אנו מתארים פרוטוקול לב של חולדה עובדת מבודד ex vivo כדי לבחון אסטרטגיות שימור לב של תורם. מאמר זה מתאר את פרוטוקול השימוש באחסון קר סטטי של לבבות תורמי מכרסמים; עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול גם עבור לבבות תורמים המתקבלים לאחר תרומה לאחר מוות במחזור הדם ומוות מוחי.
מאמר שיטה
שימוש במודל לב חולדה עובד מבודד לבדיקת אסטרטגיות שימור לב של תורם
במאמר זה
סיכום
תקציר
אופטימיזציה של פתרונות שימור לב תורם שיחקה תפקיד מפתח בהפחתת פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה בלבבות התורם במהלך שאיבת איברים, הובלה והשתלה. עבודות קודמות מהמעבדה שלנו הראו כי תוספת של גליצריל טריניטרט ואריתרופויאטין לתמיסות שימור לב תורם יכולה לשפר באופן משמעותי את התאוששות תפקוד הלב לאחר אחסון קר ממושך ובתרומה לאחר מוות לבבות במחזור הדם. פרוטוקול תוספת זה יושם בשימוש קליני ביחידות השתלות ברחבי אוסטרליה, בלגיה ובריטניה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת אסטרטגיות תוספי תזונה באמצעות מעגל זילוח לב חולדה עובד מבודד ex vivo (IWRH). באמצעות מתודולוגיה זו, ניתן לבחון אסטרטגיות תוספים בהקשר של אחסון סטטי קר ממושך, תרומה לאחר מוות מוחי ותרומה לאחר מוות במחזור הדם שימור לב מתורם. התאוששות תפקודית לבבית, הנמדדת על ידי זרימת אבי העורקים, זרימה כלילית, תפוקת לב, לחץ דופק וקצב לב, יכולה לשמש כדי לקבוע אם אסטרטגיית שימור מסוימת יכולה למזער פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה של הלב התורם.
מבוא
ההצלחה של השתלת לב יכולה להיות מושפעת מאוד משיטת השימור המשמשת את הלב התורם. לבבות תורמים חשופים לעלבונות איסכמיים לאורך כל תהליך שאיבת האיברים, הובלתם והשתלתם. ניתן למתן את מידת הנזק האיסכמי לאיבר התורם על ידי בחירת אסטרטגיית שימור לב תורם מתאימה. אחסון סטטי קר (CSS) נותר השיטה המעשית והנפוצה ביותר לשימור לב תורם; עם זאת, CSS לא בהכרח יכול להיות האפשרות הטובה ביותר עבור כל מסלולי תרומת הלב. לדוגמה, לבבות שנרכשו באמצעות מסלול התרומה לאחר מוות במחזור הדם (DCD) נשמרים ומוערכים כדאיותם באמצעות זילוח מכונה נורמותרמי, בעוד שלבבות שנרכשו באמצעות מסלול תרומה לאחר מוות מוחי (DBD) יכולים להישמר באמצעות CSS או זילוח מכונה היפותרמית. גורם חשוב נוסף לאסטרטגיית השימור בה נעשה שימוש הוא כמות האיסכמיה החמה (עבור DCD) או איסכמיה קרה (עבור DBD) שהלב נתון לה במהלך רכישת איברים והובלה.
מרכזים רבים משתמשים בתוספים פרמקולוגיים נוספים של תמיסת שימור הלב כדי להגביר את הסבילות האיסכמית ולשפר את תפקוד הלב לאחר ההשתלה. מחקרי מכרסמים מהמעבדה שלנו הראו כי תוספת של cardioplegia עם אריתרופויאטין ו glyceryl trinitrate היה מסוגל לשפר באופן משמעותי את התאוששות תפקוד הלב לאחר אחסון קר ממושך של הלב התורם 1,2. מחקרים אלה התקדמו לאחר מכן למחקרים חזיריים של שימור לב תורם וסיפקו את הבסיס הפרה-קליני שהוביל לשילוב של אריתרופויאטין וגליצריל טריניטרט בתמיסת הקרדיופלגיה של הלבבות שנרכשה באמצעות מסלול DCD תוך שימוש בזילוח מכונה נורמותרמית 3,4,5. כיום, תוספי אריתרופויאטין וגליצריל טריניטרט משמשים גם ביחידות השתלות אוסטרליות לשאיבת לב DBD קלינית המשלבת CSS. המטרה הכוללת של פרוטוקול הזלוף של לב חולדה עובד מבודד (IWRH) המתואר להלן היא לבחון אסטרטגיות שימור לב תורם בתנאי מעבדה ולבדוק את יעילותן לשימור תפקוד הלב התורם לאחר רפרפוזיה. פרוטוקול לב החולדה המבודד המתואר נמצא בשימוש כבר למעלה משני עשורים במעבדה שלנו והוכח כיעיל ביותר בסינון תוספי מזון פוטנציאליים ו / או אסטרטגיות שיכולות לשפר את שימור לב התורם 2,7,8,9.
