מאמר שיטה

טכניקה למתן תוך אפי של אגרגטים α-סינוקלאין

1.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66943

⸱

8 בנובמבר 2024

 , 
1Department of Neurology, Graduate School of Medicine, Kyoto University

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה למתן תוך-אפי של צברי α-סינוקלאין. שיטה זו מספקת תובנות לגבי התפשטות α-סינוקלאין מרירית חוש הריח לפקעת הריח במחלת פרקינסון.

תקציר

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה נוירודגנרטיבית המאופיינת בנוכחות של גופי לוי, שהם צברים של α-סינוקלאין (α-Syn). לאחרונה, המחלה הוצעה להתפתח ולהתקדם באמצעות התפשטות דמוית פריון של אגרגטים α-Syn מפקעת הריח (OB) או הגרעין הגבי של העצב התועה. למרות שמקורם של צברי α-Syn ב- OB נותר לא ברור, התפשטותם מרירית הריח הוצעה לאחרונה. בעבר הראינו כי מתן תוך-אפי של אגרגטים α-Syn במודל עכבר גרם לפתולוגיה של α-Syn ב-OB של עכברים. במחקר זה, אנו מציגים שיטה של ניהול intranasal של אגרגטים α-Syn שגרמו פתולוגיה α-Syn ב OB של עכברים. מתן תוך-אפי של אגרגטים α-Syn היא שיטה פשוטה ופשוטה מאוד, ואנו מאמינים שהיא תהיה כלי שימושי במחקר להבהרת מקור הפתולוגיה של α-Syn ב-OB ומסלול התפשטות α-Syn דרך מערכת חוש הריח.

מבוא

מחלת פרקינסון (PD), המאופיינת בתסמינים מוטוריים כגון ברדיקינזיה, רעידות במנוחה ונוקשות שרירים, היא ההפרעה הנוירודגנרטיבית השנייה בשכיחותה1. פרקינסון מציג גם תסמינים לא מוטוריים, כולל תפקוד לקוי של חוש הריח, ליקוי קוגניטיבי, דיכאון, הזיות, עצירות ולחץ דם אורתוסטטי. סימני ההיכר הפתולוגיים שלו הם מוות תאי דופמינרגי בחומר השחור ונוכחותם של אגרגטים α-סינוקלאין (α-Syn), הנקראים גופי לוי2.

יש לציין כי α-Syn הוא חלבון בן 140 חומצות אמינו הקיים בצורה של מונומר מסיס (או טטרמר) בתנאים רגילים. עם זאת, בתנאים חריגים, המונומר המסיס מומר לצברים בלתי מסיסים בעלי משקל מולקולרי גבוה, כולל אוליגומרים וסיבים. על פי הדיווחים, המעבר של α-Syn לאוליגומרים וסיבים מעורב ברעילות תאית3.

מחקרים אחרונים הציעו התפשטות דמוית פריון של צברי α-Syn בין נוירונים. בהתבסס על בדיקות רבות לאחר המוות, Braak et al. הציעו בשנת 2003 את ההשערה כי פתולוגיה של גוף לוי מתפשטת בהדרגה במוח באופן סטריאוטיפי משהו (השערת בראק)4,5. בשנת 2008, בדיקה לאחר המוות של חולי פרקינסון שעברו השתלת מוח אמצעית עוברית גילתה גופי לוי בנוירונים דופמינרגיים שמקורם ברקמות עובריות 6,7. מחקרים אלה הציעו כי צברי α-Syn יכולים להתפשט מהמוח החולה לשתלים, מה שתומך בהשערה של בראק.

בעקבות תצפיות אלה, ניסויים שכללו תרביות עצביות ראשוניות והזרקה תוך-מוחית של צברי α-Syn בעכברים שיחזרו את ההתפשטות של אגרגטים דמויי גוף לוי, וסיפקו ראיות נוספות להתפשטות α-Syn באופן דמוי פריון 8,9.

