מאמר שיטה

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66966

⸱

15 בנובמבר 2024

 ,  ,  ,  , 
1Shanghai Immune Therapy Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Zhejiang University-University of Edinburgh Institute (ZJU-UoE Institute), Zhejiang University School of Medicine, Zhejiang University, 3Institute of Immunology and Department of Rheumatology, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול להתמרה רטרו-ויראלית של RNA מנחה לתאי T ראשוניים מעכברים טרנסגניים Cas9, המספקים חלופה יעילה לעריכת גנים בחקר התמיינות Th17.

תקציר

תאי T מסייעים המייצרים IL-17A, הידועים בשם תאי Th17, ממלאים תפקיד קריטי בהגנה החיסונית ומעורבים בהפרעות אוטואימוניות. ניתן לעורר תאי CD4 T באמצעות אנטיגנים וקוקטיילים ציטוקינים מוגדרים היטב במבחנה כדי לחקות התמיינות תאי Th17 in vivo. מחקרים נרחבים נערכו על מנגנוני ויסות התמיינות Th17 באמצעות מבחן הקיטוב Th17 במבחנה .

שיטות קיטוב קונבנציונליות של Th17 כוללות בדרך כלל השגת תאי CD4 T נאיביים מעכברים מהונדסים גנטית כדי לחקור את ההשפעות של גנים ספציפיים על התמיינות Th17 ותפקודו. שיטות אלה יכולות לגזול זמן רב ויקרות ועשויות להיות מושפעות מגורמים חיצוניים של התא מבעלי החיים הנוקאאוטים. לפיכך, פרוטוקול המשתמש בטרנסדוקציה רטרו-ויראלית של רנ"א מנחה כדי להציג נוקאאוט גנטי בתאי T ראשוניים של עכבר CRISPR/Cas9 משמש כגישה חלופית שימושית מאוד. מאמר זה מציג פרוטוקול להתמיינות תאי T ראשוניים נאיביים לתאי Th17 בעקבות מיקוד גנים בתיווך רטרו-ויראלי, כמו גם שיטות ניתוח ציטומטריית זרימה עוקבות להערכת יעילות זיהום והתמיינות.

מבוא

תאי Th17, תת-קבוצה ייחודית של תאי עזר CD4+ T, חיוניים לחיסול חיידקים ופטריות חוץ-תאיים וממלאים תפקיד משמעותי במחלות אוטואימוניות שונות 1,2,3. ראיות חדשות מצביעות על כך שתאי Th17 מפגינים הטרוגניות, מתפקדים בתנאים פתוגניים ולא פתוגניים, המושפעים מגורמים סביבתיים וגנטיים. הבהרת תהליכי הבקרה השולטים בהתמיינות תאי Th17, פלסטיות והטרוגניות חיונית לקידום אסטרטגיות אימונותרפיות יעילות יותר.

בעלי חיים מהונדסים גנטית נמצאים בשימוש נרחב כדי לחשוף את הרגולטורים העיקריים של התמיינות תאי Th17 ותפקודם. שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטית כרוך במניפולציה מלאה in vivo, המספקת אותנטיות ומחקר שיטתי של תפקידו במצבים פיזיולוגיים או במודלים של מחלות. עם זאת, סינון בתפוקה גבוהה בגישה זו אינו מעשי במידה רבה. מבחני קיטוב חוץ גופי מספקים חלופה לחקר התמיינות תאי Th17. אינטרלוקין 6 (IL-6) בשילוב עם גורם גדילה טרנספורמטיבי β1 (TGFβ1) הוכח כמקדם התפתחות של תאי Th17 שאינם פתוגניים, בעוד IL-6, IL-1β ו- IL-23 מעורבים בהנעת התמיינות תאי Th17 פתוגניים (pTh17)4,5.

הופעתה של טכנולוגיית CRISPR/Cas9 אפשרה עריכה מדויקת של הגנום בבסיסים ספציפיים. בשילוב עם התמרה רטרו-ויראלית, גישה זו מספקת שיטה גנטית חזקה, יעילה וחסכונית לסינון ומחקר פונקציונלי של רגולטורים פוטנציאליים בתאי Th17 6,7. במחקר זה שיפרנו את הליך ההתמרה הרטרו-ויראלית בתוך מערכת הקיטוב Th17. באמצעות מערכת רטרו-ויראלית, הדבקנו תאי T נאיביים מופעלים המבטאים Cas9 מראש מעכברים. התאים הותמרו עם מבני רנ"א מנחה (gRNA) המונעים על ידי מקדם U6, יחד עם גנים המקודדים חלבוני כתב פלואורסצנטי תחת שליטתו של מקדם EF1a כדי להקל על נוקאאוט של גן המטרה. לאחר מכן, תאי T המומרים גודלו בתרבית בתנאים ציטוקינים ספציפיים כדי לגרום להתמיינות לתאי Th17. יש לציין, נוק אאוט RoRγt הפחית באופן משמעותי את הייצור IL-17A בהשוואה לקבוצת הביקורת. יעילותה של מערכת זו תלויה בייצור רטרו-וירוס אופטימלי ובתנאי התמרה עבור תאי T ראשוניים פעילים, המספקים גישה מהירה ומעשית לחקר גנים ספציפיים בהתמיינות ובתפקוד Th17.

פרוטוקול

כל הנהלים אושרו על ידי ועדת האתיקה לרווחת בעלי חיים ניסיוניים, בית החולים רנג'י, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי והם עומדים בהנחיות המוסדיות.

