מאמר שיטה

יישום ברקוד DNA לזיהוי צמחי מרפא

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66925

⸱

1 בנובמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, 2School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Institute of Herbgenomics, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בטכנולוגיית ברקוד DNA לאימות חומרים רפואיים מבוססי צמחים, ואת צמח המרפא Angelica sinensis (אוליב). דילס זוהה כדוגמה.

תקציר

צמחי מרפא הם משאבים יקרי ערך ברחבי העולם ומשמשים ברחבי העולם לשמירה על הבריאות ולטיפול במחלות; עם זאת, נוכחות של מהילה חוסמת את התפתחותם. ברקוד DNA, טכניקה לזיהוי מינים על ידי אזורי DNA סטנדרטיים, מאפשר זיהוי מהיר ומדויק של צמחי מרפא מסורתיים. תהליך ברקוד הדנ"א כולל שישה שלבים בסיסיים: 1) עיבוד צמחי המרפא, 2) מיצוי DNA כולל באיכות גבוהה מצמחי המרפא בשיטת עמודה צנטריפוגלית, 3) הגברת DNA המטרה אזור ספייסר פנימי משועתק 2 (ITS2) עם פריימרים אוניברסליים של צמחים וביצוע ריצוף סנגר, 4) שחבור ויישור רצף לקבלת רצף המטרה, 5) התאמת רצף הברקוד לספריית הברקוד לצורך זיהוי, 6) יישור רצף, השוואת שונות תוך-ספציפית ובין-ספציפית, בניית עץ פילוגנטי המחבר שכן. כפי שניתן לראות בתוצאות, הפריימר האוניברסלי יכול להגביר את אזור היעד. כלי חיפוש יישור מקומי בסיסי (BLAST) מדגים שהאחוז שזוהה היה 100%, והעץ המצטרף לשכן מדגים שרצפי השחבור קובצו עם הקלאדה A. sinensis OR879715.1, וערך התמיכה בקלייד הוא 100. פרוטוקול זה מספק התייחסות ליישום טכנולוגיית ברקוד DNA כשיטה יעילה לזיהוי צמחי מרפא ומהולים.

מבוא

לצמחי מרפא מגוון רחב של השפעות פרמקולוגיות והם חומרים חשובים לטיפול ומניעה של מחלות. הביקוש בשוק לצמחי מרפא בתרופות צמחיות ומוצרי תרופות הוא עצום ועדיין גדל. עם השוק הגובר של צמחי מרפא, הבעיה של מהילה הפריעה לפיתוח של צמחי מרפא. כיום, מהילה צמחי מרפא סובלת מהסיבות הבאות: 1) המורפולוגיה הדומה של צמחי המרפא מקשה על זיהויים והשימוש בהם נכון 1,2,3,4,5, 2) הביקוש הגובר לצמחי מרפא הוביל להיצע לא מספיק בשוק 6,73) צמחי מרפא הם יקרים ויש להם מחירים משתנים, והשימוש בעשבי תיבול זולים במקום בחומרים בעלי ערך כלכלי הוביל למהילה ולרווחי שוק 8,9. כדי לפתור את הבעיות של זיהוי נכון ושימוש בצמחי מרפא, יש צורך בטכנולוגיה המאפשרת ללא מומחים לזהות את המקור10.

ישנן מגבלות לזיהוי נכון ושימוש נכון בצמחי מרפא לפי מראה וריח בלבד11. לזיהוי מדויק יותר ובקרת איכות, שיטות פיסיקוכימיות משמשות12. כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC), למשל, היא שיטה מהירה לזיהוי צמחי מרפא ונכללת בפרמקופיאה הסינית. עם זאת, הוא דורש תקני ייחוס כדי לזהות את הצמחים13. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) יכולה לבצע בדיקות איכותיות וכמותיות כאחד, מה שהופך אותה למתאימה לבדיקת איכות הרפואה. עם זאת, מכשיר זה הוא יקר ודורש ידע מיוחד כדי להפעיל 14,15. טכנולוגיית ברקוד DNA היא טכנולוגיה מהירה ומדויקת לזיהוי מינים המזהה מינים באמצעות רצפי DNA יציבים כדי להבדיל בין צמחים בעלי מורפולוגיה דומה. Hebert et al. הציעו טכנולוגיית ברקוד DNA לזיהוי מינים, המשתמשת ברצף DNA מוכר וקצר יחסית בתוך הגנום16, Chen et al. הציעו את ITS2 כרצף אוניברסלי לזיהוי מולקולרי של צמחי מרפא וזיהו יותר מ 6600 צמחים ומצאו יכולת זיהוי גבוהה17. חקר צמחי מרפא המבוססים על מקטעי גנים ITS2 וכלורופלסט הוכיח את היכולת להבחין בין מינים ברמת המינים, עם יישומים בתחומי הגנת משאבים, תקנת שוק וסחר בינלאומי 17,18,19. היישום של ברקוד DNA יכול להתגבר על המגבלות של שיטות זיהוי מסורתיות, אשר מסייע להבטיח את האיכות והבטיחות של צמחי מרפא, מניעת ניצול לרעה של משאבים ובלבול20. זה הוכח מועיל לחקר צמחי מרפא, תמיכה בצמיחה של תעשיית הצמחים באופן בר קיימא, ומתן ערובה כי הצרכן משתמש בתרופה הנכונה 21,22,23,24.