פרוטוקול
כל בעלי החיים קיבלו טיפול הומני בהתאם להנחיות המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (אוסטרליה). כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של מכון גארוואן למחקר רפואי (סידני, אוסטרליה).
1. הכנת חיץ קרבס-הנסלייט (KH)
- הכן 2 ליטר של תמיסת מלאי 20x של מאגר KH המכיל 2.36 M NaCl, 0.094 M KCl, 0.024 M MgSO4, 0.024 M KH2PO4. Aliquot לתוך צינורות 50 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
- לפני הניסוי, הכינו שתי צלוחיות 2 ליטר Erlenmyer של חיץ 1x KH המכיל 1900 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה, 100 מ"ל של 20x מאגר KH, 4.20 גרם של NaHCO3 (25 מילימול) ו-3.96 גרם גלוקוז (11 מילימול).
- הניחו את צלוחיות החיץ באמבט מים בטמפרטורה של 37°C וגזו את התמיסה עם קרבוגן (95% חמצן, 5% פחמן דו חמצני, קצב זרימה מוגדר ל-2 ליטר/דקה) דרך אבני אוויר (מסנן כניסה מחליק) למשך 5 דקות, ולאחר מכן הוסיפו 2.8 מ"ל של 1 M CaCl2 (1.4 mM). המשיכו לבעבע את התמיסה לפחות שעה לפני תחילת הניסוי. שימוש באבן אוויר מסייע לאוורור אחיד של החיץ.
- מניחים נפח קטן (~ 50 מ"ל) של חיץ לתוך צלחת מתכת עגולה ב -20 ° C כדי להתקרר וליצור שכבה של חיץ קר.
2. הכנת מעגל זילוח
- יש לוודא שכל הצינורות וכלי הזכוכית נקיים ללא גידול/זיהום נראים לעין.
- הגדר גבהים של תאי זכוכית כך שיתאימו ללחצי הזילוח הנדרשים בהתבסס על 1 ס"מ H2O שווה ערך ל- 1.36 מ"מ כספית: Langendorff-to-heart 100 ס"מ (כ- 75 מ"מ כספית), לפני עומס עבודה מצד ללב 15 ס"מ (כ- 11 מ"מ כספית), תא עומס מלב לחלל 100 ס"מ (כ- 75 מ"מ כספית).
- התחל את זרימת המים החמים סביב המעגל לפחות 10 דקות לפני זילוח הלב.
- הכניסו מסנני מיקרופייבר (1.2 מיקרומטר) למחזיקי המסננים והדקו אותם היטב.
- הפעילו את המעגל עם חיץ KH, כדי לוודא שכל האוויר מוסר, והשתמשו במהדק צינורות בקרת זרימה כדי לכוונן את הזרימה בצד לנגנדורף (איור 1A, B) ל~50 מ"ל/דקה. הזרימה האיטית יותר מאפשרת הקלה על קנולציה של אבי העורקים ומונעת את עקירת הלב לפני הקשירה. מקם מדחום בתוך המעגל באמצעות מחבר צינורות בצורת T כדי לפקח על טמפרטורת המאגר ב~ 37 ° C.
3. הקמת תוכנת Lab Chart (ניתוח נתונים)
- ודא ש-Powerlab (מערכת איסוף נתונים) ומד זרימה מופעלים ומחוברים למחשב לפני פתיחת תוכנת ניתוח הנתונים.
- פתח קובץ חדש.
- הגדר איסוף נתונים על-ידי בחירת התפריט הנפתח הגדרות ובחירה באפשרות הגדרות ערוץ. בחרו לחץ אבי העורקים, זרימת אבי העורקים וקצב הלב (איור 2A).
- הגדר כל ערוץ עם ההגדרות המוצגות באיור 2B.
4. הכנת בעל חיים לבידוד לב חולדה
הערה: המתודולוגיה לבידוד לב חולדה וזילוח עבור לבבות שאינם DBD ושאינם DCD לאחסון סטטי קר מתוארת להלן. השיטות למכשור לב על מעגל הזלוף דומות יחסית ללא קשר לשיטת התרומה בה משתמשים. ההבדלים בפרוטוקול תרומת לב של חולדות DBD ו-DCD מתרחשים בעיקר מרגע כניסת ההרדמה לתוקף ועד להוצאת הלב מהחיה.
- לשקול את החיה, להבטיח כי משקלו הוא >330 גרם. טווח המשקל האידיאלי עבור חולדות זכרים הוא 330-420 גרם.
- מתן זריקה תוך צפקית של קטמין (80 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). ודא שמישור כירורגי מתאים של הרדמה מבוסס על היעדר רפלקס דוושה (רפלקס צביטת בוהן) ורפלקס מצמוץ עיניים.
- מניחים את החיה במצב שכיבה, מאבטחים את הגפיים עם קלטת. לתת חמצן לחיה דרך חרוט האף.
- יש את מיכל המתכת של KH חוצץ קרח ומיכל מתכת קטן עם קרח בתחנת הניתוח. השרו גזה בגודל 7.5 ס"מ x 7.5 ס"מ במאגר KH והניחו אותה על המיכל בקרח.
