לפני שתחזרו על התהליך.
    4. הניחו בעדינות את לוחות הסיליקה במיכל TLC המכיל את הפאזה הניידת של n-בוטאנול: חומצה אצטית: מים (2:1:1 v/v/v) כאשר הצד מכיל את כתמי הדגימות בתחתית.
    5. אפשרו לשלב הנייד לעבור מלמטה לחלק העליון של הצלחת.
      הערה: שלב זה עשוי להימשך כשעתיים. אין להזיז או להפריע למיכל בזמן הפרדת הדגימות.
    6. מוציאים את הצלחות מהפאזה הניידת ומניחים להן להתייבש בטמפרטורת החדר.
    7. מוסיפים את תמיסת הצביעה למיכל הקטן, טובלים בעדינות את צלחת הסיליקה בתמיסת צביעה של 0.3% (w/v) נפתול באתנול 95% (v/v) באמצעות 5% (v/v) חומצה גופרתית למשך 5 שניות, מסירים אותה ואז מניחים לה להתייבש בטמפרטורת החדר.
      הערה: בשלב זה, הפעל את בלוק החימום/תנור והגדר את הטמפרטורה ל-100°C.
    8. מניחים את לוחות הסיליקה המיובשים על בלוק החימום ומחממים ב 100 ° C למשך 7-10 דקות או עד כתמים כחולים-סגולים מופיעים. צלמו את לוחות הסיליקה המציגים את הכתמים הכחולים-סגולים ותיעדו אותם.
  3. לכמת את הריכוז של hydrolysates laminarin-oligosaccharides
    הערה: ריכוז ההידרוליזה של LAM יכומת עבור תמציות חלבון מרוכזות ולא מרוכזות21.
    1. הוסף 20 μL מכל דגימה על עמודת C18 (פחמימות 4.6 × 250 מ"מ) ואפשר להפריד בקצב זרימה של 500 μL/min באמצעות שיפוע מים (ממס A) ואצטוניטריל (ממס B) מ-100% B ל-60% B במשך 10 דקות ולאחר מכן שלבי שיווי משקל מחדש של עמודות עם זמן פעולה כולל של 20 דקות כדי לאפשר איזון מחדש של עמודות.
    2. ייננו את האנליטים הפולטים במצב אלקטרוספריי שלילי במקור היונים ספקטרומטריית המסות עם טמפרטורת מחמם של 400°C כדי לאדות את הממס העודף, גז נבולייזר 30 psi, גז מחמם 30 psi וגז מסך 20 psi.
    3. הגדר את פוטנציאל ביטול האשכולות על 350 וולט.
    4. נתח את האנליטות הפולטות על ספקטרומטר המסות במצב סריקה Q1 הנע בין 150 Da ל- 1000 Da עם זמן שהייה של 3 שניות.
    5. רשום את ריכוזי האנליטים בגיליון האלקטרוני.
  4. לכמת את ריכוז הגלוקוז
    1. נתח את ריכוז הגלוקוז המיוצר על ידי הידרוליזה למינרין באמצעות מגיב GOPOD בהתאם להוראות היצרן22,23.
    2. מדוד את הספיגה ב- 510 ננומטר במצב קבוע של הספקטרופוטומטר.

13. איסוף נתונים וניתוחם

  1. אקראי כל הניסויים כדי למנוע הטיה במהלך התפשטות או איסוף דגימה ולבצע את הניתוח quadruplicates.
  2. אלא אם צוין אחרת, השתמש באמצעים ± סטיית תקן כדי לייצג את הערכים בגרפים ובטבלאות שנוצרו מנתוני הניסוי שנאספו.
  3. השתמש ב- Microsoft Excel כדי לנתח את כל הנתונים וליצור גרפים.
  4. בצע ניתוח סטטיסטי עם תוכנה תואמת.
    הערה: בצע ניתוח רב-גורמי של שונות (ANOVA) כדי לבדוק מובהקות בין טיפולים לבין LSD של פישר כדי לבדוק קבוצות הומוגניות בערך אלפא של 0.05.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ארבעה העתקים ביולוגיים של זני חיטה (Tugela, Tugela-Dn1 ו-Tugela-Dn5) היו שורצים RWASA2 בשלב הגידול של 3 עלים. לאחר ההתפשטות, העלים נקטפו ב 1-, 2-, 3-, 7-, ו 14 dpi. טיפולי הבקרה לא היו שורצים RWASA2 כדי להפוך את תוצאות הניסוי לדומות לצמחי חיטה שלא נחשפו לעקה. הניסויים נערכו ברביעיות, והתוצאות הוצגו כערכים ממוצעים.

