כאן, אנו מציגים שיטה אופטימלית להסרה מיידית של חלק מקומפלקסי קומולוס-ביציות לאחר שאיבת ביציות כדי לזרז את תהליך התצפית על הפריה חוץ גופית, להפחית את הזמן הנדרש להסרת תאי גרנולוזה, למזער את חשיפת הביציות לאלמנטים חיצוניים, ואינה מעכבת את התפתחות העובר, ובסופו של דבר משפרת את היעילות של הליכי מעבדה IVF.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הסרה חלקית מיידית של קומפלקסים קומולוס-ביציות: גישה מעודנת לתצפית מהירה על הפריה חוץ גופית
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
למרות ההתקדמות המהירה בטכנולוגיות הקליניות והמעבדתיות להפריה חוץ גופית (IVF), חלק ניכר (10%-15%) מהמטופלים ממשיכים לחוות הפרעות הפריה, מה שמוביל לשיעורי הפריה נמוכים ולייצור עוברים שאינם ברי קיימא. הפריה לטווח קצר כוללת הסרה מוקדמת של תאי גרנולוזה כדי לצפות בשחול של הגוף הקוטבי השני, מה שמאפשר הערכת הפריה ואמצעי תיקון מוקדמים כדי לטפל בשיעורי הפריה נמוכים וכישלון הפריה מוחלט. עם זאת, התצפית על הפריה לטווח קצר בהפריה חוץ גופית מעוכבת על ידי אתגרים כגון אשכולות לא מעובדים גדולים מדי של קומפלקסים של קומולוס-ביציות והדבקה בין ביציות, מה שמחייב הליכים חיצוניים מורכבים להסרת תאי גרנולוזה ומשך תצפית ממושך. כדי להתמודד עם נושא זה, מחקר זה מציע שיטה להסרה חלקית מיידית של תאי גרנולוזה לאחר שאיבת ביציות. גישה זו מייעלת את השלבים הבאים של הפריה לטווח קצר וניטור דישון מסורתי, מפחיתה את הזמן הדרוש לשחול ביציות, ממזערת את הסבירות להשפעות סביבתיות חיצוניות על הביציות ומפחיתה את הסיכון להחמצת חלון תצפית הדישון הקריטי. כתוצאה מכך, המחקר מניב ראיות קליניות חדשות שמטרתן לשפר את היעילות התפעולית של מעבדות עובריות בהפריה חוץ גופית.
מבוא
בתחום ההפריה החוץ גופית-העברת עוברים (IVF-ET), שיעור ההפריה האופייני נופל בטווח של 60% עד 80%1. עם זאת, כ-4% עד 16% מהמקרים נתקלים בכישלון הפריה מוחלט או בשיעורי הפריה נמוכים, מה שמציב אתגרים בחיזוי 2,3. כדי לשפר את תוצאות ההריון הקליני ולהפחית את ההתרחשויות של אי הפריה מוחלטת והפריה נמוכה, השימוש בהפריה קצרת טווח בהליכי הפריה חוץ גופית נמצא בעלייה4. גישה זו כרוכה בהסרה מהירה של תאי גרנולוזה כדי לנטר את האקסטרוזיה של הגוף הקוטבי השני, להעריך את מצב ההפריה ולבצע הזרקת זרע תוך ציטופלזמית מתקנת (ICSI). הקשר בין קומפלקס תאי הביצית (OCCC) לבין הביצית חזק יותר במהלך הפריה לטווח קצר בהשוואה להפריה מסורתית בלילה, ובכך מגדיל את האתגר של הסרת OCCC5. גורמים כמו עודף במספר הביציות, קומפלקסים גדולים של OCCC או הידבקויות בין ביציות יכולים להוביל לזמני הסרת תאי גרנולוזה ממושכים במהלך הפריה קצרת טווח, ובכך להאריך את התקופה שבה הביציות נשארות מחוץ לחממה4. כדי לייעל את תקופת התצפית על ההפריה, הומצאה גישה שונה לאחר שאיבת ביציות, הכוללת כריתה חלקית של תאי גרנולוזה מביציות עם קומפלקסים משמעותיים של OCCC. טכניקה זו מסייעת בשימור תאי הגרנולוזה המקיפים את הביציות, שומרת על שלמות מבנה הביציות המוקדם6, ומאפשרת לתאים אלה להמשיך לספק גורמים חיוניים להבשלת הביציות ולהפריה לאחר מכן-קשירת עוברים7.