- לאחר אישור מישור כירורגי הולם של הרדמה, לגלח את העור באתר החתך הכירורגי ולנקות את העור עם אספטי כגון betadine או 70% אלכוהול. בצע חתך רוחבי לאורך הבטן (laparotomy) והזז את הקיבה והמעיים הצידה כדי לאפשר גישה לווריד הכליה השמאלי. יש להזריק 1500 IU הפרין ולהפעיל לחץ על אתר ההזרקה עד לדימום מפסיק. יש להמתין 1-2 דקות עד שההפרין יזרום לפני שתמשיך בשאיבת הלב.
- פתח את חלל החזה על ידי חיתוך דרך כלוב הצלעות משני הצדדים וחיתוך על פני הסרעפת. החזיקו והרימו בזהירות את גוש הלב-ריאה תוך כדי חיתוך לאורך אבי העורקים היורד, וודאו שקשת אבי העורקים נשארת שלמה. זה יאפשר מספיק אורך אבי העורקים להישאר עבור קנולציה.
- החולדה מורדמת על ידי הסרת הלב והריאות בזמן הרדמה. השקיעו את גוש הלב-ריאה בגוש הקרח KH כדי לאפשר ללב לעצור.
5. שימורי הלב למעגל זילוח הלב העובד המבודד
- מעבירים את גוש הלב-ריאה לגזה על קרח. מנתחים עודפי שומן סביב אבי העורקים, חותכים את אבי העורקים כדי להשאיר אורך 3-5 מ"מ לקנולציה, ומבצעים חתך קטן ~ 1-2 מ"מ בעורק הריאה. זה יאפשר נתיב לשפכים הכליליים.
- הניחו את גוש הלב-ריאה החתוך (בעודו עדיין על קרח) ישירות מתחת לצינוריות. כוונן את הזרימה מצד לנגנדורף באמצעות מהדק צינורות בקרת זרימה כדי להקל על קנולציה של אבי העורקים. בזהירות צינור אבי העורקים על הצינורית השמאלית, להחזיק אותו עם מהדק שחור, ולקשור אותו עם תפר משי 2-0.
- הגדל את הזרימה מזילוח לנגנדורף על ידי פתיחה מלאה של מהדק צינורות בקרת הזרימה. פתח את מהדק העומס שלאחר מכן. ודא שיש זרימה רציפה מתא לנגנדורף. התחל לנטר את פעילות הלב באמצעות תוכנה.
הערה: אם ערך זרימת אבי העורקים בתצוגת מד הזרימה הוא <10 מ"ל/דקה, ודא שעורק הריאה הוא בגודל מספיק. עקב/ערך נמוך של זרימת אבי העורקים יכול גם להצביע על כך שצינורית אבי העורקים הוחדרה רחוק מדי. - התאימו את גוש הלב-ריאה כך שהמשטח הקדמי של הריאות פונה למפעיל. קשרו את אונת הריאה השמאלית בתפר משי 2-0 וחתכו עודפי רקמת ריאה שמאלית. קשרו את אונות הריאה הנותרות בטאטוא אחד בתפר משי 2-0 וחתכו את הרקמה. סובב את הלב כך שהריאות הקשורות יהיו לכיוון הגב.
- בעזרת מספריים קטנים של Vannas, חותכים קצה של 2-3 מ"מ של תוספתן פרוזדורים שמאלי, ומבטיחים שיושג פתח קטן לתוך האטריאה. בזהירות לצבוע את תוספתן פרוזדורים שמאל לצינורית השמאלית, להחזיק אותו עם מהדק שחור, ולקשור אותו עם תפר משי 2-0. איור 3A מראה את המיקום של שתי הצינוריות.
- כוונן את מעיל המים של תא הלב כך שהלב ישב במרכז החדר.
- פתח את מתמר הלחץ לאוויר ואפס את מתמר הלחץ בתוכנה על ידי בחירת התפריט הנפתח לחץ אבי העורקים > גשר מגבר > אפס. לחץ על אישור.
- מבלבלים את הלב במצב לנגנדורף למשך 10 דקות. ודא כי זרימת אבי העורקים לנגנדוף מודדת בין 10-20 מ"ל / דקה (אידיאלי 20 מ"ל / דקה).
- לפני החלפת מצב העבודה, ודא שאבן האוויר (מסנן כניסה מחליק) ממאגר החיץ Langendorff KH ממוקמת במאגר החיץ KH העובד.
- העבר את הלב למצב עבודה על ידי סגירת המהדק הגדול המוביל לצינורית אבי העורקים ופתיחת הזרימה המובילה לתוספתן הפרוזדורים השמאלי. פתח ברז תלת-כיווני המוביל מעבודה מבלבלת. העבירו את צינור ההחזרה המשותף (החזרת חיץ KH למאגר) ממאגר לנגנדורף למאגר העובד.
- מחוררים את הלב במצב עבודה למשך 15 דקות. ערכי זרימת אבי העורקים חייבים להיות באופן אידיאלי >30 מ"ל/דקה בתום זילוח של 15 דקות. לאחר שהלב התייצב, התחל להקליט נתונים בתוכנת ניתוח נתונים.