המאמר מתאר פרוטוקולים כיצד ליישם ברקוד DNA לזיהוי צמחי מרפא באמצעות A. sinensis כדוגמה. ברקוד דנ"א משתמש בסמן גנטי קצר סטנדרטי אחד או יותר בדנ"א של אורגניזם כדי לזהות אותו כשייך למין מסוים. לשיטות הנוכחיות לזיהוי צמחי מרפא יש מגבלות מסוימות. זיהוי מורפולוגי מסורתי מסתמך במידה רבה על ניסיונם הרב של מומחים, אשר יכול להיות מושפע מגורמים אנושיים, בעוד זיהוי כימי נוטה לבעיות כמו מהילה של תרכובות מפתח. לעומת זאת, ברקוד DNA מספק אמצעי מדויק יותר לזיהוי מינים, ומציע יתרונות כגון מהירות, יכולת רבייה גבוהה ויציבות. יתר על כן, טכנולוגיה זו מאפשרת ניהול ושיתוף מרכזי של נתוני רצף מינים קיימים באמצעות האינטרנט ופלטפורמות מידע, ומשפרת משמעותית את היעילות והאמינות של זיהוי מינים11,12. בשל המורפולוגיה והחלקים הרפואיים הדומים שלהם, A. sinensis מבולבל לעתים קרובות עם מינים אחרים ולעתים קרובות נעשה בו שימוש לרעה או מוחלף בכוונה בשוק25. יאנג ועמיתיו זיהו את A. anomala באמצעות ברקוד DNA כדי להבדיל אותו מסמים מזויפים26. יואן ועמיתיו אספו 23 מינים של אנג'ליקה והשתמשו בברקוד דנ"א כדי להבדיל בין המינים השונים27. על-ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, משתמשים יוכלו לאמת חומרים רפואיים מבוססי צמחים משלב העיבוד המקדים ועד להתאמה הסופית של רצף הברקוד למסד הנתונים של הברקוד (איור 1).

פרוטוקול

1. הכנת מדגם

  1. המחקר הנוכחי השתמש ב- A. sinensis בן שנתיים עם טמפרטורה נמוכה ושמש ארוכה בגובה של 2800 מ 'ממחוז מין, מחוז גאנסו כחומרים ניסיוניים. נבחרו שלושה צמחים מהם נבחרו יותר משלושה שורשים לניסוי. שטפו תחילה את השורשים במים מעוקרים ולאחר מכן נקו אותם עם מרסס אלכוהול או מקלוני אלכוהול כדי למנוע זיהום שעלול להשפיע על דיוק תוצאות הניסוי. חותכים את השורשים לחתיכות קטנות מ -5 מ"מ באמצעות אזמל מעוקר ומערבבים לניתוח נוסף. (איור 2).
    הערה: לחלופין, הניחו את השורשים בחנקן נוזלי כדי להתחדד, מה שמקל על פירוקם. בהתאם לצורה, קשיות ומאפיינים אחרים של צמחי המרפא, השתמש במכשירים כדי להתמודד איתם.
  2. הכינו שלוש מבחנות של דגימות ניסוי לניסויים מקבילים. תייג כל דגימה כ- AS-1, AS-2 ו- AS-3. קחו כ-100 מ"ג רקמה טרייה או 20 מ"ג רקמה יבשה (מיובשת באוויר) והניחו אותה בצינור צנטריפוגה בנפח 2 מ"ל.
  3. הכניסו שני חרוזי נירוסטה בקוטר 5 מ"מ לצינורות הצנטריפוגות בנפח 2 מ"ל. העבר את הצינורות למטחנת רקמות בעלת תפוקה גבוהה הפועלת ב- 60 הרץ למשך 60 שניות.

2 מיצוי DNA מדגימה

הערה: מחקר זה משתמש בערכת מיצוי DNA גנומי של צמחים, המבוססת על שיטת CTAB. מיצוי DNA מתבצע על פי מדריך ההוראות עם כמה שינויים, כולל תוספת של מאגר בידוד גרעיני ייחודי (NIB). הפרוטוקול משפר את טוהר הדנ"א על ידי הפרדת המזהמים מהרקמה ולאחר מכן הוספת שלב בידוד גרעינים ראשוני 28,29,30.