Braak et al. הראו כי פתולוגיית גוף לוי בפרקינסון מתחילה בפקעת הריח (OB) ו/או בגרעין הגבי של עצב הואגוס (dmX)4. בהתבסס על השערתו של בראק, מספר מחקרים דיווחו על מתן אגרגטים α-Syn או תמציות גוף לוי ממוחות פרקינסון לתוך OB ומערכת העיכול של חיות ניסוי 10,11,12. בשנת 2018, מחקר הראה כי מתן צברים של α-Syn לתוך OB של עכברים מסוג בר גרם להתפשטות של פתולוגיה α-Syn לאורך מסלול חוש הריח, וכתוצאה מכך תפקוד לקוי של חוש הריח13. בעבר חיסנו צברי α-Syn לתוך OB של עכברים טרנסגניים α-Syn ומצאנו שזה הוביל לניוון ההיפוקמפוס ולפגיעה בזיכרון14.

בשנת 2022 חיסנו צברי α-Syn ל-OB של מרמוסטים, פרימט קטן שאינו אנושי; זה הביא להתפשטות של פתולוגיה α-Syn לאורך מסלול חוש הריח, ניוון OB, ו hypometabolism גלוקוז מוחי נרחב10.

עם זאת, אם ההתפשטות של צברי α-Syn מתרחשת מה- OB, מתעוררת שאלה קריטית: באיזה מנגנון מופיעים לראשונה צברי α-Syn? סאיטו ועמיתיו דיווחו בעבר על נוכחות של גופות לוי ברירית האף15. נוכחות של אגרגטים α-Syn זוהתה ברירית האף של חולים עם PD וניוון מערכות מרובות (MSA) באמצעות ניתוח המרה המושרה על ידי רעידות בזמן אמת (RT-QUIC)16. יש לציין כי ניתוח דגימות רירית האף מחולים עם הפרעת התנהגות שינה בתנועות עיניים מהירות (RBD), הנחשבת לשלב פרודרומלי של פרקינסון, גילה עלייה ברמות α-Syn17. מחקר זה הציע כי פתולוגיה של α-Syn עשויה להתקיים ברירית האף אפילו מהשלב הפרודרומלי של מחלת פרקינסון.

בעוד ממצאים אלה הצביעו על נתיב אפשרי מרירית האף לרופא OB, היו ראיות ניסיוניות מוגבלות התומכות בתרחיש זה. כדי להתמודד עם פער זה, נתנו אגרגטים α-Syn לתוך חלל האף של עכברים וחקרנו את התפשטות פתולוגיית α-Syn מרירית האף ל- OB. הגישה הניסויית שלנו הראתה כי מתן תוך-אפי במינון יחיד של אגרגטים α-Syn בעכברי בר גרם לפתולוגיה של α-Syn ב-OB, וסיפק ראיות ניסיוניות למסלול ההתפשטות מרירית האף ל-OB.

פרוטוקול

במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים C57BL/6J בני חודשיים. כל הליכי הניסוי בוצעו על פי הנחיות לאומיות. הוועדה לחקר בעלי חיים של אוניברסיטת קיוטו העניקה אישור אתי ואישור למחקר זה (MedKyo 23,544).

