מאמר שיטה

ניתוח החזרת עוברים באמצעות לפרוטומיה בגילטים

1.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/66984

⸱

18 באוקטובר 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Estudos sobre o Genoma Humano e Células-Tronco, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, 2Instituto do Coração (Incor), Hospital das Clínicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, 3Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את היישום של הטכניקה הכירורגית המשמשת להעברת עוברי חזירים משובטים באמצעות laparotomy בזהבים.

תקציר

פרוטוקול זה נועד להדגים את הטכניקה הכירורגית להעברת עוברי חזירים משובטים לאובידוקט, שיטה הנמצאת בשימוש נרחב בייצור חזירים מהונדסים גנטית למחקר ביו-רפואי. תשעה זהובים עברו סנכרון הורמונלי ולפרוטומיה להחזרת עוברים משובטים המיוצרים על ידי העברה גרעינית של תאים סומטיים (SCNT) בשלבים של עד 4 תאים ביום השני לאובידוקט. אבחון ההריון בוצע באמצעות בדיקת אולטרסאונד 30 יום לאחר ניתוח ההעברה. שישה מתוך תשעת הזימים שנותחו הראו סימני הריון בבדיקת אולטרסאונד. עם זאת, מכיוון שלא הייתה התקדמות בהתפתחות העובר כפי שהוערכה על ידי האכוגרפיה, הזימים עברו נקרופסיה בגיל 60 יום לאיסוף החומר הביולוגי והערכת מערכת הרבייה. הידבקויות נצפו בקרני הרחם, בשחלות ובביציות. מלומן הרחם של שניים מהזהובים המורדמים, התקבלו מבנה עוברי אחד וארבעה עם גילאי הריון הנעים בין 12 ל -20 יום. למרות היעדרם של חזירונים חיים, המיוחס ככל הנראה ליעילות נמוכה של החזרת עוברי חזירים משובטים, המושפעת מגורמים שונים, כולל מספר ואיכות העוברים המוחזרים, הטכניקה הכירורגית שהוצגה הוכחה כמהירה ובטוחה.

מבוא

חזירים הם מודל ניסיוני מצוין למחקר ביו-רפואי בשל הדמיון האנטומי, הפיזיולוגי והגנטי שלהם לבני אדם1. בעלי חיים אלה שימשו לעתים קרובות במחקר הקשור להשתלת קסנו, מתוך כוונה לייצר איברים, תאים או רקמות המקדמים סיכון נמוך לדחייה כאשר הם מושתלים בבני אדם. מחקר ההשתלות נועד להגדיל את אספקת האיברים להשתלה אנושית, ובכך לצמצם את רשימת ההמתנה של חולים2.

ייצור חזירים להשתלת קסנו כרוך במספר שלבים, כולל ייצור שיבוטים מתאי חזירים ערוכים גנטית. לאחר ייצור במבחנה של עוברים משובטים מהונדסים גנטית, העוברים מועברים למערכת הרבייה של זרע עם מחזור ייחום מסונכרן כדי להכין את הפיזיולוגיה של הרחם לקבלה ולהריון של המושג החדש3.

החזרת עוברים בחזירים יכולה להתבצע בשיטות לא פולשניות או פולשניות4. בין השיטות הלא פולשניות היא העברה transcervical , אשר אינו דורש כל התערבות כירורגית. עם זאת, שיטה זו מוגבלת להחזרת עוברים בשלבי התפתחות מאוחרים יותר (כלומר שלבי מורולה או בלסטוציסט) ואינה מאפשרת קביעה מדויקת של מקום החדרת הצנתר או שיקוע העובר5. לפרוסקופיה ולפרוטומיה נחשבות לשיטות פולשניות להחזרת עוברים. לפרוסקופיה היא פחות פולשנית אך דורשת ציוד ספציפי ויקר, ויעילותה משתנה במידה ניכרת (מפחות מ-20% ליותר מ-80%) בשל גורמים שונים כגון קושי במניפולציה של מבני הרבייה וסוג הצנתר בו נעשה שימוש 4,6. לכן, העברה באמצעות לפרוסקופיה עדיין פחות יעילה בהשוואה לשיטות העברה כירורגיות באמצעות לפרוסקופיה4.