  1. מוסיפים 800 μL של NIB מקורר מראש ומניחים את הדגימה על מערבל מערבולת, רוטט במשך 5 דקות.
  2. מניחים בצנטריפוגה ומעבדים במהירות של 13,780 x גרם למשך 10 דקות. הסר את supernatant.
  3. חזור על שלבים 2.1-2.2 במשך 3 סבבים נוספים.
    הערה: NIB מחלץ DNA באיכות גבוהה יותר, וההכנה שלו מכילה כמה כימיקלים מסוכנים שיש לטפל בהם במכסה אדים, מה שמקשה על טירונים להתמודד. עם זאת, צעד זה אינו חובה. משתמשים יכולים לבחור לעקוב אחר המלצה זו או לדלג על שלבים אלה. ניסוחו המפורט נמצא בטבלה 1.
  4. הוסף 600 μL של Buffer P1 ו 5 μL של RNase A (10 מ"ג / מ"ל). מניחים את הדגימה על מערבל מערבולת ומערבולת לערבוב. לדגור את הדגימות באמבט מים ב 65 ° C במשך 1.5 שעות, להפוך את הצינורות 2x-3x במהלך הדגירה.
  5. מוסיפים 200 μL של Buffer P2, מערבבים היטב, מניחים על קרח למשך 15 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 13,780 x גרם למשך 10 דקות.
  6. שאפו בזהירות את הסופרנאטנט על עמוד מסנן AF, צנטריפוגה בגודל 13,780 x גרם למשך 2 דקות, והעבירו את התסנין התחתון שנאסף בצינור האיסוף לצינור צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
  7. חשב את נפח התסנין, הוסף פי 1.5 נפח P3, ונער מיד כדי לקבל תמיסה מעורבת.
  8. מוסיפים 650 μL של התערובת המוכנה לעמוד ספיחה של עמוד ספיחה (AC) ודגרים במשך 5 דקות, ואז צנטריפוגה ב 13,780 x גרם במשך 30-60 שניות.
  9. הוסיפו שוב את התסנין שהתקבל משלב 2.8 למזגן, צנטריפוגה והשליכו את נוזל הפסולת. חזור על ההליך עם התמיסה המעורבת הנותרת משלב 2.7.
  10. הוסף 600 μL של תמיסת שטיפה WB, צנטריפוגה ב 13,780 x גרם במשך 30 שניות, להשליך את תמיסת הפסולת, ולחזור על התהליך 1x.
  11. החזירו את עמוד המזגן לצינור האיסוף הריק, לצנטריפוגה בגודל 13,780 x גרם למשך 2 דקות, והשאירו בטמפרטורת החדר כדי להסיר שאריות אתנול.
  12. קח את עמוד הספיגה AC ומניחים אותו בצינור צנטריפוגה נקי של 1.5 מ"ל. הוסף 45 μL של מים מעוקרים deionized (ddH2O) למרכז קרום סופח, אשר כבר מחומם ל 65 ° C. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב 13,780 x גרם למשך 2 דקות.
  13. הוסף את התמיסה המתקבלת בחזרה לעמוד ולצנטריפוגה במהירות של 13,780 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  14. אסוף את הפתרון המסונן. השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז ה- DNA; OD260 מייצג את הספיגה של חומצות גרעין. השתמש בקריטריונים הבאים עבור תקן קביעת איכות DNA: OD260/OD280=1.80-2.00, הטווח הנורמלי; OD260/OD280>2.00; יש כמות גדולה של זיהום RNA; OD260/OD280<1.80, ישנם חלבונים, פנולים ומזהמים אחרים.

3 הגברה וגילוי של שברי מטרה

הערה: בחר פריימרים מתאימים להגברה בהתבסס על אזורי ברקוד ה- DNA המוצעים של הצמח; תנאי התגובה מוצגים בטבלה 2.

  1. הגדר את תנאי התגובה המתאימים להגברת פריימר. השתמש בצינורות צנטריפוגות של 0.2 מ"ל מלאים ב- 9.5 μL של ddH2O, 12.5 μL של 2x PCR Master Mix, ו- 1 μL כל אחד של פריימר קדמי, פריימר הפוך ו- DNA של תבנית לנפח כולל של 25 μL. הכן בקרה שלילית, והחליף את התבנית במים.
  2. מוסיפים 20 מ"ל של חיץ 1x Tris Acetate-EDTA (TEA) ו-0.2 גרם אגרוז לחימום ומכינים ג'ל אגרוז 1%, ואז מוסיפים 2 μL של כתם ג'ל חומצת גרעין (10,000x) ומערבבים היטב. יוצקים את התערובת לתוך מגש יציקת ג'ל ומאפשרים לה להתמצק כדי לקבל את ג'ל האגרוז. הוסף 3 μL של מוצר PCR ו 2 μL של סמן DNA 5000 bp לג'ל.
  3. הגדר את המתח על 120 V, את הזרם על 400 mA, אלקטרופורזה למשך 40 דקות. השתמש במערכת ניתוח תמונות ג'ל רב-תכליתית כדי להציג ג'לים ולבדוק את התוצאות.

4. איסוף וניתוח נתונים

הערה: קיים מגוון רחב של תוכנות הרכבה וניתוח רצפים; אנו משתמשים בקוד קודון Aligner V11.0.1 ו- MEGA11 כדוגמאות להמחשה.