1. ייצור רטרו-ויראלי

  1. הכנת מבנה רטרו-ויראלי
    1. השתמש בכלי CRISPick (https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public) כדי לעצב את sgRNA עבור RORγt knockout8. ציין את גנום הייחוס כעכבר GRCm38, ובחר את רצף PAM כ - NGG (עבור SpyoCas9, Hsu (2013) tracrRNA) בהתבסס על מערכת מדריך CRISPRko. אמת את שם גן היעד או תבניות אחרות של גן היעד ושלח את הקלט החוקי כדי להשיג מועמדים ל-sgRNA. הגדרת פרמטרים אחרים לערכי ברירת מחדל, הגדר יעד sgRNA ל- RORγt (Rorc, Gene ID: 19885) כדי להפריע להבחנה של Th17 ובחר sgRNA שאינו מכוון (abbr. sgNT, רצף: GCGAGGTATTCGGCTCCGCG) מספריות GeCKO v2 של העכבר.
      הערה: כלי זה מציע מגוון אפשרויות לחיצות לעיצוב רנ"א מדריך, ומאפשר התאמה אישית נוחה כדי לעמוד בדרישות ספציפיות.
      1. הזן את שם גן היעד בתיבת החיפוש תחת העמודה בדיקת מידע מהירה של גנים. המערכת תציג את מזהה הגן ואת השם המלא של גן המטרה כדי להבטיח בחירה מדויקת.
        הערה: אפשרויות נוספות זמינות לאימות תבניות שונות של גני יעד.
    2. בחר sgRNA אחד ממוקד ברצף Rorc (abbr. sgRorc) בהתאם לסדר הדירוג והבחירה המשולב הגבוה כדי להימנע מהתאמות מחוץ למטרה ולהגדיל את יעילות המטרה (רצף sgRorc: GTCATCTGGGATCCACTACG). סנתז שני אוליגונוקלאוטידים עבור sgRorc ו- sgNT: עבור האוליגו הקדמי, צרף את הרצף "gttttagagctagaaatagcaagttaaaat" לסוף 5' של כל רצף מנחה; עבור האוליגו ההפוך, צרף את הרצף "tttcgtcctttccacaagatatataaagc" לסוף 3' של כל רצף מנחה.
      הערה: בדרך כלל, קיימות אפשרויות מרובות עבור רצפי sgRNA. חיוני לבחור 2 או 3 רצפי sgRNA המכוונים לאותו גנוטיפ כדי להעריך את יעילות הנוקאאוט שלהם. בניסויים הראשוניים שלנו, נבחרו שני gRNA המכוונים ל-Rorc להשוואה (רצף sgRNA 1: GTCATCTGGGATCCACTACG; רצף sgRNA 2: CTTGAGTATAGTCCAGAACG). תוצאות הניסוי הצביעו על כך שה-gRNA המוצג בשיטה הנוכחית (רצף sgRNA 1) מציג יעילות נוקאאוט גבוהה יותר בין השניים.
    3. להגביר את רצפי הקידוד sgRorc ו-sgNT באמצעות DNA פולימראז ב-PCR עם הפריימרים הנ"ל ולשכפל אותם לווקטור pMX-U6-MCS (בין האזורים של מקדם U6 לפיגום gRNA) במסגרת עם חלבון פלואורסצנטי mCherry, בהתאמה9. הגדר את מערכת התגובה (50 μL) כטבלה 1. פריימרים אלה מורכבים מרצף sgRNA ('3), אשר יכול להכניס את sgRNA לתוך הווקטור, ומקטע של רצף וקטורי ('5), אשר יכול להגביר את המקטע הווקטורי באורך מלא. בנוסף, תכננו את הפריימרים קדימה ואחורה עם חפיפה של כ-18 bp בתוך אזור sgRNA (אך לא חפיפה מלאה), מה שמקל על הרכבת וקטור השיבוט הליניארי במהלך תהליך הקשירה.
      הערה: יש לקבל מקטע וקטורי ליניארי באתר של רצף sgRNA עם פריימרים על ידי PCR של כ- 5,551 kd.
    4. לטהר את המבנה באמצעות ערכת מיצוי ג'ל ולסובב אותו באמצעות ערכת שיבוט. השתמש במוצרי הרקומבינציה למבחני טרנספורמציה.
    5. בחר את השיבוטים הבודדים מלוחות ואמת רצפי קידוד sgRorc או sgNT באמצעות ריצוף מהדור הראשון, באמצעות פריימר מקדם U6 (רצף: ATGGACTATCATATGCTTACCGTA).
    6. בחר את השיבוט היחיד הרצוי להגברה במרק LB. חלץ DNA פלסמיד באיכות גבוהה מתאי חיידקים באמצעות ערכת פלסמיד ללא אנדוטוקסין.
      הערה: ודא כי פתרון פלסמיד יש באיכות גבוהה. אנו ממליצים כי ריכוז תמיסת פלסמיד צריך להיות לפחות 1 מיקרוגרם / μL.
