אנו מתארים פרוטוקול לב של חולדה עובדת מבודד ex vivo כדי לבחון אסטרטגיות שימור לב של תורם. מאמר זה מתאר את פרוטוקול השימוש באחסון קר סטטי של לבבות תורמי מכרסמים; עם זאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול גם עבור לבבות תורמים המתקבלים לאחר תרומה לאחר מוות במחזור הדם ומוות מוחי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שימוש במודל לב חולדה עובד מבודד לבדיקת אסטרטגיות שימור לב של תורם
במאמר זה
סיכום
תקציר
אופטימיזציה של פתרונות שימור לב תורם שיחקה תפקיד מפתח בהפחתת פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה בלבבות התורם במהלך שאיבת איברים, הובלה והשתלה. עבודות קודמות מהמעבדה שלנו הראו כי תוספת של גליצריל טריניטרט ואריתרופויאטין לתמיסות שימור לב תורם יכולה לשפר באופן משמעותי את התאוששות תפקוד הלב לאחר אחסון קר ממושך ובתרומה לאחר מוות לבבות במחזור הדם. פרוטוקול תוספת זה יושם בשימוש קליני ביחידות השתלות ברחבי אוסטרליה, בלגיה ובריטניה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת אסטרטגיות תוספי תזונה באמצעות מעגל זילוח לב חולדה עובד מבודד ex vivo (IWRH). באמצעות מתודולוגיה זו, ניתן לבחון אסטרטגיות תוספים בהקשר של אחסון סטטי קר ממושך, תרומה לאחר מוות מוחי ותרומה לאחר מוות במחזור הדם שימור לב מתורם. התאוששות תפקודית לבבית, הנמדדת על ידי זרימת אבי העורקים, זרימה כלילית, תפוקת לב, לחץ דופק וקצב לב, יכולה לשמש כדי לקבוע אם אסטרטגיית שימור מסוימת יכולה למזער פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה של הלב התורם.
מבוא
ההצלחה של השתלת לב יכולה להיות מושפעת מאוד משיטת השימור המשמשת את הלב התורם. לבבות תורמים חשופים לעלבונות איסכמיים לאורך כל תהליך שאיבת האיברים, הובלתם והשתלתם. ניתן למתן את מידת הנזק האיסכמי לאיבר התורם על ידי בחירת אסטרטגיית שימור לב תורם מתאימה. אחסון סטטי קר (CSS) נותר השיטה המעשית והנפוצה ביותר לשימור לב תורם; עם זאת, CSS לא בהכרח יכול להיות האפשרות הטובה ביותר עבור כל מסלולי תרומת הלב. לדוגמה, לבבות שנרכשו באמצעות מסלול התרומה לאחר מוות במחזור הדם (DCD) נשמרים ומוערכים כדאיותם באמצעות זילוח מכונה נורמותרמי, בעוד שלבבות שנרכשו באמצעות מסלול תרומה לאחר מוות מוחי (DBD) יכולים להישמר באמצעות CSS או זילוח מכונה היפותרמית. גורם חשוב נ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל בעלי החיים קיבלו טיפול הומני בהתאם להנחיות המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי (אוסטרליה). כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של מכון גארוואן למחקר רפואי (סידני, אוסטרליה).
1. הכנת חיץ קרבס-הנסלייט (KH)
- הכן 2 ליטר של תמיסת מלאי 20x של מאגר KH המכיל 2.36 M NaCl, 0.094 M KCl, 0.024 M MgSO4, 0.024 M KH2PO4. Aliquot לתוך צינורות 50 מ"ל ולאחסן ב -20 ° C.
- לפני הניסוי, הכינו שתי צלוחיות 2 ליטר Erlenmyer של חיץ 1x KH המכיל 1900 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה, 100 מ"ל של 20x מאגר KH, 4.20 גרם של NaHCO3 (25 מילימול)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות מהזילוח הבסיסי יקבעו אם הניסוי הראשוני (טרום אחסון) היה מוצלח. זרימת אבי העורקים המוצגת במצב Langendorff צריכה להיות בין 14 - 22 מ"ל/דקה. זרימת לנגנדורף מוצגת כערך שלילי במד הזרימה עקב זילוח מדרדר של אבי העורקים. דוגמה לעקבות לנגנדורף מקובלים מוצגת באיור 4A.
