מאמר שיטה

התאמה זולה של כור מיקרוגל מסחרי לסינתזה של פפטידים בשלב מוצק

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66937

⸱

22 בנובמבר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

במאמר זה

סיכום

מוצג מכשיר פשוט, זול וחדשני לביצוע סינתזות פפטיד פאזה מוצקה בכור מיקרוגל מסחרי.

תקציר

מוצג מכשיר ביתי לביצוע סינתזת פפטיד פאזה מוצקה (SPPS), בסיוע הקרנת מיקרוגל וחימום. בניגוד לכלי תגובה SPPS קונבנציונליים, המנקזים ממס ותוצרי לוואי באמצעות פריט הממוקם בתחתית הכלי, המנגנון המוצג משתמש בצינור פיזור גז תחת ואקום כדי להסיר ממס, תוצרי לוואי ועודפי ריאגנטים. אותו צינור פיזור גז מספק תסיסה של גז חנקן של חרוזי SPPS במהלך שלבי התגובה של צימוד וביטול הגנה. חימום מיקרוגל מועיל לצימודי SPPS של שאריות מעוכבות סטרית, כגון חומצה אלפא-אמינואיזובוטירית (Aib), שאריות חומצות אמינו אלפא, אלפא-דיאלקיליות. מכשיר ביתי זה שימש להכנה, באמצעות שיטות Fmoc SPPS ידניות, פפטידים הפטמריים ואוקטמריים הנשלטים על ידי שאריות ה-Aib, אשר ידוע לשמצה שקשה לחבר בתנאי טמפרטורת החדר הסטנדרטיים וריאגנטים. יתר על כן, כורי מיקרוגל מסחריים טיפוסיים SPPS מוקדשים אך ורק לסינתזה של SPPS מה שהופך אותם לבלתי נגישים למשתמשים שאינם SPPS. לעומת זאת, המנגנון המוצג שומר על הרבגוניות של כור המיקרוגל להאצת מיקרוגל קונבנציונלית של תגובות כימיות, מכיוון שהמנגנון מוסר באופן טריוויאלי מכור המיקרוגל המסחרי.

מבוא

הצגתו של מריפילד של סינתזת פפטיד פאזה מוצקה SPPS בשנות ה-60 חוללה מהפכה בפפטידים ובסינתזות כימיות וזכתה בצדק בפרס נובל לכימיה 1,2. בעשורים שלאחר מכן, חוקרים רבים שיפרו את הטכניקות המקוריות של מריפילד, מה שהוביל לשתי חלופות השולטות בשיטות SPPS: מבוסס פלואורנילמתוקסיקרבוניל (FMOC) לעומת מבוסס טרט-בוטיל אוקיקרבוניל (BOC)3. פיצול סופי של הפפטיד משרף מוצק ב-FMOC דורש קוקטייל המכיל חומצה טריפלואוראצטית, בהשוואה ל-HF עבור טכניקות BOC, מה שהופך שיטות מבוססות FMOC לבחירה המועדפת על מעבדות רבות.

שיטות SPPS חדישות מאותגרות מדי פעם על ידי רצפים רצויים. בשנים האחרונות חלה התקדמות המתגברת על כמה חששות אידיוסינקרטיים של צבירה4, היווצרות דיקטופיפרזין5 ושאריות חומצות אמינו N-מתילציה6. במאמץ לייעל את תפוקת הצימוד, נחקרו אלפי ריאגנטים ותוספים לצימוד7. באופן ספציפי, הפעלת חומצה קרבוקסילית באמצעות COMU 8,9 או פלואורידים חומציים 10,11,12, יחד עם תוספים כגון אוקסימה13 והידרוקסיבנזוטריאזול (HOBt), פותחו עבור צימודים מאתגרים במיוחד כגון אלה הכוללים שאריות α,α דיאלקיליות.

שיטות אחרות שאינן מבוססות ריאגנטים שימשו כדי להגדיל את התפוקות עבור צימודים קשים, כולל זמני תגובה ממושכים, "צימוד כפול" וחימום, במיוחד חימום מיקרוגל 14,15,16. ואכן, סינתיסייזרים פפטידים אוטומטיים זמינים מסחרית המשתמשים בחימום מיקרוגל הם בין היחידות המצליחות ביותר מבחינה מסחרית בשוק מכיוון שהם מאיצים את קצב התגובה, נראה שהם משפרים את הטוהר הסופי של פפטידים וממזערים פסולת ממסים. למרבה הצער, יחידות אלו יכולות להיות יקרות, ועולות למעלה מ-100,000 דולר במקרים מסוימים.