  2. הכנת תאי אריזה
    1. הכינו תאי Platinum-E (Plat-E) באמצעות ההליך הבא: תאי Plat-E בתרבית עם מדיום הנשר המעובד (DMEM medium) של Dulbecco המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 100 יחידות / מ"ל פניצילין, וסטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל בצלחת תרבית של 10 ס"מ. זה ייקרא מדיום תרבית התא להלן.
      הערה: כדי להשיג את יעילות הטרנספקציה הנכונה, אנו ממליצים להשתמש בתאים בשלב הגידול הלוגריתמי עם פחות מ- 15 מספרי מעבר.
    2. לפצל צלחת מלאה של 10 ס"מ Plat-E תאים (~ 2.6 × 107 תאים) ביחס נכון לתוך צלחת חדשה 10 ס"מ 1 יום לפני transfection כדי להשיג מפגש תאים של כ 80% למחרת, שהוא המצב האופטימלי עבור transfection. בצע העברת תאים עבור צלחת חדשה של 10 ס"מ ביחס של 1:3 (זרע ~ 8 × 106 תאים בצלחת חדשה של 10 ס"מ יום לפני ההדבקה).
      הערה: יחס הפיצול מותנה במצב הגידול של התאים, עם יעילות טרנספקציה גבוהה יותר הניתנת להשגה בתאים המציגים צמיחה איתנה. אנו מבצעים העברת תאים לצלחת של 10 ס"מ ביחס של 1:3. עבור מנות תרבית תאים שונות, כגון צלחת 6 ס"מ, אנו ממליצים כי 1.5 × 106 תאים Plat-E צריך להיות זרע יום לפני transfection.
  3. טרנספקציה
    1. שעה לפני הטרנספקציה, להחליף את מדיום תרבית התא עם 8 מ"ל של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום עם 5% FBS, אבל ללא פניצילין-סטרפטומיצין, כפי שהוא עלול להפריע מגיב transfection. יש לחמם את הסרום המופחת ל-37°C לפני השימוש.
    2. הכינו את תערובת הטרנספקציה המכילה תערובת 1 וערבוב 2: ערבוב 1 כולל 18 מיקרוגרם DNA פלסמיד (pMXs-U6-MCS-sgNT-mCherry/pMXs-U6-MCS-sgRorc-mCherry) ו-6 מיקרוגרם של pCL-Ecotropic Retroviral Vector (pCL-Eco) ב-1,000 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת. Mix 2 מכיל 48 μL של מגיב transfection ב 1,000 μL של מדיום סרום מופחת. הוסיפו את תערובת 2, טיפה אחר טיפה לערבב 1 וערבבו בעדינות וביסודיות. לדגור את המתחם במשך 15-20 דקות ב 20-25 מעלות צלזיוס.
    3. טפטפו בזהירות את התערובת לתוך תאי Plat-E, ערבלו את הצלחת בעדינות כדי להבטיח פיזור אחיד. לדגור על התאים ב 37 ° C תחת 5% CO2 במשך 6-12 שעות.
    4. החלף את המדיום עם 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים טריים ולהמשיך לדגור את התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 48 שעות.
    5. להעריך את יעילות הטרנספקציה בתאי Plat-E על ידי זיהוי התג הווקטורי הרטרו-ויראלי, המשמש כפרוקסי, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או ציטומטריית זרימה.
      הערה: אות mCherry fluorescence חזק (החיובי הפלואורסצנטי עולה על 80%) זוהה בחלק ניכר של תאי Plat-E שהודבקו בווקטור pMX-U6-MCS, מה שמצביע על טרנספקציה מוצלחת.
    6. קצרו את הסופרנאטנט והצנטריפוגה המכילים וירוס בטמפרטורה של 1,500 × גרם למשך 10 דקות כדי להסיר שברי תאים. Aliquot את supernatant וירוס 1 מ"ל לכל בקבוקון ולאחסן ב -80 ° C.
      הערה: סינון הוא שיטה חלופית לסילוק פסולת תאים. אנו ממליצים להשתמש במסנן מזרק בגודל נקבוביות של 0.45 מיקרומטר ובקרום פוליאתרסולפון (PES) כדי למזער את שימור החלקיקים הנגיפיים על קרום המסנן.