לאחר המעבר למצב עבודה, זרימת אבי העורקים צריכה להיות לפחות 30 מ"ל / דקה ברגע שהלב מתיישב. זה נורמלי שהזרימה תזנק בתחילה לכ-50 מ"ל/דקה, ואז תרד לכ-25 מ"ל/דקה לפני שתגדל חזרה לזרימה יציבה של אבי העורקים........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בהתחשב באופי הרגיש של תפקוד הלב הבסיסי, יש להקפיד לשמור על מתקן הזילוח נקי ועם רכיבים תואמים. לדוגמה, יש להשתמש בצינורות PVC נכונים. חומרי צינורות מסוימים, כגון סיליקון, יכולים לתרום לזרימת אבי העורקים והתכווצות נמוכה יותר, אשר עשויה להיות עקב אובדן חמצן דרך הצינור. בעוד שישנם מעגלי זילוח לב של חולדות עובדים מבודדים הזמינים באופן מסחרי, רובם משמשים בעיקר לזילוח לנגנדורף בלבד. באופן כללי, ניתן לקבל מדידות תפקודיות במודל זילוח לנגנדוף באמצעות החדרת קטטר בלון לחדר השמאלי כדי לקבל מדידות לחץ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
המחקרים המתוארים כאן מומנו על ידי מענקים שהוענקו ל- P.S Macdonald מהמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי באוסטרליה, קרן מרפאת סנט וינסנט, ומענק החוקר הבכיר של יכולת המחקר הקרדיווסקולרית של NSW Health.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1.5 מ"ל צינור אפנדורף חסר צבע, 1000 לקופסה | Bio Strategy Pty Ltd | 0030.125.150 | |
| 15 מ"ל סנט / צינורות (S) שרוול / 25 PP ctn / 500 | Sigma-aldrich Pty Ltd | CLS430791-500ea | |
| BP מתמר / ערכת כבלים | ADIמבנים | MLT1199 | רכישת נתונים |
| גשר מגבר | ADInstruments | FE221 | רכישת נתונים |
| קרבוגן 555G2 | BOC | BOC002 | |
| Checktemp1 מדחום | Hanna Instruments | HI98509 | מהדק בניית אסדה |
| צביטה 1/4-7/16 PK 12 | תומאס סיינטיפיק | 2848Y40 | מהדק בניית אסדה |
| עם גזע הארכה Med. | תומאס סיינטיפיק | 8847T08 | בניית אסדה |
| עם גזע הארכה Sm. | תומאס סיינטיפיק | 8847T02 | לבניית אסדה |
| , כלי, 60 גרם לחץ | קוהרנטי מדעי | 14121 | ציוד כירורגי |
| מחבר סגור | תומאס סיינטיפיק | 8847E25 | בניית אסדה |
| Covidien Sofsilk 2-0 שחור חתוך מראש 45 ס"מ קופסה של 24 | ציוד רפואי מומחה | S195 | חומרים מתכלים כירורגיים |
| בהתאמה אישית 250 מ"ל מסיר גז מעוטר | מותאם אישית מפוצץ כלי זכוכית Pty בע"מ | N/A | אסדה בניית מותאם |
| אישית 750 מ"ל מאגר | מותאם אישית מפוצץ כלי זכוכית Pty בע"מ | N/A | אסדה בניית |
| D-(+)-גלוקוז נטול מים SigmaUltra | Sigma-aldrich Pty Ltd | G7528-1Kg | כדי להפוך את Krebs Buffer |
| Dual Channel Console | ADInstruments | TS402 | Data Acquisition |
| צלוחיות Erlenmyer 2 L | |||
| מסנן מיקרופייבר מסוג GF/C סיבי זכוכית 47 מ"מ, 100 | Bio-strategy Pty Ltd | 1822047 | |
| מלקחיים, 15 ס"מ, 0.3 מ"מ, CRVD | Coherent Scientific | 14114 | ציוד כירורגי |
| ארבעה מהדקי שיניים עם זרוע ארוכה 9 מ"מ x 115 מ"מ להחזקת חפצים בקוטר 2-70 מ"מ. מצופה ויניל | Met-App Australia Pty Ltd | 1352 | |
| Rig Construction Heater Circulator. בקרת מצב מוצק דיגיטלית. (1020 וואט/240 וולט) | Thermoline Scientific | TU3 | אסדה בנייה |
| הפרין 5000 U/5 מ"ל קופסה 50 פייזר 02112115 | Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd | 1258693 | תרופות |