ריכוזי החלבון הן של תמציות שורצות RWASA2 והן של תמציות ביקורת כומתו באמצעות BSA כתקן חלבון. זה היה שימושי בעת קביעת פעילות האנזים עבור β-1,3-גלוקנה ו- POD וכדי להבט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

חיטה ושעורה הם גידולי דגנים שורצים לעתים קרובות על ידי מיני כנימות, כולל כנימות חיטה רוסיות (Diuraphis noxia)7,24. צמחי חיטה עמידים גורמים להגברת הרגולציה של פעילויות POD ו- β-1,3-גלוקנאז כתגובות הגנה לאורך כל תקופת ההתפשטות לשינוי דופן התא על ידי ויסות הצטברות קלוזה וליגנין 6,25,26,27. חשוב לציין כי רוב המחקרים חילצו את האנזימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין כל ניגוד עניינים הכרוך בעבודה זו.

תודות

M. Mafa קיבל מימון מה-NRF-Thuthuka (מספר סימוכין: TTK2204102938). S.N. Zondo קיבל את מלגת הקרן הלאומית למחקר לתואר שני לתואר שני שלו. המחברים אסירי תודה למועצה למחקר חקלאי - מכון דגנים קטנים (ARC-SG) על אספקת הזרעים ששימשו במחקר זה. כל דעה, ממצאים והמלצות המובעות בחומר זה הן של המחבר/ים, ולפיכך המממנים אינם מקבלים על עצמם כל אחריות בקשר לכך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מכשיר ממברנה מרוכז צנטריפוגה 10 kDaSigma-AldrichR1NB84206לשימוש מחקרי בלבד. לא לשימוש בהליכי אבחון. לריכוז וטיהור תמיסות ביולוגיות.
2 גרם LaminaribioseMegazyme (וויקלו, אירלנד)O-LAM2למינריביוז בטוהר גבוה לשימוש במחקר, בדיקות אנזימים ביוכימיים וניתוח אבחון במבחנה.
3 גרם LaminaritrioseMegazyme (וויקלו, אירלנד)O-LAM3למינאריטריוז בטוהר גבוה לשימוש במחקר, בדיקות אנזימים ביוכימיים וניתוח אבחון במבחנה.
3,5 חומצה סליצילית דיניטרוסיגמא-אולדריץ'D0550משמש לקביעה קולורימטרית של הפחתת סוכרים
4 גרם Laminaritetraose Megazyme (וויקלו, אירלנד)O-LAM4laminaritetraose בטוהר גבוה לשימוש במחקר, בדיקות אנזימים ביוכימיים וניתוח אבחון במבחנה.
5 גרם LaminaripentaoseMegazyme (וויקלו, אירלנד)O-LAM5laminaripentaose בטוהר גבוה לשימוש במחקר, בדיקות אנזימים ביוכימיים וניתוח אבחון במבחנה.
95% אתנול מוחלטסיגמא-אולדריץ'107017אתנול מוחלט לניתוח
חומצה אצטיתSigma-AldrichB00063Acetc חומצה קרחונית 100% לניתוח (מכיל חומצה אצטית)
Azo-CM-CelluloseMegazyme (וויקלו, אירלנד)S-ACMCהפוליסכריד נצבע ב-Remazolbrilliant Blue R במידה של כ. מולקולת צבע אחת לכל 20 שאריות סוכר.