  1. השתמש ביישור כדי לפתוח את קובץ הרצף כדי לצפות במפת הפסגות ולפרוס את קובצי מפת הפסגות של הרצף הדו-כיווני.
    1. בחר צור פרוייקט חדש ולחץ על אישור כדי לעבור לדף הבית של התוכנה. בחר Add Samples בתפריט File, בחר את הקובץ שיעובד כתבנית מעקב אחר רצף, וייבא אותו ישירות לתוכנה כקובץ המיובא ב- Unassembled Samples.
    2. בחר Contig ולאחר מכן, במקטע, בחר הרכבה מתקדמת ולאחר מכן בחר הרכיב בקבוצות. משתמשים בפעם הראשונה, לאחר בחירת הרכיב בקבוצות, יראו את תיבת הדו-שיח הבאה: בחר הגדר שמות. שנה את חלקי השם לדוגמה Define בהתאם לשם הקובץ ולחץ על Assemble. הרצף המיושר יוצג.
    3. אחזר את רצפי ITS2 המלאים בהתאם לניתוח מודל מוסתר מבוסס מרקוב (HMM). השתמש ברצפים 5.8s (CGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCA) ו- 28s (CGACCCCAGGTCAGGCGGGGCCACC)31 כדי לחפש את הרצף המיושר מההתחלה כדי להסיר את האזורים 5.8s ו- 28s.
    4. בחר בצע, ולאחר מכן, במקטע, בחר רצף חיפוש ולחץ על אישור כדי לקבל את הרצף התואם. בחר Contig, בחר מחק במקטע כדי להסיר את אזורי 5.8s ו- 28s ואת הרצפים באיכות נמוכה, ולאחר מכן התוכנה תפיק את רצפי השחבור להתאמה.
  2. השתמש ברצפי השחבור שהתקבלו משלושת שלבי הניסוי המקבילים לזיהוי, בחר חיפוש BLAST באמצעות מסד הנתונים של הנוקלאוטידים במרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI), ובחר את כלי זיהוי המינים ואת פריימר ITS2 הספציפי המתאים במסד הנתונים Global Pharmacopoeia Genome Database (GPGD).
    הערה: NCBI32 ו- GPGD33 כוללים את רצפי הנוקלאוטידים של צמחי מרפא ובעלי חיים והם מוכרים כמאגרי מידע מוסמכים. שיטות הזיהוי העיקריות שלהם הן השיטות המבוססות על השוואת רצפים34 (BLAST). אחוז הזהות מתוצאות הזהות משמש כדי לקבוע אם המין בעל הדמיון הרב ביותר הוא סוג היעד.
  3. השתמש ב- MEGA11 ליישור רצפים, נתח והשווה שונות רצף תוך ספציפית ובין-ספציפית, ובנה עץ פילוגנטי המחבר שכן.
    1. הורד את הרצפים של שלושה מינים של אנג'ליקה ומין אחד של Peucedanum praeruptorum כקבוצת חוץ מ- NCBI. נתח רצפים אלה יחד עם רצף התוצאות המתקבל.
    2. לחצו על 'קובץ', בחרו 'פתח קובץ/הפעלה ' לייבוא הקובץ, ותיבת דו-שיח תופיע. בחר Align > DNA ובחר Align by ClustalW להשוואת רצפים. בחר ניתוח פילוגנטי בנתונים ולאחר מכן חזור לדף הבית. לחץ על בנה/בדוק עץ הצטרפות שכנים ב- PHYLOGENY. התוכנה מייצרת עץ פילוגנטי.

תוצאות

איכות DNA לדוגמה

טווח יחסי הספיגה של OD260/OD280 היה 1.80-1.84. כמות הדנ"א שנמדדה על ידי ספקטרופוטומטר עבור כל דגימה הייתה גדולה מ-100 ננוגרם/מיקרוליטר (טבלה 3), מה שמצביע על איכות טובה של מיצוי דנ"א דגימה. הדבר מצביע על כך שהדגימות לא זוהמו על ידי חלבון, RNA או ריאגנטים במהלך תהליך המיצוי וכי הן היו באיכות טובה ומתאימות להגברת PCR במורד הזרם.

ניתוח PCR

אלקטרופורזה בג'ל בוצעה על מוצר PCR של שלוש דגימות ניסוי מקבילות. ההגדרה הייתה: סמן, דגימות 1-3 (AS-1, AS-2, AS-3), ובקרה שלילית (0), כפי שמוצג באיור 3. הגדלים של AS-1, AS-2 ו-AS-3 הם כולם בין 500 bp עם פסים יחידים, בהירים ושקופים, ואין פסים ב-0, מה שמצביע על כך שהדנ"א שחולץ הוגבר ל-500 bp באמצעות פריימרים ITS2.

השוואת מסד נתונים של תוצאות רצף

תוצאות הריצוף זיהו את A. sinensis עם דמיון של 100% ברצף על ידי שילוב תוצאות זיהוי BLAST של מסד הנתונים NCBI, הזהה לתוצאות זיהוי המינים של מסד הנתונים GPGD (טבלה 4). תוצאת BLAST נקבעה באמצעות ציון הזהות הגבוה ביותר באחוזים והערך האלקטרוני הנמוך ביותר. זיהוי מינים נחשב מוצלח כאשר זהות האחוזים המקסימליים הגבוהה ביותר כללה מין בודד וקיבלה ציון של >99%. אם הציון הוא ≤ 99%, בדקו את איכות קובץ הריצוף או אם מוצר ה-PCR מזוהם.

ניתוח פילוגנטי מבוסס עצים של זיהוי מינים

התוצאות הראו כי בעץ הפילוגנטי שנבנה בניו ג'רזי, כל ארבעת המינים קובצו בקלאדיות נפרדות, וה-P. praeruptorum כקבוצת חוץ הופרד מקלאדות אנג'ליקה . רצפי השחבור קובצו עם A. sinensis OR879715.1 clade, וערך התמיכה בקלייד (bootstrap) היה 100, ואז שני המינים האחרים, A. dahurica, ו-A. cartilaginomarginata קובצו כל אחד בקלאדה נפרדת, מה שהוכיח שרצפי השחבור היו A. sinensis (איור 4).