למעבדה שלנו יש אינטרסים בהכנת וריאציות של פפטידים המכילים שאריות הליקוגניות חזקות של חומצה אלפא-אמינואיזובוטרית (Aib)17,18,19. בשל המכשול הסטרי הנובע מהדיאלקילציה של האלפא-פחמן שלו, קשה מאוד לזווג את אייב. השיטות שהוזכרו לעיל (פלואורידים חומציים, חימום מיקרוגל20), כמו גם כימיה חכמה של SPPS "דיפפטיד"21, שימשו להתאמת SPPS לאתגרי הצימוד של Aib. הכנה מחוץ לשרף של דימרים Aib, תוך שיפור התפוקה הכוללת, דורשת כימיה רטובה נוספת וטמפרטורות גבוהות (50 מעלות צלזיוס)21. יתר על כן, נמנענו משימוש בפלואורידים חומציים של Aib בשל האופי הרעיל של חומרים מפליריים. למרבה הצער, במעבדה שלנו חסר סינתיסייזר SPPS אוטומטי ייעודי מבוסס מיקרוגל, עם כלי תגובה ייעודיים לניקוז הדרוש של תוצרי לוואי של SPPS. אף על פי כן, דו"ח שפורסם לאחרונה מקבוצתו של קליידן שהראה הצלחה מסחררת בהכנת אוליגומרים מבוססי Aib באמצעות SPPS וקרינת מיקרוגל22 עורר אותנו להתאים את יחידת המיקרוגל CEM Discover SP של המעבדה שלנו לסינתזות SPPS.

תחילה חקרנו את האביזר הזמין מסחרית של CEM להמרת כור המיקרוגל ליחידת SPPS/מיקרוגל ידנית23. מלבד העלות, אביזר זה ידרוש את המחויבות של יחידת המיקרוגל שלנו ל- SPPS ידני בלבד . למשתמשי מעבדה אחרים לא תהיה עוד גישה ליכולות המצוינות של יחידת המיקרוגל. לפיכך, מימוש האביזר המסחרי נחשב פסול בענייננו.

במקום זאת, הרכבנו, באמצעות רכיבים זולים יחסית, מכשיר לביצוע SPPS בסיוע מיקרוגל בקנה מידה מילימולר. הפרוטוקול שלהלן מתאר שימוש ברכיבים פשוטים וזולים יחסית כדי להשפיע על SPPS ידני בסיוע מיקרוגל.

פרוטוקול

1. הרכיבו את המכשיר (איור 1)

הערה: כל הרכיבים להרכבת המכשיר נמצאים בטבלת החומרים.

  1. הרכיבו את שקע הוואקום.
    1. חבר צינורות טפלון בגודל 2 אינץ' מתוך 1/8 אינץ' לצד ימין של ה"טי" (איור 1, חלק שכותרתו "1") עשוי אתילן טטרפלואורואתילן (ETFE).
    2. חבר את צינור הטפלון בגודל 1/8 אינץ' לשסתום (איור 1, חלק שכותרתו "2") עשוי ETFE.
    3. חבר 100 ס"מ של צינורות טפלון לצד השני של השסתום (איור 1, חלק שכותרתו "2").
    4. הכנס את הצינור הזה דרך פתח 1/8 אינץ' של פקק גומי והשתמש בפקק זה כדי לכסות בקבוק ארלנמאייר זרוע בצד (איור 1A, חלק שכותרתו "8") המחובר לוואקום (משאבה ביתית או צנועה).
  2. הרכיבו את כניסת גז החנקן.
    1. חבר 2 אינץ' של צינורות טפלון בגודל 1/8 אינץ' לצד שמאל של ה-ETFE "טי" (איור 1, חלק שכותרתו "1").
    2. חבר את צינור הטפלון בגודל 1/8 אינץ' לשסתום ETFE (איור 1, חלק שכותרתו "3").
    3. חבר 100 ס"מ של צינורות טפלון בגודל 1/8 אינץ' לצד השני של שסתום ה-EFTE (איור 1, חלק שכותרתו "3").
    4. השחילו את הקצה הרחוק של צינור הטפלון בגודל 1/8 אינץ' דרך פקק גומי והשתמשו בפקק זה כדי להתחבר לצינור טיגון המחובר לגליל חנקן המצויד בווסת (איור 1A, חלק שכותרתו "7").
    5. כששסתום המחט של הרגולטור סגור, השתמש בשסתום הסרעפת של הרגולטור (איור 1A, חלק שכותרתו "7"). כדי להשיג לחץ של 5-10 psi.
  3. הרכיבו את השואב/מבעבע.
    1. חבר את הגבעול של ה"טי" (איור 1, חלק שכותרתו "1") באורך 100 ס"מ של צינורות טפלון OD בגודל 1/8 אינץ'.
    2. הכניסו את הצינור הזה דרך מיקרו-מחיצה (איור 1, חלק שכותרתו "6") שקודם לכן נוקב במחט.
    3. הכנס את הצינור עד הסוף לתוך צינור פיזור גז. השתמש במיקרו-מחיצה כדי ליצור אטימה בין צינור פיזור הגז (איור 1, חלק המסומן "4") לבין צינורות הטפלון.
    4. הכנס את צינור פיזור הגז לתוך מיכל התגובה של המבחנה (איור 1, חלק שכותרתו "5"), והנח את המבחנה לתוך המחזיק שלה (בתמונה באיור 1B), החיצוני לכור המיקרוגל.
      הערה: במהלך תגובות כימיות, המבחנה תוכנס לכור המיקרוגל. במהלך הוספת תמיסות תגובה ושטיפות ממס, המבחנה מוחזקת חיצונית לכור המיקרוגל.
  4. חבר את מנחת הכלי הפתוח לכור המיקרוגל. המנגנון אמור להיות מוכן כעת לשימוש.