- יש למדוד שפכים כליליים (זרימה כלילית) בדקה, 5 דקות, 10 דקות ו-15 דקות.
הערה: ערכי הזרימה הכלילית צריכים להיות בין 10-20 מ"ל/דקה. זרימה כלילית גדולה מ-22 מ"ל/דקה מצביעה בדרך כלל על דליפה שמקורה בכלי ריאתי לא קשור. קצב הלב צריך להיות בין 200-300 פעימות לדקה. ניתן לאסוף שפכים כליליים לצורך ניתוח במורד הזרם של סמני פגיעה ברקמות (למשל, טרופונין-I, שחרור לקטט דהידרוגנאז).
6. מתן cardioplegia לאחסון סטטי קר של הלב
- מלאו את תא הקרדיופלגיה (ממוקם בגובה של 60 ס"מ כדי להפיק לחץ זילוח של כ-40 מ"מ כספית) בתמיסת שימור לב ייעודית של 50 מ"ל (עם או בלי תוספת).
- הנמיכו את מעיל המים וסגרו את הברז התלת-כיווני בצד מצב העבודה.
- עצור את הזרימה לכיוון צינורית הפרוזדורים השמאלית על ידי סגירת המהדק.
- פתח את הזרימה לצינורית אבי העורקים.
- סגור את המהדק מצד לנגנדוף ועל העומס הבא.
- פתח את המהדק מקו הקרדיופלגיה ושטף 15 מ"ל של קרדיופלגיה מקו הלחץ. סגור את הברז בקו הלחץ.
- אפשר ללב להיות סמוק עם cardioplegia דרך צינורית אבי העורקים ולאסוף את השפכים הכליליים. הפעל cardioplegia במשך 3 דקות להקליט את נפח cardioplegia מנוהל.
- הפסק להקליט נתונים בתוכנה ושמור את הקובץ.
- לאחר 3 דקות, סגור את מהדק cardioplegia ואת מהדק כחול קטן המוביל צינורית אבי העורקים.
- מניחים מהדק בולדוג על צינורית אבי העורקים ומהדק בולדוג שני על הצינורית השמאלית. נתקו את גוש צינורית הלב מהמעגל והניחו אותו בתוך המכילה קרדיופלגיה בקופסת קרח (איור 3B, C).
- אחסנו את הלב במקרר למשך 6 שעות (או זמן האחסון הקר הרצוי).
7. זילוח לב לאחר אחסון סטטי קר
- הכינו חיץ KH לפי סעיף 1.
- הקדימו את מעגל הזלוף לפי סעיף 2.
- פתח את הקובץ שנשמר מזילוח מקו הבסיס.
- הסר בזהירות את גוש צינורית הלב מקופסת הקרח וחבר אותו למעגל הזילוח. לפני חיבור מחדש של צינורית אבי העורקים, השתמש במזרק 18 G קהה מלא בחיץ KH כדי להסיר אוויר מהצינורית. חבר תחילה את צינורית אבי העורקים, פתח את מהדק הצינור בצד לנגנדורף וודא שמהדק הצינור פתוח.
- חבר מחדש את צינורית הפרוזדורים השמאלית, וודא שהאוויר הוסר מהצינורית לפני החיבור למעגל הזילוח. שמור על מהדק צד העבודה סגור עד שהגיע הזמן לעבור ממצב לנגנדורף למצב עבודה.
- מחוררים את הלב במצב לנגנדורף למשך 15 דקות. הקפד להתחיל להקליט נתונים בתחילת הרפרפוזיה של לנגנדורף.
- לפני המעבר למצב עבודה, מקם את שתי האבנים המבעבעות במאגר KH, פתח את הברז התלת-כיווני בצד העבודה, והעבר צינורות החזרה נפוצים למאגר העבודה.
- סוגרים את מהדק לנגנדורף הלבן, פותחים את מהדק הצד הלבן ומערבבים את הלב למשך 30 דקות. למדוד ולאסוף שפכים כליליים בנקודות זמן ייעודיות לניתוח במורד הזרם (למשל, סמני פגיעה לבבית). הקפד להפסיק להפעיל מחדש את הקלטת התוכנה כדי להתחיל קטע חדש (או לחילופין, הוסף תגובה).
- לאחר כ-15 דקות פרפוזיה של מצב עבודה, סגור את ההקשה התלת-כיוונית.
- בסוף הרפרפוזיה, שמור את קובץ הנתונים, עצור את הזרימה דרך המעגל, ונתק את בלוק הלב. איסוף דגימות חדר שמאל לעיבוד היסטולוגי ו/או הקפאת הצמדה למחקרים עתידיים (למשל, מיצוי חלבונים למחקרי כתמים מערביים).
- הסירו את המסננים ממחזיקי המסנן, רוקנו את החיץ מהמעגל ושטפו פעמיים ב-5 ליטר מים מזוקקים.
הערה: למרות שזה לא הכרחי, זה עוזר לחמם מראש את המים המזוקקים במיכל גדול בתוך אמבט המים.
8. ניתוח התאוששות תפקודית
- פתח את הקובץ LabChart.