בטא גלוקן (שעורה) Megazyme (וויקלו, אירלנד)G6513מצע אבקתי, פחות מסיס במים. משמש לקביעת פעילות &בטא;-1,3-גלוקנאז.
Bio-Rad Protein AssayDye Bio-Rad Laboratories, דרום אפריקה500-0006צבע לבדיקה קולורימטרית, תרכיז, לשימוש עם ערכות בדיקת חלבון Bio-Rad I ו-II 
אלבומין בסרום בקר (BSA)Gibco Europe810-1018לשימוש במעבדה בלבד
חומצה ציטראטSigma-AldrichC0759למחקר במדעי החיים בלבד. לא לשימוש בהליכי אבחון.
CM-curdlan Megazyme (וויקלו, אירלנד)P-CMCURמצע אבקה לקביעת פעילות β-1,3-glucanase. לא מסיס במים.
D-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270למחקר במדעי החיים בלבד. לא לשימוש בהליכי אבחון.
מחוון חמצון GuaiacolSigma-AldrichG5502. משמש לקביעת פעילות פרוקסידאז.
מי חמצןBDH Laboratory Supplies, אנגליה10366חומר חמצון רב עוצמה.
Mikskaar Professional SubstarteMikskaar (אסטוניה)NIמצע שתילים מבוסס טחב כבול.
דשן Multifeed (5.2.4 (43))Multifeed ClassicB1908248דשן מסיס במים לצמחים ושתילים מתפתחים צעירים עם דרישת זרחן גבוהה (P) כדי להבטיח התפתחות שורשים אופטימלית.
נפתולמרק, גרמניהN2780עובר הידרוגנציה בנוכחות זרז.
פנולסיגמא-אולדריץ'33517רגיש לאור. למחקר ומחקר D לשימוש בלבד. לא לשימושים תרופתיים, ביתיים או אחרים. SDS זמין
אשלגן נתרן טרטרט טטרהידרט (מלח רושל)Sigma-AldrichS2377המשמש להכנת תמיסת חומצה 3,5-דיניטרוסליצילית המשמשת לקביעת הסוכר המפחית.
צלחת סיליקה (TLC סיליקה ג'ל 60 F254)Sigma-Aldrich60778-25EAמטריצת ג'ל סיליקה, עם מחוון פלורסנט 254 ננומטר
נתרן הידרוקסידSigma-AldrichS8045למחקר & D לשימוש בלבד. לא לשימושים תרופתיים, ביתיים או אחרים.
נתרן מטאביסולפיטסיגמא-אולדריץ'31448נוסף כנוגד חמצון במהלך הכנת תמיסות חומצה 3,5-דיניטרוסליצילית.
נתרן פוספט דו-בסיסי הפטהידראטSigma-AldrichS9390משמש כתמיסת חיץ במחקר ביולוגי לשמירה על pH קבוע.
נתרן פוספט מונו-בסיסי heptahydrateSigma-Aldrich71500תרכובת אנאורגנית, המסיסה במים. משמש כמגיב בפיתוח דיסים על בסיס סיליקט.
תוכנת ניתוח סטטיסטיTIBCO Statisticaגרסה 13.1
חומצה גופרתיתMerck, דרמשטדט, גרמניה30743חומצה גופרתית 95-97% לניתוח מגיב כספית, ACS.
Tris-HClSigma-Aldrich10812846001חומר חציצה בתערובות דגירה.  הוא שימש גם כמרכיב של מאגר ליזה ו-TE (Tris-EDTA). למחקר במדעי החיים בלבד. לא לשימוש בהליכי אבחון.
UV– ספקטרופוטומטר גלויGENESYS 120 
  NI = לא מזוהה.