2. הכן ריאגנטים

  1. הכן תמיסות חומצות אמינו FMOC. עבור קנה מידה של 0.100 מילימול, הכן 0.2 M FMOC-AA-OH ב-DMF. כל מחזור צימוד ישתמש ב-2.5 מ"ל של תמיסות חומצות האמינו.
  2. הכן מגיב צימוד diisopropylcarbodiimide (DIC). הכן 1.0 M DIC ב-DMF. כל צימוד ישתמש ב-1.0 מ"ל של תמיסת DIC.
  3. הכן תמיסת תוסף Oxyma Pure. הכן 0.5 M אוקסימה ב-DMF. כל צימוד ישתמש ב-1.0 מ"ל של תמיסת אוקסימה.
  4. הכן פתרון הגנה. הכן תמיסת 20% v/v morpholine/DMF. כל ריצת ביטול הגנה דורשת 7 מ"ל של פתרון. בצע שתי ריצות ביטול הגנה עבור כל ביטול הגנה של fmoc.

3. הכנת שרף פפטיד

  1. מדוד את המסה המתאימה של שרף SPPS Wang, 100-200 רשת, פוליסטירן צולב עם 1% דיווינילבנזן והנח את השרף היבש לתוך כלי התגובה של המבחנה. לדוגמה, עבור סינתזה בקנה מידה של 0.100 מילימול, שרף עם עומס של 0.500 מילימול גרם-1 ידרוש 200 מ"ג שרף.
  2. הוסף 3 מ"ל של ממס DMF לשרף ונפח את השרף בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. עבור שלב זה, ודא שאספקת גז החנקן "מופעלת/פתוחה" לערבוב, ושסתום הוואקום (איור 1, מסומן "2") "כבוי/סגור". השתמש בשסתום המחט של אספקת החנקן (איור 1A, מסומן 7) כדי להשיג בעבוע עדין בתוך התמיסה.
    הערה: הגדרה זו צריכה להתאים לכל תסיסה נוספת על ידי גז החנקן.
  3. לאחר 15 דקות של נפיחות השרף, שאפו ממס DMF בוואקום: סגור את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3"). פתח את השסתום לוואקום (איור 1, מסומן "2") ושאף ממס DMF. כאשר הממס כמעט מוסר, פתח את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3").
  4. חזור על שלבים 3.2 ו-3.3 פעמיים כדי לנפח את השרף במלואו.

4. הסרת FMOC

הערה: שרפים זמינים טעונים מראש עם מגוון חומצות אמינו מוגנות FMOC הטעונות מראש כשאריות מסוף C. לכן, הסרת FMOC היא בדרך כלל הצעד הראשון לאחר נפיחות השרף.