כתוצאה מכך, מחקר זה מתמקד במטופלות העוברות טיפול IVF-ET במרכז לרפואת רבייה כמשתתפות במחקר, במטרה לחקור את ההשפעה של שיטת כריתה מכנית של תאי גרנולוזה חלקית מיידית על משך ההליכים הן להפריה קצרת טווח והן לניטור הפריה לילה תוך הערכת תוצאות של הפריה תקינה והתפתחות בשלב מאוחר. מחקר זה נועד להציע תובנות חשובות לשיפור הליכי מעבדת עוברים בהפריה חוץ גופית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים נערכו בהתאם לנוהלי ההפעלה הסטנדרטיים של המחלקה לרפואת רבייה בבית החולים העממי מייג'ואו והיו כפופים לביקורת של ועדת האתיקה של אותה מחלקה. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל זוג משתתף. המחקר כלל משתתפים שעברו את מחזור ההפריה החוץ גופית הראשון שלהם עם מחשוף או העברת עוברים בשלב בלסטוציסט, כמו גם נשים בגילאי 20 עד 45. קריטריוני ההחרגה כללו שימוש בביציות/זרע של תורם ומצבים ספציפיים כגון מומים מולדים או משניים ברחם (למשל, רחם מחיצה, רחם חד-קרני, רחם דידלפי), אדנומיוזיס, שרירנים תת-ריריים ברחם, או עובי רירית הרחם מתחת ל-7 מ"מ ביום החזרת העוברים. בסך הכל 115 חולים שנרשמו בין דצמבר 2023 לפברואר 2024 חולקו לשתי קבוצות על סמך האם בוצעה הסרה חלקית מיידית של OCCC.
1. הכנה לפני שאיבת ביציות
- מניחים את כלי איסוף הביציות (טבלת החומרים) בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- דגירה של 12 מ"ל של מדיום מניפולציה של זקיק (טבלת חומרים) במבחנות תחתונות עגולות של 14 מ"ל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. העבירו את הצינורות למדף המבחנה שחומם מראש 30 דקות לפני שאיבת הביציות.
- הכן את המדיום למניפולציה של הזקיק: הוסף 9 מ"ל של מדיום מניפולציה של זקיק למבחנה תחתונה עגולה של 14 מ"ל (טבלת חומרים) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום שאיבת הביציות, העבירו 4.5 מ"ל מהמדיום לצלחת איסוף ביציות מודגרת מראש (טבלת חומרים) מכוסה ב-2 מ"ל שמן פרפין 100%.
- הכן את תמיסת ההדחה של OCCC: הוסף 4.5 מ"ל של מדיום דישון (טבלת חומרים) לכלי איסוף ביציות ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- מכינים את אמצעי הדישון: מוסיפים 1 מ"ל של מדיום דישון לכלי 6 ס"מ מכוסה ב-100% שמן פרפין (טבלת חומרים) ודוגרים ב-37 מעלות למשך הלילה.
- הכינו את פיפטות הזכוכית של פסטר (טבלת החומרים): הקהו בעדינות ועגלו את הקצוות על ידי שריפתם על מנורת אלכוהול למשך כ-5 שניות (איור 1). חבר ראש יניקה לקצה הפיפטות של פסטר, וודא שהוא יכול לגעת בתחתית הכלי מבלי לשרוט. שוטפים את פיפטות הזכוכית של פסטר וכלים בגודל 10 ס"מ עם מדיום מניפולציה של זקיקים.
2. שאיבת ביציות והסרה חלקית מיידית של OCCC
הערה: השתמש בסטריאומיקרוסקופ במהלך הליכי בידוד ביציות והסרת OCCC. לקבלת תוצאות מיטביות, יש לבצע את כל ההליכים על שולחן חימום עם בקרת טמפרטורה (37 מעלות צלזיוס), ולחמם את כל הציוד 30 דקות לפני שאיבת הביציות.