figure-results-1
איור 1: תרשים זרימה לזיהוי מיני צמחי מרפא. (A) עיבוד הצמח, מיצוי דנ"א וריצוף של צמח מרפא, (B) השוואה של רצף מינים באמצעות מאגרי מידע, ו-(C) שימוש בעצים פילוגנטיים לצורך אימות טקסונומי כדי לאשר את היחסים הפילוגנטיים בין מינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תהליך עבודה של מיצוי דנ"א צמחי מרפא. (A) סה"כ 6 שלבים מעורבים בהפקת דנ"א מצמחי מרפא. (B) הגברה של מכשיר PCR ותהליך מחזור PCR. (C) אלקטרופורזה. (D) ריצוף סנגר וכרומטוגרמה של ריצוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אלקטרופורזה בג'ל של Angelica sinensis (אוליב.) דילים. באמצעות סמן DNA DL5000 כסמן מולקולרי, AS-1, AS-2 ו-AS-3 משמשים כדגימות, ו-0 כקבוצת ביקורת. אלקטרופורזה בג'ל בוצעה, והתוצאות הראו כי לדגימות AS-1, AS-2 ו- AS-3 היו רצועות ב- 500 bp, בעוד שהביקורת לא הראתה פסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: עץ פילוגנטי שכן-מצטרף שנוצר מ-13 רצפים. בסך הכל הורדו 10 רצפים מארבעה מיני צמחים ממסד הנתונים של NCBI, ורצפי השחבור הושוו כדי לנתח ולהשוות שונות רצפים תוך-ספציפיים ובין-ספציפיים ולבנות עצים פילוגנטיים המצטרפים זה לזה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שם החומר/ציודמנה
פוליוויניל פירולידון10 גרם
Tris-HCl1 מטר 50 מ"ל
חומצה Ethylenediaminetetraacetic0.5 מטר 20 מ"ל
NaCl20.45 גרם
β-מרקפטואתנול10 מ"ל
מים מעוקרים שעברו דה-יוניזציה500 מ"ל

טבלה 1: ריאגנטים לניסוח חיץ בידוד גרעיני.

ברקודתחלרצף פריימר (5'-3')ריצוף הגברה PCR
ITS2R:3RGACGCTTCTCCAGACTACAAT94°C5 דקות
94°Cשנות ה-3040מחזורים
56°Cשנות ה-30
F:2FATGCGATACTTGGTGTGAAT72°C45 שניות
72°C10 דקות

טבלה 2: פריימרים לברקוד DNA ותנאי תגובת PCR.

דגימותמיצוי DNA (ng/μL)OD260/OD280
AS-11241.84
AS-21841.81
AS-31641.82

טבלה 3: Angelica sinensis (אוליב.) דיזלים חילצו איכות DNA.

דגימותאורך רצף מיושר (bp)אורך רצף שחבור (bp)GC(%)NCBI:אחוז פיצוץ (%)GPGD:אחוז זיהוי מינים (%)
AS-1500 נ"ב229bp55.50%100%100%
AS-2504bp229bp55.50%100%100%
AS-3499bp229bp55.50%100%100%

טבלה 4: השוואת מסד נתונים של תוצאות רצף.

דיון

טכנולוגיית זיהוי מולקולרית קלה יותר ללמידה ולשליטה מאשר שיטות זיהוי מסורתיות. הוא מתגבר על מגבלות הזיהוי המסורתי של צמחי מרפא, שכן הוא אינו מושפע משלב הצמיחה של הצמח ואינו מסתמך על שיפוט סובייקטיבי או על צבירת מומחיות מיוחדת35 . מינים אחרים מבולבלים עם A. sinensis בשל המורפולוגיה והחלקים הרפואיים הדומים שלו, אך עם השימוש ברקוד DNA, ניתן לזהות אותו בוודאות36.

השלבים המרכזיים בפרוטוקול זה כרוכים במספר שיקולים קריטיים. ראשית, הימנעות מזיהום בעת טיפול בעשבי תיבול ומיצוי DNA חיונית כדי למנוע מדנ"א זר או זיהומים לסכן את התוצאות. ניקוי נכון של הדגימות נחוץ כדי להסיר מזהמים חיצוניים, בעוד כתישה יסודית משפרת את מיצוי ה- DNA על ידי הגדלת שטח הפנים לאינטראקציה מגיב. חשוב גם להשתמש בכמות מתאימה של דגימה כדי להבטיח ערבוב יעיל עם ריאגנטים, המאפשר ציטוליזה טובה יותר ושחרור DNA. לבסוף, שליטה בזמן אמבט המים היא קריטית, שכן חימום מוגזם יכול להוביל לפירוק DNA, המשפיע על איכות ה- DNA שחולץ. יחד, צעדים אלה מבטיחים מיצוי מוצלח של DNA באיכות גבוהה לניתוח.