  1. כאשר כלי התגובה של המבחנה חיצוני לכור המיקרוגל ושסתום הוואקום (איור 1, מסומן "2") סגור, הוסף 7 מ"ל של 20% פיפרידין/DMF או 20% מורפולין/DMF ישירות למבחנה.
  2. הפעילו את שסתום החנקן (איור 1, מסומן "3") כדי לעורר את החרוזים.
    הערה: שרפי SPPS זמינים טעונים מראש עם שאריות מסוף C, מוגנים על ידי FMOC.
  3. הכנס את המבחנה המכילה את החרוזים לכור המיקרוגל דרך מנחת "הכלי הפתוח" (איור 1B, יציאת המתכת של הכור).
  4. מחממים ל-90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות על ידי שימוש במיקרוגל במצב דינמי: הגדר את יעד הטמפרטורה ל-90 מעלות צלזיוס, הספק של 50 וואט, זמן החזקה = 2.0 דקות (ראה משלים file 1 לדוח על ביטול הגנה בתוך המיקרוגל). עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות חיישן האינפרא אדום של המיקרוגל; המיקרוגל יפחית את הכוח כדי לשמור על טמפרטורת התגובה.
  5. הסר את המבחנה המכילה את החרוזים מכור המיקרוגל.
  6. שאיבה של תמיסת DMF ותוצרי לוואי של תגובה בוואקום: סגור את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3"). פתח את השסתום לוואקום (איור 1, מסומן "2"). כאשר התמיסה כמעט מוסרת, פתח את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3").
  7. סגור את שסתום הוואקום (איור 1, מסומן "2"). הוסף 3 מ"ל DMF כדי לשטוף את המבחנה ואת צינור פיזור הגז.
  8. שטיפת ממס DMF שואבת בוואקום: סגור את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3"). פתח את השסתום לוואקום (איור 1, מסומן "2"). כאשר התמיסה כמעט מוסרת, פתח את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3").
  9. חזור על שלבים 4.7 ו-4.8 פעמיים, בסך הכל שלוש כביסות עם ממס DMF.
  10. חזור על שלבי הסרת FMOC 4.1-4.9 בסך הכל שני שלבי הגנה רצופים.

5. צימוד של חומצות אמינו FMOC

  1. הנח את כלי התגובה של המבחנה במחזיק שלו מחוץ לכור המיקרוגל.
  2. הוסף ידנית 2.5 מ"ל של 0.2 M חומצת אמינו FMOC (עודף מולרי פי 5), 1.0 מ"ל של תמיסת חומר צימוד DIC של 1.0 M (עודף מולרי פי 10), ו-1.0 מ"ל של תמיסת תוסף 0.5 M oxyma (עודף מולרי פי 5) לשרף במבחנה.
  3. פתח את שסתום החנקן (איור 1, מסומן "3") כדי להשיג תסיסה של חרוזים.
  4. הכנס את המבחנה המכילה את החרוזים לכור המיקרוגל דרך מנחת הכלי הפתוח (איור 1B, יציאת המתכת של הכור). מחממים את התמיסה ל -100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. באמצעות המיקרוגל במצב דינמי, הגדר את יעד הטמפרטורה ל-100 מעלות צלזיוס, הספק של 60 וואט, זמן החזקה = 10.0 דקות (ראה משלים file 1 לדוח על צימוד בתוך המיקרוגל). עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות חיישן האינפרא אדום של המיקרוגל; המיקרוגל יפחית את הכוח כדי לשמור על טמפרטורת התגובה.
  5. הסר את המבחנה המכילה את החרוזים מכור המיקרוגל.
  6. שאיבת ממס DMF ותוצרי לוואי של תגובה בוואקום: סגור את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3"). פתח את השסתום לוואקום (איור 1, מסומן "2"). כאשר התמיסה כמעט מוסרת, פתח את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3").
  7. סגור את שסתום הוואקום (איור 1, מסומן "2"). הוסף 3 מ"ל DMF כדי לשטוף את המבחנה ואת צינור פיזור הגז.
  8. שטיפת ממס DMF שואבת בוואקום: סגור את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3"). פתח את השסתום לוואקום (איור 1, מסומן "2"). כאשר התמיסה כמעט מוסרת, פתח את שסתום N2 (איור 1, מסומן "3").
  9. חזור על שלבים 5.7 ו-5.8 פעמיים בסך הכל שלוש כביסות עם ממס DMF.

6. חזור על מחזורי פפטיד SPPS

  1. חזור על כל השלבים בסעיפים 4 (הסרת FMOC) ו-5 (צימוד של חומצות אמינו FMOC) עד לקבלת פפטיד של הרצף הרצוי.
    הערה: הקפד להוסיף תמיסות ריאגנטים מחוץ לכור המיקרוגל, בטמפרטורת החדר, ישירות לכלי התגובה של המבחנה. כמו כן, ודא כי תסיסה של חנקן מופעלת לפני הנחת המבחנה בכור המיקרוגל.