- אסוף נוזל זקיקי לפני הביוץ במהלך שאיבת הביציות בהתאם להמלצות ESHRE8.
- בקצרה, השתמש במחט 17 G כדי לאחזר את הביציות בהנחיית אולטרסאונד טרנס-ווגינלי. הלחץ השלילי המתאים נע בין 120-140 מ"מ כספית.
- יוצקים את הנוזל הזקיקי שנאסף במבחנה התחתונה העגולה בנפח 14 מ"ל לכלי בגודל 10 ס"מ (טבלת חומרים), תוך שמירה על עומק נוזל של פחות מ- 0.5 ס"מ. מניחים את המנה על פלטפורמה בטמפרטורה קבועה (37 מעלות צלזיוס).
- התבונן ב-OCCC תחת סטריאומיקרוסקופ כדי לאשר את נוכחותן של ביציות ולהעריך את בשלותן.
הערה: הבשלות של ה-OOOC מוערכת על סמך המורפולוגיה של תאי הקומולוס והנראות של מבני ביציות מסוימים9. - שאפו את ה-OCCC באמצעות פיפטת פסטר קהה. הטה את צלחת ה-10 ס"מ כ-15 מעלות ופזר את כל ה-OCCC הגדול. הימנע משאיבת הביצית ותאי הגרנולוזה שמסביב ברדיוס של 2500 מיקרומטר. חותכים תאי גרנולוזה עודפים עם פיפטת פסטר לאורך ציר האורך (איור 2). השלבים המפורטים הם כדלקמן:
- התבונן בעין בלתי כדי לראות אם יש מסה רירית שקופה אפרפרה בנוזל הזקיקים. אם לא נמצא, חפש במהירות את המסה הרירית השקופה והאפרפרה על ידי סיבוב עם כיוון השעון מבחוץ לפנים תחת סטריאומיקרוסקופ, ה-OCCC.
- אשר אם יש ביציות ב-OCCC ובצע הערכה ראשונית של בשלות הביציות.
- לאחר מכן, הכינו מראש פיפטת שאיפה מסיליקון עם פיפטת פסטר עגולה מלוטשת להבה, שאפו את ה-OCCC, ובמקביל, הרימו בעדינות את צלחת התרבות במצב השעה 9-10 כשהאצבע השמאלית של היד מחזיקה את צלחת ה-10 ס"מ, מטה את צלחת התרבות מעט כ-15 מעלות שמאלה (הנחת האצבע מתחת לכלי היא בערך הזווית הנדרשת).
- תוך כדי יריקה החוצה של ה-OCCC הנשאף במיקום השעה 11 של הצלחת, האריכו אותו בעדינות אופקית ימינה. לאחר מכן, התבונן בגודל תאי הגרנולוזה סביב ה-OCCC המורחב. לאחר מכן, במיקום המתאים של ה-OCCC המוארך אופקית, השתמש בפיפטה של פסטר כדי לבצע חתך יורד מהיר ועדין על תאי הגרנולוזה העודפים מלמעלה למטה.
- העבירו את ה-OCCC החתוך לתבנית איסוף המכילה תמיסת שטיפה OCCC. יוצקים את הנוזל הזקיקי הנותר למיכל דגימה סטרילי (טבלת חומרים). חזור על שלבים אלה עד שכל המתחמים נאספים.
3. הכנת זרע והזרעה חוץ גופית
- אסוף את דגימות הזרע באמצעות שפיכה בבוקר שאיבת הביציות. להעריך את ריכוז הזרע, התנועתיות והמורפולוגיה תחת מיקרוסקופ אור בהתאם לקריטריונים של ארגון הבריאות העולמי (WHO, 2010)10. לאחר מכן, העבירו את כדור הזרע לצינור צנטריפוגה חדש ושטפו אותו פעמיים במדיום הפריה11. דגרו אותם בטמפרטורה של 6% CO2 ו-37 מעלות צלזיוס עד הצורך.
- OCCCs מזריעים עם 1 x 105 עד 3 x 105 זרעונים נעים למיליליטר בטיפה אחת כ-2-3 שעות לאחר השליפה בצלחת ההפריה (טבלת החומרים). הוסף 6-8 OCCC ו -1 מ"ל של מדיום ההפריה לתבנית ההפריה.