| איליום Xylazil 20 Inj 50 מ"ל | Cenvet Australia Pty Ltd | X5010 | הרדמה |
| ג'ונס הופקינס בולדוג מהדק | קוהרנטי מדעי | CS-WPI-14117 | |
| קטמין 100 מ"ג/50 מ"ל | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | הרדמה |
| מגנזיום סולפט heptahydrate AR 500 גרם Chemsupply | Bio Strategy Pty Ltd | MA048-500g | כדי להפוך את Krebs Buffer |
| נקבה מתאם צירים תומאס | סיינטיפיק | 8847V08 | בניית אסדה |
| Masterflex L/S ראש עומס קל לצינורות מדויקים, PPS, רוטור | CRSJohn Morris | 1015164 | Rig Construction |
| Metzenbaum מספריים, 11.5 ס"מ | קוהרנטי מדעי | WPI-501748 | ציוד כירורגי |
| מספריים מצנבאום, 14.5 ס"מ ישר | קוהרנטי | מדעי WPI-501252 | ציוד כירורגי |
| חומרת הרכבה F/2-HEADS SS | John Morris | 1014414 | ברגי הרכבה לראשי משאבה |
| מחבר פתוח | תומאס סיינטיפיק | 8847E05 | בניית אסדה |
| Paraformadehyde | סיגמא-אולדריץ' | P6148-500G | עיבוד דגימות |
| אשלגן כלורי (AnalaR NORMAPUR) 500 גרם | VWR כימיקלים | 26764.26 | להפוך את קרבס בופר |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי | Sigma-Aldrich Pty Ltd | P5379-500g | כדי להפוך את Krebs Buffer |
| Powerlab 2/26, מקליט 2 ערוצים + תוכנת Labchart | ADInstruments | ML826 | חומרה ותוכנה למחשב |
| דיוק XN חיישן זרימה מוטבע, 3.2 מ"מ (1/8 אינץ') ID ME4PXN-KR37 XF | ADInstruments | ME4PXN | אסדת בניית |
| אזמל עם ידית חד פעמית #11 pkt/10 | BSN רפואי (Aust) Pty Ltd | 73252-36 | |
| אטם סיליקון עבור Swinnex 47 מ"מ 5 / PK | Merck Millipore | SX0004701 | אסדה בניית |
| סיליקון O-טבעת 5-329 10 / PK | Merck Millipore | XX1104707 אסדת בניית | |
| יחיד בורט מהדק | תומאס סיינטיפיק | 8847T32 | אסדה בניית |
| החלקה כניסת מסנן נקבוביות גודל 10 ומיקרו; m (מבעבע) | Sigma-aldrich | 59277 | בניית אסדה |
| Sm. 360 מחבר סיבוב | תומאס סיינטיפיק | 8847E35 | בניית |
| אסדה נתרן ביקרבונט | Sigma-Aldrich Pty Ltd | S6297 - 250 גרם | לייצור |
| מחזיק מסנן Swinnex Buffer Krebs, 47 מ"מ | Merck Millipore | SX0004700 | מזרקי בניית אסדה |
| 1 מ"ל קופסה/100 | בקטון Dickinson Pty Ltd | 302100 | |
| מהדקי שלושה שיניים בקוטר 9 מ"מ x זרוע ארוכה 125 מ"מ ובורג תאום להחזקת 5-80 מ"מ | Met-App Australia Pty Ltd | 1356 | מודול מד זרימה צינורות לבניית אסדה |
| TS410 | ADמבנים | TS410 | צינורות רכישת נתונים |
| PVC 6.35 מ"מ קוטר x 9.52 מ"מ OD 50ft גליל 15.24 מ', שקוף, DEHP ללא פתלטים, דרגת מזון פוגשת REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0600 | בניית אסדה |
| צינורות PVC 7.94 מ"מ קוטר פנימי x 11.1 מ"מ OD 50ft גליל 15.24 מ', שקוף, DEHP ללא פתלטים, דרגת מזון פוגשת REAC | Thermo Fisher | NAL 8701-0900 | צינורות בניית אסדה |
| PVC 9.52 מ"מ קוטר פנימי x 12.7 מ"מ OD 100ft גליל | תרמו פישר | NAL 8701-4120 | מספריים לבניית אסדה |
| , 8.5 ס"מ, ישר, 7 מ"מ להבים | קוהרנטיים מדעיים | WPI-500-086 | ציוד |
| כירורגיאמבט מים 30 ליטר עם מגש תלוי | Thermoline Scientific | TLWB-30 | בניית אסדה |
מקורות
- Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
- Watson, A. J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