7. מחשוף פפטיד

  1. העבירו את השרף למזרק פלסטיק מוגן.
  2. הכינו קוקטייל מחשוף של 95% חומצה טריפלואורואצטית (TFA), 2.5% מים ו-2.5% טריאיזופרופיל סילאן (TIPS) בנפח של 1 מ"ל/100 מ"ג שרף.
  3. חתכו את הפפטיד למשך שעתיים בטמפרטורת החדר עם ניעור מתמשך או מדי פעם.
  4. זרז את תוצר הפפטיד ב -10 מ"ל של אתר דיאתיל קר כקרח.
  5. יש להשעות את הגלולה בכמות מינימלית של MeCN/0.1% TFA מימי וליופיליזציה למשך הלילה.

תוצאות

דוגמאות לרצפי פפטידים שהוכנו עם המכשיר שלנו מוצגות באיור 2 ובאיור 3. טבלה 1 מסכמת את הפתרונות, פרמטרי המיקרוגל והשטיפות שהשתמשנו בהם. אישור ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF מוצג באיורים. התאוששות מסה של פפטידים אלה הייתה מעל 80%. באופן משמעותי, לכל הרצפים הללו יש צימודים מרובים בין חומצות אמינו אלפא סמוכות, אלפא דיאלקיליות. אלה הם בין השאריות הקשות ביותר לחיבור יחד באמצעות היווצרות קשרים פפטידיים.

figure-results-1
איור 1: מכשיר SPPS ידני שנבנה בבית, בסיוע מיקרוגל. (A) מציג סכמטי 1) "טי" ETFE; 2) שסתום ETFE לוואקום; 3) שסתום ETFE לגז חנקן; 4) צינור פיזור גז, בתוך 5) כלי תגובה של מבחנה פיירקס; 6) מחיצה מסוג NMR לחיבור צינורות טפלון בגודל 1/8 אינץ' לצינור פיזור גז; 7) שסתום מחט לשליטה בזרימת גז החנקן; 8) בקבוק זרוע צד לאיסוף פסולת תגובה. ראה טבלת חומרים ליצרנים ומספרים קטלוגיים של רכיבים. (ב) תצלום של תמונה מורכבת. המספור זהה לאיור 1A. קיצורים: SPSS = סינתזת פפטיד פאזה מוצקה; ETFE = אתילן טטרפלואורואתילן; NMR = תהודה מגנטית גרעינית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: מבנה של פפטיד 1, מסונתז באמצעות שיטות SPPS מיקרוגל ואישור MALDI-TOF. (A) CHCA שימש כמטריצה. השיא ב-m/z = 880.18 הוא אשלגן אדוקט, [MK+], מחושב m/z=880.45. (B) עקבות HPLC של פפטיד גולמי 1. שיפוע הממס הוא MeCN מ-20% ל-80% מעל 0.1% TFA מימי, 20 דקות. אורך גל התצפית = 222 ננומטר. קיצורים: SPSS = סינתזת פפטיד פאזה מוצקה; MALDI-TOF = יינון לייזר בעזרת מטריצה - זמן טיסה; CHCA = חומצה אלפא-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית, HPLC = כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים; MeCN = אצטוניטריל; TFA = חומצה טריפלואורואצטית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: מבנה של פפטיד 2, מסונתז באמצעות שיטות SPPS מיקרוגל ואישור MALDI-TOF. (A) CHCA שימש כמטריצה. השיא ב-m/z = 1022.7 מוקצה לתוספת האשלגן, [MK+], מחושב m/z=1023.5. השיא ב-m/z = 966.5 הוקצה באופן זמני לאוקסאזולון C-terminal באמצעות אובדן מים24, מחושב m/z = 967.5. (B) עקבות HPLC של פפטיד גולמי 2. שיפוע הממס הוא MeCN מ-20% ל-80% למשך 20 דקות על פני 0.1% TFA מימי. אורך גל התצפית = 222 ננומטר. קיצורים: SPSS = סינתזת פפטיד פאזה מוצקה; MALDI-TOF = יינון לייזר בעזרת מטריצה - זמן טיסה; CHCA = חומצה אלפא-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית, HPLC = כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים; MeCN = אצטוניטריל; TFA = חומצה טריפלואורואצטית, אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