- סמן אזור של הקלטה של 30 שניות לפחות ולאחר מכן לחץ על Command > Add data selection OR Multiple add to data. פעולה זו תוסיף את הפרמטרים הרצויים לקובץ DataPad בתוך התוכנה.
- בחר תפריט נפתח חלון > DataPad.
- סמן והעתק את ערכי השחזור מ- DataPad לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח שחזור פונקציונלי. חשב התאוששות פונקציונלית כאחוזמהערך הבסיסי המתאים 1,6,7.
תוצאות
התוצאות מהזילוח הבסיסי יקבעו אם הניסוי הראשוני (טרום אחסון) היה מוצלח. זרימת אבי העורקים המוצגת במצב Langendorff צריכה להיות בין 14 - 22 מ"ל/דקה. זרימת לנגנדורף מוצגת כערך שלילי במד הזרימה עקב זילוח מדרדר של אבי העורקים. דוגמה לעקבות לנגנדורף מקובלים מוצגת באיור 4A.
לאחר המעבר למצב עבודה, זרימת אבי העורקים צריכה להיות לפחות 30 מ"ל / דקה ברגע שהלב מתיישב. זה נורמלי שהזרימה תזנק בתחילה לכ-50 מ"ל/דקה, ואז תרד לכ-25 מ"ל/דקה לפני שתגדל חזרה לזרימה יציבה של אבי העורקים. ברגע שהפרמטרים הבסיסיים משביעי רצון (מיקוד אוטומטי > 30 מ"ל/דקה, CF 10-20 מ"ל/דקה, HR 200-300 פעימות לדקה), הלב עשוי להיות מאוחסן. דוגמה למעקב בסיסי טוב מוצגת באיור 4B.
בהתאם לפתרון השימור שנבדק, לבבות מסוימים לא יניבו התאוששות טובה לאחר אחסון סטטי קר ממושך למרות שיש להם קו בסיס מצוין. דוגמה לעקבות המצביעות על התאוששות לקויה במצב עבודה מוצגת באיור 4C.
ניתן לחשב את ההתאוששות התפקודית הסופית עבור זרימת אבי העורקים בהתבסס על קריאת זרימת אבי העורקים הסופית כאחוז מערך הבסיס. לדוגמה, אם המיקוד האוטומטי בקו הבסיס של הלב היה 40 מ"ל/דקה, והמיקוד האוטומטי בסוף הרפרפוזיה לאחר אחסון סטטי קר היה 20 מ"ל/דקה, התאוששות המיקוד האוטומטי עבור לב זה הייתה 50%. דוגמה לייצוג נתונים זה מוצגת באיור 5.
איור 1: מעגל זילוח לב עובד. (A) תמונה של מעגל זילוח הלב המבודד של חולדה עובדת. התיבה האדומה מציינת היכן ממוקם הלב המבודד. (B) סכמה של מעגל זילוח הלב העובד המבודד המציין את כיוון הזרימה של חיץ KH דרך המעגל עבור זילוח לנגנדורף (קו מקווקו) ומצב עבודה (קו מוצק). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרת תוכנת LabChart. (A) הגדרת הגדרות ערוץ עבור לחץ אבי העורקים, זרימת אבי העורקים וקצב הלב. (B) דוגמה לתבנית LabChart המוגדרת עם שלושה ערוצים. Windows משמאל מציג כל ערוץ בנפרד מוגדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: קנולציה וקרדיופלגיה. (A) קנולציית לב לפני הנחתה בתוך תא מעיל המים. הצינורית השמאלית מוחדרת לאבי העורקים, והצינורית הימנית מוחדרת לחדר השמאלי דרך תוספתן פרוזדורים שמאלי. כלי הדם הריאתיים נקשרו, ורקמת הריאה נותחה. (B) לאחר מתן cardioplegia, הלב ממוקם בתוך המכילה את תמיסת cardioplegia. הצינוריות הודקו בקליפסים של בולדוג לפני ההתנתקות מהאסדה. (C) דוגמה ללבבות שהונחו בתוך ארגז קרח לאחסון קר ממושך. כאן, שני לבבות נשמרו עבור reperfusion. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דוגמאות לעקבות LabChart. עקבות לחץ (גרף אדום), זרימת אבי העורקים (גרף כחול) וקצב לב (גרף ירוק) עבור לב עם (A) עקבות לנגנדורף טובים, (B) התאוששות טובה במהלך זילוח מצב עבודה, (C) התאוששות גרועה במהלך זילוח מצב עבודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: גרפים מייצגים להתאוששות תפקודית. (A) זרימת אבי העורקים, (B) זרימה כלילית, (C) תפוקת לב ו-(D) דופק. נעשה שימוש חוזר בנתון זה באישור Gao et al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
דיון
בהתחשב באופי הרגיש של תפקוד הלב הבסיסי, יש להקפיד לשמור על מתקן הזילוח נקי ועם רכיבים תואמים. לדוגמה, יש להשתמש בצינורות PVC נכונים. חומרי צינורות מסוימים, כגון סיליקון, יכולים לתרום לזרימת אבי העורקים והתכווצות נמוכה יותר, אשר עשויה להיות עקב אובדן חמצן דרך הצינור. בעוד שישנם מעגלי זילוח לב של חולדות עובדים מבודדים הזמינים באופן מסחרי, רובם משמשים בעיקר לזילוח לנגנדורף בלבד. באופן כללי, ניתן לקבל מדידות תפקודיות במודל זילוח לנגנדוף באמצעות החדרת קטטר בלון לחדר השמאלי כדי לקבל מדידות לחץ דיאסטולי בחדר שמאל (LVDP). עם זאת, היכולת למדוד מדידות זרימת אבי העורקים הגולמי ותפוקת הלב במערכת זילוח לנגנדוף אינה אפשרית. יתרון עיקרי של פרוטוקול IWRH הוא היכולת לקבל מדידות תפקודיות של זרימת אבי העורקים ותפוקת הלב ללא צורך בהתערבויות נוספות של הלב (כלומר, קטטר בלון). ישנן אפשרויות מסחריות למערכת זילוח לב חולדה עובדת ולמרות שניתן להתאים אותן לדרישות מחקר בודדות, מערכות אלה יכולות להיות יקרות.