הערה: לאחר שטיפת ה-OCCC הדביק, הם מועברים לכלי הדישון באמצעות פיפטה של פסטר. שחרר OCCC אחד בכל פעם, הרם את הפיפטה בעדינות מעל פני הנוזל לפני שחרור הבא, וודא שכל OCCC מונח בנפרד בצלחת כדי למנוע התקבצות
4. הסרת תאי קומולוס
- להפריה לטווח קצר, בצע את השלבים המתוארים להלן.
- דגירה משותפת של OCCCs עם זרעונים למשך 4-6 שעות. לאחר הדגירה, הסר מכנית את תאי הקומולוס המקיפים את הביציות.
- שאפו את הביציות באמצעות פיפטה בקוטר פנימי מעט קטן יותר מהביציות כדי להבטיח הסרה מלאה של תאי קומולוס.
- אשר הפריה על ידי התבוננות בנוכחותם של שני גופים קוטביים. ביציות המציגות גוף קוטבי שני נחשבות מופרות.
- זהה את המקרים שאינם מראים את הגוף הקוטבי השני ככשלים בהפריה, מה שמחייב הצלה ICSI.
- להפריה קבועה, לאחר 18-20 שעות של דגירה משותפת, הסר תאי קומולוס באמצעות הפיפטות להערכת ההפריה.
5. תרבית עוברים
- תרבית ומעקב אחר הביציות המופרות במשך 3-5 ימים לאחר שאיבת הביציות. העריכו את ההפריה לאחר 20 שעות לאחר ההזרעה כדי לקבוע את מספר הפרו-גרעינים. לאחר מכן, תרבית כל זיגוטה בנפרד בטיפה בינונית והעבירה את העוברים לאחר ההפריה למדיום מחשוף.
הערה: עובר אידיאלי עד היום השלישי צריך להיות מורכב משישה בלסטומרים או יותר בגודל שווה ולהפגין שיעור פיצול של פחות או שווה ל-10%12. - ההחלטה להמשיך בתרבית בלסטוציסט תלויה בהעדפות המטופל ובנסיבות הספציפיות, כגון כמות ואיכות העוברים המתקבלים ביום השלישי. העבירו את העוברים של היום השלישי למדיום הבלסטוציסט והעריכו ביום החמישי. השתמש במערכת הניקוד של גרדנר כדי להעריך בלסטוציסטים, כאשר לבלסטוציסטים איכותיים יש ציונים של ≥ 4 BB13.
6. מדידות תוצאות וניתוח סטטיסטי
- דווח על נתונים רציפים כממוצע ± סטיית תקן ומבטא נתונים סידוריים כפרופורציות. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות מבחן t של הסטודנט או מבחן חי בריבוע בתוכנת ניתוח נתונים מתאימה (כאן, IBM SPSS Statistics). הגדר רמת מובהקות של P < 0.05 כמובהקת סטטיסטית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בקבוצה שעברה הליכי דגירה משותפת קצרים, חולים שקיבלו חילוץ לא נכללו. מתוך 47 חולים שקיבלו הזרעה קצרת טווח, לא נצפו הבדלים משמעותיים מבחינת גיל המטופלים ומספר הביציות שנשלפו (טבלה 1). ההסרה החלקית המיידית של OCCC הביאה להתרופפות של ה-OCCC שנותר סביב הביציות (איור 3), מה שהקל על גילוי גוף קוטבי שני. זמן ההליך הממוצע היה קצר משמעותית בהסרה חלקית של קבוצת OCCC (4.42 ± 1.68 דקות לעומת 9.29 ± 5.04 דקות, P < 0.001) בהשוואה לקבוצת הביקורת, למרות שלא נמצאו הבדלים משמעותיים...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הסרה חלקית מיידית של תאי גרנולוזה יכולה להאיץ את תהליך ההתפוררות המוקדם של הפריה קצרת טווח, להפחית את זמן התצפית על הגוף הקוטבי השני הן בהפריה קצרת טווח והן בהפריה חוץ גופית קונבנציונלית ולא לפגוע בהתפתחות העובר שלאחר מכן. נכון לעכשיו, מעבדות ברחבי העולם משתמשות באסטרטגיות שונות להפחתת הפרעות הפריה ושיעורי הצלחה נמוכים. השיטה המועדפת כוללת הסרת תאי גרנולוזה לתצפית על הגוף הקוטבי השני 4-6 שעות לאחר הפריה קצרת טווח14. אתגרים מתעוררים עקב ההידבקות ההדוקה בין הביציות ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.