מקורות

  1. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Salicylic acid is involved in resistance responses in the Russian wheat aphid-wheat interaction. J Plant Physiol. 159 (6), 585-590 (2002).
  2. Mohase, L., Vander Westhuizen, A. J. Glycoproteins from Russian wheat aphid-infested wheat induce defense responses. Z Naturforsch C J Biosci. 57 (9-10), 867-873 (2002).
  3. Moloi, M. J., Vander Westhuizen, A. J. The reactive oxygen species are involved in resistance responses of wheat to the Russian wheat aphid. J Plant Physiol. 163 (11), 1118-1125 (2005).
  4. Manghwar, H., et al. Expression analysis of defense-related genes in wheat and maize against Bipolaris sorokiniana. Physiol Mol Plant Pathol. 103, 36-46 (2018).
  5. Botha, C. E., Matsiliza, B. Reduction in transport in wheat (Triticum aestivum) is caused by sustained phloem feeding by the Russian wheat aphid (Diuraphis noxia). S Afr J Bot. 70 (2), 249-254 (2004).
  6. Mafa, M. S., Rufetu, E., Alexander, O., Kemp, G., Mohase, L. Cell-wall structural carbohydrates reinforcements are part of the defense mechanisms of wheat against Russian wheat aphid (Diuraphis noxia) infestation. Plant Physiol Biochem. 179, 168-178 (2022).
  7. Walker, G. P. Sieve element occlusion: Interaction with phloem sap-feeding insects - A review. J Plant Physiol. 269, 153582(2022).
  8. Botha, A. M. Fast developing Russian wheat aphid biotypes remains an unsolved enigma. Curr Opin Insect Sci. 45, 1-11 (2020).
  9. Saheed, S. A., et al. Stronger induction of callose deposition in barley by Russian wheat aphid than bird cherry-oat aphid is not associated with differences in callose synthase or β-1,3-glucanase transcript abundance. Physiol Plant. 135 (2), 150-161 (2009).
  10. Zondo, S. N. N., Mohase, L., Tolmay, V., Mafa, M. S. Functional characterization of cell wall-associated β-1,3-glucanase and peroxidase induced during wheat-Diuraphis noxia interactions. Research Square. , (2024).
  11. Jimoh, M. A., Saheed, S. A., Botha, C. E. J. Structural damage in the vascular tissues of resistant and non-resistant barley (Hordeum Vulgare L.) by two South African biotypes of the Russian wheat aphid. NISEB J. 14 (1), 1-5 (2018).
  12. Mohase, L., Taiwe, B. Saliva fractions from South African Russian wheat aphid biotypes induce differential defense responses in wheat. S Afri J Plant Soil. 32 (4), 235-240 (2015).
  13. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Botha, A. M. β-1,3-glucanases in wheat and resistance to the Russian wheat aphid. Physiol Plant. 103 (1), 125-131 (1998).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  15. Miller, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).
  16. Zieslin, N., Ben-Zaken, R. Peroxidases, phenylalanine ammonia-lyase and lignification in peduncles of rose flowers. Plant Physiol Biochem (Paris). 29 (2), 147-151 (1991).
  17. Damager, I., et al. First principles insight into the α-glucan structures of starch: Their synthesis, conformation, and hydration. Chemical Rev. 110 (4), 2049-2080 (2010).
  18. Nakashima, J., Laosinchai, W., Cui, X., Brown Jr, M. New insight into the mechanism and biosynthesis: proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding. Cellulose. 10, 269-289 (2003).
  19. Cierlik, I. Regulation of callose and β-1,3-glucanases during aphid infestation on barley cv. Clipper. Master thesis in Molecular Cell Biology. , Sodertorn University College. Stockholm. (2008).
  20. Rahar, S., Swami, G., Nagpal, N., Nagpal, M. A., Singh, G. S. Preparation, characterization, and biological properties of β-glucans. J Adv Pharm Technol Res. 2 (2), 94(2011).
  21. Mafa, M. S., et al. Accumulation of complex oligosaccharides and CAZymes activity under acid conditions constitute the Thatcher + Lr9 defense responses to Puccinia triticina. Biologia. 78, 1929-1941 (2023).
  22. Megazyme. GOPOD reagent enzymes: Assay procedure. Megazyme. , 1-4 (2019).
  23. Hlahla, J. M., et al. The photosynthetic efficiency and carbohydrates responses of six edamame (Glycine max. L. Merrill) cultivars under draught stress. Plants. 11 (3), 394(2022).
  24. Botha, A. M., Li, Y., Lapitan, N. L. Cereal host interactions with Russian wheat aphid: A review. J Plant Interact. 1 (4), 211-222 (2005).
  25. Forslund, K., Pettersson, J., Bryngelsson, T., Jonsson, L. Aphid infestation induces PR-proteins differently in barley susceptible or resistant to the birdcherry-oat aphid (Rhopalosiphum padi). Physiol Plant. 110 (4), 496-502 (2000).
  26. Miedes, E., Vanholme, R., Boerjan, W., Molina, A. The role of the secondary cell wall in plant resistance to pathogens. Front Plant Sci. 5, 358(2014).
  27. Rajninec, M., et al. Basic β-1,3-glucanse from Drosera binate exhibits antifungal potential in transgenic tobacco plants. Plants. 10 (8), 1747(2021).
  28. Vander Westhuizen, A. J., Qian, X. M., Wilding, M., Botha, A. M. Purification and immunocytochemical localization of wheat β-1,3-glucanase induced by Russian wheat aphid infestation. S Afri J Sci. 98, 197-202 (2002).
  29. Cosgrove, D. J. Loosening of plant cell walls by expansins. Nature. 407 (6802), 321-326 (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בטא-1פעילות פראוקסידאזכינימה של החיטה הרוסיתחלבונים הקשורים לנתיב הפתוגנזהאפיון אנזימטיכרומטוגרפיה בשכבה דקהסגוליות של סובסטרט גלוקנאזאינטראקציה בין מזיקי צמחים לצמחים
הבהרת #946;-1,3-גלוקנאז ופרוקסידז תכונות פיסיקוכימיות של מנגנון ההגנה על דופן תא החיטה מפני התפשטות Diuraphis noxia
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.