ישנם שלבים קריטיים בפרוטוקול כדי להבטיח תפקוד בסיסי אופטימלי של לב המכרסם במהלך הזילוח. הכנת פתרונות מלאי מאגר KHB צריכה להיות לא יותר מ -4 שבועות. מעגל הזילוח חייב להיות נקי מבועות אוויר בעת ההקדמה. יש להקפיד על קישוט התוספתן הפרוזדורי השמאלי. טיפול מוגזם ברקמה יכול להגביר את הסיכון לקרע ויכול גם להוסיף לעצבנות תפקודית של הלב.
איכות הביצועים של מעגל הזלוף IWRH יכולה להיקבע בדרך כלל על ידי קריאות הבסיס המתקבלות בלבבות (מיקוד אוטומטי > 30 מ"ל/דקה, CF ~ 20 מ"ל/דקה). בדיקות בקרת איכות נוספות במודל CSS יכולות להתבצע על ידי מעצר ואחסון הלב בתמיסת שימור צלזיוס בתוספת 1 μmol/L zoniporide בתוספת 0.1 מ"ג/מ"ל גליצריל טריניטרט. לבבות שנעצרו עם Celsior בתוספת גליצריל טריניטרט בתוספת זוניפוריד מבטיחים התאוששות מיידית של Langendorff reperfusion והתאוששות תפקודית סופית בין 40-60% לאחר 6 שעות אחסון קר. אם יש ספק אם האסדה מתפקדת היטב, תוסף בקרת איכות זה שימושי לבדיקה.
השיטות לשימוש בלבבות מכרסמים שנרכשו באמצעות תרומה לאחר מוות במחזור הדם תוארו בעבר10,11. בקצרה, חולדות מורדמות, עורק התרדמה מפותל, וקריאות לחץ מתקבלות. הפרין (500 IU) מוזרק דרך צינורית עורק התרדמה. קנה הנשימה קשור ליזום נסיגה של תמיכת חיים. ברגע שמגיעים לזמן האיסכמי החם הנדרש, ניתן לכרות את הלב ולהכניס אותו למעגל הזילוח. עבור מתן תמיסת שימור לתוך לב DCD, 60 מ"ל של תמיסת שימור נשטפת דרך אבי העורקים (~ 20 מ"ל / דקה) דרך קו הלחץ על המעגל. כלי הדם הריאתיים קשורים, הריאות מנותחות, הצינורית השמאלית מוחדרת, ואז 40 מ"ל של פתרון שימור הוא שטף דרך קו הלחץ. לאחר מכן הלב מחורר בהתאם לפרוטוקול לעיל. התאוששות תפקודית נלקחת כערך גולמי של המודינמיקה תפקודית, וניתוח סטטיסטי מתבצע על ידי השוואת הערכים לאותם לבבות שהופעלו בדמה (עם זאת, לא DCD סמוק על האסדה).
השיטות לשימוש בלבבות מכרסמים שנרכשו לאחר מוות מוחי תוארו בעבר12. בקצרה, בעלי החיים מורדמים, מרותמים ומונשמים, עם ניטור המודינמי בהתאם לפרוטוקול מכרסם DCD. חור בור מבוצע בגולגולת הרקתית-קודקודית, וצנתר אמבולקטומיה 3F ממוקם מתחת לדוראלי. לבקרות דמה יש חורי בור אך אין החדרת קטטר. הבלון מנופח במים של 0.3 מ"ל במשך 2 דקות ונשמר מנופח למשך שעה. לאחר שעה אחת של תצפית המודינמית, הלבבות נשתלים ומונחים על מעגל זילוח הלב העובד המבודד, נרשמות מדידות בסיסיות, קרדיופלגיה מנוהלת, ולבבות מאוחסנים קרים כמתואר לעיל.