צעדתמיסה/ממסנפח (מ"ל)זמן (דקות)טמפ' (°C)
1ביטול הגנה20% מורפולין7290
2שוטףDMF4, 4, 4-RT
3ביטול הגנה20% מורפולין7290
4שוטףDMF4, 4, 4-RT
5צימודFmoc-AA-OH, אוקסימה, DIC5, 2, 210100
6שוטףDMF4, 4, 4-RT
7חוזר
קצההמחשוףTFA/טיפים/H2O1>120

טבלה 1: שלבים למחזור אחד של SPPS בסיוע מיקרוגל בקנה מידה 0.1 מילימול: הגנת FMOC, שטיפות וצימוד FMOC-חומצות אמינו. 0.2 מ' FMOC-AA-OH, 0.5 מ' אוקסימה, 1.0 מ' DIC. פתרונות שנוספו באופן ידני על ידי מיקרו-פיפטר ישירות למבחנה עבור כל שלב. קיצורים: SPSS = סינתזת פפטיד פאזה מוצקה; FMOC = פלואורנילמתוקסיקרבוניל; DIC = diisopropylcarbodiimide.

קובץ משלים 1: דוח כור מיקרוגל CEM Discover SP להסרת קבוצת ההגנה על Fmoc ודוח כור מיקרוגל CEM Discover SP לצימוד חומצת אמינו מוגנת Fmoc. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

המנגנון המוצג כאן מפעיל שיטה פשוטה, חדשנית וזולה להסרת ממס, ריאגנטים עודפים ומוצרי פסולת, כמו גם הוספת תסיסה של גז חנקן, במהלך SPPS בסיוע מיקרוגל. בניגוד לכלי SPPS קונבנציונליים, המעוררים פריט בתחתית הכלי, המנגנון המוצג מפעיל צינור פיזור גז תחת ואקום כדי לשאוב את הכלי. כלי התגובה הוא אפוא מבחנה רגילה, המחוממת במיקום המומלץ על ידי יצרן כור המיקרוגל בתוך "מנחת הכלי הפתוח".

החידוש העיקרי שלנו הוא הסרת ממיסים ותוצרי לוואי של תגובה מהמבחנה באמצעות "צינור פיזור גז" בוואקום. במהלך טרנספורמציות כימיות תחת קרינת מיקרוגל, כמו גם במהלך שטיפות עם ממס (N,N-dimethylformamide (DMF) או N-methyl pyrrolidinone, NMP), חרוזי ה-SPPS נסערים על ידי גז חנקן המפוזר דרך הצינור. גז הוואקום והחנקן נשלטים על ידי שסתומי ETFE כדי לייעל את העמידות בפני ממס. פסולת SPPS נאספת בבקבוק ארלנמאייר בזרוע צד. כל הרכיבים מחוברים באמצעות צינורות טפלון בגודל 1/8 אינץ'. בעוד שאנו משתמשים בשואב "בית", משאבת ואקום מכנית תשמש גם כן. איור 1, למעלה, הוא סכימה של המנגנון שלנו.

SPPS מוצלח דורש לא רק מנגנון, אלא פרוטוקולים כימיים של טמפרטורה, זמן וריאגנטים כימיים. תוך שימוש בפרוטוקול של Clayden et al.22, הכנו מספר פפטידים שיהיה קשה, אם לא בלתי אפשרי להכנה באמצעות שיטות SPPS קונבנציונליות בטמפרטורת החדר. לצורך צימוד של חומצות אמינו, אנו משתמשים בדיסופרופיל קרבודימיד (DIC) ובאוקסימה כקוקטייל הצימוד ומקרינים ל-100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אוקסימה נחשבת כמדכאת את הגזע של שאריות במהלך תהליך הצימוד13. להגנה מפני FMOC, אנו משתמשים ב-20% מורפולין ב-DMF, מוקרן ב-90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, וחוזרים על הפעולה פעם נוספת. בין תגובות, אנו משתמשים ב-DMF כדי לשטוף שוב ושוב (פי 3) את חרוזי ה-SPPS (שרף וואנג).

באמצעות מכשיר ידני זה, הכנו פפטידים קשים לסינתזה בקצב של כ-40 דקות לכל שאריות. עדיין לא חקרנו אופטימיזציות אפשריות של קצב זה. לדוגמה, אנו מאמינים שהזמן בתוך כור המיקרוגל יכול להיות מוגבל ל"זמן תגובה כולל", בניגוד ל"זמן בטמפרטורת היעד", מבלי להפחית את התוצאות. הסיבה לכך היא משך הזמן המושקע בהתקרבות אסימפטוטית לטמפרטורת היעד (ראה קובץ משלים 1 לפרטים). יתר על כן, באופן עקרוני, ניתן להוסיף את כל הריאגנטים והממיסים מבלי להוציא את כלי התגובה מהמיקרוגל. עם זאת, אנו מעדיפים להיות מסוגלים לבדוק את השרף בכל השלבים.