2. זיהום רטרו-ויראלי של תאי CD4 + T פעילים והתמיינות Th17

  1. הכנה והפעלה של תאי T נאיביים ראשוניים מסוג CD4+
    1. מצפים כל באר של צלחת תרבית תאים 24 בארות עם 2 מיקרוגרם / מ"ל של אנטי CD3e ו 4 מיקרוגרם / מ"ל של אנטי CD28 ב 500 μL PBS סטרילי, לעטוף את הצלחת בפרפילם כדי למנוע אידוי וזיהום, ולאחר מכן לדגור צלחת ב 4 ° C במשך הלילה (או 37 ° C במשך 1-2 שעות לפני ציפוי תאי CD4 + T) ביום לפני בידוד תאי CD4 + T נאיביים.
      הערה: שלב זה נדרש כדי לבצע גירוי הקשור לצלחת עבור תאי T של העכבר לפני ביצוע התמרה ויראלית.
    2. למחרת, הרדימו עכברים בני 6-8 שבועות המבטאים Cas9 (עכברי R26-CAG-Cas9) על ידי חנקCO2 ועיקרו אותם עם 70% אתנול.
    3. קצרו את טחול העכבר והניחו אותו ב-PBS עם 2% FBS ו-100 μM EDTA (FACS BUFFER).
    4. טוחנים את הטחול עם זכוכית טחונה מעוקרת (צד מט) במאגר FACS, הופכים את הרקמה לתרחיף חד-תאי ומסננים את תרחיף התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל.
      הערה: הקפד לטחון את הרקמה בעדינות ובעקביות כדי לשמור על לחות הרקמה. שחיקה אלימה של הרקמה יכולה להשפיע על הישרדות התא באופן דרמטי.
    5. סובב את מתלה התא הטפלני ב 800 × גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 2 מ"ל של חיץ ליזה של תאים אדומים. הניחו לו לשבת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ולאחר מכן הוסיפו מאגר FACS כדי להגיע לנפח כולל של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הטחול ב 800 × גרם במשך 5 דקות.
    6. השהה מחדש את הטחול וסנן אותם דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 1 מ"ל עבור בידוד תאי CD4+ T.
    7. בודד תאי CD4+ T באמצעות ערכות ריאגנטים מסחריות על ידי ביצוע ההוראות במדריך.
    8. תייג את תאי CD4+ T עם תערובת נוגדנים פלואורסצנטיים (CD4, CD25, CD44 ו- CD62L) ב 4 ° C במשך 30 דקות, לשטוף את התאים עם מאגר FACS, ולבודד את תאי CD4+ T נאיבי באמצעות ממיין תאי זרימה. זה יביא להשגת CD4 + CD25-CD62LגבוהCD44 תאי T נאיבינמוך.
    9. הסר את הסופרנאטנט לגירוי הקשור לצלחת מצלחת תרבית התאים בעלת 24 הבארות (שהוכנה בשלב 2.1.1) ושטוף כל באר פעמיים עם 500 מיקרוליטר PBS. צלחת 1 x 106 תאי T נאיביים CD4+ ב 1 מ"ל של מדיום תרבית לימפוציטים בבאר של צלחת תרבית תאים 24 באר. לדגור על התאים באינקובטור התא.
      הערה: מדיום תרבית לימפוציטים מכיל 10% FBS, 100 יחידות / מ"ל פניצילין, ו 0.1 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין, 1 mM נתרן פירובט, 10 mM HEPES, ו 50 מיקרומטר β-ME במדיום RPMI 1640.
  2. זיהום רטרו-ויראלי
    1. לאחר 18-24 שעות, לאסוף כל באר של תאים פעילים לתוך צינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 5 דקות, ולהשליך את supernatant.
    2. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של תערובת זיהום (10 מיקרוגרם/מ"ל הקסדימתרין ברומיד, 10 מ"מ HEPES בסופרנטנט וירוסים) ולהוסיף 1 מ"ל מהתערובת לבאר חדשה של צלחת תרבית תאים בת 48 בארות. בינתיים, שמור מספיק תאים כבקרה שלילית (לא מומרת).
      הערה: זה אפשרי להיות פחות מ 1 x 106 תאי CD4 + T נאיבי מופעל לכל באר, אבל לא מומלץ להשתמש פחות מ 0.5 x 106 תאים לכל באר. בנוסף, אין לזרוע תאים בבארות ההיקפיות של צלחת התרבית בת 48 הקידוחים.
    3. עוטפים את הצלחת בפרפילם, וצנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 90 דקות ב 32 ° C. הגדר האצה והאטה ב- 3. לאחר הצנטריפוגה, להסיר את parafilm, לדגור את התאים באינקובטור במשך 4 שעות, ולהמשיך עם שלבי התמיינות.
  3. התמיינות של תאים נגועים לתאי Th17
    1. הכינו את התאים מציגי האנטיגן (APC) במהלך הדבקה רטרו-ויראלית. ראשית, השג טחול מעכברי בר בהתאם להוראות משלבים 2.1.2 עד 2.1.4. להשעות מחדש את הטחול עם 1 מ"ל של מדיום תרבית לימפוציטים עם 50 מיקרוגרם / מ"ל מיטומיצין בצינור 15 מ"ל. לדגור על הטחול ב 37 ° C תחת 5% CO2 במשך 1 שעות.
    2. שעה לאחר מכן, הוסף PBS עד סימן 15 מ"ל כדי לשטוף את הטחול, צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant, להשעות מחדש את splenocytes עם 1 מ"ל של מדיום תרבית לימפוציטים, ולספור את מספר התא. תאי APC הוכנו בהצלחה.
    3. לאחר 4 שעות של דגירה התא (כמו בשלב 2.2.3), לאסוף תאי CD4 + T מותמרים בצינורות 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש תאים נגועים ב-600 מיקרוליטר של PBS כדי לשטוף. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.
    4. מניחים 0.5 × 106 תאי CD4+ T מומרים ב 1 מ"ל של מדיום תרבית לימפוציטים עם 1.5 x 106 תאי APC בבאר של צלחת תרבית תאים 24 בארות. תוסף עם 2 מיקרוגרם/מ"ל של אנטי-CD3e, 2 מיקרוגרם/מ"ל של אנטי-CD28 וקוקטייל התמיינות תאים Th17, המכיל 10 מיקרוגרם/מ"ל אנטי-IFNγ, 10 מיקרוגרם/מ"ל אנטי-IL-12/IL23 p40, 10 מיקרוגרם/מ"ל אנטי-IL4, 2.5-3 ננוגרם/מ"ל hTGF-β ו-20-30 ננוגרם/מ"ל IL-6. תאי תרבית במשך יומיים.
    5. אספו כל באר תאים לתוך צינורות 1.5 מ"ל, צנטריפוגות ב 800 x גרם במשך 5 דקות, והשליכו את supernatant. רענן 1 מ"ל חדש של מדיום תרבית הלימפוציטים רק עם 3 ng/mL TGF-β ו- 30 ng/mL IL-6. הניחו את התאים בבאר חדשה של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות לתקופת תרבית ממושכת. נתח את התאים 2 ימים לאחר שינוי בינוני.