צמחי מרפא מכילים פוליסכרידים ופוליפנולים המשפיעים על מיצוי והגברה של DNA. השימוש במאגר בידוד גרעיני מפחית את ההשפעה של חומרים אלה ומאפשר ליזה גרעינית, וכתוצאה מכך מיצוי טוב יותר של gDNA 28,29,30 בעל טוהר גבוה. כיום קיימות שלוש שיטות עיקריות למיצוי DNA: שיטת העמודה הצנטריפוגלית, שיטת CTAB ושיטת SDS. עם זאת, מחקר זה בחר בשיטת העמודה הצנטריפוגלית לניסויים בשל יציבותה, פשטותה, יעילותה ויכולתה לחלץ ריכוזים גבוהים של DNA37, וחימום חיץ האלוטיון יכול לסייע באיתור DNA באיכות טובה יותר. כאן, מחקר זה בחר פריימרים ספציפיים ל-ITS217,38, רצף ITS2 הקצר משמש כתג רצף טקסונומי יעיל בהשוואה לפריימרים39 האחרים, בעלי שונות בין-ספציפית גבוהה וטווח רחב יותר של זיהויים. הסיבה האפשרית לכשל ההגברה היא התפרקות DNA בחלק מהדגימות; אפשרות נוספת היא שזוג הפריימרים האוניברסליים של ITS2 שבהם נעשה שימוש עשויים שלא לעבוד עבור מינים מסוימים או להשתמש בערכה החלופית של פריימרים אוניברסליים40. תוצאת BLAST נקבעה באמצעות ציון הזהות הגבוה ביותר באחוזים והערך האלקטרוני הנמוך ביותר. זיהוי מינים נחשב מוצלח כאשר האחוז המקסימלי הגבוה ביותר כלל מין בודד וקיבל ציון >99%40,41, עבור הציון ≤99%, בדקו את איכות קובץ הריצוף או האם מוצר ה-PCR מזוהם.

לסיכום, ברקוד DNA צריך לשחק תפקיד מפתח בבקרת האיכות של רפואת צמחים מסורתית וסחר צמחי מרפא בינלאומי. מאמר זה מספק כמה תובנות לגבי מיצוי דנ"א של צמחים ומדריך מפורט לשימוש בטכנולוגיית ברקוד דנ"א לזיהוי צמחי מרפא. הוא מדגיש את נקודות המפתח שיש לציין במהלך תהליך הניסוי. לפיכך, מאמר זה מספק הפניות לזיהוי צמחי מרפא בסיסי ומסייע ליותר אנשים לשלוט במהירות בטכנולוגיה. עם זאת, במקרים מיוחדים שבהם היעילות של זיהוי ברקוד מוקד יחיד אינה מספקת, הדבר תלוי בספריית העיון. בניית ספריית ייחוס עם כיסוי מינים גבוה תהיה צעד גדול לקראת זיהוי מינים באמצעות ברקודי DNA42, וחוקרים רבים הציעו כי טכנולוגיית ברקוד רב-לוקוס יכולה לשפר את היעילות 43,44. בנוסף, עם התפתחות הטכנולוגיה המולקולרית, Zheng et al. שילבו טכנולוגיית ברקוד DNA עם טכנולוגיית הגברה איזותרמית של DNA וזיהוי RPA-LFD כדי לאמת במהירות צמחים רעילים45 וכמה ערכות מדף פותחו גם46. מאגר ברקוד ה- DNA משתפר ללא הרף, מה שממלא תפקיד חשוב בקידום הכללה, סטנדרטיזציה ובינאום של שיטות הזיהוי של רפואת צמחים.

גילויים

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הצגת האדם המוכשר מחקר מדעי להתחיל מימון פרויקט סבסוד של אוניברסיטת צ'נגדו לרפואה סינית מסורתית (030040015).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת מיצוי DNA גנומי של צמח CTABשנחאי Huiling Biotechnology Co.NG411Mמתאים למיצוי מהיר של DNA גנומי באיכות גבוהה מרקמות שונות של מגוון רחב של צמחים
DL5000 DNA MarkerNanjing vazyme Bio-technology Co.MD102-02מוצר מוכן לשימוש, יש ליטול כמות מתאימה של מוצר זה ישירות לאלקטרופורזה בעת הפעלת הג'ל.
אלקטרופורזהבייג'ינג Liuyi ביוטכנולוגיה ושות'.DYY-6Cלאמץ עיצוב מסך מגע, יכול להציג מתח מוגדר, להגדיר זרם בו זמנית, פלט מקביל
Ethylenediaminetetraacetic חומצהBeijingpsaitongBiotechnologyCo., LtdE70015-100Gריאגנטים לניסוח מאגר בידוד גרעיני.
Goldview כתם ג'ל חומצת גרעין (10,000&)Yisheng Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd10201ES03כאשר משתמשים באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז לזיהוי DNA, הוא נקשר ל-DNA ומייצר אות פלואורסצנטי חזק.
צנטריפוגה שולחנית במהירות גבוההצ'אנגשה היי-טק אזור פיתוח תעשייתי Xiangyi צנטריפוגה מכשיר ושות'.H1650להפרדה מהירה ויעילה של דגימות, צנטריפוגה קומפקטית וקלת משקל זו מציעה בטיחות אמינה
מטחנת רקמות בתפוקה גבוההשנחאי Jingxin פיתוח תעשייתי ושות'.Tiss-48מכשיר רטט בתדר גבוה לטחינת דגימות
http://www.gpgenome.com/המכון לרפואה סינית, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית-מסדהנתונים של HerbGenomics כולל רצפי גנום, ערכות גנים, גנומים של אברונים, נתוני גנום בכיסוי נמוך ורצפי ברקוד DNA.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/הספרייה הלאומית לרפואהשלב - המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי מקדם את המדע והבריאות על ידי מתן גישה למידע ביו-רפואי וגנומי.
Kylin-BellHaimen Qilinbel Instrument Manufacturing Co.VORTEX-5ערבוב מהיר בצורה של מערבולת במהירות גבוהה, מהירות ערבוב, אחידות, יסודיות
LifeTouchHangzhou BORI Technology Co.TC-96/G/H(b)Bאימוץ טכנולוגיית קירור תרמו-אלקטרית מתקדמת וטכנולוגיית TAS שנוצרה לאחרונה כדי לשפר את הביצועים הכוללים שלה
מערכת ניתוח תמונות ג'ל רב תכליתיתמרכז התפעול הדרום-מערבי של שנחאי Tianneng Life Science Co.טאנון-מיני ספייס 2000מבצעת ניסויי הגברה מהירה של גנים עם פונקציית שיפוע למיפוי תנאי הגברה וטווח טמפרטורות שיפוע של עד 30 מעלות; C
NaClבייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מS8210-100ריאגנטים לניסוח מאגר בידוד גרעיני.
ננו-דרופ וואןג'נס בע"מND ONEכמת דגימות DNA, RNA וחלבון תוך שניות עם 1-2 ומיקרו בלבד; L של מדגם
פוליוויניל פירולידוןשנחאי yuanye ביו-טכנולוגיה ושות', בע"מS30268-500gריאגנטים לניסוח מאגר בידוד גרעיני.
יצרנית קרח פתיתי שלגשנחאי Zhixin Experimental Instrument Technology Co.ZX-60Xאימוץ שיטת ייצור קרח שחול סיבובי, מהירות ייצור קרח מהירה ויעילות גבוהה של ייצור קרח
חרוזי נירוסטה להומוגניזטור רקמותBeyotime Biotechnology. F6623ציוד לטחינה וערבוב של רקמות ודגימות אחרות על ידי רטט
Tris Acetate-EDTA bufferBeyotime Biotech IncST716TAE הוא מאגר נפוץ לאלקטרופורזה של DNA, המשמש לעתים קרובות באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.
Tris-HClבייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מT8230ריאגנטים לניסוח מאגר בידוד גרעיני.
אמבט מים קומקוםשנחאי Senxin Experimental Instrument Co.DK-8Dתרמוסטט מדויק וויסות טמפרטורה, בקרת טמפרטורה מדויקת ואמינה
ובטא;-מרקפטואתנולשנחאי Eon Chemical Technology Co.R054186-100 מ"ל   ריאגנטים לניסוח מאגר בידוד גרעיני.
ארה"

מקורות

  1. Chen, S. L., et al. Conservation and sustainable use of medicinal plants: Problems, progress, and prospects. Chin Med. 11, 37(2016).
  2. Han, J., et al. An authenticity survey of herbal medicines from markets in China using DNA barcoding. Sci Rep. 6, 18723(2016).
  3. Zhang, W., et al. Integration of high-throughput omics technologies in medicinal plant research: The new era of natural drug discovery. Front Plant Sci. 14, 1073848(2023).
  4. Ji, C., et al. Determination of the authenticity and origin of panax notoginseng: A review. J AOAC Int. 105 (6), 1708-1718 (2022).
  5. Parveen, I., Techen, N., Khan, I. A. Identification of species in the aromatic spice family apiaceae using DNA mini-barcodes. Planta Med. 85 (2), 139-144 (2019).
  6. Techen, N., Parveen, I., Pan, Z., Khan, I. A. DNA barcoding of medicinal plant material for identification. Curr Opin Biotechnol. 25, 103-110 (2014).
  7. Xiong, Y., et al. Market access for Chinese herbal medicinal products in Europe-a ten-year review of relevant products, policies, and challenges. Phytomedicine. 103, 154237(2022).
  8. Virk, J. K., Gupta, V., Kumar, S., Singh, R., Bansal, P. Ashtawarga plants - suffering a triple standardization syndrome. J Tradit Complement Med. 7 (4), 392-399 (2017).
  9. An, Y. L., Wei, W. L., Guo, D. A. Application of analytical technologies in the discrimination and authentication of herbs from fritillaria: A review. Crit Rev Anal Chem. 54 (6), 1775-1796 (2024).
  10. Li, M., Cao, H., But, P. P. H., Shaw, P. C. Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes. J Systemat Evolut. 49 (3), 271-283 (2011).
  11. Khan, A., et al. Herbal spices as food and medicine: Microscopic authentication of commercial herbal spices. Plants (Basel). 13 (8), 1067(2024).
  12. Techen, N., Crockett, S. L., Khan, I. A., Scheffler, B. E. Authentication of medicinal plants using molecular biology techniques to compliment conventional methods. Curr Med Chem. 11 (11), 1391-1401 (2004).
  13. Sasidharan, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M., Yoga Latha, L. Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants' extracts. Afr J Tradit Complement Altern Med. 8 (1), 1-10 (2011).
  14. Wei, Y., et al. Identification techniques and detection methods of edible fungi species. Food Chem. 374, 131803(2022).
  15. Mehle, N., Trdan, S. Traditional and modern methods for the identification of thrips (thysanoptera) species. J Pest Sci. 85 (2), 179-190 (2012).
  16. Hebert, P. D., Cywinska, A., Ball, S. L., Dewaard, J. R. Biological identifications through DNA barcodes. Proc Biol Sci. 270 (1512), 313-321 (2003).
  17. Chen, S., et al. Validation of the its2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species. PLoS One. 5 (1), e8613(2010).
  18. Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (its) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (49), 19641-19646 (2011).
  19. Raskoti, B. B., Ale, R. DNA barcoding of medicinal orchids in asia. Sci Rep. 11 (1), 23651(2021).
  20. Chen, S., et al. DNA barcoding in herbal medicine: Retrospective and prospective. J Pharm Anal. 13 (5), 431-441 (2023).
  21. Pei, Y., et al. Whole-genome sequencing in medicinal plants: Current progress and prospect. Sci China Life Sci. 67 (2), 258-273 (2024).
  22. Zhu, S., Liu, Q., Qiu, S., Dai, J., Gao, X. DNA barcoding: An efficient technology to authenticate plant species of traditional chinese medicine and recent advances. Chin Med. 17 (1), 112(2022).
  23. Pang, X., Shi, L., Song, J., Chen, X., Chen, S. Use of the potential DNA barcode its2 to identify herbal materials. J Nat Med. 67 (3), 571-575 (2013).
  24. Ajmal Ali, M., et al. The changing epitome of species identification - DNA barcoding. Saudi J Biol Sci. 21 (3), 204-231 (2014).
  25. Peng, H., Chen, G., Ou, L. L., Luo, M., Zhang, C. Development of a new efficient scar marker for authentication of Angelica sinensis, an important traditional Chinese medicine. Scienceasia. 47 (6), 751-757 (2021).
  26. He, Y., et al. Authentication of Angelica anomala avé-lall cultivars through DNA barcodes. Mitochondrial DNA. 23 (2), 100-105 (2012).
  27. Yuan, Q. J., et al. Identification of species and materia medica within Angelica l. (umbelliferae) based on phylogeny inferred from DNA barcodes. Mol Ecol Resour. 15 (2), 358-371 (2015).
  28. Xie, P. J., Ke, Y. T., Kuo, L. Y. Modified ctab protocols for high-molecular-weight DNA extractions from ferns. Appl Plant Sci. 11 (3), e11526(2023).
  29. Stefanova, P., Taseva, M., Georgieva, T., Gotcheva, V., Angelov, A. A modified ctab method for DNA extraction from soybean and meat products. Biotech Biotechnol Equipment. 27 (3), 3803-3810 (2013).
  30. Li, Z., Parris, S., Saski, C. A. A simple plant high-molecular-weight DNA extraction method suitable for single-molecule technologies. Plant Meth. 16, 38(2020).
  31. Keller, A., et al. 5.8s-28s rrna interaction and hmm-based its2 annotation. Gene. 430 (1-2), 50-57 (2009).
  32. Morgulis, A., et al. Database indexing for production megablast searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
  33. Liao, B., et al. Global pharmacopoeia genome database is an integrated and mineable genomic database for traditional medicines derived from eight international pharmacopoeias. Sci China Life Sci. 65 (4), 809-817 (2022).
  34. Ghahramanlu, A., Rezaei, M., Heidari, P., Balandari, A. Species survey of iranian barberry genotypes using ITS2 sequences and basic local alignment search tools. Erwerbs-Obstbau. 65, 2491-2499 (2023).
  35. Han, K., Wang, M., Zhang, L., Wang, C. Application of molecular methods in the identification of ingredients in Chinese herbal medicines. Molecules. 23 (10), 2728(2018).
  36. Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J., Chen, S. A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix (danggui) and its products. Sci Rep. 6, 34940(2016).
  37. Chen, R., et al. DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines. Sci Rep. 2, 958(2012).
  38. Hou, D. Y., et al. Molecular identification of corni fructus and its adulterants by ITS/ITS2 sequences. Chin J Nat Med. 11 (2), 121-127 (2013).
  39. Han, J., et al. The short ITS2 sequence serves as an efficient taxonomic sequence tag in comparison with the full-length its. Biomed Res Int. 2013, 741476(2013).
  40. Trujillo-Argueta, S., Del Castillo, R. F., Velasco-Murguía, A. Testing the effectiveness of rbcla DNA-barcoding for species discrimination in tropical montane cloud forest vascular plants (oaxaca, mexico) using blast, genetic distance, and tree-based methods. PeerJ. 10, e13771(2022).
  41. Marizzi, C., et al. DNA barcoding brooklyn (new york): A first assessment of biodiversity in marine park by citizen scientists. PLoS One. 13 (7), e0199015(2018).
  42. Antil, S., et al. DNA barcoding, an effective tool for species identification: A review. Mol Biol Rep. 50 (1), 761-775 (2023).
  43. Pang, X., et al. Utility of the trnh-psba intergenic spacer region and its combinations as plant DNA barcodes: A meta-analysis. PLoS One. 7 (11), e48833(2012).
  44. Tripathi, A. M., et al. The internal transcribed spacer (its) region and trnh-psba [corrected] are suitable candidate loci for DNA barcoding of tropical tree species of India. PLoS One. 8 (2), e57934(2013).
  45. Zheng, X. S., An, W. L., Yao, H., Xu, J., Chen, S. L. Rapid authentication of the poisonous plant Gelsemium elegans by combining filter-paper-based DNA extraction and rpa-lfd detection. Engineering. 7 (1), 14-16 (2021).
  46. Jiang, C., et al. Barcoding melting curve analysis for rapid, sensitive, and discriminating authentication of saffron (Crocus sativus l.) from its adulterants. Biomed Res Int. 2014, 809037(2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

DNAITS2BLAST

מאמרים קשורים