בעוד שמקרה השימוש שלנו הוא ב-SPPS, יש לציין ששיטות פאזה מוצקה מיושמות יותר ויותר על מגוון רחב של סינתזות, כגון דנדרימר25, RNA26 וסינתזות אלקטרוכימיות27. מגוון מקרי שימוש עשויים להפיק תועלת מסיוע במיקרוגל, שעבורו מכשיר זה יתאים. לבסוף, בעוד שהמנגנון נבנה לביצוע SPPS בסיוע מיקרוגל, כלי התגובה הבסיסי שלו הוא מבחנה. לכן, ניתן להשתמש במנגנון ב-SPPS קונבנציונאלי בטמפרטורת החדר, כמו גם ב-SPPS המתנהל בטמפרטורות גבוהות, למשל, באמבט שמן.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

המחברים אסירי תודה על תמיכת מענקי INSPIRE של אוניברסיטת פיירפילד, תמיכת המחלקה לכימיה וביוכימיה באוניברסיטת פיירפילד, וסיועה של ד"ר דורותי סובצ'ינסקי על מומחיותה בניהול המעבדה. בנוסף, המחברים אסירי תודה לפרופסורים ג'יליאן סמית'-קרפנטר ואהרון ואן דייק על הדיונים בנוגע לפפטידים וסינתזה אורגנית. המחברים מעריכים את תמיכת קרן הפרסום של המכללה לאמנויות ומדעים של אוניברסיטת פיירפילד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כור מיקרוגל CEM Discover SPCEMהופסק.  לאחרונה הוחלף בקו המוצרים על ידי דיסקבר 2.0
דיאיזופרופילקרבודימייד (DCC)TCI אמריקה
דימתילפוראמיד (DMF)תרמו-סיינטיקה כימיקלים
צינור פיזור גז, מיקרו,  כימגלאסCG-207-02נקבוביות בינונית
מחיצה מיקרוChemGlassCG-3022-20מחיצה מסוג "צינור NMR"
מורפוליןתרמו-סיינטיקה כימיקלים
חומצות אמינו מוגנות על ידי N-Fmoc
אויקסמה פיורTCI אמריקה
בקבוק ארלנמאייר עם זרוע צדדיתספקים שוניםאיסוף פסולת
"טי"אידקסP-713ETFE
צינור טפלון 1/8", רסטק25306OD x 0.063" מזהה, 3 מ'
מבחנה (מחזיק לכלי תגובה מחוץ למיקרוגל) ספקים שונים(30 x 175)
מבחנה (כלי תגובה)קורנינג גלאס9820-25XPyrex 25 x 200 מ"מ, ללא שוליים 
שסתוםאידקסP-721ETFE (פעמיים)
שרף Wang SPPS, 1% דיווינילבנזן משולב, רשת 100-200ChemTech מתקדם

