מאמר שיטה

מערכות AAV ומודלים של עכברים לחקירת ביטוי חוץ רחמי של Neurod1 בתאים שעברו התמרה בזמנים תת-חריפים וכרוניים לאחר שבץ איסכמי

DOI:

10.3791/66965

⸱

29 בנובמבר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Division of Anatomy, University of Toronto, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 4Donnelly Centre for Cellular and Biomedical Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הביטוי החוץ רחמי בתיווך ויראלי של Neurod1 לאחר שבץ איסכמי קליפת המוח. Neurod1 מועבר (1) באמצעות מערכת Cre-Flex AAV בעכברים מסוג בר במהלך השלב התת-חריף לאחר שבץ מוחי (7 ימים) ו-(2) באמצעות וקטור AAV יחיד בעכברים מדווחים מותנים במהלך השלב הכרוני שלאחר השבץ (21 ימים).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביטוי חוץ רחמי של גורמים נוירוגניים in vivo התגלה כגישה מבטיחה להחלפת נוירונים אבודים במודלים של מחלות. השימוש בגורמי שעתוק סליל-לולאה סליל בסיסיים עצביים (bHLH) באמצעות מערכות חלקיקים דמויות וירוס שאינן מתפשטות, כולל רטרו-וירוס, לנטי-וירוס ווירוס הקשור לאדנו (AAV), דווח בהרחבה. עבור ניסויים in vivo , נעשה שימוש הולך וגובר ב-AAVs בשל הפתוגניות הנמוכה שלהם ופוטנציאל התרגום. פרוטוקול זה מתאר שתי מערכות AAV לחקירת הביטוי החוץ רחמי של גורמי שעתוק בתאים שעברו התמרה לאחר שבץ איסכמי. בשתי המערכות, ביטוי Neurod1 נשלט על ידי מקדם ה-GFAP הקצר (gfaABC(1)D), אשר מווסת באסטרוציטים תגובתיים לאחר שבץ מוחי כמו גם בנוירונים אנדוגניים בשילוב עם ביטוי גורמים נוירוגניים. במודל השבץ האיסכמי המתואר, איסכמיה מוקדית נגרמת על ידי הזרקת אנדותלין-1 (ET-1) לקליפת המוח המוטורית של עכברים, ויוצרת נגע מוקף באסטרוציטים המבטאים GFAP תגובתיים ונוירונים ששרדו. זריקות תוך מוחיות של AAV מבוצעות כדי לגרום לביטוי אקטופי של Neurod1 בשלבים התת-חריפים (7 ימים) והכרוניים (21 ימים) לאחר שבץ מוחי. תוך שבועות לאחר הזרקת AAV, מספר גבוה משמעותית של נוירונים בקרב תאים מתמרים מזוהה בעכברים המבטאים Neurod1 באופן אקטופי בהשוואה לעכברים המקבלים נגיפי בקרת AAV. האסטרטגיות המבוססות על AAV השתמשו בתוצאות נצפות משוכפלות של מספר מוגבר של נוירונים המבטאים את הגן המדווח במודל של שבץ קליפת המוח קל עד בינוני. פרוטוקול זה קובע פלטפורמה סטנדרטית לבחינת ההשפעות של ביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק המועברים במערכות מבוססות AAV, התורם להבנת ביטוי הגורמים הנוירוגניים בהקשר של שבץ מוחי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שבץ מוחי הוא גורם מוביל לנכות ברחבי העולם1. שבץ מוחי מתרחש כאשר זרימת הדם למוח מופרעת. זה יכול להתרחש באמצעות שבץ דימומי (~15% מהמקרים), שבו כלי דם במוח מתפוצץ, או באמצעות שבץ איסכמי, שבו זרימת הדם למוח נחסמת1. שבץ איסכמי הוא השכיח ביותר ומהווים ~85% ממקרי השבץ1. שבץ מוחי מפחית את אספקת הגלוקוז והחמצן למוח, מה שמוביל למוות מהיר של תאי עצב ולפגיעה בתפקוד העצבי.

שבץ איסכמי מוביל לאובדן תאים תוך דקות בליבת הנגע באמצעות מנגנונים של אקסיטוטוקסיות, מתח חמצוני וניטרוזטיבי, חוסר ויסות סידן, דפולריזציה מתפשטת בקליפת המוח, בצקת, שיבוש מחסום הדם-מוח (BBB) ודלקת 2,3. תאים באזורי האוטם עוברים מוות של תאים אפופטוטיים תוך שעות, ובמשך ימים, לאחר שבץמוחי 4. הסביבה הפרי-אוטמית חשופה לאותות פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתיים המובילים להפעלת מיקרוגליה ואסטרוציטים (אסטרוציטים "תגובתיים"), הממלאים תפקידים מגוונים לאחר פציעה 5,6,7,8. אסטרוציטים תגובתיים עוברים מספר שינויים פנוטיפיים הכוללים ויסות מוגבר של חלבון חומצי סיבי גליה (GFAP), והיווצרות גבול סביב הנגע תוך ימים לאחר השבץ המוחי המסייע להגביל את היקף הנגע וכן משפיע על הנוירופלסטיות בתוך הרקמה הפגועה 8,9,10.

תכנות מחדש תאי ישיר מאפשר המרה של סוג תא בוגר אחד לסוג תא בוגר אחר מבלי לעבור מצב פלוריפוטנטי11. הפיכת תאי מוח תושבים לנוירונים חדשים כדי להחליף את אלה שאבדו בפציעה מהווה דרך אטרקטיבית לשיקום המוח. שבץ מוחי הוא יעד אידיאלי לטיפולים מבוססי תאים, בהתחשב בצורך בשיטות טיפוליות להחלפת נוירונים שאבדו, להרחיב את מסגרת הזמן הטיפולית ובסופו של דבר להקל על התאוששות תפקודית. לשם כך, היו מאמרים רבים המדגימים תכנות מחדש של אסטרוציטים לנוירון (AtN) במבחנה וב-vivo, תוך שימוש במגוון גורמי שעתוק נוירוגניים בסיסיים, כולל Ascl1, Neurog2, Neurod1 ולאחרונה, גרסאות מוטנטיות של Ascl1 (Ascl1-SA6) שהראו יעילות תכנות מחדש משופרת 11,12,13,14. חשוב לקחת בחשבון את גורמי תכנון הניסוי הרבים שיכולים להשפיע על תוצאות, פרשנות והשוואות בין מחקרים. Ghazale et al. הראו שיעילות התכנות מחדש של AtN השתנתה בין זני עכברים שונים, סרוטיפים של AAV ומקדמים כאשר השתמשו באותו גורם שעתוק bHLH14. שיקולים אחרים, כגון מודל הפגיעה, אזור המוח, מינון ויראלי, תזמון העברת הגנים, גורם התכנות מחדש ואופן המסירה, ישפיעו על התוצאות. דיווחים אחרונים הראו כי נוירונים מתמרים קיימים פורשו באופן שגוי כתאי עצב מתוכנתים מחדש15,16. בעוד שהדיווחים אינם שוללים בהכרח את העובדה שמתרחשת המרה של AtN, מחקרים אלה הדגישו את החשיבות של ניסויים מבוקרים היטב, ומספר מאמרים הציגו המלצות לצעדים הבאים בתחום 15,17,18,19. מה שברור מהספרות הוא שהביטוי החוץ רחמי של גורמי שעתוק bHLH יכול לשפר את התוצאות התפקודיות במגוון מודלים של בעלי חיים של מחלה/פציעה ניוונית 13,20,21,22,23,24.