המגבלה העיקרית של השימוש במעגל הזילוח IWRH היא חוסר היכולת להשתמש במאגר זילוח מבוסס דם כדי לזרום דרך המערכת. זה יהיה בלתי אפשרי למצוא מספיק דם מכרסמים כדי להוסיף perfusate; לכן, זילוח מבוסס דם אינו אפשרי. מודלים חלופיים, כגון השתלת לב הטרוטופית של מכרסמים או מחקרים גדולים על השתלות לב אורתוטופיות בבעלי חיים, יצטרכו ככל הנראה להתבצע כדי לבחון את ההשפעה של זילוח מבוסס דם. עם זאת, שיטות חלופיות אלה דורשות מומחיות במיומנויות מיקרוכירורגיות ו / או מתקנים כירורגיים גדולים לבעלי חיים ומרדימים מנוסים, זילוח ומנתחי לב-חזה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
המחקרים המתוארים כאן מומנו על ידי מענקים שהוענקו ל- P.S Macdonald מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי באוסטרליה, קרן מרפאת סנט וינסנט, ומענק החוקר הבכיר של יכולת המחקר הקרדיווסקולרית של NSW Health.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.5 מ"ל צינור אפנדורף חסר צבע, 1000 לקופסה | Bio Strategy Pty Ltd | 0030.125.150 | |
| 15 מ"ל סנט / צינורות (S) שרוול / 25 PP ctn / 500 | Sigma-aldrich Pty Ltd | CLS430791-500ea | |
| BP מתמר / ערכת כבלים | ADIמבנים | MLT1199 | רכישת נתונים |
| גשר מגבר | ADInstruments | FE221 | רכישת נתונים |
| קרבוגן 555G2 | BOC | BOC002 | |
| Checktemp1 מדחום | Hanna Instruments | HI98509 | מהדק בניית אסדה |
| צביטה 1/4-7/16 PK 12 | תומאס סיינטיפיק | 2848Y40 | מהדק בניית אסדה |
| עם גזע הארכה Med. | תומאס סיינטיפיק | 8847T08 | בניית אסדה |
| עם גזע הארכה Sm. | תומאס סיינטיפיק | 8847T02 | לבניית אסדה |
| , כלי, 60 גרם לחץ | קוהרנטי מדעי | 14121 | ציוד כירורגי |
| מחבר סגור | תומאס סיינטיפיק | 8847E25 | בניית אסדה |
| Covidien Sofsilk 2-0 שחור חתוך מראש 45 ס"מ קופסה של 24 | ציוד רפואי מומחה | S195 | חומרים מתכלים כירורגיים |
| בהתאמה אישית 250 מ"ל מסיר גז מעוטר | מותאם אישית מפוצץ כלי זכוכית Pty בע"מ | N/A | אסדה בניית מותאם |
| אישית 750 מ"ל מאגר | מותאם אישית מפוצץ כלי זכוכית Pty בע"מ | N/A | אסדה בניית |
| D-(+)-גלוקוז נטול מים SigmaUltra | Sigma-aldrich Pty Ltd | G7528-1Kg | כדי להפוך את Krebs Buffer |
| Dual Channel Console | ADInstruments | TS402 | Data Acquisition |
| צלוחיות Erlenmyer 2 L | |||
| מסנן מיקרופייבר מסוג GF/C סיבי זכוכית 47 מ"מ, 100 | Bio-strategy Pty Ltd | 1822047 | |
| מלקחיים, 15 ס"מ, 0.3 מ"מ, CRVD | Coherent Scientific | 14114 | ציוד כירורגי |
| ארבעה מהדקי שיניים עם זרוע ארוכה 9 מ"מ x 115 מ"מ להחזקת חפצים בקוטר 2-70 מ"מ. מצופה ויניל | Met-App Australia Pty Ltd | 1352 | |
| Rig Construction Heater Circulator. בקרת מצב מוצק דיגיטלית. (1020 וואט/240 וולט) | Thermoline Scientific | TU3 | אסדה בנייה |
| הפרין 5000 U/5 מ"ל קופסה 50 פייזר 02112115 | Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd | 1258693 | תרופות |
| איליום Xylazil 20 Inj 50 מ"ל | Cenvet Australia Pty Ltd | X5010 | הרדמה |
| ג'ונס הופקינס בולדוג מהדק | קוהרנטי מדעי | CS-WPI-14117 | |
| קטמין 100 מ"ג/50 מ"ל | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | הרדמה |
| מגנזיום סולפט heptahydrate AR 500 גרם Chemsupply | Bio Strategy Pty Ltd | MA048-500g | כדי להפוך את Krebs Buffer |
| נקבה מתאם צירים תומאס | סיינטיפיק | 8847V08 | בניית אסדה |
| Masterflex L/S ראש עומס קל לצינורות מדויקים, PPS, רוטור | CRSJohn Morris | 1015164 | Rig Construction |
| Metzenbaum מספריים, 11.5 ס"מ | קוהרנטי מדעי | WPI-501748 | ציוד כירורגי |
| מספריים מצנבאום, 14.5 ס"מ ישר | קוהרנטי | מדעי WPI-501252 | ציוד כירורגי |
| חומרת הרכבה F/2-HEADS SS | John Morris | 1014414 | ברגי הרכבה לראשי משאבה |
| מחבר פתוח | תומאס סיינטיפיק | 8847E05 | בניית אסדה |
| Paraformadehyde | סיגמא-אולדריץ' | P6148-500G | עיבוד דגימות |
| אשלגן כלורי (AnalaR NORMAPUR) 500 גרם | VWR כימיקלים | 26764.26 | להפוך את קרבס בופר |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי | Sigma-Aldrich Pty Ltd | P5379-500g | כדי להפוך את Krebs Buffer |
| Powerlab 2/26, מקליט 2 ערוצים + תוכנת Labchart | ADInstruments | ML826 | חומרה ותוכנה למחשב |