מקורות

  1. Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. J Am Chem Soc. 85 (14), 2149-2154 (1963).
  2. Sheppard, R. C. Nobel prize: Merrifield wins in chemistry. Nature. 311 (5988), 699-699 (1984).
  3. Jaradat, D. M. M. Thirteen decades of peptide synthesis: key developments in solid phase peptide synthesis and amide bond formation utilized in peptide ligation. Amino Acids. 50 (1), 39-68 (2018).
  4. Paradís-Bas, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. The road to the synthesis of "difficult peptides.". Chem Soc Rev. 45 (3), 631-654 (2016).
  5. Wang, J., et al. Mechanistic Study of diketopiperazine formation during solid-phase peptide synthesis of tirzepatide. ACS Omega. 7 (50), 46809-46824 (2022).
  6. Sharma, A., et al. N-methylation in amino acids and peptides: Scope and limitations. Biopolymers. 109 (10), e23110(2018).
  7. El-Faham, A., Albericio, F. Peptide coupling reagents, more than a letter soup. Chem Rev. 111 (11), 6557-6602 (2011).
  8. Subirós-Funosas, R., Nieto-Rodriguez, L., Jensen, K. J., Albericio, F. COMU: scope and limitations of the latest innovation in peptide acyl transfer reagents. J Peptide Sci. 19 (7), 408-414 (2013).
  9. El-Faham, A., Albericio, F. COMU: A third generation of uronium-type coupling reagents. J Peptide Sci. 16 (1), 6-9 (2010).
  10. Wenschuh, H., Beyermann, M., Rothemund, S., Carpino, L. A., Bienert, M. Multiple solid-phase synthesis via Fmoc-amino acid fluorides. Tet Lett. 36 (8), 1247-1250 (1995).
  11. Wenschuh, H., Beyermann, M., Krause, E., Carpino, L. A., Bienert, M. Efficient solid phase assembly of peptides bearing contiguous highly hindered Aib residues via Fmoc Aib fluoride. Tetrahedron. 34 (23), 3733(1993).
  12. Wenschuh, H., et al. Fmoc amino-acid fluorides - convenient reagents for the solid-phase assembly of peptides incorporating sterically hindered residues. J Org Chem. 59 (12), 3275-3280 (1994).
  13. Manne, S. R., De La Torre, B. G., El-Faham, A., Albericio, F. OxymaPure coupling reagents: beyond solid-phase peptide synthesis. Synthesis. 52 (21), 3189-3210 (2020).
  14. Collins, J. M. Microwave-enhanced synthesis of peptides, proteins, and peptidomimetics. Microwaves in Organic Synthesis. Hoz, A., Loupy, A. , Wiley-VCH Verlag & Co. KGaA: Weinheim, Germany. 897-959 (2012).
  15. Pedersen, S. L., Tofteng, A. P., Malik, L., Jensen, K. J. Microwave heating in solid-phase peptide synthesis. Chem Soc Rev. 41 (5), 1826-1844 (2012).
  16. Pedersen, S. L., Sørensen, K. K., Jensen, K. J. Semi-automated microwave-assisted SPPS: Optimization of protocols and synthesis of difficult sequences. Peptide Sci. 94 (2), 206-212 (2010).
  17. Zeko, T., et al. FT-IR spectroscopy and density functional theory calculations of 13C isotopologues of the helical peptide Z-Aib 6 -OtBu. J Phys Chem B. 118 (1), 58-68 (2014).
  18. Gord, J. R., et al. Conformation-specific spectroscopy of capped, gas-phase Aib oligomers: Tests of the Aib residue as a 310-helix former. Phys Chem Chem Phys. 18 (36), 25512-25527 (2016).
  19. Fischer, J. L., et al. Single-conformation spectroscopy of capped aminoisobutyric acid dipeptides: the effect of C-terminal cap chromophores on conformation. J Phys Chem A. 123 (19), 4178-4187 (2019).
  20. Hjørringgaard, C. U., Pedersen, J. M., Vosegaard, T., Nielsen, N. C., Skrydstrup, T. An automatic solid-phase synthesis of peptaibols. J Org Chem. 74 (3), 1329-1332 (2009).
  21. Haynes, S. R., Hagins, S. D., Juban, M. M., Elzer, P. H., Hammer, R. P. Improved solid-phase synthesis of α,α-dialkylated amino acid-rich peptides with antimicrobial activity. J Peptide Res. 66 (6), 333-347 (2005).
  22. Zieleniewski, F., Woolfson, D. N., Clayden, J. Automated solid-phase concatenation of Aib residues to form long, water-soluble, helical peptides. Chem Commun. 56 (80), 12049-12052 (2020).
  23. CEM Corporation. Manual peptide synthesis. Discover SPSS. , https://cem.com/discover-spps (2023).
  24. Theis, C., Degenkolb, T., Brückner, H. Studies on the selective trifluoroacetolytic scission of native peptaibols and model peptides using HPLC and ESI-CID-MS. Chem Biodivers. 5 (11), 2337-2355 (2008).
  25. Ya-Ting Huang, A., Kao, C. -L., Selvaraj, A., Peng, L. Solid-phase dendrimer synthesis: a promising approach to transform dendrimer construction. Materials Today Chemistry. 27, 101285(2023).
  26. Flemmich, L., Bereiter, R., Micura, R. Chemical synthesis of modified RNA. Angew Chem Int Ed Engl. 63 (22), e202403063(2024).
  27. Li, M., Li, Y. Solid-phase electrosynthesis. Acc Chem Res. 56 (24), 3694-3703 (2023).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Fmoc SPPS
התאמה זולה של כור מיקרוגל מסחרי לסינתזה של פפטידים בשלב מוצק
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.