תודות
המחברים מביעים את תודתם לצוות המחלקה לרפואת רבייה בבית החולים העממי מייג'ואו בגואנגדונג, סין, על השתתפותם הפעילה במחקר זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| G-IVFT פלוס | Vitrolife | 10136 | |
| OVOIL | Vitrolife | 10029 | |
| G-MOPS PLUS | ויטרולייף | 10130 | |
| פלקון 3003 צלחת | קורנינג | 353003 | |
| פלקון 3001 צלחת | קורנינג | 353001 | |
| פלקון 2001 צינור | קורנינג | 352001 | |
| פלקון 4013 | קורנינג | 354013 | |
| פלקון 3037 צלחת | קורנינג | 351058 | |
| פסטר | דרווין | D1150-5P |
מקורות
- Chen, C., Kattera, S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF. Hum Reprod. 18 (10), 2118-2121 (2003).
- Barlow, P., et al. Fertilization failure in IVF: why and what next. Hum Reprod. 5 (4), 451-456 (1990).
- Kuczyński, W., et al. Rescue ICSI of unfertilized oocytes after IVF. Hum Reprod. 17 (9), 2423-2427 (2002).
- He, Y., et al. Effect of early cumulus cells removal and early rescue ICSI on pregnancy outcomes in high-risk patients of fertilization failure. Gynecol Endocrinol. 34 (8), 689-693 (2018).
- Turathum, B., Gao, E. M., Chian, R. C. The function of cumulus cells in oocyte growth and maturation and in subsequent ovulation and fertilization. Cells. 10 (9), 2292(2021).
- Bárcena, P., Rodríguez, M., Obradors, A., Vernaeve, V., Vassena, R. Should we worry about the clock? Relationship between time to ICSI and reproductive outcomes in cycles with fresh and vitrified oocytes. Hum Reprod. 31 (6), 1182-1191 (2016).
- Telfer, E. E., Grosbois, J., Odey, Y. L., Rosario, R., Anderson, R. A. Making a good egg: human oocyte health, aging, and in vitro development. Physiol Rev. 103 (4), 2623-2677 (2023).
- D'Angelo, A., et al. Recommendations for good practice in ultrasound: oocyte pick up. Hum Reprod Open. 2019 (4), hoz025(2019).
- Hu, Y., et al. Transcriptomic profiles reveal the characteristics of oocytes and cumulus cells at GV, MI, and MII in follicles before ovulation. J Ovarian Res. 16 (1), 225(2023).
- Lu, W. H., Gu, Y. Q. Insights into semen analysis: a Chinese perspective on the fifth edition of the WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Asian J Androl. 12 (4), 605-606 (2010).
- Delos Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Hum Reprod. 31 (2015), 685-686 (2016).
- Nagy, Z. P., et al. Pronuclear morphology evaluation with subsequent evaluation of embryo morphology significantly increases implantation rates. Fertil Steril. 80 (1), 67-74 (2003).
- Gardner, D. K., Lane, M., Stevens, J., Schlenker, T., Schoolcraft, W. B. Reprint of: Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer. Fertil Steril. 112 (4), Suppl1 e81-e84 (2019).
- Esfandiari, N., Claessens, E. A., Burjaq, H., Gotlieb, L., Casper, R. F. Ongoing twin pregnancy after rescue intracytoplasmic sperm injection of unfertilized abnormal oocytes. Fertil Steril. 90 (1), e5-e7 (2008).
- Wetzels, A. M., et al. The effects of co-culture with human fibroblasts on human embryo development in vitro and implantation. Hum Reprod. 13 (5), 1325-1330 (1998).
- Kattera, S., Chen, C. Short coincubation of gametes in in vitro fertilization improves implantation and pregnancy rates: a prospective, randomized, controlled study. Fertil Steril. 80 (4), 1017-1021 (2003).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