1. מתן תוך אפי של סיבי α-Syn מוכנים

  1. הכן תמיסת סיבי α-Syn בעכבר ב- PBS (4 מ"ג / מ"ל) על פי שיטות שדווחו בעבר11. עטפו את הצינור בסרט שקוף כדי למנוע זיהום.
  2. Sonicate 200 μL של תמיסת סיבי α-Syn ליצירת סיבים מוכנים α-Syn (PFFs) באמצעות סוניק מסוג אמבט מים (Table of Materials). מלאו את האמבטיה העל-קולית במים והוסיפו קוביות קרח כדי להתקרר ל-4°C לצורך סוניקציה. סוניק סיבים במשך 5 דקות בסך הכל כאשר כל מחזור מורכב מ -30 שניות של סוניקציה ואחריו מרווח של 30 שניות (סה"כ חמישה מחזורים).
    הערה: השתמש בציוד מגן אישי כגון כפפות חד פעמיות, מסכה ומשקפי מגן כדי למנוע חשיפה של α-Syn.
  3. הכינו פיפטה P10 (טבלת חומרים) עם קצה פיפטה 10 μL. מרדים כל עכבר באמצעות שילוב של medetomidine hydrochloride, midazolam, ו butorphanol (MMB) על ידי הזרקה intraperitoneal (i.p.). חומר ההרדמה המשולב MMB הכיל מידזולם (0.3 מ"ג/ק"ג), מדטומידין (4 מ"ג/ק"ג) וטרטרט בוטורפנול (5 מ"ג/ק"ג). יש להשתמש ב-0.005 מ"ל/גרם בהזרקת i.p. בעת ערבוב מידזולאם (1 מ"ג/מ"ל) 0.3 מ"ל, מדטומידין (5 מ"ג/מ"ל) 0.8 מ"ל, טרטרט בוטורפנול (5 מ"ג/מ"ל) 1 מ"ל ומי מלח 2.9 מ"ל.
  4. המתן 10 דקות כדי לוודא שהעכברים מורדמים לחלוטין. ניתן לאשר הרדמה נכונה אם העכבר נמצא בשכיבה צידית ואינו יכול לתקן את עצמו. לאחר ההרדמה, יש למרוח משחה אופתלמית באמצעות מוליך כותנה סטרילי כדי למנוע התייבשות של העיניים.
    הערה: ללא הרדמה, בעת מתן מנות אף, קשה לשמור על העכברים בשכיבה ולתת תמיסת α-Syn כראוי כאשר העכברים מתעטשים. מסיבות אלה, היה צורך בטשטוש.
  5. הניחו את העכבר המורדם במצב שכיבה. הניחו מגבת נייר או חומר דומה מתחת לגוף, כדי להבטיח הטיה קלה כלפי מטה של הראש (איור 1A,B). מיקום זה מונע מתמיסת α-Syn הניתנת לזרום במהירות לריאות או לוושט, ומקל על שמירתה בחלל האף. הנחיריים נראים באיור 1C.
  6. ציירו 1 μL של תמיסת α-Syn (4 מ"ג/מ"ל) לתוך פיפטה P10 והניחו את קצה הפיפטה ליד אפו של העכבר. צרו באיטיות טיפה עגולה ושמרו אותה בקצה קצה הפיפטה (איור 1D, חץ אדום). ניהול intranasal מבוצע עבור הנחיר חד צדדי, להשתמש בצד contralateral כמו צד הבקרה.
  7. קרבו את הטיפה לצד אחד של נחיריי העכבר ואפשרו לעכבר לשאוף אותה באופן טבעי. צפו בשאיפה והמתינו 30 שניות עד דקה אחת (איור 1E).
  8. חזור על שלבים 1.6.-1.7. עד למתן נפח כולל של 20 μL של תמיסת α-Syn. לאחר כל ההליכים, השליכו את הכפפות ונגבו ספסל עם חומרי ניקוי מסחריים אם המשטח מזוהם ב- α-Syn
    הערה: ההליך כולו צריך להתבצע בארון בטיחות כדי למנוע שאיפת סיבי α-Syn על ידי הצוות המבצע את ההליך. דו"ח קודם הראה כי נפח של 25 μL הוא היעיל ביותר עבור מתן תרופות אף למוח18. אנו משתמשים בנפח דומה של 20 μL במחקר הנוכחי. אנו משתמשים גם באותו ריכוז של PFFs כמו זה להזרקה לתוך OB בדו"ח הקודם10, שהוא קרוב ל 400 מיקרומטר (5.6 מ"ג / מ"ל) של PFFs19.
  9. מתן atipamezole (3 מ"ג / ק"ג; טבלת חומרים) על ידי הזרקת I.P. כדי להפוך medetomidine ולהקל על ההתאוששות. השתמש 0.005 מ"ל / גרם על ידי הזרקת i.p. בעת ערבוב atipamezole (5 מ"ג / מ"ל) 0.6 מ"ל מלוחים 4.4 מ"ל.
    הערה: לספק שיכוך כאבים כי זה לא לגמרי מובן כמה מלחיץ הממשל intranasal של α-Syn יהיה.
  10. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. לאחר התאוששות מלאה, להחזיר את העכבר לכלוב.

2. הכנת מדגם

  1. הקריבו את העכברים שטופלו בגיל 1, 3, 6 ו-12 חודשים לאחר מתן תוך-אפי של סיבי α-Syn.
    1. הכניסו את העכברים לקופסת האינדוקציה, נתנו סבופלורן (>6.5%) והמשיכו עד לדום נשימה למשך > 60 שניות. הסר את העכברים ובצע כריתה מהירה על ידי חתך פרוזדורים ימני כדי להבטיח המתת חסד.
  2. הכנס מחט 25G (טבלה של חומרים) לתוך קודקוד הלב. לערבב את העכבר ב 4 מ"ל / דקה עם 15 מ"ל של PBS ולאחר מכן 15 מ"ל של 4% PFA ב PBS.
  3. חותכים את הראש במספריים ועושים חתך של 2 ס"מ בקרקפת עם אזמל. חתכו את עצם הגולגולת בעזרת מספריים בצד הצדדי מלמטה ועד האף (איור 2A,B). כדי להשיג את ה-OBs, הסירו לחלוטין את עצם הגולגולת שעל ה-OBs (איור 2B, עיגול צהוב).
  4. הפכו את הראש, נתקו את עצבי המוח, ואז הסירו את המוח בזהירות בעזרת מלקחיים (איור 2C, D). השיגו את המוח עם OBs שלמים (איור 2E). כדי להשיג את ה-OBs השלמים, חתכו בזהירות את עצבי חוש הריח בעזרת מלקחיים, כאשר ה-OBs נצמדים לעצם הגולגולת (איור 2D, עיגול צהוב).
  5. הכניסו את דגימות המוח ל-4% PFA ב-PBS למשך הלילה ב-4°C. אין להשאיר את דגימות המוח במשך יותר מ -24 שעות.
    הערה: קיבוע יתר יפחית את הצביעה האימונוהיסטוכימית. אם נדרש אחסון לטווח ארוך, שמרו דגימות מוח באתנול 70% או PBS המכילים 0.1% נתרן אזיד כדי לשמור על סטריליות.

3. צביעה אימונוהיסטוכימית של OB

  1. פרפין את הדגימות באמצעות מעבד רקמות אוטומטי (רשימת חומרים) כמתואר להלן.
    1. יש לטבול באתנול 70% למשך 120 דקות, ולאחר מכן לטבול באתנול 100% למשך 8x למשך 60 דקות. לאחר מכן, לטבול 100% קסילן במשך 3x במשך 120 דקות.
    2. יש לטבול בפרפין בטמפרטורה של 60°C למשך 120 דקות ולאחר מכן לטבול בפרפין בטמפרטורה של 60°C למשך 240 דקות.
  2. הטמע את הדגימות בפרפין כמתואר להלן.
    1. הטמע את הדגימות בפרפין ב 60 ° C עם מרכז שיבוץ רקמות מודולרי (טבלה של חומרים). מצננים אותם על קרח.
  3. חתכו את הדגימות למקטעים בעובי 8 מיקרומטר בעזרת מיקרוטום (טבלת חומרים)18.
  4. בצע deparaffinization כמתואר להלן.
    1. יש לטבול ב-100% קסילן למשך 2 פעמים למשך 5 דקות, ולאחר מכן לטבול באתנול 100% למשך 2 פעמים למשך 3 דקות.
    2. יש לטבול באתנול 70% למשך 3 דקות. שטפו ב-PBS במשך 3 דקות.
  5. לבצע אחזור אנטיגן כמתואר להלן.
    1. יש לטבול ב-100% חומצה פורמית למשך 15 דקות. יש לשטוף במי מלח חוצצי פוספט (PBS) במשך 2 דקות.
    2. Autoclave ב 120 ° C למשך 10 דקות. תנו לו להתקרר באופן טבעי.
  6. יש לטבול במתנול 1% מי חמצן למשך 10 דקות. יש לשטוף ב-PBS למשך 5 דקות.
  7. מוסיפים 500 מיקרוליטר חלב רזה 5% ב-PBS על המגלשות ודגרים עליהן במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. שים את 500 μL של נוגדן α-Syn אנטי זרחני (p-α-Syn, 1/10000) ב- PBS על שקופיות ודגור אותם לילה ב 4 ° C. שטפו פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
  9. לדגור עם פולימר אוניברסלי immuno-peroxidase, אנטי ארנב (טבלה של חומרים) במשך 1 שעה ב 25 ° C. שטפו פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד.
  10. יש לפתח באמצעות ערכת צביעה 3,3'-diaminobenzidine (DAB) (טבלת חומרים) למשך 5 דקות בהתאם להוראות היצרן.
  11. לטבול בתמיסת המטוקסילין למשך דקה אחת (טבלת חומרים). יש להסיר את הצבע במים זורמים למשך 10 דקות.
  12. בצע הרכבה כמתואר להלן.
    1. יש לטבול באתנול 70% למשך 5 דקות. יש לטבול באתנול 100% למשך 2 פעמים למשך 5 דקות.
    2. יש לטבול ב-100% קסילן למשך 2 פעמים למשך 5 דקות. הרכבה באמצעות אמצעי הטבעה (טבלת חומרים). יש למרוח את 100 μL של מדיום הטבעה על המגלשות ולכסות בכיסוי זכוכית.
  13. קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ All-in-One בהגדלה של 20x ו- 40x (רשימת חומרים).