כאן, פרוטוקול זה Neurod1, גורם שעתוק מעניין, מתבטא באופן אקטופי בתאים מותמרים13,22. נעשה שימוש במודל האנדותלין-1 (ET-1) המבוסס היטב של שבץ איסכמי לקליפת המוח התחושתית-מוטורית בעכברים בוגרים. הזרקת ET-1 מובילה להתכווצות כלי דם מקומית המחקה את הפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי, כולל ליקוי תפקודי 22,23,25. מקדם ה-GFAP הקצר הנפוץ (gfaABC(1)D) משמש להנעת הביטוי החוץ רחמי של Neurod1 באתר הפגיעה ובאזור הפרילסיוני באמצעות שתי אסטרטגיות ויראליות: (1) אספקת AAV5-CAG-Flex::GFP+AAV5-GFAP-Neurod1-Cre בעכברים מסוג בר ו-(2) אספקת AAV5-GFAP-Neurod1-Cre בעכברים מדווחים tdTom-Cre. כדי להבין עוד יותר את הפוטנציאל לביטוי חוץ רחמי של Neurod1 במוח שנפגע משבץ מוחי, AAVs הועברו בשלב התת-חריף (7 ימים), או בשלב הכרוני (21 ימים), לאחר שבץ מוחי. בשתי הפרדיגמות, נמצאו באופן משמעותי יותר נוירונים מסומנים תוך שבועות לאחר ביטוי חוץ רחמי של Neurod1.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת טורונטו ועומד במדריך לטיפול ושימוש בחיות ניסוי (מהדורה שנייה, המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים, 2017). עבור מחקר זה, מדווח tdTom-Cre מסוג בר (C57BL/6J) וטרנסגני tdTom-Cre (B6. נעשה שימוש בזני עכברים Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 זני עכברים. העכברים היו בני 7-9 שבועות וכללו זכרים ונקבות כאחד. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים מפורטים בטבלת החומרים.

1. ניתוח שבץ מוחי אנדותלין-1

הערה: כל המכשירים והחומרים הכירורגיים עוברים חיטוי על ידי חיטוי לפני הניתוח. המסגרת הסטריאוטקסית מעוקרת באמצעות PREempt. המזרקים מעוקרים עם PREempt, 70% אלכוהול, ומוכנים עם PBS סטרילי לפני הניתוח. אנדותלין-1 (ET-1) מאוחסן על קרח לאורך כל הניתוח.

  1. לפני תחילת הניתוח, הגדר את אזור ההתאוששות על ידי הנחת כלוב נקי על כרית חימום המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס. לחלופין, אם משתמשים במנורת חימום, הניחו רק מחצית מהכלוב מתחת לחום.
    1. כדי להרדים עכברים באמצעות איזופלורן, עקוב אחר הפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים. הנח את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה והפעל את החמצן ל-1-1.5 ליטר לדקה, ולאחר מכן כוונן את מכשיר האידוי איזופלורן ל-3%-5% כדי להתחיל בהרדמה.
  2. הוציאו את החיה מהתא ברגע שהיא שוכבת על צדה ואינה יכולה עוד לעמוד, והניחו אותה על משטח נקי. ודא שהחיה מורדמת כראוי על ידי אישור היעדר רפלקס צביטה בבוהן לפני ובמהלך הניתוח.
    1. אבטח את חרוט האף המורחב ממכונת ההרדמה על החיה והתאם איזופלורן ל-1%-2% לצורך תחזוקה. צמצם את החשיפה לאיזופלורן (5 דקות ב-3%-5% לאינדוקציה והזמן הנותר ב-1%-2%), מכיוון שההליך יכול להימשך עד 40 דקות.
  3. השתמש בגוזמי שיער של בעלי חיים כדי להסיר פרווה מהצוואר/מאחורי האוזניים לאף החיה כדי לחשוף את העור על הגולגולת לניתוח.
  4. יש לשקול את בעל החיים ולתת את המינון המתאים של משכך כאבים טרום ניתוחי תת עורי (מלוקסיקם (2.0 מ"ג/ק"ג)) בהתאם למשקל.
  5. יש למרוח משחת סיכה לעיניים על כל עין של העכבר כדי למנוע התייבשות בקרנית במהלך ההרדמה.
  6. עקר את אזור העור קצוץ הפרווה (שלב 1.3) עם 70% אתנול, ולאחר מכן אלכוהול כלורהקסידין פעמיים ליצירת שדה ניתוח.
  7. העבירו את העכבר למסגרת סטריאוטקסית של עכבר על ידי הנחת אפו תחילה בחרוט האף הסטריאוטקסי, ואז ייצבו את הגולגולת בעזרת מוטות אוזניים. שמור את העכבר על כרית חימום מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס לתמיכה תרמית לאורך כל הליך הניתוח. שמור על איזופלורן ב-1%-2% כך שהעכבר יציג קצב נשימה של נשימה אחת לשנייה.
  8. יש לחזור על מריחת סיכוך העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית במהלך ההליך במידת הצורך. מרחו וילון כירורגי סטרילי על גוף העכבר, מתחת לאוזניים, כדי להרחיב את גודל השדה הסטרילי.
  9. בצע חתך אנכי במקביל למישור הסגיטלי של החיה מאחורי נקודת האמצע של העיניים לחלק האחורי של הראש (עצם קודקודית) בעזרת להב אזמל #10. חשוף את הגולגולת על ידי נסיגה עדינה של העור לצדדים.
  10. השתמש בקצה Q כדי לשבש את הפאשיה על הגולגולת ולאפשר לגולגולת להתייבש כדי לחשוף ברגמה.
  11. הגדר זרועות מניפולטור עם מחזיק מקדחה הנושא מקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוהה עם מקדח 0.018 אינץ'.
  12. קדחו 3 חורי קוצים (קוטר 0.018 אינץ') עם מקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוהה בקואורדינטות בקליפת המוח התחושתית-מוטורית הימנית ב-2.25 מ"מ לרוחב לברגמה ו-+0.0 מ"מ רוסטרל, +1.0 מ"מ רוסטרל ו-1.0 מ"מ זנב לברגמה.
  13. החלף את המקדחה במזרק 26 גרם עם מחט באורך 0.375 אינץ'.
  14. טען 1.5 מיקרוליטר של 400 מיקרומטר ET-1 מומס ב-PBS סטרילי לתוך המזרק. כדי להבטיח זרימה טובה, שחרר נפח קטן של ET-1 עד שניתן להבחין בטיפה בקצה המחט. השתמש ב-Q-tip סטרילי כדי לנגב את העודפים לפני ביצוע ההזרקה.
  15. הורד את קצה המחט מעבר לגולגולת בחור הקוצים האמצעי (בקליפת המוח התחושתית-מוטורית הימנית ב-+ 0.0 קדמי ו-2.25 מ"מ לרוחב לברגמה) מבלי לנקב את הדורה מאטר. לאחר היישור, הורידו את המחט 1 מ"מ לתוך המוח.
  16. הזרקת 1 μL של ET-1 על ידי הוצאת 0.1 μL בכל פעם. דחוף את הבוכנה של מזרק המילטון קדימה כדי להוציא 0.1 מיקרוליטר והמתן דקה לפני הזרקת 0.1 מיקרוליטר הבא, הזריק עד להוצאת 1 מיקרוליטר.
    1. לאחר הוצאת ה-0.1 מיקרוליטר הסופי (0.1 מיקרוליטר x 10 זריקות = 1 מיקרוליטר בסך הכל), שמור את המחט במקומה למשך 10 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת ולאחר מכן משוך לאט כלפי מעלה כדי להסיר את המזרק.
  17. כדי להבטיח שהמחט לא תיחסם במהלך ההזרקה, שחרר נפח קטן של ה-ET-1 עד שניתן יהיה להבחין בטיפה בקצה המחט. השתמש ב-Q-tip סטרילי כדי לנגב את העודפים לפני ביצוע ההזרקה. עקר מזרקים לפני הזרקת PREempt לבעל החיים הבא, ואחריו 70% אלכוהול, ולאחר מכן PBS סטרילי.
  18. כדי לסגור את הפצע, תפר את העור שמעל הגולגולת יחד באמצעות תפר סטרילי פוליאסטר 4-0.
  19. יש לתת משחה אנטיביוטית באמצעות צמר גפן על האזור התפור כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח.
  20. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והעבר אותו לכלוב דיור בעלי חיים נקי ומחומם מראש באזור ההתאוששות. כבה את מכשיר האידוי והחמצן של איזופלורן.
  21. שמור את הכלוב על גבי כרית חימום למשך ההחלמה מההרדמה. לחלופין, אם אתה משתמש במנורת חימום, הנח את העכבר בצד הכלוב מתחת למנורה כך שהעכבר יוכל לעבור לצד הקריר של הכלוב כשהוא מתעורר מההרדמה כדי למנוע התחממות יתר. עקוב אחר העכבר כשהוא יוצא מההרדמה ב-5-10 הדקות הבאות.
  22. עקוב אחר העכבר במהלך 3 הימים הבאים (ניטור משקל), ספק טיפול לאחר הניתוח (צ'או מחית לח כדי להבטיח הידרציה) ומשככי כאבים (2 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם, פעמיים ביום תת עורית, למשך 2-3 ימים) בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים.

2. אספקת נגיף אדנו (AAV) (7 ימים - מודל תת-חריף או 21 ימים - מודל כרוני) לאחר שבץ מוחי

זהירות: עיין בהנחיות בטיחות ביולוגית מוסדיות לעבודה עם AAVs. על פי ההנחיות באוניברסיטת טורונטו, ניתוח זה מבוצע בארון בטיחות ביולוגית ברמה 2.

הערה: כל המכשירים והחומרים הכירורגיים עוברים חיטוי על ידי חיטוי לפני הניתוח. המסגרת הסטריאוטקסית מעוקרת באמצעות PREempt. מזרקים מעוקרים עם PREempt, 70% אלכוהול, ומוכנים ב-PBS סטרילי. AAV מאוחסנים על קרח לאורך כל הניתוח.

  1. לפני תחילת הניתוח, הגדר את אזור ההתאוששות על ידי הנחת כלוב נקי על כרית חימום המכוונת ל-37 מעלות צלזיוס. לחלופין, אם משתמשים במנורת חימום, הניחו רק מחצית מהכלוב מתחת לחום.
    1. כדי להרדים עכברים באמצעות איזופלורן, הנח את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה והפעל את החמצן ל-1-1.5 ליטר לדקה, ולאחר מכן כוונן את מכשיר האידוי איזופלורן ל-3%-5% כדי להתחיל הרדמה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על פי החוק).
  2. הסר את החיה מהתא ברגע שהיא שוכבת על צדה ואינה יכולה עוד לעמוד על משטח נקי. ודא שהחיה מורדמת כראוי על ידי אישור היעדר רפלקס צביטה בבוהן לפני ובמהלך הניתוח.
    1. אבטח את חרוט האף המורחב ממכונת ההרדמה על החיה והתאם איזופלורן ל-1%-2% לצורך תחזוקה. צמצם את החשיפה לאיזופלורן (5 דקות ב-3%-5% לאינדוקציה והזמן הנותר ב-1%-2%), מכיוון שההליך יכול להימשך עד 40 דקות.
  3. יש לשקול את בעל החיים ולתת את המינון המתאים של משכך כאבים טרום ניתוחי תת עורי (מלוקסיקם (2.0 מ"ג/ק"ג)) בהתאם למשקל.
  4. מרחו משחת סיכה לעיניים על כל עין של העכבר כדי למנוע ייבוש בקרנית תחת הרדמה.
  5. עקר את אזור העור קצוץ הפרווה עם 70% אתנול, ולאחר מכן אלכוהול כלורהקסידין פעמיים ליצירת שדה ניתוח.
  6. העבירו את העכבר למסגרת סטריאוטקסית של עכבר על ידי הנחת אפו תחילה בחרוט האף הסטריאוטקסי, ואז ייצבו את הגולגולת בעזרת מוטות אוזניים. שמור את העכבר על כרית חימום מוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס לתמיכה תרמית לאורך כל הליך הניתוח. שמור על איזופלורן ב-1%-2% כך שהעכבר יציג את קצב הנשימה של נשימה אחת לשנייה.
  7. יש לחזור על מריחת סיכוך העיניים כדי למנוע התייבשות בקרנית במהלך ההליך במידת הצורך. מרחו וילון כירורגי סטרילי על גוף העכבר, מתחת לאוזניים, כדי להרחיב את גודל השדה הסטרילי.
  8. אם עדיין קיים, חותכים תפרים עם מספריים כירורגיים ומסירים את הגלד בעזרת זוג מלקחיים. משוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
    הערה: עבור הדגם הכרוני ייתכן שיהיה צורך לכרות את העור עם להב אזמל #10.
  9. השתמש בקצה Q סטרילי כדי לייבש את הגולגולת ולאתר חורי קוצים.
  10. הגדר זרועות מניפולטור של המנגנון הסטריאוטקסי עם מחזיק מחט הנושא מזרק 26 גרם עם מחט באורך 0.375 אינץ'.
  11. טען 3.4 מיקרוליטר של AAV (1 x 109 עותקי גנום (GC)/μL למחקר חריף; 1 x 1010 GC/μL למחקר כרוני) לתוך המזרק. כדי להבטיח שהזרימה טובה, שחרר נפח קטן של AAV עד שניתן להבחין בטיפה בקצה המחט. השתמש ב-Q-tip סטרילי כדי לנגב את העודפים לפני ביצוע ההזרקה.
  12. הורד את קצה המחט מעבר לגולגולת בחור הקוצים הראשון המשמש ל-ET-1 (בקליפת המוח התחושתית-מוטורית הימנית ב-+ 0.0 קדמי ו-2.25 מ"מ לרוחב לברגמה) מבלי לנקב את הדורה מאטר. לאחר היישור, הורידו את המחט 1 מ"מ לתוך המוח. (0 AP, +2.25 מ"ל, -1.0 DV מברגמה).
  13. הזרקו 1 מיקרוליטר של AAV (1 x 109 GC/μL למחקר אקוטי; 1 x 1010 GC/μL למחקר כרוני) על ידי הוצאת 0.1 מיקרוליטר בכל פעם. דחוף את הבוכנה של מזרק המילטון קדימה כדי להוציא 0.1 מיקרוליטר והמתן דקה לפני הזרקת 0.1 מיקרוליטר הבא; להזריק עד להוצאת 1 מיקרוליטר. לאחר הוצאת ה-0.1 מיקרוליטר הסופי (0.1 מיקרוליטר x 10 זריקות = 1 מיקרוליטר בסך הכל), שמור את המחט במקומה למשך 10 דקות כדי למנוע זרימה חוזרת ולאחר מכן משוך לאט כלפי מעלה כדי להסיר את המזרק.
  14. כדי להבטיח שהמחט לא תיחסם במהלך ההזרקה, שחרר נפח קטן של ה-AAV עד שניתן להבחין בטיפה בקצה המחט. השתמש ב-Q-tip סטרילי כדי לנגב את העודפים לפני ביצוע ההזרקה.
  15. חזור על שלבים 2.11-2.14 עבור הזרקות ה-AAV לתוך שני חורי הקוצים הנותרים (בקליפת המוח התחושתית-מוטורית הימנית ב-+1 AP, +2.25 מ"ל, -1.0 DV; ו-1 AP, +2.25 מ"ל, -1.0 DV מ"מ מברגמה. עקר מזרקים לפני הזרקת PREempt לבעל החיים הבא, ואחריו 70% אלכוהול, ולבסוף PBS סטרילי.
  16. כדי לסגור את הפצע, תפר את העור שמעל הגולגולת יחד באמצעות תפר סטרילי פוליאסטר 4-0.
  17. יש לתת משחה אנטיביוטית באמצעות צמר גפן על האזור התפור כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח.
  18. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והעבר אותו לכלוב דיור בעלי חיים נקי ומחומם מראש באזור ההתאוששות. כבה את מכשיר האידוי והחמצן של איזופלורן.
  19. שמור את העכבר בתוך הכלוב ועיקר את החלק החיצוני של הכלוב עם PREempt ו-70% אלכוהול לפני הנחתו על גבי כרית חימום להתאוששות מהרדמה.
    1. לחלופין, אם אתה משתמש במנורת חימום, הנח את העכבר בצד הכלוב מתחת למנורה כך שהעכבר יוכל לעבור לצד הקריר של הכלוב כשהוא מתעורר מההרדמה כדי למנוע התחממות יתר. עקוב אחר העכבר כשהוא יוצא מההרדמה ב-5-10 הדקות הבאות.
  20. עקוב אחר העכבר במהלך 3 הימים הבאים (ניטור משקל), ספק טיפול לאחר הניתוח (צ'או מחית לח כדי להבטיח הידרציה) ומשככי כאבים (2 מ"ג/ק"ג מלוקסיקם, פעמיים ביום תת עורית, למשך 2-3 ימים) בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים.

3. הכנת רקמות ודיסקציה

  1. כדי להמית את העכבר, יש להזריק לעכבר תוך הצפק טריברומו-אתנול (אברטין) (12.5 מ"ג/מ"ל, 250 מ"ג/משקל (ק"ג)) ולאפשר 2-3 דקות לאינדוקציה מלאה. ודא שהחיה מורדמת כראוי על ידי הוצאת העכבר מהכלוב ואישור היעדר רפלקס צביטה בבוהן.
  2. במכסה אדים, בצע זלוף טרנס-קרדיאלי26 עם מי מלח ואחריו 4% פרפורמלדהיד. מרססים את ראשו של בעל החיים המורדם באתנול 70% עד להשרייה.
  3. חותכים את הראש בבסיס הגולגולת באמצעות מספריים גדולים. חותכים את העור לאורך קו האמצע של הגולגולת כולה בעזרת מספריים ישרים של קשתית בגודל 4-1/2 אינץ'. משוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
  4. מפתח חלל עמוד השדרה בצוואר, הכנס את מספרי הקשתית וחתוך את הגולגולת לאורך התפר הסגיטלי והבין-מצחי.
  5. לאחר מכן הכנס מספריים לשתי ארובות העיניים וחתוך את התפר הקדמי-אף.
  6. היזהר במיוחד לא לפגוע במוח. פתחו את לוחות הגולגולת שמאלה וימינה עד שהמוח נחשף.
  7. העבירו את המוח לבקבוקון נצנוץ עם 4% פרפורמלדהיד. שמור על המוח ב-4% פרפורמלדהיד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
  8. לאחר מכן המוח מוגן בהקפאה על ידי החלפת 4% פרפורמלדהיד ב-30% סוכרוז. שמור על המוח ב-30% סוכרוז ב-4 מעלות צלזיוס עד שהמוח שוקע לתחתית הבקבוקון (~12 שעות).

4. חיתוך מוחות קפואים

  1. הגדר את הטמפרטורה של תא הקריוסטט בין -20 מעלות צלזיוס ל-26 מעלות צלזיוס.
  2. בצע חתך עטרה על פני המוח הקטן והצמד את החלק השטוח והזנבי של המוח על צ'אק קריוסטט עם תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT).
  3. הנח את הצ'אק עם המוח במחזיק הדיסק ויישר את נורת הריח עם להב הסכין.
  4. חתכו את המוח לפרוסות עטרה בעובי של 20 מיקרומטר. כדי למנוע פסים או קווי שריטות על פרוסות מוח חתוכות, הנח פיסת סרט על משטח החיתוך כדי ליצור רווח קטן בין הצלחת נגד גלגול לפלטפורמה. ניתן להשתמש במברשת צבע כדי להתאים את כיוון החלק לפני צילומו על שקופית זכוכית טעונה חיובית.
  5. אחסן שקופיות המכילות חלקי מוח ב-20 מעלות צלזיוס.

5. אימונוהיסטוכימיה וכימות

  1. לעבד את החלקים לאימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדן ראשוני כנגד NeuN, סמן פאן-עצבי, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים22,26.
  2. הפשירו חלקי מוח שמורים בהקפאה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את החלקים שלוש פעמים עם 1x מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) למשך 5 דקות כל אחד.
  3. דגרו את החלקים ב-0.3% Triton X-100 ב-PBS למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל.
  4. הכן את תמיסת החסימה (5% סרום עיזים רגיל ו-0.3% טריטון X-100 ב-PBS) ודגר את החלקים בתמיסת החסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  5. לדלל את הנוגדן העיקרי, ארנב אנטי-NeuN, ביחס של 1:500 בתמיסת החסימה. דגרו את החלקים עם תמיסת הנוגדנים העיקרית למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  6. שטפו את החלקים שלוש פעמים עם 0.3% Triton X-100 ב-PBS, למשך 5 דקות בכל כביסה.
  7. יש לדלל את הנוגדן המשני, עז נגד ארנב 568 או 488, ביחס של 1:1000 ב-PBS. דגרו את החלקים עם תמיסת הנוגדנים המשנית למשך שעה בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור.
  8. בצע שלוש כביסות עם 0.3% Triton X-100 ב-PBS, למשך 5 דקות כל אחת. דגרו את החלקים עם DAPI (1:10,000 ב-PBS) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. שוטפים את החלקים שלוש פעמים נוספות עם PBS, למשך 5 דקות כל אחד. הרכיב את החלקים המוכתמים על מגלשת זכוכית עם מדיום הרכבה פלואורסצנטי וכיסוי זכוכית. אפשר למגלשות המותקנות להתייבש למשך הלילה.
  10. שקופיות מוכתמות בתמונה באמצעות אובייקט פי 20 עם מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לקבל תצוגות של תאי Reporter+ סביב נגע השבץ ב-3 קטעי קורונל שונים (בין האזורים האנטומיים של חציית הקורפוס קלוסום מלפנים וחציית הקומיסורה הקדמית מאחור) עבור כל בעל חיים.
    הערה: המרחק של התפשטות ה-AAV ישתנה בתוך חצי הכדור. עם זאת, בהתבסס על הניסיון שלנו וניתוח עיבוד הרקמות של תאי Reporter+, התפשטות ה-AAV משתרעת בדרך כלל על פני כ-+3 מ"מ עד -3 מ"מ מברגמה. יש לכמת תאים מדווח + סביב נגע השבץ (כפי שזוהה על ידי היעדר/צביעה דלילה של NeuN) באזור שבין המקום שבו הקורפוס קלוסום חוצה את קו האמצע לבין חיבור הקומיסורה הקדמית.
  11. לכימות נוירונים מותמרים, בצע ניתוח קולוקליזציה. ספור ידנית את מספר התאים החיוביים הכפולים (Reporter+NeuN+) ואת המספר הכולל של תאים שהומרו (Reporter+) בפרוסות מוח. לתוצאות כאן, נספרו >3 שדות ראייה המקיפים את הנגע (מדיאלי, רוחבי ונחות) מ-3 חתכים עטרתיים לכל עכבר.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לבחון את התוצאות התאיות של ביטוי מקדם GFAP קצר (gfaABC(1)D), מונע על ידי מקדם חוץ רחמי בסוג פרא (C57BL/6J) ובזנים מדווחים טרנסגניים tdTom-Cre (ספציפית, B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)22 שתי מערכות מבוססות AAV5 שימשו בעכברים שנפגעו משבץ ET-1 (איור 1A-C). במודל תת-חריף של שבץ מוחי, Neurod1 נארז במערכת Cre-Flex AAV ונמסר לעכברים מסוג בר ביום 7 לאחר השבץ (איור 1B). וקטור ה-Flex השני מכיל את הרצף ההפוך עבור GFP המונע על ידי מקדם ה-CAG המוקף באתרי רקומבינציה הטרוטיפיים אנטי-מקבילים מסוג loxP (איור 1B). שני המבנים הנגיפיים מוזרקים יחד באותו זמן לאחר השבץ המוחי. ברגע ש-Cre מתבטא בתאים שעברו התמרה, ה-GFP מתהפך ונכרת באתרי רקומבינציה, ומכוון את הרצף לכיוון החישה, מה שמאפשר ביטוי של GFP. לפיכך, תאים המבטאים Cre יהיו חיוביים ל-GFP, מה שמצביע על כך שהם הומרו על ידי וקטורי Cre-Flex. במודל התת-חריף, עכברים הוקרבו 21 ימים לאחר הטרנסדוקציה (כלומר, 28 ימים לאחר השבץ), ומספר התאים המומרים (GFP+), כמו גם מספר תאי NeuN+GFP+ (תאים מותמרים המבטאים NeuN), נספרו בפרנכימה של המוח שנפגע משבץ. כפי שניתן לראות באיור 2A, תאי עצב הולכים לאיבוד באתר הפגיעה האיסכמית. כימות של תאים מותמרים בפרדיגמה התת-חריפה באמצעות מערכת Cre-Flex AAV מגלה באופן משמעותי יותר נוירונים מסומנים (תאי NeuN+GFP+/GFP+) בעכברים שטופלו ב-Neurod1 בהשוואה לעכברי ביקורת Stroke-Cre (43.05 +/- 5.50% לעומת 18.43 +/- 3.03% תאי NeuN+GFP+/GFP+, ב-Stroke-Neurod1 לעומת 18.43 +/- 3.03% תאי NeuN+GFP+/GFP+, ב-Stroke-Neurod1 לעומת 18.43 +/- 3.03% בתאי Stroke-Neurod1 לעומת 18.43 +/- 3.03% בתאי NeuN+GFP+/GFP+, ב-Stroke-Neurod1 לעומת 18.43 +/- 3.03% תאי NeuN+GFP+/GFP+, ב-Stroke-Neurod1 לעומת 18.43 +/- 3.03% תאי NeuN+GFP+/GFP+. עכברים שטופלו ב-Stroke-Cre (ביקורת), בהתאמה) (p = 0.0172) (איור 2B,C).

בקבוצה נפרדת של ניסויים, המרת AtN בוצעה במודל כרוני של שבץ מוחי (איור 1B,C). גורם השעתוק Neurod1 הועבר לעכברי דיווח tdTom-Cre שנפגעו משבץ ביום ה-21 לאחר השבץ (איור 1C). זהה למערכת Cre-Flex המשמשת בעכברים מסוג בר, ביטוי Neurod1 הונע על ידי מקדם ה-GFAP הקצר. עם זאת, במערכת זו, נעשה שימוש במבנה AAV יחיד עם Cre recombinase בעקבות Neurod1 (איור 1B). לפיכך, תאים המבטאים GFAP ייצרו Cre recombinase, ויגרמו למדווח tdTom, המציין תאים שעברו התמרת AAV. עכברים הוקרבו 77 ימים לאחר השבץ (8 שבועות לאחר ה-AAV) (איור 1C). כפי שניתן לראות באיור 3A, נגע קליפת המוח נצפה ביום 77 לאחר השבץ בעכברי tdTom-Cre. מספר התאים המומרים המבטאים את הסמן העצבי, NeuN+, כומת (אחוז יחסי של תאי (NeuN+tdTom+/tdTom+) בשלב הכרוני שלאחר השבץ ומצא כי לעכברים שקיבלו Stroke-Neurod1 היו הרבה יותר נוירונים מתויגים בהשוואה לעכברי הביקורת Stroke-Cre (74.81 +/- 4.835% לעומת 53.05 +/- 5.028% תאי NeuN+tdTom+/tdTom+ ב-Stroke-Neurod1vs. עכברים שטופלו ב-Stroke-Cre (ביקורת), בהתאמה) (p = 0.0355) (איור 3B,C).

בסך הכל, התוצאות מדגימות התמרה בסיסית של נוירונים ומספר גבוה יותר של תאים מתמרים המבטאים NeuN+ עם העברת Neurod1 הן בשלב התת-חריף והן בשלב הכרוני שלאחר שבץ בעכברים מדווחים מסוג בר ו-tdTom-Cre, עם שתי מערכות שונות מבוססות AAV.

figure-results-1
איור 1: ביטוי חוץ רחמי של Neurod1, וקטורים וצירי זמן. (A) ייצוג גרפי של השראת שבץ על ידי הזרקת אנדותלין-1 (ET-1) לקליפת המוח המוטורית של העכבר. Adeno-Associated Virus (AAV) מועבר ב-3 אתרים, באתר ההזרקה ET-1 וכן באתרים המקיפים את הנגע, 1 מ"מ קדמי ואחורי. פאנל מוגדל המציג תאים מותמרים עם AAV-Neurod1 בקליפת המוח המוטורית. (B) סכמטי של שני וקטורי ה-AAV במערכת Cre-Flex שנמסרו לעכברים מסוג פרא (פאנל עליון). וקטור AAV5 1 מכיל את מקדם ה-GFAP הקצר, גורם השעתוק Neurod1 ורצף Cre recombinase המוקף באתר loxP (משולש שחור) ובאתר lox2272 (משולש לבן). וקטור AAV5 2 נושא את רצף מדווח הגנים GFP ההפוך משני צדיו זוג אתרי loxP ו-lox2272. התמרה של שני הווקטורים בתאים מביאה לכריתה והיפוך בתיווך Cre, מה שמאפשר לביטוי GFP לתייג תאים מותמרים. Neurod1 הועבר גם לעכברי tdTom-Cre באמצעות וקטור AAV5 אחד (פאנל תחתון). בווקטור AAV5 1 ארוזים מקדם ה-GFAP הקצר, גורם השעתוק Neurod1 ורצף ה-Cre recombinase. ביטוי Cre בתאים מתמרים מניע כריתה של קודון העצירה באתרי loxP (משולש שחור), המאפשר ביטוי tdTomato. (C) מערכת Cre-Flex נבדקה בעכברים מסוג בר עם AAVs שהוזרקו בתקופה התת-חריפה שלאחר השבץ (יום 7 לאחר השבץ). עכברים מסוג בר הוקרבו 21 ימים לאחר התמרת AAV (28 ימים לאחר השבץ). AAV הועבר לעכברי tdTom-Cre בתקופה הכרונית שלאחר השבץ (יום 21 לאחר השבץ), ועכברים הוקרבו 56 ימים לאחר התמרת AAV (77 ימים לאחר השבץ). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: העברת Neurod1 חוץ רחמית באמצעות Cre-Flex AAVs בשלב התת-חריף שלאחר שבץ מוחי מובילה למספר מוגבר של תאים מתמרים המבטאים NeuN. (A) צביעה חיסונית של חלקי מוח קורונליים דרך קליפת המוח המוטורית ביום 28 לאחר שבץ מעכברי Stroke-Cre (משמאל) ו-Stroke-Neurod1 (מימין). אובדן עצבי נצפה במקום הנגע (קווים מקווקווים לבנים). תאים מותמרים (GFP+, ירוק), נוירונים (NeuN+, אדום) ותאי NeuN+GFP+ (כתומים) משותפים נראים בקליפת המוח. פסי קנה מידה: 250 מיקרומטר. (B) תמונות מייצגות של בקרת Stroke-Cre (למעלה) ו-Stroke-Neurod1 (למטה) רקמת מוח המציגות נוירונים (NeuN+, אדום) ו-AAV התמרו GFP+ (ירוק). כניסות המתוארות בלבן מציגות תקריב של תאים עבור כל ערוץ בנפרד. ראשי חץ לבנים מציינים תאים שהומרו AAV (GFP+). חיצים לבנים מצביעים על תאי NeuN+GFP+ שעברו מיקום משותף. פסי קנה מידה: 125 מיקרומטר. (C) כימות של תאי NeuN+GFP+/GFP+ בעכברי Stroke-Cre ו-Stroke-Neurod1. N = 3 עכברים לקבוצה. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. מבחן שפירו-וילק (p = 0.3223). מבחן t לא מזווג, *p < 0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: העברת Neurod1 חוץ רחמית בעכברים מדווחים tdTom-Cre בשלב הכרוני שלאחר שבץ מוחי מובילה למספר מוגבר של תאים מתמרים המבטאים NeuN. (A) צביעה חיסונית של מקטעי מוח קורונליים דרך קליפת המוח המוטורית ביום 77 לאחר השבץ מעכברי Stroke-Cre ו-Stroke-Neurod1. אובדן עצבי נראה באתר הפגיעה האיסכמית (קווים מקווקווים לבנים). תאים מותמרים מסומנים ב-tdTom (אדום) ב-peri-infarct. NeuN+tdTom+ (כתום) הם תאים מותמרים המבטאים סמנים עצביים. פסי קנה מידה: 250 מיקרומטר. (B) תמונות מייצגות של בקרת Stroke-Cre (למעלה) ו-Stroke-Neurod1 (למטה) רקמת מוח המציגות נוירונים (NeuN+, ירוק) ותאים מותמרים AAV (tdTom+, אדום). כניסות המתוארות בלבן מציגות תקריב של תאים עבור כל ערוץ בנפרד. ראשי חצים לבנים מציינים תאים שהומרו AAV (tdTom+). חיצים לבנים מצביעים על תאי NeuN+tdTom+ משותפים. פסי קנה מידה: 125 מיקרומטר. (C) כימות של תאי NeuN+tdTom+/tdTom+ בפרדיגמה הכרונית מראה יותר תאים מותמרים המבטאים NeuN+ (תאי NeuN+tdTom+/tdTom+) בעכברים שטופלו ב-Neurod1 . N = 3 עכברים לקבוצה. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. מבחן שפירו-וילק (p = 0.2044). מבחן t לא מזווג, *p < 0.05. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מפרט שתי מערכות AAV ומודלים של עכברים לחקירת הביטוי החוץ רחמי של Neurod1 בהקשר של מודל שבץ מוחי ET-1 קל-בינוני. חשוב לקחת בחשבון מספר שלבים קריטיים הקשורים לשבץ ET-1 לצורך שחזור ועקביות הפציעה. יש לקדוח בזהירות חורי בור מבלי לנקב את הדורה מאטר כדי למנוע פציעה כירורגית לא מכוונת. חשוב להשתמש בציוני דרך עקביים, במקרה זה ברגמה, כדי להבטיח אזור עניין דומה (קליפת המוח התחושתית-מוטורית במחקר זה). זה חשוב במיוחד עבור מחקרים המשתמשים בהערכות התנהגותיות מכיוון שמיקום הנגע וגודלו ישפיעו על התוצאות התפקודיות 13,22,25,27. והכי חשוב, קצב ההזרקה של ET-1 והלחץ שמפעיל המנתח על המזרק צריכים להיות עקביים לתוצאות הניתנות לשחזור. יש לציין כי מחט המזרק עלולה להיסתם ויש לנקות אותה בין בעלי חיים כדי להבטיח משלוח מדויק של ET-1. במהלך ניתוח תאים של רקמות, אם לא נצפה נגע שבץ מוחי, סביר להניח שהמחט נסתמה במהלך הניתוח. אם הבעיה נמשכת, השג כמות חדשה של אנדותלין-1 מהיצרן, מכיוון שנצפו בעבר בעיות עוצמה תלויות אצווה.

השלבים להליך הכירורגי למתן AAV דומים לזה של פרוטוקול השראת שבץ ET-1. לפיכך, השיקולים הנ"ל הם קריטיים. בנוסף, הטיטר והנפח הנגיפי של AAV חייבים להיות עקביים כדי להבטיח שניתן להשוות את יעילות ההתמרה בין קבוצות. בפרוטוקול זה ניתנו 1 x 109 GC/μL של AAV עבור המחקר החריף ו-1 x10 10 GC/μL של AAV עבור המחקר הכרוני. חיוני לבחור מינון ויראלי נמוך מספיק כדי למזער ביטוי שגוי של מלאכותיות תוך שהוא עדיין גבוה מספיק כדי להבטיח העברת תאים מספקת, מה שמאפשר זיהוי הבדלים בין קבוצות ניסוי. טווח המינון הנגיפי האופטימלי למחקרים כאלה נקבע כ-107-10 10 GC/μL13,24. טיטרים גבוהים יותר של AAV לא רק מביאים לתיוג נרחב של נוירונים בקבוצת הביקורת, אלא גם הוכחו כגורמים לאסטרוציטוזיס, משבשים את מחסום הדם-מוח ומווסתים תגובות דלקתיות28,29. מחקרים שבדקו מתן גורם שעתוק בתיווך ויראלי לאחר שבץ השתמשו באתרי אספקה שונים לזריקות AAV. מחקר אחד תיאר תיוג מוצלח של תאים מתמרים באמצעות הזרקת AAV בודדת לאתר נגע השבץ13. מחקרים אחרים מכוונים לאזור אחד עד שלושה סביב אזור האוטם30. כאן, AAV הועבר בשלושה מקומות, עם זריקה אחת בקואורדינטות לאתר הזרקת ET-1 ו-2 סביב אתר הנגע (זריקה אחת ב-1.0 מ"מ קדמי וזריקה אחת ב-1.0 מ"מ אחורי) במטרה להמיר אסטרוציטים ריאקטיביים בגבול הגליה הפרילזיונלי9. במהלך ניתוח תאים של רקמה, אם לא נצפו תאים פלואורסצנטיים או מעט מאוד (1-10 תאים/חתך), ייתכן שהמחט נסתמה במהלך ההזרקה, או שה-AAV הופשר בהקפאה יותר מדי פעמים, מה שהוביל להשבתת הנגיף.

יעילות ההתמרה נבדקה בזמנים שונים במודל שבץ קל-בינוני, והתוצאות מראות כי הרבה יותר נוירונים מסומנים במוחות שטופלו ב-Neurod1 הן בתקופה התת-חריפה והן בזמנים הכרוניים שלאחר השבץ. העבודה המוצגת כאן היא הראשונה שמדגימה התמרה של Neurod1 בשלב הכרוני שלאחר שבץ מוחי וחושפת נוירונים המבטאים באופן אקטופי את Neurod1 עד 8 שבועות לאחר השבץ. בעוד שהממצאים לפיהם מספר גדל של נוירונים מתמרים נראים במוחות נפגעי שבץ שקיבלו Neurod1 לעומת וקטורי ביקורת עולים בקנה אחד עם Neurod1 הממלא תפקיד בהמרת AtN, פירוש התוצאות התאיות דורש ידע מוצק של מגבלות הפרדיגמה הניסויית. הרוב המכריע של המחקרים שפורסמו החוקרים המרת AtN משתמשים ב-GFAP כמקדם מכיוון ש-GFAP מווסת באסטרוציטים תגובתיים במחלות ניווניות, כולל שבץמוחי 4,31. עם זאת, הוכח כי ביטוי GFAP נמוך מתרחש גם בתאי עצב32. זה עולה בקנה אחד עם הממצאים שדווחו כאן לפיהם אחוז התאים המתמרים בקבוצת הביקורת (Stroke-Cre) הם נוירונים קיימים32. באופן ספציפי, קבוצות הביקורת של Stroke-Cre בפרוטוקול זה הראו תיוג של 18.43 +/- 3.03% ו-53.05 +/- 5.028% של תאי NeuN+Reporter+, המייצג תיוג של נוירונים קיימים, המצביע על ביטוי מונע GFAP בתאי עצב. ואכן, ביטוי ממוקד של Neurod1 תלוי במספר גורמים, כולל טרופיזם ויראלי. הוכח כי AAV5 מתמיר נוירונים ביעילות שונה באזורי מוח שונים, כולל קליפת המוח התחושתית-מוטורית, מה שמצביע על כך שלסרוטיפים של AAV יש טרופיזם תאים אזורי, אשר צריך להילקח בחשבון במחקרים הגורמים לביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק31,33. זני עכברים יכולים גם להשפיע על התמרת AAV14,34. מחקר שהשווה התמרת AAV בסטריאטום של עכברים מסוג בר (C57BL/6J) ו-FVB/N מצא טרופיזם תאים משתנה ויעילות התמרה בשני הזנים34.

היתרון של מערכת Cre-Flex הוא שניתן להשתמש בה לתיוג ארוך טווח בעכברים מסוג בר, מה שעשוי להפחית את הנושא של ביטוי Cre לא ספציפי הקיים בשורות עכבר Cre-reporter15,35. החיסרון של מערכת Cre-Flex הוא שביטוי טרנסגנים בלתי תלוי ב-Cre עשוי להתרחש עקב 0.1%-0.8% מהחלקיקים הנגיפיים ששילבו מחדש אתרי LoxP במהלך ייצור הנגיף36. ממצאים אלה מדגישים את החשיבות של ניסויי מעקב אחר שושלת, למשל, תיוג מראש של אסטרוציטים לפני מתן AAV באמצעות קו העכבר Aldh1l1-CreERT2, כדי להבטיח שהמרת AtN לא תהיה מוערכת יתר על המידה בעת דיווח מסקנות15. מחקרים הציעו כי הפעלה של מקדם ה-GFAP האנושי (כפי שנעשה בו שימוש במחקרים אלה) באמצעות ויסות ציס על ידי גנים במורד הזרם (כגון Neurod1) עשויה לגרום לביטוי GFAP בנוירונים אנדוגניים, מה שמוביל למספר גבוה יותר של נוירונים מסומנים בקבוצת הטיפול15,32. יחד, מחקרים אלה והממצאים כאן מדגישים את החשיבות של ניסויי מעקב אחר שושלת, למשל, תיוג מראש של אסטרוציטים או נוירונים לפני מתן AAV, כדי להבדיל בין נוירונים קיימים ואנדוגניים במהלך הניתוח15.

בבחינת הצעדים הבאים שיכולים להפחית את ההתמרה העצבית, סרוטיפים שונים של AAV ו/או שימוש במקדם פחות מופקר ספציפי לאסטרוציטים יהיו שימושיים19. מספר הולך וגדל של דיווחים המתארים הטרוגניות של אסטרוציטים עשוי להשפיע עוד יותר על ספציפיות ביטוי הגנים אם תת-אוכלוסיות שונות של אסטרוציטים רגישות יותר להמרת AtN באופן כללי 37,38,39,40.

גיל בעלי החיים המשמשים במודלים פרה-קליניים של פציעה או מחלה הוא גם שיקול חשוב שעשוי להציג תוצאות משתנות. לדוגמה, במקרה של נוירוטראומה, הגיל יכול להשפיע על תגובתיות האסטרוציטים, מה שישפיע על תוצאות המחקר עבור המרת AtN41. בנוסף, קווי דיווח הניתנים להשראה יכולים לאבד את ספציפיות הביטוי לאורך זמן, מה שיכול להשפיע על מדדי התוצאה42. עד כה, תכנות מחדש בבעלי חיים מבוגרים לא נחקר באופן מקיף43.

הפרוטוקול מתאר מתן AAV בשני שלבים לאחר שבץ מוחי: (1) השלב התת-חריף (לאחר 7 ימים) ו-(2) השלב הכרוני (לאחר 21 יום) לאחר שבץ איסכמי. ביטוי חוץ רחמי של Neurod1 במודל שבץ כרוני לא נבדק; לפיכך, לתצפית כי הרבה יותר נוירונים מסומנים בשלב מאוחר זה יש השלכות חשובות על מחקרים עתידיים שמטרתם לקדם התאוששות משבץ מוחי בשבץ כרוני. מחקרים הבוחנים את הפוטנציאל לביטוי חוץ רחמי של Neurod1 כדי לשפר את תוצאות השבץ יצטרכו לשלב הערכות התנהגותיות, שכן תוצאות תפקודיות לאחר שבץ מוחי הן המדדים הרלוונטיים ביותר מבחינה קלינית להצלחה להתערבות טיפולית 13,22,25,27.

נכון לעכשיו אין טיפולים זמינים לחולים הסובלים ממוגבלויות הנגרמות משבץ מוחי בשלבים התת-חריפים והכרוניים שלאחר השבץ, למעט שיקום, שיש לו תועלת מוגבלת. ביטוי מאולץ של גנים נוירוגניים bHLH בגליה הוכח כמשפר את התוצאות התפקודיות לאחר שבץמוחי 22,30. הממצאים עולים בקנה אחד עם מחקרי תכנות מחדש של AtN המראים כי הביטוי החוץ רחמי של Neurod1 מגביר את ההתמרה העצבית ב-3 ו-7 שבועות לאחר מתן AAV בהשוואה לעכברים שקיבלו את וקטור הביקורת. והכי חשוב, מספר מאמרים תיארו המלצות לבקרות מחקר, עיצוב ופרשנויות בתחום התכנות מחדש של AtN 17,18,19,22. לשם כך, פרוטוקול זה תיאר מערכות AAV ומודלים של עכברים לביטוי חוץ רחמי של גורמי שעתוק לאחר שבץ מוחי, שניתן להשתמש בהם כדי ליידע ולקדם חקירות נוספות על המנגנונים התאיים העומדים בבסיס התצפיות.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי קרן הלב והשבץ, המכון לרפואה רגנרטיבית של אונטריו, קרן המצוינות המחקרית הראשונה של קנדה (Medicine by Design, MbD) ופרס החדשנות של קונוט (אוניברסיטת טורונטו).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
#77 מקדח (0.018 אינץ')דיוויד קופף אינסטרומנטס8177
AAV5-GFAP(0.7)-mNeurod1-2A-iCreוקטור  תפר נספג Biolabs
עם פוליסורב מחט; פוליאסטר CV-15 3/8 מחט נקודת התחדדות מעגל גודל 4 - 0 קלועCovidienGL-881
נוגדן נגד NeuN (ארנב) Millipore SigmaABN78 
C57BL/6 עכבריםנהר צ'ארלס027
תמיסת כלורהקסידיןPartnarPCH-020
Contec™   PREempt™ תמיסת חיטוי RTUFisher Scientific29-636-6212
CryostatThermo Scientific HM525 NX 
Endothelin 1Millipore Sigma05-23-3800-0.5MG
בטיחות נוצה סכין גילוח מיקרוטוםלהבים נוצה12-631P
Fisherbrand  משקפי כיסוי: מלבניםפישר סיינטיפיק12-545M 
הרכבה פלואורסצנטית MediumAgilent TechnologiesS3023 
מזרק המילטוןחברת המילטון7634-01
מקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוההDavid Kopf Instruments1474
Metacam Solution (Meloxicam)Boehringer Ingelheim
O.C.T CompoundFisher Scientific23-730-571
pAAV2/5-GFAP-iCreVector BuilderP190924-1001suq
משחת פולידרם USPTARO2181908
SOMNI Scientific™   כרית חימום טמפרטורת בעלי חייםפישר סיינטיפיק04-777-177
מכשירים סטריאוטקסייםדיוויד קופףדגם 902
שקופיות סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ, לבןפישרברנד12-550-15
tdעכברי כתב עגבניות מעבדת ג'קסון007914
V-1 מערכת הרדמה לבעלי חיים במעבדה שולחניתVetEquip901806
מכשירי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2016 Stroke Collaborators. Global, regional, and national burden of stroke, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 439-458 (2016).
  2. Iadecola, C., Buckwalter, M. S., Anrather, J. Immune responses to stroke: Mechanisms, modulation, and therapeutic potential. J Clin Invest. 130 (6), 2777-2788 (2020).
  3. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. Int J Mol Sci. 21 (20), 7609(2020).
  4. Fifield, K. E., Vanderluit, J. L. Rapid degeneration of neurons in the penumbra region following a small, focal ischemic stroke. Eur J Neurosci. 52 (4), 3196-3214 (2020).
  5. Burda, J. E., Sofroniew, M. V. Reactive gliosis and the multicellular response to CNS damage and disease. Neuron. 81 (2), 229-248 (2014).
  6. Kowalczyk, A., Kleniewska, P., Kolodziejczyk, M., Skibska, B., Goraca, A. The role of endothelin-1 and endothelin receptor antagonists in inflammatory response and sepsis. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 63 (1), 41-52 (2015).
  7. Silver, J. The glial scar is more than just astrocytes. Exp Neurol. 286, 147-149 (2016).
  8. Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
  9. Adams, K. L., Gallo, V. The diversity and disparity of the glial scar. Nat Neurosci. 21 (1), 9-15 (2018).
  10. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  11. Vasan, L., Park, E., David, L. A., Fleming, T., Schuurmans, C. Direct neuronal reprogramming: Bridging the gap between basic science and clinical application. Front Cell Dev Biol. 9, 681087(2021).
  12. Berninger, B., et al. Functional properties of neurons derived from in vitro reprogrammed postnatal astroglia. J Neurosci. 27 (32), 8654-8664 (2007).
  13. Chen, Y. C., et al. A neurod1 aav-based gene therapy for functional brain repair after ischemic injury through in vivo astrocyte-to-neuron conversion. Mol Ther. 28 (1), 217-234 (2020).
  14. Ghazale, H., et al. Ascl1 phospho-site mutations enhance neuronal conversion of adult cortical astrocytes in vivo. Front Neurosci. 16, 917071(2022).
  15. Wang, L. L., et al. Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo. Cell. 184 (21), 5465-5481.e16 (2021).
  16. Xie, Y., Zhou, J., Wang, L. L., Zhang, C. L., Chen, B. New aav tools fail to detect neurod1-mediated neuronal conversion of muller glia and astrocytes in vivo. EBioMedicine. 90, 104531(2023).
  17. Bocchi, R., Masserdotti, G., Gotz, M. Direct neuronal reprogramming: Fast forward from new concepts toward therapeutic approaches. Neuron. 110 (3), 366-393 (2022).
  18. Huang, L., et al. A promise for neuronal repair: Reprogramming astrocytes into neurons in vivo. Biosci Rep. 44 (1), BSR20231717(2024).
  19. Hickmott, J. W., Morshead, C. M. Glia-to-neuron reprogramming to the rescue. Neural Regen Res. 20 (5), 1395-1396 (2024).
  20. Gao, X., Wang, X., Xiong, W., Chen, J. In vivo reprogramming reactive glia into iPSCs to produce new neurons in the cortex following traumatic brain injury. Sci Rep. 6, 22490(2016).
  21. Guo, Z., et al. In vivo direct reprogramming of reactive glial cells into functional neurons after brain injury and in an alzheimer's disease model. Cell Stem Cell. 14 (2), 188-202 (2014).
  22. Livingston, J. M., et al. Ectopic expression of neurod1 is sufficient for functional recovery following a sensory-motor cortical stroke. Biomedicines. 12 (3), 663(2024).
  23. Tai, W., Xu, X. M., Zhang, C. L. Regeneration through in vivo cell fate reprogramming for neural repair. Front Cell Neurosci. 14, 107(2020).
  24. Wu, Z., et al. Gene therapy conversion of striatal astrocytes into gabaergic neurons in mouse models of Huntington's disease. Nat Commun. 11 (1), 1105(2020).
  25. Roome, R. B., et al. A reproducible endothelin-1 model of forelimb motor cortex stroke in the mouse. J Neurosci Methods. 233, 34-44 (2014).
  26. Islam, R., et al. Inhibition of apoptosis in a model of ischemic stroke leads to enhanced cell survival, endogenous neural precursor cell activation and improved functional outcomes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1786(2024).
  27. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
  28. Guo, Y., et al. High-titer AAV disrupts cerebrovascular integrity and induces lymphocyte infiltration in adult mouse brain. Mol Ther Methods Clin Dev. 31, 101102(2023).
  29. Ortinski, P. I., et al. Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition. Nat Neurosci. 13 (5), 584-591 (2010).
  30. Jiang, M. Q., et al. Conversion of reactive astrocytes to induced neurons enhances neuronal repair and functional recovery after ischemic stroke. Front Aging Neurosci. 13, 612856(2021).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), e76310(2013).
  32. Su, M., et al. Expression specificity of GFAP transgenes. Neurochem Res. 29 (11), 2075-2093 (2004).
  33. Kofoed, R. H., et al. Efficacy of gene delivery to the brain using AAV and ultrasound depends on serotypes and brain areas. J Control Release. 351, 667-680 (2022).
  34. He, T., et al. The influence of murine genetic background in adeno-associated virus transduction of the mouse brain. Hum Gene Ther Clin Dev. 30 (4), 169-181 (2019).
  35. Hu, N. Y., et al. Expression patterns of inducible cre recombinase driven by differential astrocyte-specific promoters in transgenic mouse lines. Neurosci Bull. 36 (5), 530-544 (2020).
  36. Botterill, J. J., et al. Off-target expression of cre-dependent adeno-associated viruses in wild-type c57bl/6j mice. eNeuro. 8 (6), ENEURO.0363-ENEURO.0421 (2021).
  37. Hasel, P., Rose, I. V. L., Sadick, J. S., Kim, R. D., Liddelow, S. A. Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the mouse brain. Nat Neurosci. 24 (10), 1475-1487 (2021).
  38. Kim, R. D., et al. Temporal and spatial analysis of astrocytes following stroke identifies novel drivers of reactivity. bioRxiv. , (2023).
  39. Matias, I., Morgado, J., Gomes, F. C. A. Astrocyte heterogeneity: Impact to brain aging and disease. Front Aging Neurosci. 11, 59(2019).
  40. Miller, S. J. Astrocyte heterogeneity in the adult central nervous system. Front Cell Neurosci. 12, 401(2018).
  41. Early, A. N., Gorman, A. A., Van Eldik, L. J., Bachstetter, A. D., Morganti, J. M. Effects of advanced age upon astrocyte-specific responses to acute traumatic brain injury in mice. J Neuroinflammation. 17 (1), 115(2020).
  42. Donocoff, R. S., Teteloshvili, N., Chung, H., Shoulson, R., Creusot, R. J. Optimization of tamoxifen-induced cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 10 (1), 15244(2020).
  43. Gresita, A., et al. Very low efficiency of direct reprogramming of astrocytes into neurons in the brains of young and aged mice after cerebral ischemia. Front Aging Neurosci. 11, 334(2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Neurod1GFAPEndothelin 1

מאמרים קשורים