3. הערכת יעילות התמרה ותוצאות בידול

  1. לאחר יומיים של שינוי בינוני, לאסוף תאים וצנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant. טפל בתאים ממוינים עם 50 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 500 ng/mL ionomycin ו- 5 μg/mL brefeldin A ב- 500 μL של מדיום תרבית לימפוציטים בבאר חדשה של צלחת תרבית תאים 24 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. קצור מחצית מהתאים לניתוח ציטומטריית זרימה וליזה את החצי השני של התאים עם מאגר מיצוי RNA לניתוח qPCR.
  2. לניתוח ציטומטריית זרימה
    1. לאסוף את התאים לתוך צינורות 1.5 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של חיץ FACS לתוך צינורות וצנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 5 דקות כדי לשטוף את התאים.
    2. השהה מחדש את גלולת התא עם תערובת נוגדנים פלואורסצנטיים (CD4 וצבע קיימא ניתן לתיקון ב -100 מיקרוליטר של PBS) והכתים את התאים ב -4 ° C למשך 30 דקות.
    3. שטפו את התאים עם 300 μL של PBS וקבעו אותם עם 300 μL של 2% פורמלדהיד חוצץ פוספט (FA) ב 4 °C למשך 60 דקות לפחות.
    4. שעה לאחר מכן, לשטוף את התאים עם PBS, להשעות אותם עם 600 μL של 1x permeabilization חיץ וצנטריפוגה ב 800 × גרם במשך 5 דקות.
    5. יש להשליך את הסופרנאטנט והכתם עם אנטי-IL-17A ב-100 מיקרוליטר של חיץ חדירה 1x למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר או 4°C למשך הלילה.
    6. למחרת, לשטוף את התאים עם 1x permeabilization buffer ולהשעות אותם מחדש 200 μL של PBS. נתח את התאים לפי ציטומטריית זרימה10. עיין בסעיף תוצאות מייצגות.
  3. לניתוח qPCR, חלץ RNA בהתאם להוראות ערכת מיצוי ה- RNA. תעתיק לאחור את הרנ"א לתוך cDNA לאחסון או ניתוח qPCR לאחר מכן. העיצוב של פריימרים אלה צריך לדבוק בעקרונות התכנון הכלליים של פריימר qPCR תוך התמקדות ספציפית באזור המשתרע על פני אתר האינדל הצפוי, שבו התרחש מחשוף בתיווך gRNA. כל ירידה ביעילות ההגברה או אובדן אות באתר זה עשויה לשמש אינדיקטור לנוקאאוט מוצלח. פריימרים qPCR הם כדלקמן:
    Rorc F: TCCACTACGGGGTTATCACCT; R: AGTAGGCCACATTACACTGCT.
    IL17a F: TCAGCGTGTCCAAACACTGAG; R: CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT.

תוצאות

במחקר שיבטנו את מטרת ה-sgRNA לרצפי קידוד Rorc ו-sgRNA-non-targeting לווקטור pMX-U6-MCS עם חלבון פלואורסצנטי mCherry (איור 1A,B). ייצור רטרו-וירוס בוצע בהתאם לפרוטוקול המתואר באיור 2. הטרנספקציה החלה ביום 0, והקציר הרטרו-ויראלי התרחש ביום השני. ניתן לבדוק את יעילות הטרנספקציה על-ידי עוצמת הפלואורסצנטיות של mCherry (איור 1C). לפני קצירת הנגיף, תאי CD4+ T נאיביים מוינו והופעלו. תאי CD4+ T מופעלים אלה נדבקו לאחר מכן באמצעות זיהום ספין, ואחריו המשך שלבי ההתמיינות כמתואר. לבסוף, יעילות הטרנסדוקציה ותוצאות הדיפרנציאציה הוערכו באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה וניתוח qPCR.

איור 3 מדגים את אסטרטגיית ה-gating המיושמת למיון תאי T נאיביים מסוג CD4+. לאחר בחירת אוכלוסיית התאים הראשית ותאי סינגלט (כפי שמוצג בשני השערים הראשונים של איור 3), תאי +FVD CD4 גודרו כדי להבחין בין תאי CD4 T בתאי Th17 מקוטבים לבין תאי APC. לבסוף, IL-17A המיוצר על ידי תאי CD4 T מייצגים יעילות התמיינות Th17, אשר הצביעה על יעילות הנוקאאוט. אחוז התאים החיוביים mCherry משקף את היעילות של זיהום רטרו-ויראלי, בעוד יעילות הנוקאאוט מסומנת על ידי אחוז התאים החיוביים IL-17A. כדי לשפר את כדאיות התאים ולמזער את משך המיון, הטחול הועשר באמצעות ערכת בידוד תאי CD4+ T של עכבר, וכתוצאה מכך יעילות העשרה עלתה על 90%.

היעילות של זיהום רטרו-וירוס, המצוין על-ידי נוכחות של תאים חיוביים ל-mCherry, היא בדרך כלל בסביבות 40% (איור 4A). למרות שניתן להגביר את יעילות ההדבקה באמצעות ריכוז הנגיף, גישה זו באה על חשבון משך ניסוי ממושך ועלויות גבוהות יותר. בניסויים שלנו, תאים נגועים שגודלו בתרבית ללא קוקטייל התמיינות תאי Th17 שימשו כבקרה שלילית להתמיינות Th17, המסומנת כ-Th0. sgRNA שאינו מכוון שימש כבקרה חיובית, המכונה sgNT. לצורך עריכת גנים, השתמשנו ב-gRNA המכוון לגן RORγt (sgRNA-Rorc), מה שהפחית באופן משמעותי את יעילות התמיינות Th17 (איור 4A). התערבות זו הובילה גם לירידה משמעותית ברמות הביטוי של Rorc ו-IL-17a (איור 4B).

figure-results-1
איור 1: דוגמה של sgRNA המשובט לתת-וקטור רטרו-ויראלי ויעילות טרנספקציה. וקטור pMX-U6-MCS שימש כמבנה הראשוני. פיגום ה-gRNA, יחד עם רצפי ה-sgRNA (החלק הכתום) המכוונים לאתר המקושקש (A) ו-(B) Rorc, הוכנסו במורד הזרם של מקדם U6 (החלק הירוק כקטע לריצוף עם פריימרים U6). המיקומים של פריימרים המכילים sgRNA ואתרי פריימר ריצוף מסומנים מתחת לווקטור המעגלי השמות המלאים של הקיצורים על הפלסמיד הם כדלקמן. קיצורים: AmpR = עמידות לאמפיצילין, קרבניצלין ואנטיביוטיקה קשורה; LTR = חזרה מסוף ארוך; MMLVψ = אות אריזה של נגיף לוקמיה מולוני מורין; gag = קטוע Moloney murine leukemia virus (MMLV) גן gag חסר קודון התחלה. (C) הדמיה מיקרוסקופית של mCherry בתאי Plat-E נגועים בפלסמיד DNA. סרגל קנה מידה: 500 פיקסלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: המחשה סכמטית של הפרוטוקול. יום לפני הטרנספקציה, צפיפות תאי Plat-E צריכה להיות מותאמת לטווח הנכון. למחרת (יום 0), לבצע transfection ולהחליף בינוני 12 שעות מאוחר יותר. ביום הראשון, מיין והפעל את תאי T נאיביים מעכברים המבטאים Cas9. לאחר מכן (יום 2), קצרו את תרבית העל המכילה את הנגיף ושלבו עם תאי T המופעלים לצורך התמרה רטרו-ויראלית. התאים הנגועים מתמיינים לתאי Th17 למשך 3-4 ימים ומנותחים באמצעות FACS. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: אסטרטגיית Gating למיון תאי T נאיביים CD4. צביעת פני השטח בוצעה על תאי CD4 T מועשרים כדי לתייג CD4, CD25, CD44 ו- CD62L. אסטרטגיית הגאטינג שננקטה הייתה כדלקמן: בתחילה, לימפוציטים היו מגודרים על בסיס פרמטרים של פיזור קדמי ופיזור צד. לאחר מכן, תאים בודדים זוהו באמצעות FSC-H ו- FSC-W. תאי CD4+CD25 גודרו כדי להוציא תאי T רגולטוריים (Tregs). לבסוף, זוהו תאי T נאיבייםגבוהים CD44 CD62L. תאי T נאיביים CD4+ שבודדו נאספו לניסויים הבאים. קיצורים: FSC = פיזור קדימה; SSC = פיזור צד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: דוגמה להתמרה מוצלחת של תאי T פעילים והתמיינות Th17. (A) יעילות ההתמיינות של Th17 מופחתת באופן משמעותי, אשר נערך על ידי RORγt gRNA (gating on mCherry+ IL-17a+population). (B) ביטוי יחסי של Rorγt ו-IL-17a ב-Th0 (תאים נגועים בתרבית ללא קוקטייל התמיינות תאי Th17), sgNT (sgRNA שאינו ממוקד) ו-sgRNA-Rorc (sgRNA המכוון לגן RORγt ). p < 0.001 (מבחן t של תלמיד דו-זנבי לא מזווג; הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

רכיבי תגובת PCRתוכנית PCR
רכיבנפח (μL)צעדטמפ.זמןמחזור
2 × תערובת פנטה (צבע פלוס)25195ºC3 דקות1
ddH2020295ºC15 שניות
פריימר-F (10 מיקרומטר)2356ºC15 שניות
פריימר-R (10 מיקרומטר)2472ºC5 דקות 30 שניותעבור לשלב 2
35 ×
תבנית (~ 30 ng)1572ºC5 דקות1
612ºC∞

טבלה 1: רכיבי תגובת PCR ותוכנית PCR לבניית וקטור gRNA.

דיון

עריכת גנום CRISPR/Cas9 באמצעות העברה רטרו-ויראלית היא שיטה חזקה לחקר תפקידיהם של תאי T עוזרים. פרוטוקול זה מציע גישה מהירה ויעילה לבחינת גנים ספציפיים המעורבים בהתמיינות ובתפקוד Th17. יש לעקוב בזהירות אחר מספר צעדים קריטיים כדי להשיג תוצאות אופטימליות. ראשית, לשיפור יעילות הנוקאאוט של גנים, יש לבחור בקפידה gRNA. בהתחשב בסיכון של השפעות מחוץ למטרה בעריכת גנים CRISPR/Cas9, זה נבון לבחור 2-3 gRNA עם ציונים גבוהים, כפי שזוהה בסעיף פרוטוקול 1.1.1, עבור ניסויים נוספים11,12. שנית, טיטר נגיפי גבוה חיוני להדבקה מוצלחת. תחזוקה נאותה של קו תאי האריזה Plat-E היא חיונית. תאים צריכים להגיע למפגש של כ -80% ביום ההדבקה, מכיוון שגם מספרי תאים לא מספיקים וגם מוגזמים יפגעו בטיטרים של הנגיף. אם תאי Plat-E אינם זמינים, העברה משותפת של תאי כליות עובריות אנושיות 293T עם וקטור pCL-Eco יכולה גם לייצר טיטרים נגיפיים גבוהים13,14. שמירה על ריכוז פלסמיד גבוה של לפחות 1 מיקרוגרם / μL חשובה להשגת טיטר וירוס גבוה. חיוני לקצור את ההשעיה של הנגיף לפני שהוא הופך לצהוב לימון מכיוון שהווירוס מפגין רגישות לשינוי pH. לכן, יש לווסת בזהירות את רמת החומציות של מדיום התרבית בטווח מתאים. הנגיף צריך להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמותו ומוגן מפני מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים15.

שלישית, כדי להשיג יעילות זיהום גבוהה, תאים ראשוניים חייבים להיות מופעלים כראוי. הפעלה תאית לקויה פוגעת באופן משמעותי ביעילות הזיהום הנגיפי16. לפני ההדבקה הנגיפית, מצב ההפעלה של תאי T צריך להיות מאושר מיקרוסקופית, שכן תאים פעילים מציגים גודל גדול יותר מאשר תאים בלתי פעילים. ראוי לציין כי פרוטוקול הבידול Th17 שלנו עבר אופטימיזציה ספציפית עבור עכברי C57BL/6, כך שייתכן שיהיה צורך בהתאמות עבור זני עכברים אחרים. רביעית, כדי להשיג את תוצאות ההתמיינות הרצויות של Th17, שמירה על תנאים תאיים אופטימליים היא חיונית. במהלך זיהום ספין, חשוב למקם את התאים בבארות ליד המרכז כדי לסייע בשמירה על קיום התא. לאחר זיהום ספין, דגירה של התאים במשך 4 שעות (שלב פרוטוקול 2.2.4) חיונית להחלמתם. בנוסף, בעת העברת תאים, פיפטינג עדין חשוב לשמירה על כדאיות התא. תנאי גירוי שונים יכולים להשפיע על התמיינות Th17. בניסוי זה, שילוב תאים מציגי אנטיגן במערכת ההתמיינות שיפר משמעותית את יעילות ההתמיינות בהשוואה לגירוי אנטי-CD3e ואנטי-CD28 הקשור לצלחות. לבסוף, חיוני להבטיח שכל הציטוקינים שבהם נעשה שימוש ימשיכו לתפקד במהלך ההובלה והאחסון. ציטוקינים עלולים לאבד במהירות יציבות במחזורי הפשרה חוזרים ונשנים של הקפאה או בפתרונות הרכבה מחדש בלתי הולמים. טיפול קר aliquots שווים נחוצים עבור ציטוקינים לשמור על פונקציות לאורך כל ההליכים.

לפרוטוקול זה ליצירת תאי Th17 ספציפיים בנוקאאוט גנטי יש מספר מגבלות. ראשית, קשה להשיג יעילות התמרה מלאה בתאי T ראשוניים של עכבר. תאים מסוימים עשויים שלא לעבור את הנוקאאוט הגנטי המיועד במהלך התמיינות Th17. שנית, לתאי T ראשוניים יש תוחלת חיים מוגבלת במבחנה. לאחר כשבוע, תאים אלה נוטים למות, מה שמציב אתגרים לניסויים הבאים. שלישית, הפרוטוקול שלנו מסתמך על עכברים טרנסגניים Cas9 וכאשר ניסינו לשלב את רצף Cas9 בפלסמיד הליבה, הדבר הביא לירידה משמעותית בטיטרים נגיפיים. לבסוף, אנו מבחינים כי פרוטוקול זה אינו מתאים לניתוח פונקציות של גנים המעורבים בשלבים המוקדמים של הפעלת תאי CD4+ T נאיבית, שכן תאים אלה חייבים להיות מופעלים לפני התמרה רטרו-ויראלית.

למרות מגבלותיו, פרוטוקול זה יושם בהצלחה במחקרים שונים, מה שמקל על חקירתם של רגולטורים גנטיים מרכזיים המעורבים בהתמיינות Th17. הוא מאפשר להעריך שינויים ביעילות התמיינות Th17 בעקבות נוקאאוט של גני מטרה בתאי T פעילים. בנוסף, פרוטוקול זה מתאים להערכת היבטים אחרים של תפקוד תאי Th17, כולל שגשוג תאים, הישרדות, יציבות פקטורי שעתוק, הפרשת ציטוקינים ותגובות חיסוניות. יתר על כן, המעבדה שלנו הוכיחה את יעילותה בהתמרה רטרו-ויראלית ובהתמיינות של תאי T רגולטוריים מושרים (iTregs). למרות שלא כל סוגי תאי T נבדקו, פרוטוקול זה עשוי להיות ישים גם בתת-קבוצות אחרות, כגון תאי T Th1, Th2 ו- CD8+ . בסך הכל, טכניקה זו משמשת ככלי רב ערך לביצוע נוקאאוטים גנטיים בתאי מערכת החיסון, ומציעה פוטנציאל משמעותי לחשיפת אותות גנטיים קריטיים המווסתים את תפקודי מערכת החיסון.

גילויים

המחברים קובעים כי אין ניגודי עניינים.

תודות

אנו מודים לדאו ליו, דונגליאנג שו ופינפין הו ממתקן הליבה של המכון לטיפול חיסוני בשנחאי על תמיכתם בשימוש במכשירים. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין מענקים 31930038, U21A20199, 32100718 ו-32350007 (ללינרונג לו); 32100718 (לשואשיאו ג'ין); צוות מחקר חדשני של אוניברסיטאות מקומיות ברמה גבוהה בשנחאי SHSMU-ZLCX 20211600 (ללינרונג לו); תוכנית הדגירה הפנימית RJTJ24-QN-076 (לזג'ין קוי). איור 2 הוכן עם Figdraw.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5 M EDTA (pH 8.0)SolarbioE1170
צלחת תרבית תאים ורקמות 100 מ"מBIOFILTCD010100
1 M Hepes (חומצה חופשית, סטרילית)SolarbioH1090
צלחת תרבית תאים ורקמות 24 בארותNEST702002
צלחת תרבית תאים ורקמות 48 בארותNEST748002
Brefeldin תמיסה (פי 1,000)BioLegend420601
נוגדן CD4 נגד עכבר סגול מבריק 650 (RM4-5)BioLegend100546
CD3e נוגדן חד-שבטי (145-2C11), דרגה פונקציונלית, נוגדן חד-שבטי eBioscienceInvitrogen16-0031-82
CD44 (IM7), PE, נוגדן חד-שבטי של eBioscienceInvitrogen12-0441-83
CD62L (L-Selectin) נוגדן חד-שבטי (MEL-14), APC, eBioscienceInvitrogen17-0621-82 
מונה תאיםNexcelom BioscienceCellometer אוטומטי 2000
מסננת תאים (40 μ m)מסננת תאים biosharpBS-40-CS
(70 μ m) אפנדורף5425  צנטריפוגה R
 eppendorf5810 R
ChamQ SYBR צבע qPCR מאסטר מיקסVazymeQ411-02
ClonExpress II ערכת שיבוט שלב אחדVazymeC112
DH5α תאים מוכשריםSangon BiotechB528413
Direct-zol RNA MiniprepZYMO RESEARCHR2050
DMEM בינוניBasalMediaL110KJ
EasySep עכבר CD4+ ערכת בידוד תאי T STEMCELL19852
eBioscience כדאיות לתיקון צבע eFluor 660Invitrogen65-0864-18
ערכת מיני פלסמיד EndoFree IITIANGENDP118-02
ExFect Transfection ReagentVazymeT101-01
סרום בקר עוברי, פרימיום פלוסGibcoA5669701
FITC נוגדן IL-17A נגד עכבר (TC11-18H10.1)BioLegend506907
תמיסת פורמלדהידMacklinF864792
HiScript IV RT SuperMix עבור qPCR?+מגב gDNA?VazymeR423-01
IonomycinBeyotimeS1672
Mitomycin CMaokang Biotechnology7/7/1950
עכבר GRCm38NCBIRefSeq v.108.20200622
OPTI-MEM סרום מופחת בינוניGibco31985070סרום מופחת בינוני
פסיפיק כחול נגד עכבר CD4 נוגדן CD4 (RM4-5)BioLegend
100531 PE/Cyanine7 נגד עכבר CD25 נוגדן (PC61)BioLegend102015
PE/Cyanine7 נגד עכבר CD4 נוגדן (GK1.5)BioLegend100422
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)Gibco15140122-PMA
/TPA עכברי BeyotimeS1819
R26-CAG-Cas9 מרכז אורגניזמים מודל שנחאיCat. מס' NM-KI-00120
חלבון TGF-beta 1 רקומביננטי אנושי (מבוטא CHO), CFR& D Systems11409-BH
עכברים רקומביננטיים IL-6PeproTech216-16
מנתח תאי מחקרBD BiosciencesBD LSRFortessa
Research Cell SorterSONYMA900
RPMI 1640 בינוניBasalMediaL210KJ
SimpliAmp Thermal Cycler PCR SystemApplied BiosystemsA24811
תמיסת נתרן פירובט (100 מ"מ)Sigma-AldrichS8636
Ultra-LEAF מטוהר נגד עכבר CD28 נוגדן (37.51)BioLegend102121
Ultra-LEAF מטוהר נגד עכבר IFN-γ נוגדן (XMG1.2)BioLegend505847
Ultra-LEAF מטוהר נגד עכבר IL-4 נוגדן (11B11)BioLegend504135
Ultra-LEAF מטוהר נגד עכבר IL-12/IL-23 p40 נוגדן (C17.8)BioLegend505309
&-Mercaptoethanol (50 מ"מ)SolarbioM8211

מקורות

  1. Wu, B., Wan, Y. Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases. Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).
  2. Dong, C. Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming. Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).
  3. Patel, D. D., Kuchroo, V. K. Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions. Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).
  4. Ghoreschi, K., et al. Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling. Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).
  5. Lee, Y., et al. Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells. Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).
  6. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  7. Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).
  8. Doench, J. G., et al. Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  9. Holst, J., et al. Generation of t-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).
  10. Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells. J Vis Exp. (172), (2021).
  11. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  12. Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases. Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).
  13. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function. J Vis Exp. (117), e54698(2016).
  14. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  15. Cante-Barrett, K., et al. Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters. BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).
  16. Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells. J Vis Exp. (44), 2307(2010).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

T CD4In VitroROR Gamma TRNA sgRNA
מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.