תוצאות

איור 3 מראה כמה דוגמאות לצברי α-Syn ב-OB. במחקר הנוכחי נתנו צברי α-Syn לתוך הנחיר החד-צדדי. שני חללי האף מופרדים על ידי מחיצת האף, וכל OB מקרין את נוירוני חוש הריח לכל חלל אף בנפרד. לכן, OB בצד הנגדי יכול לשמש כבקרה.

פתולוגיה של P-α-Syn לא נצפתה ב-OB בצד המטופל לאחר חודש ושלושה חודשים (איור 3A, B). אגרגטים דמויי נויריט לוי p-α-Syn נצפו בגלומרולי בצד המטופל לאחר 6 ו -12 חודשים. (איור 3C,D,F,G). הצברים האלה לא נצפו ב-OB בצד הבקרה (איור 3E).

אנו יכולים להעריך את הפתולוגיה של α-Syn על ידי ספירת אגרגטים של α-Syn או בחינת הגודל, וכו ', באמצעות ImageJ (טבלה של חומרים). לדוגמה, בעבר ספרנו ודיווחנו על מספר צברי α-Syn במודלזה 20. ב- OB בצד המטופל, אגרגטים דמויי נויריט לוי ב- OB גדלו באופן משמעותי במשך 12 חודשים (ANOVA חד כיוונית, ואחריה מבחן דנט, p < 0.01; איור 3H). ב- OB בצד הבקרה, ישנם מעט צברי α-Syn.

מחקר קודם הראה כי PFFs שהוזרקו למוח העכבר התפרקו תוך שבוע, ועכבר אנדוגני α-Syn הומר לצברי α-Syn19. במחקר הנוכחי, העלייה בפתולוגיה של α-Syn לאורך זמן מצביעה על כך שעכבר אנדוגני α-Syn הומר לצברי α-Syn על ידי מתן תוך-אפי במינון יחיד של PFFs. תוצאות אלה הצביעו על כך שהפתולוגיה של α-Syn עלולה להתפשט מרירית חוש הריח ל- OB.

figure-results-1
איור 1: שיטת ניהול חלל האף של עכבר. (A) העכבר ממוקם במצב שכיבה כשהראש מוטה מעט כלפי מטה. (B) נחירי העכבר מסומנים על-ידי ראשי חץ צהובים. (ג, ד) תמיסת הפיבריל α-Syn נשללת לנחיר העכבר (C, חץ אדום) ונשאפת במהירות (D, חיצים אדומים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תיאור השלבים להשגת נורות הריח השלמות. (A) באמצעות מספריים, חותכים את עצם הגולגולת בצורה חדה ורוחבית (קו מקף צהוב). (B) הסר לחלוטין את עצם הגולגולת שעל פקעות הריח (OBs). (C) להפוך את הראש ולהסיר בזהירות את המוח. לנתק את עצבי המוח. (D) לחתוך את עצבי הריח המחוברים לעצם הגולגולת. (E) המוח כולו עם OBs שלמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: P-α-Syn מצטבר בגלומרולי של פקעת הריח. (A-G) P -α-Syn (EP1536Y) אימונוהיסטוכימיה של OB על (A-D) בצד המטופל 1, 3, 6 ו-12 חודשים (1 מ', 3 מ', 6 מ' ו-12 מ', בהתאמה) לאחר מתן תוך-אפי ו-(E) בצד הבקרה 12 חודשים לאחר מתן תוך-אף. (ג, ד) צברי α-Syn דמויי חוט דמוי חוט Lewy neurite מופיעים סביב הגלומרולי. (ו, ז) תמונות מוגדלות הן תמונות בהגדלה גבוהה של p-α-Syn דמוי Lewy neurite 6 ו-12 חודשים לאחר מתן תוך האף. (H) כמות התצהיר p-α-Syn דמוי נויריט לוי ב-OB בצד המטופל והבקרה (n = 4-5). גרפים מראים ממוצע ± SEM. ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן דנט; **<0.01. נתון זה שונה מדוחקודם 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

במחקר קודם, מתן אגרגטים של α-Syn לתוך חלל האף של קופי מקוק גרם למוות של תאים דופמינרגיים ושקיעת ברזל בחומר השחור, אם כי אגרגטים α-Syn לא נצפו21. מתן יומי של A53T α-Syn אנושי מצטבר לתוך חלל האף של עכברים טרנסגניים מקדם פריונים α-Syn (עכברי M83) במשך 28 ימים דווח כגורם לפתולוגיה של α-Syn במוח ולתסמינים מוטוריים בעכברים19,22. במחקר הנוכחי, הראינו כי מתן מנה אחת של α-Syn מצטבר לתוך חלל האף של עכברים מסוג בר המושרה פתולוגיה α-Syn ב OB. שיטה פשוטה זו יכולה להיחשב בעלת ערך לחקר התפשטות α-Syn מרירית האף ל- OB.

סוניקציה מספקת של סיבי α-Syn בשיטה זו היא קריטית מכיוון שדיווחים קודמים הראו שהגודל הקטן של צברי α-Syn מקוטעים הוא היעיל ביותר להפעלת פתולוגיה של α-Syn23,24. סוניקציה לא מספקת של סיבי α-Syn תגרום להתפשטות מועטה ל-OB. מכיוון שלסוניקטורים שונים יש עוצמת סוניקציה משתנה, יש צורך באופטימיזציה של תהליך זה. תנוחת השכיבה של העכבר כאשר תמיסת α-Syn ניתנת לנחיריים של העכבר היא גם קריטית. אם ראשו של העכבר מורם, תמיסת α-Syn תזרום לריאות ולוושט. יציבה לא נכונה עלולה לגרום למוות בלתי צפוי או להתפשטות α-Syn לא מספקת.

במחקר הנוכחי, I.P. השתמש בחומר הרדמה משולב MMB להרדמה. הרדמה משולבת MMB דווחה כמספקת הרגעה טובה ושיכוך כאבים, והשפעתה יכולה להתהפך במהירות על ידי atipamezole23. מכיוון שהרדמה בשאיפה דורשת כיסוי הנחיריים במסכה כדי לשמור על ההרדמה, קשה יותר לתת את תמיסת α-Syn תוך האף. בנוסף, מודל הרוטנון נחקר רבות והוא מודלשימושי מאוד 25. עם זאת, זהו מודל המושרה על ידי תרופות ועשויים להיות פתומנגנונים שונים מאשר מחלת פרקינסון אידיופתית (iPD)25. מאחר שמודל זה גרם להתפשטות α-Syn, אנו מאמינים שהוא קרוב יותר ל-iPD.

המחקר שלנו גם הציע כי אגרגטים אקסוגניים של α-Syn יכולים לעבור דרך רירית האף. לכן, כאשר חוקרים עורכים ניסויים באמצעות אגרגטים α-Syn, יש לנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע שאיפת אגרגטים α-Syn. לדוגמה, אירוסולים α-Syn יכולים להיווצר במהלך שלב הסוניקציה. אנו ממליצים להשתמש בסוניקטור מסוג אטום או סוניקציה בתוך ארון בטיחות. בנוסף, עכברים עלולים להתעטש, מה שעלול לייצר תרסיסי α-Syn. כדי להפחית סיכון זה, כל הפעולות צריכות להתבצע בתוך ארון בטיחות. כמו כן, החוקרים צריכים להשתמש בציוד מגן אישי כגון כפפות חד פעמיות, מסכות ומשקפי מגן כדי למנוע חשיפה ל- α-Syn. לאחר כל ההליכים, החוקרים צריכים לנגב ספסל עם חומרי ניקוי מסחריים אם המשטח מזוהם עם α-Syn. דוחות קודמים הראו כי הן דטרגנטים מסחריים והן SDS ניתקו אגרגטים ממשטחים מזוהמים 26,27.

במחקר זה, קטעי פרפין שימשו להערכת פתולוגיה α-Syn ב- OB, מכיוון שהמבנה הקטן של OB נשמר טוב יותר בקטעי פרפין בהשוואה לזה שבקטעים קפואים. מחקר זה הראה כי פתולוגיה α-Syn הושרה ב- OB; עם זאת, פתולוגיית α-Syn שנצפתה הייתה קלה ומוגבלת ויוצגה בעיקר על ידי אגרגטים דמויי חוט הידועים בשם Lewy neurites בגלומרולי.

יש לציין כי שינויים התנהגותיים לכאורה בעכברי ניסוי לא נצפו במחקר הנוכחי. פתולוגיית ה- α-Syn הנגרמת בשיטה זו עשויה שלא להספיק כדי לגרום לשינויים בפנוטיפ ההתנהגות. יש צורך בחקירות נוספות כדי להבהיר את התנאים הספציפיים המובילים לפתולוגיה חמורה ולשינויים התנהגותיים. בעתיד, אם נוכל לבסס דרך יעילה יותר להתפשטות מרירית האף ל- OB, שיטה פשוטה זו מספקת דרך חלופית להעריך התפשטות α-Syn ללא טכניקת ניתוח.

בנוסף, השתמשנו ב- OB בצד הנגדי בעכברים המטופלים כביקורת. עם זאת, התפשטות מדרדרית מגרעין הריח הקדמי או קליפת המוח הפיריפורמית ל- OB הנגדי עלולה להתרחש במעקב ארוך טווח. במקרה זה, עכברים שלא טופלו שימשו כביקורת.

בעוד שיטה פשוטה זו מספקת תובנות חשובות על התפשטות α-Syn מרירית האף ל- OB, נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין באופן מקיף את המנגנונים העומדים בבסיס PD.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

כל הניסויים נתמכו על ידי רי היקאווה. אנו מודים ליאסוקו מאטסוזאווה על הניירת. מחקר זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI (M.S., NO. JP19K23779, JP20K16493 ו-JP20H00663).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-One BZ-X710KEYENCEN/Aמיקרוסקופ All-in-One
Ampicillin נתרן מלחנקלאי טסק02739-32
Bioruptor IISonicbioBR2006Aסוניקטור מסוג אמבט מים.
Butorphanol tartrateMeiji Seika PharmaWAK-52850
שפופרת תאיתMISUMIUC20-32-100
DeepWellMaximizerTAITECMBR-022UPשייקר
DynaQualified Cells Zip BL21(DE3)BioDynamics Laboratory Inc.DS255תא מוכשר
EntellanSigma-Aldrich107961מדיום הרכבה מהיר למיקרוסקופיה
Graefe מלקחיים עדינים במיוחד מעוקלFST11152-10 מלקחיים
מספריים עדינים מוקשיםFST14090-09מספריים
היסטופין עכבר כתמים פשוט MAX-PO (R)Nichirei Bioscience414341פולימר אימונו-פרוקסידאז אוניברסלי, אנטי ארנב
ImageJ ver 1.52pNANAhttps://imagej.net/
innova4200ניו ברונסוויק9105085מדעי שייקר אינקובטור
איזופרופיל-&בטא;- D-thiogalactopyranosideNacalai tesque19742-94
LB broth, LennoxNacalai tesque20066-24
Leica EG 1150 HLeica14 0388 86 108מרכז הטמעת רקמות מודולרי
Leica TP 1020Leica14 0422 85108מעבד רקמות אוטומטי 
MedetomidineFuji Film135-17473
Microm HM325 Rotary MicrotomeThermo Scientific902100
MidazolamMaruishi Seiyaku4987-211-76210-0
המטוקסילין חדש מסוגG Muto65-9197-38תמיסת המטוקסילין
מחט מכונפת רגילה לווריד מסוג D, מחט 25GTERUMONN2332R25G
אופטימה TLX אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולר8043-30-1197אולטרה-צנטריפוגה
P10 פיפטהגילסוןFA10002P
פרפיןלייקה39601095
פרפורמלדהידנקלאי טסק30525-89-4
ערכת DAB כתם פרוקסידאזNacalai tesque25985-50
ערכות בדיקת חלבון Pirece BCAThermo Scientific23225BCA assay
pRK172Addgene#134504פלסמיד
Q-Sepharose זרימה מהירה. cytiva17051001שרף חילופי יונים