| דיוק XN חיישן זרימה מוטבע, 3.2 מ"מ (1/8 אינץ') ID ME4PXN-KR37 XF | ADInstruments | ME4PXN | אסדת בניית |
| אזמל עם ידית חד פעמית #11 pkt/10 | BSN רפואי (Aust) Pty Ltd | 73252-36 | |
| אטם סיליקון עבור Swinnex 47 מ"מ 5 / PK | Merck Millipore | SX0004701 | אסדה בניית |
| סיליקון O-טבעת 5-329 10 / PK | Merck Millipore | XX1104707 אסדת בניית | |
| יחיד בורט מהדק | תומאס סיינטיפיק | 8847T32 | אסדה בניית |
| החלקה כניסת מסנן נקבוביות גודל 10 ומיקרו; m (מבעבע) | Sigma-aldrich | 59277 | בניית אסדה |
| Sm. 360 מחבר סיבוב | תומאס סיינטיפיק | 8847E35 | בניית |
| אסדה נתרן ביקרבונט | Sigma-Aldrich Pty Ltd | S6297 - 250 גרם | לייצור |
| מחזיק מסנן Swinnex Buffer Krebs, 47 מ"מ | Merck Millipore | SX0004700 | מזרקי בניית אסדה |
| 1 מ"ל קופסה/100 | בקטון Dickinson Pty Ltd | 302100 | |
| מהדקי שלושה שיניים בקוטר 9 מ"מ x זרוע ארוכה 125 מ"מ ובורג תאום להחזקת 5-80 מ"מ | Met-App Australia Pty Ltd | 1356 | מודול מד זרימה צינורות לבניית אסדה |
| TS410 | ADמבנים | TS410 | צינורות רכישת נתונים |
| PVC 6.35 מ"מ קוטר x 9.52 מ"מ OD 50ft גליל 15.24 מ', שקוף, DEHP ללא פתלטים, דרגת מזון פוגשת REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0600 | בניית אסדה |
| צינורות PVC 7.94 מ"מ קוטר פנימי x 11.1 מ"מ OD 50ft גליל 15.24 מ', שקוף, DEHP ללא פתלטים, דרגת מזון פוגשת REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0900 | צינורות בניית אסדה |
| PVC 9.52 מ"מ קוטר פנימי x 12.7 מ"מ OD 100ft גליל | תרמו פישר | NAL 8701-4120 | מספריים לבניית אסדה |
| , 8.5 ס"מ, ישר, 7 מ"מ להבים | קוהרנטיים מדעיים | WPI-500-086 | ציוד |
| כירורגיאמבט מים 30 ליטר עם מגש תלוי | Thermoline Scientific | TLWB-30 | בניית אסדה |
מקורות
- Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
- Watson, A. J., et al. Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution. J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).
- Chew, H. C., et al. Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia. J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).
- Dhital, K. K., et al. Adult heart transplantation with distant procurement and ex-vivo preservation of donor hearts after circulatory death: a case series. Lancet. 385 (9987), 2585-2591 (2015).
- Joshi, Y., et al. Heart transplantation from DCD donors in Australia: Lessons learned from the first 74 cases. Transplantation. 107 (2), 361-371 (2023).
- Villanueva, J. E., et al. Functional recovery after dantrolene-supplementation of cold stored hearts using an ex vivo isolated working rat heart model. PLoS One. 13 (10), e205850(2018).
- Villanueva, J. E., et al. The cardioprotective potential of the sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor empagliflozin in donor heart preservation. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1151-1153 (2020).
- Gao, L., et al. Critical role of the STAT3 pathway in the cardioprotective efficacy of zoniporide in a model of myocardial preservation - the rat isolated working heart. Br J Pharmacol. 162 (3), 633-647 (2011).
- Cropper, J. R., Hicks, M., Ryan, J. B., Macdonald, P. S. Cardioprotection by cariporide after prolonged hypothermic storage of the isolated working rat heart. J Heart Lung Transplant. 22 (8), 929-936 (2003).
- Gao, L., et al. Enhanced functional recovery of the heart donated after circulatory death determination with antemortem heparin. J Heart Lung Transplant. 39 (6), 607-609 (2020).
- Villanueva, J. E., et al. The effect of increasing donor age on myocardial ischemic tolerance in a rodent model of donation after circulatory death. Transplant Direct. 7 (6), e699(2021).
- Kumarasinghe, G., et al. Improved heart function from older donors using pharmacologic conditioning strategies. J Heart Lung Transplant. 35 (5), 636-646 (2016).
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה