מאמר שיטה

זיהוי מונחה ביואסי של מוצרים טבעיים להדברה ביולוגית על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה - ביואוטוגרפיה ישירה

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66967

⸱

26 ביולי 2024

 ,  ,  , 
1Charlottetown Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, 2Department of Chemistry, University of Prince Edward Island, 3Saskatoon Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים את השימוש בכרומטוגרפיה בשכבה דקה, בדיקת ביואוטוגרפיה ישירה וספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית כדי לזהות מוצרים טבעיים מיקרוביאליים המציגים אנטגוניזם נגד פתוגנים פטרייתיים באמצעות הפתוגן Sclerotinia sclerotiorum והדברה ביולוגית Bacillus isolates כמערכת מודל.

תקציר

ביואוטוגרפיה ישירה כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC-DB) היא בדיקה ביולוגית מבוססת היטב המשמשת להפרדה וזיהוי של מוצרים טבעיים (NPs) האנטגוניסטים כנגד פתוגן מטרה. זוהי אפשרות מהירה, זולה ופשוטה לבידוד וזיהוי מונחה ביולוגיה של NPs התלויה בהפרדה על ידי TLC יחד עם יישום ישיר של פתוגן מטרה לבחינת פעילות ביולוגית. הוא משמש בדרך כלל לניתוח תמציות צמחים ביו-אקטיביות, לזיהוי פעילות מעכבת נגד חיידקים, פטריות ואנזימים. עם זאת, יש לו פוטנציאל גדול בגילוי NP חיידקי, במיוחד להערכת NPs חיידקיים כנגד פתוגנים חקלאיים רלוונטיים, שהוא בעל ערך לגילוי ופיתוח חומרי הדברה ביולוגיים חדשניים לתעשיית החקלאות. יתר על כן, זהו פרוטוקול גמיש שניתן ליישם על פתוגני מטרה אחרים או מקורות של NPs בתוכניות מחקר הנוגעות לגילוי וזיהוי של תרכובות ביו-אקטיביות. במאמר זה אנו מתארים מערכת מודל לגילוי וזיהוי NPs של חומרי הדברה ביולוגיים באמצעות TLC-DB עם Bacillus spp. והפתוגן החקלאי Sclerotinia sclerotiorum.

מבוא

פתוגנים חקלאיים פטרייתיים גורמים להפסדים משמעותיים באיכות היבול וביבולים ברחבי העולם, ותורמים לאתגרים הכלכליים והאספקה של מערכת ייצור מזון עולמית יציבה 1,2. ניתן למנוע נזק לפתוגנים על ידי גידול זנים עמידים לזיהום ושימוש במערכות משולבות לניהול יבולים, כולל סיבובי יבולים ושיטות ניהול קרקע לדיכוי התפשטות פתוגן 3,4. למרות ששיטות אלה מפחיתות את הנזק ליבולים, חומרי הדברה כימיים משמשים בדרך כלל יחד כדי להרוג באופן פעיל מבני רבייה פטרייתיים בשדה ולמנוע עוד יותר נזק והפחתת יבול. למרות יעילותו, לשימוש בחומרי הדברה כימיים יש חסרונות רבים, כולל נזק למערכות האקולוגיות הסובבות, ירידה בפוריות הקרקע, סיכונים הקשורים לבריאות האדם ופיתוח עמידות לפתוגנים, כאשר האחרון גורם למינונים גבוהים יותר של חומרי הדברה להידרש מדי שנה 5,6,7.

מוצרים מבוססי חיידקים להדברת מזיקים ופתוגנים נחשבים זה מכבר לחלופות פוטנציאליות או משלימים לחומרי הדברה סינתטיים. מאז תחילת 1900, Bacillus thuringiensis נמצא בשימוש נרחב להדברת מזיקים ופתוגנים חקלאיים כטיפול בזרעים, כריסוס עלווה, ובטיפול ישיר בקרקע8. מוצרים כאלה נקראו חומרי הדברה ביולוגיים והם מאופיינים כמיקרואורגניזמים טבעיים או ביוכימיקלים שיכולים להרוג, לדכא או להפחית את המרץ של מזיק מטרה או פתוגן. הדברה ביולוגית יכולה לשלוט בגדילה של פתוגן באמצעות מנגנונים שונים, אך לרוב היא עושה זאת באמצעות הפרשת מטבוליטים שניוניים9. מטבוליטים שניוניים, המכונים לעתים קרובות מוצרים טבעיים, אינם מעורבים בחילוף החומרים הראשוני אלא מיוצרים כיתרון אבולוציוני כדי להתחרות במיקרואורגניזמים אחרים10.

חומרי הדברה ביולוגיים מציעים יתרונות רבים על פני עמיתיהם הסינתטיים. הם מהווים סיכון רעילות נמוך לסביבה, לבעלי החיים ולבני האדם בהשוואה למוצרי הדברה סינתטיים 9,10. מאחר שרוב חומרי ההדברה הביולוגיים קיימים באופן טבעי בסביבה מזה אלפי שנים, קיימים בסביבה מסלולי פירוק ביולוגי של מטבוליטים מיקרוביאליים, המגבילים את האפשרות לזיהום קרקע או מערכות אקולוגיות ומקצרים את זמני השהייה התורמים לכך שחומרי הדברה סינתטיים הרסניים לסביבה11 . בנוסף, חומרי הדברה ביולוגיים רבים המשמשים להפחתת זיהום פתוגני מפגינים גם תכונות מעודדות גדילה של צמחים, אשר יכולות להגביר את הזמינות הביולוגית של חומרי מזון ולגרום לעמידות מערכתית של צמחים12.

לרוב, חומרי הדברה ביולוגיים מיושמים בצורה של חיסון מיקרוביאלי, ו-NPs מופרשים על ידי מיקרואורגניזמים חיים באתרם 12,13. במקרה כזה, זיהוי מקור הפעילות של חומר הדברה ביולוגי הוא בעל ערך רב. פעולה זו מספקת תובנה לגבי מנגנון הפעולה של חומר ההדברה הביולוגי, מסייעת בבניית טיעון להגנה על מיקרואורגניזם עם פטנט, ויכולה להיות לה השפעה מדעית משמעותית אם המבנים שלהם חדשניים. אך חשוב מכל, זיהוי המקור הביו-אקטיבי מודיע על אפשרויות הניסוח של מוצר הדברה ביולוגית במורד הזרם. אם NP עצמו פעיל, אפשר להשתמש במיקרואורגניזם כמפעל ביומולקולות לייצור חומרי הדברה ביולוגיים בקנה מידה גדול. בנוסף, NPs רבים שנחקרו עבור הדברה ביולוגית יש גם יישומים פוטנציאליים ברפואה אנושית, מה שהופך אותם אפילו יותר ערך כלכלי8.

בדיקות ביואוטוגרפיה ישירה של כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC-DB) הן שיטה זולה ופשוטה לבידוד מונחה ביואקטיביות וזיהוי של מטבוליטים של חומרי הדברה ביולוגיים. אף על פי שהטכניקה משמשת בדרך כלל להפרדת בדיקות ביואקטיביות של פיטוכימיקלים מתמציות צמחים גולמיים, יש לה גם פוטנציאל גדול לניתוח תמציות מיקרוביאליות14. TLC מספק הפרדה מהירה וזולה של NPs בתמצית מיקרוביאלית גולמית, ולאחר ציפוי עם תרחיף פתוגן מדיה, אזורים המכילים מטבוליטים פעילים הם דמיינו בקלות. ניתן לגרד אזורים אלה מהצלחת ולחלץ אותם לצורך ניתוח כימי על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים במיוחד בשילוב עם ספקטרומטריית מסות (UPLC-MS) כדי לזהות מטבוליטים ידועים. מטבוליטים שאינם תואמים תרכובות שדווחו בעבר יכולים להיות מבודדים בכמויות גדולות יותר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית כדי לעבור מחקרי הבהרת מבנה באמצעות טכניקות כגון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית וקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן15.

מאמר זה מתאר מערכת מודל לגילוי וזיהוי NPs של חומרי הדברה ביולוגיים באמצעות TLC-DB עם Bacillus spp. והפתוגן החקלאי Sclerotinia sclerotiorum. איור 1 מספק סקירה סכמטית של הליך TLC-DB.

figure-introduction-1
איור 1: סקירה סכמטית של שלבים 4-7 של הליך TLC-DB. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בחירת המועמדים להדברה ביולוגית מיקרוביאלית

  1. באמצעות מבחני לוחיות תחרות, בחר מבודדים מיקרוביאליים המפגינים אנטגוניזם נגד הפתוגן המעניין.
    הערה: נבחרו תשעה מבודדי Bacillus שהפגינו אנטגוניזם נגד S. sclerotiorum, כולל המינים Bacillus atrophaeus, mojavensis ו-subtilis, כדי להדגים פרוטוקול זה.

2. הכנת מדיה

  1. הכינו אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA) על ידי המסת 39 גרם של מדיום לליטר מים.
  2. הכינו Pseudomonas F אגר על ידי הוספת 45 גרם של מדיה לכל ליטר מים.
  3. הכינו ציר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDB) עם 1% אגר על ידי הוספת 24 גרם בינוני, ו 0.24 גרם אגר לליטר מים.
  4. הכינו ציר שמרים-גלוקוז-מנגן (YGM). צור תמיסת חיץ המורכבת מ- 2.5 גרם של KH2PO4 ו- 2.5 גרם K2HPO4 ב- 100 מ"ל מים, ותמיסת מלח המורכבת מ- 0.58 גרם של MnSO4. H20, 0.5 גרם של NaCl ו 0.05 גרם של FeSO 4.7H20 ב 100 מ"ל של מים.
    1. לאחר מכן, להוסיף 1 גרם של תמצית שמרים, 1.25 גרם של דקסטרוז, 400 מ"ל של מים, 5 מ"ל של תמיסת חיץ, 5 מ"ל של תמיסת מלח ו 90 מ"ל של מים כדי להבטיח כי מלחי מתכת לא לזרז בתמיסה.
  5. לעקר את המדיה, לשפוך את האגר לתוך לוחות פטרי 100 x 15 מ"מ, ולתת לכולם להתקרר לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

3. הכנת פתוגן

  1. תרכבו חמש צלחות של Sclerotinia sclerotiorum על מחשב כף יד (מוכן בשלב 2.1) ודגרו ב 25 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.

4. הכנת תמצית מוצר טבעית

  1. תרבית כל חיידק מבודד על Pseudomonas F אגר (מוכן בשלב 2.2) וגדל עד מושבות בודדות נצפים.
  2. תת-תרבית מושבות חיידקים בודדות לתוך 25 מ"ל של מדיה YGM בצנטריפוגות או צינורות תרבית ולדגור עם רעד במשך 3 ימים.
  3. מעבירים 5 מ"ל של aliquots של כל תמצית לתוך 1 L של YGM ולדגור באותם תנאים במשך 3 ימים נוספים.
  4. צנטריפוגה כל תרבית ב 3000 x גרם במשך 15 דקות ב 25 ° C כדי pellet את התאים.
  5. דקקו ושטפו את הסופרנאטנט שלוש פעמים עם אתיל אצטט כדי לחלץ מטבוליטים ממדיום התרבית.
  6. ערבבו וייבשו את שכבת האתיל אצטט של כל אחת מהן באמצעות אידוי סיבובי.
  7. ממיסים מחדש את התמצית במתנול מינימלי, מעבירים אותה לבקבוקון קטן ומייבשים אותה שוב על ידי אידוי סיבובי.
    הערה: אם התמצית מתייבשת לחומר שומני או שרף, בצע ליופיליזציה של החומר כדי לקבל אבקה יבשה שניתן לשקול במדויק.

5. הכנת צלחת TLC

  1. הכינו את צלחת TLC בגודל 20 ס"מ על 20 ס"מ על ידי ציור קו 2 ס"מ מלמטה ו-2 ס"מ מהחלק העליון של הצלחת. בשורה התחתונה, הניחו תשע נקודות במרחק של 2 ס"מ זו מזו. מעל הקו העליון, מקמו ארבע נקודות במרחק של 4 ס"מ זו מזו.
  2. יש להמיס 5 מ"ג מכל תמצית ב-15 מיקרוליטר מתנול ולמרוח 5 מיקרוליטר מכל תמצית על תשע הנקודות המסומנות בשורה התחתונה באמצעות פיפטה. תן לכל כתם תמצית להתייבש על צלחת TLC ולהחיל עוד 5 μL aliquot על אותה נקודה. חזור על הפעולה עד שכל החומר נטען על צלחת TLC.
  3. מפתחים את צלחת TLC במיכל מתפתח באמצעות תמיסה ביחס 1:2 של דיכלורומתאן ומתנול עד שהממס מגיע לקו המסומן 2 ס"מ מראש הצלחת (כ-45 דקות).
  4. לאחר הפיתוח, הסר את צלחת TLC והחל סדרה של פקדים חיוביים על ארבע הנקודות המסומנות מעל קו הממס. ארבעה ריכוזים של אותה בקרה משמשים. עבור S. scl., 0.5 מיקרוגרם/מ"ל, 5 מיקרוגרם/מ"ל, 50 מיקרוגרם/מ"ל ו-500 מיקרוגרם/מ"ל של היגרומיצין B הם בקרות חיוביות.
  5. לפני שכל הממס מתאדה מהצלחת, הניחו אותו בקופסת צלחת TLC מעוקרת אתנול.

6. בדיקת ביואוטוגרפיה ישירה

  1. Autoclave החומרים שישמשו בבדיקה (רכיבי זכוכית של מרסס הכרומטוגרפיה, מרית מתכת, ארבעה גיליונות של מגבת נייר, תאית או נייר פילטר, מים ומדיה) בתוך גדולה מכוסה tinfoil.
    הערה: חומרי נייר (מגבת נייר, נייר תאית) צריכים להיות עטופים בנייר כסף כדי למנוע הרטבה באוטוקלאב.
  2. חבר מקור אוויר, מד לחץ ומרסס כרומטוגרפיה באמצעות צינורות PTFE מעוקרים באתנול. חבר מסנן HEPA בין מרסס הכרומטוגרפיה לבין מד הלחץ.
  3. אספו את מחצלת התפטיר של חמשת לוחות הפתוגן באמצעות מרית המתכת הסטרילית לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל באמצעות מרית סטרילית.
    הערה: השתמשו בכמות קטנה של ציר נוזלי כדי לעזור לעקור את התפטיר במידת הצורך, והעבירו עם פיפטה סטרילית.
  4. הוסף 25 מ"ל של PDB מתוקן עם אגר וחרוזי זכוכית סטריליים לצינור הצנטריפוגה 50 מ"ל ולמערבולת למשך 5 דקות כדי לשבור את מחצלת התפטיר.
  5. מעבירים את מתלה התפטיר למרסס כרומטוגרפיה באמצעות מזרק סטרילי עם קצה מחט כדי להבטיח שחתיכות גדולות של תפטיר לא יסתמו את מרסס הכרומטוגרפיה.
  6. הניחו את לוחות TLC שפותחו בעבר על מגבות נייר סטריליות במכסה מנוע זרימה למינרית כדי להפחית את מגע היד עם הצלחת תוך החלת מתלי המדיה.
  7. הגדל את לחץ האוויר לכ -4 ברים והחל שלוש שכבות של המתלה על צלחת TLC, מה שמאפשר לצלחת להתייבש לחלוטין בין היישומים.
    הערה: שלוש שכבות נמצאו ככמות האופטימלית. פחות מזה, ולפתוגן אין מספיק מדיה לגדול עליה. יותר מזה, התקשורת עבה מדי, אשר לא יכול לאפשר מגע פתוגן עם מטבוליטים פעילים.
  8. הוסיפו 500 מ"ל מים סטריליים לקופסת צלחת פלסטיק מעוקרת והניחו יריעות תאית מקופלת מעוקרת או נייר סינון מכל צד כדי לשמור על לחות.
  9. הניחו את צלחת הבדיקה השלמה על ארבע צלחות פטרי ריקות בקופסה.
  10. דגרו על הבדיקה במשך 3 ימים עד שבוע או עד ששכבה אחידה של תפטיר גדלה באופן שווה על פני צלחת TLC למעט סביב הבקרות החיוביות ואזור העיכוב (ZOIs).

7. ניתוח ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית

  1. צלם את הבדיקה שהושלמה באמצעות צילום.
  2. חשב את מקדם השמירה עבור כל אזור עיכוב על-ידי חלוקת המרחק מהשורה התחתונה ל-ZOI במרחק מהשורה התחתונה לקו העליון.
  3. מגרדים את הסיליקה מאזורי העיכוב ומניחים אותה בצינורות מיקרוצנטריפוגה.
  4. הוסיפו 500 מיקרוליטר מתנול לכל צינור ומערבולת כדי לחלץ את המטבוליטים מהסיליקה.
  5. צנטריפוגה ב-8,500 x גרם ב-20°C למשך 10 דקות, ומעבירים את הסופרנאטנט לבקבוקון קטן.
  6. להתאדות ליובש על ידי אידוי סיבובי או תחת זרם של חנקן.
  7. להשעות מחדש את התמצית ב 50 μL של מתנול בבקבוקון LC.
  8. נתח את המטבוליטים באזור העיכוב על ידי LC-MS והשווה אותם למטבוליטים בתמצית הגולמי כדי לקבוע אילו מטבוליטים בתמצית הגולמי אחראים לעיכוב הפתוגן16.
  9. באמצעות הסוג והמינים של מיקרואורגניזם המקור והמסות המזוהות ב- ZOI, חפש בספרות ובמאגרי מידע רלוונטיים כגון Antibase ומילון המוצרים הטבעיים כדי לזהות את המטבוליטים.

תוצאות

עם הפרדת תמציות מיקרוביאליות על ידי TLC, מטבוליטים צריכים להיות מפוזרים לאורך צלחת TLC אנכית. תחת אור נראה, זה יכול להיות קשה לראות מטבוליטים שאינם בולעים בתחום האור הנראה. לכן, הדמיה תחת אור על-סגול יכולה לעזור לראות את ההפרדה של מטבוליטים, כפי שניתן לראות באיור 2A,B. לאחר תקופת הדגירה, הפתוגן אמור להיראות כגדל באופן שווה על פני כל הצלחת, למעט על פני הבקרות החיוביות ואזורי העיכוב שבהם שוכנים מטבוליטים פעילים, כפי שניתן לראות באיור 2C.

figure-results-1
איור 2: הפרדת תמציות מיקרוביאליות על-ידי TLC. (A) לוח TLC מפותח המכיל תשע תמציות בצילוס שצולמו תחת אור נראה ו-(B) תחת אור UV של 320 ננומטר לפני היישום של חיסון פטרייתי. (C) בדיקת ביו-אוטוגרפיה מלאה עם צמיחת פתוגן שנצפתה על פני הצלחת, למעט היכן שהצמיחה מעוכבת סביב הבקרות החיוביות, ו-ZOI של כל תמצית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

מטבוליטים המופקים מאזורי העיכוב מנותחים על ידי LC-MS ומושווים לתמצית הגולמית כדי לקבוע את NPs האחראים לאנטגוניזם נגד הפתוגן. מטבוליטים תואמים צריכים להיות בעלי אותו זמן שמירה ומיני יונים מולקולריים כדי להיחשב כהתאמה. לאחר זיהוי המטבוליטים הפעילים, ניתן לגדל את תרבית החיידקים בכמויות גדולות כדי לבודד מטבוליטים פעילים בעלי עניין לכימיה מבנית או מחקר ביולוגי.

דיון

TLC-DB הוא כלי מחקר NP יקר ומבוסס היטב וחלופה פשוטה וזולה לשיטות בידוד מונחות ביו-צלחותמיקרו-צלחות 17. זה דורש מינימום זמן ומשאבי חומר בהשוואה לבדיקות microplate, אשר דורשים הפרדת מטבוליטים באמצעות טכניקות כרומטוגרפיה נוזלית. זוהי בדיקה רב-תכליתית ביותר שניתן להשתמש בה כדי לזהות NPs אנטיבקטריאליים, אנטי פטרייתיים, אנטי-טפיליים ונוגדי חמצון בנוסף למעכבי אנזימים 18,19,20,21,22,23. למרות שהשיטה נפוצה ביותר לזיהוי וזיהוי של פיטוכימיקלים ביו-אקטיביים, ניתן ליישם את אותה שיטה עבור NPs חיידקיים כפי שנחקר בפרוטוקולזה 18. בנוסף, ניתן למטב את הפרוטוקול לשימוש עם מגוון מקורות NP ופתוגני מטרה כדי לסייע בגילוי והערכה של NPs ביו-אקטיביים חדשים.

המדיה המשמשת לגידול חיידקים וממס המשמש למיצוי יכולה להשפיע מאוד על תוצאות גילוי מוצרים טבעיים. המדיה המשמשת בפרוטוקול זה מותאמת לחיידקים המייצרים ליפופפטידים מחזוריים, כולל Pseudomonas ו - Bacillus spp. אבל יש לשקול מקורות מדיה וחומרים מזינים אחרים אם חוקרים סוגים אחרים. ניתן לבחור להשלים את TLC-DB באמצעות אותו מיקרואורגניזם שגדל במגוון מדיות כדי להעריך את מלוא רוחב מגוון המטבוליטים ממבודד אחד או להשתמש בתנאי גידול זהים עבור מגוון רחב יותר של מבודדים. הבחירה בממס מיצוי משפיעה גם על המוצרים הטבעיים שזוהו. מקובל להבין כי לרוב NPs הביו-אקטיביים יש קוטביות נמוכה עד בינונית, מה שהופך אתיל אצטט לבחירה מתאימה בשל נקודת הרתיחה הנמוכה שלו, מה שמקל על הסרתו. עם זאת, אם רוצים לבחון גם את השברים הקוטביים והלא קוטביים, ניתן לבצע מיצוי מרובה עם ממסים אחרים. לחלופין, תמצית ללא תאים ניתן lyophilized ולהשתמש בבדיקה כדי לראות את כל מטבוליטים שוחררו לתוך התקשורת. עם זאת, לעתים קרובות יהיה צורך להעמיס חומר נוסף על צלחת TLC כדי לקחת בחשבון את רכיבי המדיה המיובשים בחומר הליופילי. באופן דומה, אם שיטה זו משמשת עם פתוגן אחר, כגון inoculum, המדיה המשמשת ותנאי הדגירה חייבים להיות אופטימליים כדי לקבל את 5 לוחות אגר של תפטיר המשמש לבדיקת TLC-DB.

TLC-DB הוא יתרון בהשוואה לביואוטוגרפיה של מגע וטבילה מכיוון שהוא משתמש בשכבה הדקה ביותר של אגר ואינקולום, וממזער את ההסתמכות על דיפוזיה של מטבוליטים לשכבת האגר, מה שיכול לאפשר כמויות קטנות יותר של מוצרים טבעיים לגרום לעיכוב פתוגן17. ממצאים שפורסמו בעבר בשיטות ביואוטוגרפיות של TLC השתמשו בתרחיף נבגים של הפתוגן כדי להשלים את הבדיקה17. למרות שזה מאפשר שליטה מדויקת על ריכוז התרחיף, זה יכול להיות קשה מאוד וגוזל זמן רב לגרום לנבג של פטריות מסוימות24. שינוי זה מפשט מאוד את הבדיקה ומאפשר את השלמת הבדיקה באמצעות פתוגנים פטרייתיים שקשה לנבג ואולי נמנעו בעבר בשיטה זו.

המסה של תמצית חיידקית המשמשת בבדיקה יכולה להשפיע על התוצאות. אם מעט מדי תמצית מוחלת על צלחת TLC, ייתכן כי הריכוז המעכב המינימלי של תרכובת פעילה לא יעלה, ופעילות ביולוגית לא תזוהה. כתוצאה מכך, במקרים מסוימים, וכפי שניתן לראות באיור 1 ובאיור 2, כדאי להעמיס יתר על המידה על לוח TLC, מה שפוגע בהפרדה לטובת היכולת לזהות פעילות בקלות. באופן דומה, אסור שעומס הפתוגן המרוסס על הצלחת יהיה נמוך מדי, מכיוון שלא יופעל מספיק מדיה לתמיכה בצמיחת פתוגנים. ניתן לכוונן בקלות שיטה זו כך שתתאים למגוון תמציות חיידקים ופתוגנים, וכמויות התמצית המיקרוביאלית והחיסון המתוארות בפרוטוקול הבטיחו שניתן יהיה לזהות פעילות ביולוגית עבור פתוגנים ותמציות מיקרוביאליות מרובות. אם לא נצפו אזורי עיכוב עם השלמת הבדיקה, הדבר עשוי להצביע על אחד מהבאים. ראשית, מטבוליטים פעילים עשויים שלא להיות נוכחים בתמצית המיושמת עקב מדיה לא תואמת המשמשת לצמיחת חיידקים או בשל פעילות החיידקים שאינה תוצאה של ייצור NP. ניתן להשלים בדיקת דיפוזיה של דיסק עם התמצית כדי לאשר או להכחיש את קיומם של NPs פעילים בתמצית. אם בדיקת דיפוזיית הדיסק אינה מראה דיכוי פתוגן, ניתן לבדוק מדיה אחרת כדי לקבוע אם תנאים אחרים מייצרים NPs ביו-אקטיביים. אם בדיקת דיפוזיית הדיסק אכן מצביעה על כך שהתמצית מדכאת את הפתוגן, ייתכן שיהיה צורך להחיל מסה גדולה יותר של תמצית החיידקים על צלחת TLC, ובמקרה זה ניתן לנסות בדיקה נוספת.

השוואת מטבוליטים ב-ZOI לתמצית גולמית חיונית לזיהוי NPs פעילים. בבדיקה, מטבוליטים מן תמצית גולמית יכול להיות metabolized או שונה על ידי הפתוגן, אשר ניתן לראות באמצעות LC-MS. לכן, רק מטבוליטים המתרחשים הן בתמצית הגולמי והן ב- ZOI יכולים להיחשב NPs המיוצרים על ידי החיידקים הנחקרים. אם לא ניתן להתאים את המטבוליטים המופקים מה-ZOI למטבוליטים בתמצית הגולמית, ניתן להכין צלחת TLC, כמתואר בשלב 5. מבלי להשלים את בדיקת הביואוטוגרפיה, חלץ את המטבוליטים מלוח TLC באותו זמן שמירה שנצפה בבדיקה שהושלמה. זה אמור לאפשר מתאם קל יותר בין המטבוליטים ב-ZOIs לבין תמצית גולמית, מה שגורם לדיכוי פתוגנים.

חסרון אחד של TLC-DB הוא שהרזולוציה של TLC נמוכה משמעותית מזו המושגת בעת שימוש בטכניקות סינון מיקרו-באר מסורתיות, הדורשות כרומטוגרפיה נוזלית להפרדה. לכן, זה נפוץ עבור מטבוליטים מרובים להתקיים באזור של עיכוב שבו מטבוליטים מסוימים עשויים שלא לתרום לפעילות הביולוגית. בעיה זו יכולה להיגרם עוד יותר על ידי הנוהג של עומס יתר על צלחת TLC כדי לבחון פעילות ביולוגית בצורה ברורה יותר. עבודות אחרונות פורסמו באמצעות TLC (HP-TLC) בעל ביצועים גבוהים, אשר משפר מאוד את הרזולוציה ויכול לאפשר אוטומציה של פיתוח TLC שאחרת אינה אפשרית בעת שימוש ב- TLC 14,21,22,23 קונבנציונאלי. כמו כן, ניתן לפתח לוחות בממד שני (2D-TLC) כדי להפריד עוד יותר מטבוליטים עם זמני שמירה דומים. עם זאת, יש להעריך האם תוספת הזמן ועלות החומרים היא פשרה כדאית עבור רזולוציה מוגברת המתקבלת מ- HP ו- 2D-TLC25.

גילויים

ד"ר סוזן בויצ'קו נפטרה לפני הגשת עבודה זו (8 בפברואר 2023). כל המחברים האחרים הצהירו שאין להם ניגודי עניינים.

תודות

אנו מודים ל-Agriculture and Agri-Food Canada על המימון שבמסגרתו התאפשר מחקר זה (פרויקטים J-001843 ו-J-002021). אנו מודים לברט ואן היינינגן על צילום תוכן הווידאו עבור פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לסטודנטים לשעבר לתארים מתקדמים (ג'ניפר ווקון ומארק נאבורס) על תובנותיהם לגבי השיטות המתוארות בכתב יד זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5-5 מ"ל פיפטה ערוץ יחידVWRCA11020-004
10 מ"ל מרסס כרומטוגרפיה בשכבה דקהVWRKT422530-0010
100 x 15 מ"מ לוחות פטריVWR89038-970
100-1000 ומיקרו; קצות פיפטה LVWR76322-164
100-1000 ומיקרו; L פיפטה חד ערוציתVWR76169-240
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטרילייםVWRCA21008-918
1 ליטר בקבוק זכוכיתMillipore SigmaCLS13951Lחייב להיות בטוח לחיטוי
1 מ"ל מזרק סטרילי עם מחטתומאס סיינטיפיק8935L75מחט ניתנת להסרה מומלצת
2 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגהVWR87003-298
צינורות צנטריפוגה סטריליים 50 מ"לVWRCA21008-940
5 מ"ל קצות פיפטהVWRCA11020-008
בקבוקוני סינטלציה 7 מ"לVWR76538-962
95% אתנולתרמו פישר מדעיA412-500
אוטוקלאבקול-פארמרUZ-01850-348 ליטר, אגר
בקטריולוגיVWR97064-336
binThomas Scientific1216H91
D-גלוקוזVWRBDH9230-500G
דיכלורומתאן ≥ 99.8% ACSVWRBDH1113-4LG
אתיל אצטט ≥ 99.8% ACSVWRBDH1123-4LG
נייר סינוןVWRCA28297-846
חרוזי שחיקהVWR12621-148
Hygromycin BVWRCA80501-074
ברזל גופרתי HeptahydrateVWR97061-542
קולט אדים זרימה למינאריCleanTech1000-6-A
LC-MSמערכת מיםLITR10064178 UPLC/MS/MS TQD
ליופילייזרLabconco700201000אספן טמפרטורה -50° C 
מנגן סולפט הידרטVWRCAAA10807-14
מתנול ו-GE; 99.8% ACSVWRBDH2018-5GLP
מגבת ניירVWR89402-824
תפוחי אדמה דקסטרוז אגרVWRCA90000-758
מרק דקסטרוז תפוחי אדמהVWRCA90003-494
פוטססיום פוספט דיבסיסיVWR470302-246
פוטססיום פוספט מונוביסיקVWR470302-252
מד לחץ 6 מ"מ איחוד ישר 0-10 בר (0-145 psi)TamesonF25U6
Pseudomonas F AgarVWR90003-352ידוע גם בשם Flo Agar
PTFE TubingSigma Aldrich58697-Uקוטר פנימי 1/16 אינץ' 
נתרן כלוריVWRBDH9286-500G
מריתVWR82027-490
לולאות חיסון סטריליות עם מחטVWR76534-512
נייר כסףתומאס סיינטיפיק1086F24ניתן לרכוש בסופרמרקט
TLC סיליקה ג'ל 60 RP-18 F254S 25 צלחות זכוכית 20 X 20 ס"מתומאס סיינטיפיק1205Q12
משאבת ואקוםLabconco147210098 ליטר / דקה
מערבולתVWR76549-928חייב להכיל צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל ו-50 מ"ל
Whatman בשורה HEPA-VENTMillipore SigmaWHA6723500010 מסננים, 1/4 עד 3/8 אינץ' כניסה/יציאה
VWR97063-370
115 VAC

מקורות

  1. Fisher, M. C., et al. Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health. Nature. 484 (7393), 186-194 (2012).
  2. Savary, S., et al. The global burden of pathogens and pests on major food crops. Nat Ecol Evol. 3 (3), 430-439 (2019).
  3. Lin, B. B. Resilience in agriculture through crop diversification: Adaptive management for environmental change. BioSci. 61 (3), 183-193 (2011).
  4. Piquerez, S. J., Harvey, S. E., Beynon, J. L., Ntoukakis, V. Improving crop disease resistance: Lessons from research on arabidopsis and tomato. Front Plant Sci. 5, 671(2014).
  5. Damalas, C., Koutroubas, S. Current status and recent developments in biopesticide use. Agriculture. 8 (1), 13(2018).
  6. Syed Ab Rahman, S. F., Singh, E., Pieterse, C. M. J., Schenk, P. M. Emerging microbial biocontrol strategies for plant pathogens. Plant Sci. 267, 102-111 (2018).
  7. Tudi, M., et al. Exposure routes and health risks associated with pesticide application. Toxics. 10 (6), 335(2022).
  8. Santos, E. N., et al. Bacillus thuringiensis: From biopesticides to anticancer agents. Biochimie. 192, 83-90 (2022).
  9. Kumar, J., Ramlal, A., Mallick, D., Mishra, V. An overview of some biopesticides and their importance in plant protection for commercial acceptance. Plants. 10 (6), 1185(2021).
  10. Marrone, P. Pesticidal natural products - status and future potential. Pest Manag Sci. 75 (9), 2325-2340 (2019).
  11. Ayilara, M. S., et al. Biopesticides as a promising alternative to synthetic pesticides: A case for microbial pesticides, phytopesticides, and nanobiopesticides. Front. Microbiol. 14, 1040901(2023).
  12. Abdelaziz, A. M., et al. Biocontrol of soil borne diseases by plant growth promoting rhizobacteria. Trop. Plant Pathol. 48 (2), 105-127 (2023).
  13. Zhao, Z., Liu, D., Ruan, L., Wang, T., Liang, Z. Antifungal mechanism of Bacillus amyloliquefaciens SC-B15 and its application in cereal mildewproof and grape preservation. Food Biosci. 56, 103287(2023).
  14. Jamshidi-Aidji, M., Dimkic, I., Ristivojevic, P., Stankovic, S., Morlock, G. Effect-directed screening of bacillus lipopeptide extracts via hyphenated high-performance thin-layer chromatography. J Chromatogr A. 1605, 460366(2019).
  15. Prichystal, J., Schug, K. A., Lemr, K., Novak, J., Havlicek, V. Structural analysis of natural products. Anal Chem. 88 (21), 10338-10346 (2016).
  16. De Souza, C. G., et al. Simultaneous quantification of lipopeptide isoforms by UPLC-MS in the fermentation broth from Bacillus subtilis CNPMS22. Anal Bioanal Chem. 410 (26), 6827-6836 (2018).
  17. Dewanjee, S., Gangopadhyay, M., Bhattacharya, N., Khanra, R., Dua, T. Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry. J Pharm Anal. 5 (2), 75-84 (2015).
  18. Choma, I., Jesionek, W. TLC-direct bioautography as a high throughput method for detection of antimicrobials in plants. Chromatography. 2 (2), 225-238 (2015).
  19. Attia, R., et al. Thin-layer chromatography-bioautographic method for the detection of arginase inhibitors. J Sep Sci. 43 (12), 2477-2486 (2020).
  20. Legerska, B., Chmelova, D., Ondrejovic, M. TLC-bioautography as a fast and cheap screening method for the detection of alpha-chymotrypsin inhibitors in crude plant extracts. J Biotechnol. 313, 11-17 (2020).
  21. Agatonovic-Kustrin, S., Doyle, E., Gegechkori, V., Morton, D. W. High-performance thin-layer chromatography linked with (bio)assays and FTIR-ATR spectroscopy as a method for discovery and quantification of bioactive components in native Australian plants. J Pharm Biomed Anal. 184, 113208(2020).
  22. Hilaire, V., et al. New method for screening anti-leishmania compounds in plants extracts by HPTLC-bioautography. J Chromatogr B. 1188, 123061(2022).
  23. Stankovic, J., et al. HPTLC-direct bioautography-guided isolation of isogeranic acid as the main antibacterial constituent of Artemisia santonicum essential oil. J Serb Chem Soc. 84 (12), 1355-1365 (2019).
  24. Su, Y., Qi, Y., Cai, L. Induction of sporulation in plant pathogenic fungi. Mycology. 3, 195-200 (2012).
  25. Wedge, E., Nagle, D. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J Nat Prod. 63, 1050-1054 (2000).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

זיהוי מונחה ביואסי של מוצרים טבעיים להדברה ביולוגית על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה - ביואוטוגרפיה ישירה
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.