מקורות

  1. Tysnes, O. B., Storstein, A. Epidemiology of Parkinson's disease. J Neural Transm (Vienna). 124 (8), 901-905 (2017).
  2. Goedert, M. Alpha-synuclein and neurodegenerative diseases. Nature Rev Neurosci. 2, 492-501 (2001).
  3. Conway, K. A., et al. Acceleration of oligomerization, not fibrillization, is a shared property of both alpha-synuclein mutations linked to early-onset Parkinson's disease: implications for pathogenesis and therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (2), 571-576 (2000).
  4. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 24 (2), 197-211 (2003).
  5. Braak, H., Rüb, U., Gai, W. P., Del Tredici, K. Idiopathic Parkinson's disease: possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. J Neural Transm (Vienna). 110 (5), 517-536 (2003).
  6. Kordower, J. H., Chu, Y., Hauser, R. A., Freeman, T., Olanow, C. W. Lewy body-like pathology in long-term embryonic nigral transplants in Parkinson's disease. Nat Med. 14 (5), 504-506 (2008).
  7. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14 (5), 501-503 (2008).
  8. Luk, K. C., et al. Pathological α-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  9. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 13010-13015 (2009).
  10. Sawamura, M., et al. Lewy body disease primate model with α-Synuclein propagation from the olfactory bulb. Mov Disord. 37 (10), 2033-2044 (2022).
  11. Uemura, N., et al. Inoculation of α-synuclein preformed fibrils into the mouse gastrointestinal tract induces Lewy body-like aggregates in the brainstem via the vagus nerve. Mol Neurodegener. 13 (1), 21(2018).
  12. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  13. Rey, N. L., et al. Spread of aggregates after olfactory bulb injection of α-synuclein fibrils is associated with early neuronal loss and is reduced long term. Acta Neuropathol. 135 (1), 65-83 (2018).
  14. Uemura, N., et al. α-Synuclein spread from olfactory bulb causes hyposmia, anxiety, and memory loss in BAC-SNCA mice. Mov Disord. 36 (9), 2036-2047 (2021).
  15. Saito, Y., et al. Lewy body pathology involves the olfactory cells in Parkinson's disease and related disorders. Mov Disord. 31 (1), 135-138 (2016).
  16. De Luca, C. M. G., et al. Efficient RT-QuIC seeding activity for α-synuclein in olfactory mucosa samples of patients with Parkinson's disease and multiple system atrophy. Transl Neurodegener. 8, 24(2019).
  17. Stefani, A., et al. Alpha-synuclein seeds in olfactory mucosa of patients with isolated REM sleep behaviour disorder. Brain. 144 (4), 1118-1126 (2021).
  18. Ucciferri, C. C., et al. Scoring central nervous system inflammation, demyelination, and axon injury in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (204), e65738(2024).
  19. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 136 (Pt 4), 1128-1138 (2013).
  20. Sawamura, M., et al. Single-dose intranasal administration of α-syn PFFs induce lewy neurite-like pathology in olfactory bulbs. Parkinsonism Relat Disord. 112, 105440(2023).
  21. Guo, J. J., et al. Intranasal administration of α-synuclein preformed fibrils triggers microglial iron deposition in the substantia nigra of Macaca fascicularis. Cell Death Dis. 12 (1), 81(2021).
  22. Macdonald, J. A., et al. Assembly of α-synuclein and neurodegeneration in the central nervous system of heterozygous M83 mice following the peripheral administration of α-synuclein seeds. Acta Neuropathol Commun. 9 (1), 189(2021).
  23. Abdelmotilib, H., et al. α-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration. Neurobiol Dis. 105, 84-98 (2017).
  24. Tarutani, A., et al. The effect of fragmented pathogenic α-Synuclein seeds on prion-like propagation. J Biol Chem. 291 (36), 18675-18688 (2016).
  25. Taguchi, T., Ikuno, M., Yamakado, H., Takahashi, R. Animal model for prodromal Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 1961(2020).
  26. Bousset, L., Brundin, P., Böckmann, A., Meier, B., Melki, R. An efficient procedure for removal and inactivation of alpha-Synuclein assemblies from laboratory materials. J Parkinsons Dis. 6 (1), 143-151 (2016).
  27. Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces. Sci Rep. 8, 10788(2018).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

טכניקה למתן תוך אפי של אגרגטים α-סינוקלאין
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.