ניתוח החזרת עוברים בזרע באמצעות לפרוטומיה הוא הליך פשוט ומהיר יחסית, הנמשך בדרך כלל כ -30 דקות. עם זאת, זה צריך להתבצע במרכז כירורגי מצויד מנגנון הרדמה שאיפה צוות מיוחד. עבור זני חזירים מסחריים (כגון Landrace, Large White, או הכלאות שלהם), ציוד מיוחד כמו מנופים להרמת זהבים ושולחן ניתוחים רחב ויציב נחוצים בשל משקלם הרב של בעלי החיים (סביב 130-150 ק"ג).

כדי שהניתוח יצליח, יש להעריך את שלב התפתחותם של העוברים לפני כן. מומלץ להעביר עוברים של עד 4 תאים לצינור הרחם. עוברים בשלבים שמעבר ל-4 תאים, כגון מורולות ובלסטוציסטים, צריכים להיות מועברים לקרן הרחם 7,8.

למרות שקבוצות מחקר ברחבי העולם מבצעות ייצור והעברה כירורגית של עוברי חזירים משובטים מהונדסים גנטית, עדיין אין פרוטוקולים מוגדרים היטב המדגימים הליך זה באמצעות סרטונים. גישה זו חיונית להצלחת ההיריון, שכן הטכניקה דורשת תצהיר מדויק של עוברים במיקום המדויק של האובידוקט, הכולל לוקליזציה של אוסטיום הצינורית והכנסת פיפטה המכילה את העוברים. טכניקה זו יכולה להיות מובנת טוב יותר באמצעות סרטוני הסבר של ההליך כולו. לכן, מאמר זה נועד להדגים את ניתוח הלפרטומיה להעברת עוברים משובטים לאובידוקט של זהבים, תנאי מוקדם חיוני לייצור עתידי של חזירים מהונדסים גנטית שישמשו להשתלת קסנו או למטרות קשורות אחרות.

פרוטוקול

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה לשימוש בבעלי חיים במחקר של המכללה לרפואה וטרינרית ומדעי בעלי חיים של אוניברסיטת סאו פאולו, פרוטוקול מספר 6088030523. תשעה זהובים בני שבעה חודשים מגרעין החזירים Água Branca, הממוקם בעיר איטו, מדינת סאו פאולו, ברזיל, שימשו מיד לאחר גילוי הייחום השני9. פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת בעלי חיים

  1. מהר את בעלי החיים במשך 12 שעות והגביל את הגישה למים במשך 4 שעות לפני ההליך הכירורגי.
  2. באמצעות מחט 40 מ"מ x 12 מ"מ, לצייר 10 מ"ג / ק"ג של קטמין ו 0.2 מ"ג / ק"ג של midazolam באותו מזרק 50 מ"ל. חברו את המזרק לאינפוזיה כדי להקל על מתן תרופות, לשמור על מרחק בטוח מבעל החיים ולאפשר לו לנוע בחופשיות.
  3. יש לתת את התרופה טרום הרדמה באמצעות הזרקה תוך שרירית לשריר הטרפז, קאודלי לתעלת האוזן החיצונית.
  4. יש לערבב את הווריד האוריקולרי עם קטטר 20 גרם ולחבר אותו למתן מקרודריפ לטיפול בנוזלים תוך ניתוחיים עם תמיסת NaCl של 0.9% בקצב של 10 מ"ל/ק"ג/שעה.
  5. יש להשרות הרדמה עם 4 מ"ג/ק"ג פרופופול תוך ורידי (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות).
  6. בצע אינטובציה orotracheal של החיה באמצעות laryngoscope ואת גודל 9 צינור orotracheal עם שרוול10.
  7. יש לשמור על הרדמה עם שאיפת איזופלורן של 1.5% עד 2%. בנוסף, עקוב אחר הרדמה על ידי הערכת פרמטרים פיזיולוגיים כגון קצב הלב, אשר צריך להישמר בין 100 ל 120 פעימות לדקה, רווי חמצן, אשר צריך להישמר בין 99% ל 100%, הרפיה שרירים, היעדר תנועה, והערכת רפלקסים.
    הערה: טמפרטורת הגוף צריכה להיות גם מנוטרת ומבוקרת, להישאר בין 37.5-38.5 מעלות צלזיוס. במידת הצורך, בנוסף isoflurane, propofol ניתן להשתמש כדי לשמור על שליטה של הפרמטרים. פנטניל הידרוכלוריד צריך להיות מנוהל כמו משכך כאבים במינון של 0.02 מ"ג / ק"ג כל 20 דקות. יש לרשום את כל הפרמטרים כל 5 דקות.
  8. ניהול שיכוך כאבים perioperative עם מנה אחת של 0.002 מ"ג / ק"ג של פנטניל תוך ורידי ו 4 מ"ג / ק"ג של tramadol hydrochloride תוך שרירית לתוך שריר gluteal או טרפז.
  9. מקם אלקטרודות לב על אזור החזה לניטור תוך ניתוחי של קצב הלב. רשום קצב לב, טמפרטורת פי הטבעת וריווי חמצן כל 5 דקות.

2. הליך כירורגי

  1. מקמו את הזהב על שולחן הניתוחים בשכיבה גבית.
  2. כסו את רגלי החיה בכפפות פרוצדורליות כדי למזער את זיהום שדה הניתוח.
  3. ביצוע הסרת שיער בטן גחוני קאודלי בין הזוג הלפני אחרון של בלוטות החלב באמצעות קוצץ כירורגי.
  4. בצע חיטוי עור לפני הניתוח עם מברשת חיטוי ספוגת כלורהקסידין, ביצוע תנועות מעגליות מאזור צלקת הטבור לזוג האחרון של בלוטות החלב. הסר chlorhexidine עם דחיסה נקייה ולחה.
  5. ודא כי המנתח והעוזר מבצעים חיטוי כירורגי ולובשים שמלות כירורגיות סטריליות וכפפות לניתוח.
    הערה: יש להכין את בעל החיים לניתוח באזור הכנה נפרד מאתר הניתוח.
  6. הכינו את שולחן הניתוחים עם המכשירים המתאימים והמעוקרים בעבר המופיעים בטבלת החומרים.
  7. בצע חיטוי שדה כירורגי סופי באמצעות גזה סטרילית וחיטוי כלורהקסידין, ניקוי האזור בתבנית עצם דג, החל מאתר החתך והתרחבות לרוחב.
  8. חזור על הליך זה שלוש פעמים עם חיטוי chlorhexidine, ולאחר מכן חזור על ההליך עם chlorhexidine אלכוהול.
  9. מכסים לחלוטין את בעל החיים בשפשוף כירורגי סטרילי, ובעזרת מספריים יוצרים פתח מלבני בשפשוף הכירורגי, כ-10X20 סמ"ר, אם הווילון אינו מגונן.
  10. מקמו את הווילון הכירורגי מעל הזוג הלפני אחרון של בלוטות החלב המפשעות. הניחו 4 מהדקים של Backhaus כדי לאבטח את הווילונות הכירורגיים מעל עור החיה.
  11. חותכים את העור באזמל, ויוצרים חתך באורך של כ-10 ס"מ.
  12. להשיג המוסטזיס של כלי דם תת עוריים עם מלקחיים המוסטטיים ו / או גודל תפר נספג 2.
  13. לנתח את הרקמה תת עורית עם אצבעות או בעזרת מספריים מחודדים עדינים, העמקת החתך כדי להגיע linea alba בשרירי הבטן.
    הערה: למשש את קו האמצע של הבטן כדי להרגיש את linea alba כמו אזור נוקשה יותר סיבי; שימו לב להיפרדות שרירי הבטן של הרקטוס ושימו לב לשינוי בעקביות הרקמה תוך כדי ניתוח כדי לזהות את הלינאה אלבה במדויק11.
  14. בעזרת מלקחיים של אליס, תופסים את השרירים ומרימים אותם כדי לבצע חתך דקירה בלינאה אלבה עם אזמל.
  15. הכנס את האצבע המורה לתוך החתך כדי להעריך את נוכחותם של הידבקויות. יש להרחיב את החתך מעל ה-linea alba בצורה קאודלית וגולגולתית בעזרת מספריים קהות/קהות או עדינות/קהות בזהירות כדי למנוע פגיעה באיברים אחרים ובמבנים שמתחתיו.
  16. בצע חתך באורך מספיק כדי שניתן יהיה להחדיר את ידו האחת של המנתח לחלל הבטן כדי לאתר ולהוציא החוצה את קרני הרחם ו / או השחלות. ניתן להשתמש ברסרקטור גוסט כדי להקל על הכניסה לחלל הבטן ותפירת השרירים בשכבה אחת בסוף ההליך.
  17. אם אחת מקרני הרחם ממוקמת לפני השחלות, עקבו אחריה בעדינות עד שיגיעו לקצה קרן הרחם ולשחלה האיפסילטרלית. במהלך הליך זה, להעריך את נוכחותם של נוזל בתוך הרחם, אשר עלול לסכן את ההריון.
  18. לאחר איתור השחלה, משכו אותה בעדינות וחשפו אותה בזהירות. להעריך את נוכחותם של זקיקים טרום ביוץ, corpora lutea hemorrhagic, corpora lutea מחזורי, ו corpus albicans כדי להעריך אם הסנכרון של הזהב הוא כצפוי.
  19. הסר בעדינות את הפימבריה של צינור הרחם המכסה את השחלה, כרת את ריריתה, ואתר את האוסטיום של צינור הרחם.
    הערה: אם המנתח מתקשה לזהות את האוסטיום של הפימבריה, כיס על האמפולה של האובידוקט יכול להיעשות עם מחט תפר עגול גוף, הימנעות ניקוב כלי דם, כדי להחדיר את קטטר Tomcat המכיל את העוברים.
  20. בזהירות להכניס קטטר Tomcat המכיל את העוברים לתוך האוסטיום של fimbriae עד הגעה לאזור ampulla של צינור הרחם.
  21. חבר מזרק 1 מ"ל לצנתר Tomcat כדי לדחוף את הנוזל המכיל את העובר לתוך צינור הרחם. מכסים את השחלה בפימבריה ומחזירים אותה לחלל הבטן.
  22. אתר את קרן הרחם והשחלה הנגדית וחזור על שלבים 2.17-2.21.
  23. מקמו מחדש את המבנים בתוך חלל הבטן והוסיפו 1 ליטר של תמיסת מלח או תמיסת לקטט של רינגר מחוממת (39 מעלות צלזיוס) כדי למנוע הידבקויות לפני התחלת הבטן-מינורפיה.
  24. תפרו את שרירי הבטן עם תפר נספג בגודל 2 בתפרי "X" (סולטן) קטוע.
  25. קירוב הרקמה התת עורית בתפר מזרן רציף באמצעות תפר נספג בגודל 2.
  26. סגור את העור בתפר ניילון במידה 2 בתפרים פשוטים קטועים, סיכות כירורגיות או דבק אתיל-ציאנואקרילט. בהליך זה, בחרנו להשתמש בדבק.
  27. נקה את הפצע הכירורגי עם גזה ספוגה במי חמצן וייבוש עם דחיסה כדי לשפר את הקיבוע של דבק כירורגי על פצע הניתוח. החל rifamycin או משחה של פירסון, לכסות עם גזה, ולבסוף, להחיל דבק כירורגי.
    הערה: הפצע צריך להישאר סגור עם חבישה במשך 5 ימים.

3. טיפול לאחר הניתוח

  1. להעריך את בעלי החיים עבור סימנים של כאב קליני אופייני לפחות במשך 3 ימים רצופים הבאים, על פי קנה המידה המוצע על ידי Luna et al.12.
    הערה: סולם זה מבוסס על התנהגויות שונות המוצגות על ידי חזירים כאשר הם חווים רמות שונות של כאב, כגון יציבה, אינטראקציה ועניין בסביבה, פעילות, תיאבון ותשומת לב לאזור הפגוע. הציון נע בין 0 ל-3, בהתאם לסוג ההתנהגות המוצגת, עבור כל פרמטר שהוערך. בסוף ההערכה, סכום כל הציונים משקף את עוצמת הכאב שחווה החיה, כאשר 0 מייצג שום כאב, ו-18 מייצג כאב עז מאוד12.
  2. לנהל מנה אחת של 15 מ"ג / ק"ג של amoxicillin ו 0.4 מ"ג / ק"ג של 2% meloxicam הן תוך שרירית (בשריר gluteal או צוואר הרחם) פעם ביום במשך 3 ימים כטיפול לאחר הניתוח כדי למנוע כאב, תהליכים דלקתיים, וזיהום.
    הערה: אם ציון הכאב שווה או גדול מ-6 בסולם הכאב המשמש (ציון מ-0 עד 18), יש לתת 5,000 מ"ג/חיה של נתרן דיפירון תוך שרירית (בשריר העכוז או צוואר הרחם) פעם ביום, בנוסף לאנטי דלקתי ולאנטיביוטיקה. לחלופין, בצע שיכוך כאבים כמפורט בהנחיות IACUC המקומיות.
  3. ביום השישי לאחר הניתוח, יש להסיר את הדבק הכירורגי לניקוי פצעים עם גזה ספוגה בתמיסת כלורהקסידין אלכוהולית 2% ולמרוח משחה מקומית של פירסון עד היום העשירי, כאשר מומלץ להסיר תפרים או הסרת סיכות כירורגיות, אם נעשה בהם שימוש.

4. אבחון הריון אולטרה-סונוגרפי של הריון

  1. לבצע הערכה אולטרה-סונוגרפית של הריון טרנס-בטני עם מכשיר אולטרסאונד (טווח תדרים 4.5 עד 8.5 מגה-הרץ) 30 יום לאחר ניתוח החזרת עוברים.
  2. החל ג'ל אולטרסאונד על הבדיקה ולמקם אותו ליד אזור הבטן המפשעה, פונה מדיאלית.
    הערה: הדמיה של שלפוחיות עובריות מעוגלות אנכואיות, עקב נוזל בלומן הרחם, מצביעה על הריון. אי הדמיה של נוזל תוך רחמי, או נוכחות של נוזל תוך רחמי ללא תיחום של שלפוחיות עובריות, מצביע על היעדר הריון.

5. המתת חסד של בעלי החיים

הערה: יש להרדים את הזהובים שלא הציגו עוברים בגודל ובמראה המתאימים לגיל ההריון בבדיקה האולטרה-סונוגרפית.

  1. בעזרת מחט בגודל 40 מ"מ על 12 מ"מ, יש לשאוב 15 מ"ג/ק"ג קטמין ו-2 מ"ג/ק"ג מידזולם באותו מזרק של 50 מ"ל המחובר למערך מתן תוך ורידי, ולתת תוך שרירית לשריר הטרפז באזור הצוואר הצווארי הקאודלי לתעלת האוזן החיצונית, כתרופה טרום הרדמה.
  2. לערבב את הווריד האוריקולרי עם קטטר 20 גרם ולגרום להרדמה עם 4 מ"ג/ק"ג פרופופול תוך ורידי בבולוס עד להופעת ברדיקרדיה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות).
  3. לאחר מכן, לנהל 10 עד 20 מ"ל של 19.1% אשלגן כלורי תוך ורידי. לאשר דום לב ריאתי על ידי התבוננות בהיעדר תנועות נשימה, ריריות חיוורות, אובדן רפלקס הקרנית והיעדר פעימות לב על ידי הצבת סטטוסקופ מעל אזור הלב.
  4. לאסוף כל סוג של תוכן תוך רחמי (רקמה עוברית, נוזל או הפרשות ריריות) מנקבות נקרופסיות13 ולהעביר אותו לניתוח מיקרוביולוגי כדי לזהות פתוגנים אפשריים וגם לאפיון גנוטיפי של השיבוטים (במידת הצורך). לבדוק חזותית את נוכחותם או היעדרם של corpora lutea, ציסטות השחלות, הפרשות חריגות, ואת התרחשות של הידבקויות ברחם, השחלות, ואת oviducts14.

תוצאות

מאמר זה נועד להדגים את ניתוח הלפרטומיה להחזרת עוברים משובטים לאובידוקט של זהבים. כל בעלי החיים נשארו במישור הרדמה מתאים, ללא אירועים תוך ניתוחיים או סיבוכים במהלך ההתאוששות מההרדמה. לזהובים נדרשו, בממוצע, 2-3 שעות לעמוד לאחר סיום הניתוח.

כל ההליכים הכירורגיים נמשכו, בממוצע, 44 דקות. תשעה זהובים נותחו, כאשר בממוצע 185 עוברים משובטים הוחזרו לכל זהב, ובסך הכל 1,664 עוברים הוחזרו באופן דו-צדדי (טבלה 1). לוקליזציה של השחלות, יציאתן, והכנסת קטטר Tomcat המכיל את העוברים לתוך האוסטיום של oviduct התאימו את הרגעים העדינים ביותר של הניתוח. השחלות של כל הזימים נבדקו במהלך הניתוח, וכולן הציגו זקיקים דימומיים שעברו לאחרונה ביוץ, בהתאם למה שהיה צפוי עבור פרוטוקול סנכרון הייחום שבוצע, שמטרתו לבצע החזרת עוברים זמן קצר לאחר התרחשות הביוץ. כל ההליכים התרחשו ללא אירועים תוך ניתוחיים.

אף בעל חיים לא הראה סימנים של כאב עז לאחר הניתוח, עם ציון כאב ממוצע של 0.33, 0.33, 3.67, 1.33, 0.33, 1.33, 4.67, 2.00 ו-0.33 בסולם הכאב (שנע בין 0 ל-18) שבוצע במהלך 3 הימים שלאחר הניתוח עבור כל אחד מהזהבים שנותחו (טבלה 2). רק 1 מהזימים המנותחים הציג הצטברות נוזלים תת עורית (סרומה) ביום ה- 12 לאחר הניתוח, עם סימני זיהום ודלקת מקומיים ליד פצע הניתוח. לאחר ניקוז הנוזל עם מחט 40 מ"מ x 1.6 מ"מ מונחה על ידי אולטרסאונד, החלת קומפרסים קרים על האזור המודלק במשך 30 דקות מדי יום במשך 7 ימים, מתן ceftiofur (3 זריקות תוך שריריות, עם מרווח של 72 שעות בין זריקות) ו 2% meloxicam (0.4 מ"ג / ק"ג SID, תוך שרירית, במשך 3 ימים), הפצע fistuled וניקוז את התוכן ריר שנותר, וכתוצאה מכך שיפור מוחלט של החיה. שאר הזימים המנותחים נשארו עם החבישה הכירורגית במשך 5 ימים ללא צורך בהחלפתה או הסרתה לצורך ניקוי פצעים, דבר שבוצע רק מהיוםה-6 עד היוםה-10 לאחר הניתוח.

בזימים 2, 8 ו-9 לא נצפתה הצטברות נוזלים והיווצרות שלפוחית עוברית בלומן הרחם (איור 1A). לכן, האבחנה ההריונית של בעלי חיים אלה נחשבה שלילית. הזהובים האחרים הראו הצטברות נוזלים תוך רחמיים והיווצרות שלפוחיות עובריות שהוצגו כמבנים מעוגלים אנאקואיים מוגדרים היטב (איור 1B-D). ניתן היה לזהות, בשניים מהמושתלים, אזור היפראקואי ביחס למבנה העוברי בשלב ההתפתחות המוקדמת בתוך השלפוחיות העוברית ביוםה-32 להריון (איור 1E,F).

לאחר אבחנה הריונית שלילית או אי התקדמות ההיריון, הרדימו את הזהבים, ונותחה מערכת הרבייה. הידבקויות באזורים של שחלות, ביציות וקרני רחם במידה פחותה או רבה יותר נצפו בזהובים 1, 2, 3 ו-4, וציסטות בשחלות נצפו בזהב 8 (איור 2). ארבעה מבנים עובריים, עם גיל הריון התואם בערך 12 עד 20 ימי הריון, התקבלו מרחם של מוזהב 3, ומבנה אחד התקבל מזהב 7 (איור 3). ניתוח של שברי רקמות עובריות הביא שלילי לזיהוי של נגיף הפרוו, Leptospira sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, וסוגים 2 ו -3 של נגיף החזיר (PCV2 / PCV3), אשר יכול לגרום למוות עוברי או הפלות.

רצף אולטרסאונד, ניתוח מבנה הכליה, הדמיה רפואית, הליך אבחון, חקר כליות.
איור 1: תמונות אולטרה-סונוגרפיות של הרחם של עובר מושתל מוזהבות 30 יום לאחר ההליך הכירורגי. (A) הרחם של זהב 2 ללא נוכחות נוזל בתוכו, המאפיין אבחנה הריונית שלילית. הרחם הגרביד של מוזהב 1 (B), מוזהב 3 (C) ומוזהב 4 (D) המכיל שלפוחיות עובריות עם נוזל בתוכו (כוכביות). הרחם הכביד של מוזהב 3 (E) ומוזהב 7 (F) מראה מבנה היפראקואי (חץ) בתוך שלפוחית העובר, המציין היווצרות עוברית בשלב המוקדם ב 32 ימים של הריון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תהליך דיסקציה, מחקר אנטומי, מקטעי דגימה מתויגים, תרשים מחקר חינוכי.
איור 2: ניתוח מערכת הרבייה. תמונות של רחם, שחלות ואובידוקט לאחר הנקרופסיה של זהב 1 (A), מוזהב 2 (B), מוזהב 3 (C), מוזהב 4 (D), מוזהב 5 (E), מוזהב 6 (F), מוזהב 7 (G), מוזהב 8 (H) ומוזהב 9 (I). חצים מדגישים הידבקויות בקרניים של הרחם, בשחלות ובביציות, וראשי חץ מדגישים ציסטות בשחלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תמונות דיסקציה המציגות דגימות רקמה ביולוגיות ודגימה בצלחת פטרי למחקר אנטומי.
איור 3: אבחון הריון. עוברים בשלב מוקדם שהוסרו מזהב 3 (A-D) ומוזהב 7 (E) מציגים אבחנה הריונית חיובית ומבנים היפראקואיים בתוך שלפוחיות עובריות בבדיקה אולטרה-סונוגרפית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: מספר וסוג העוברים המוחזרים לכל זהב, הריונות מאובחנים ומספר העוברים המתקבלים לאחר נקרופסיה של הזהובים המנותחים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: ערכים שהוקצו לכל אחד מהזימים המנותחים לגבי הצגת סימני כאב. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

השיטה הכירורגית המתוארת בוצעה בעבר על ידי קבוצות מחקר אחרות העובדות עם ייצור חזירים משובטים או חזירים משובטים מהונדסים גנטית, עם דיווחים על לידות לאחר יישום טכניקה זו 15,16,17,18,19,20. שיעורי ההריון והלידה של עוברי SCNT המיוצרים מקווי תאים שונים נעים סביב 20%-30% (מתוך 264 החזרות מאז 2017), עם ממוצע של 3.2 ± 0.4 חזירונים שנולדים בכל המלטה 3,21. מספר גורמים קשורים ליעילות הנמוכה של טכניקה זו, כולל פרוטוקול הסנכרון המשמש לזריעות מקבלות, סנכרון בין הזורע המקבל לשלב החזרת העוברים, אתר שיקוע העוברים, איכות הביציות המשמשות ל- SCNT ועוברים מיוצרים, האיכות והשלב התאי של תאים סומטיים של תורם גרעין, ומספר העוברים המוחזרים21.

על פי המחקר הנוכחי, הניתוח המתואר הוכח כיעיל, מהיר ובטוח לביצוע העברה כירורגית של עוברים משובטים (עד שלב 4 תאים) בזהבים, וכתוצאה מכך אבחנות הריון אולטרה-סונוגרפיות חיוביות והדמיה של מבנים עובריים בתוך לומן הרחם לאחר נקרופסיה, עם גיל הריון בערך בין 12-20 ימים של הריון22. שיטה נוספת פחות פולשנית להחזרת עוברי SCNT לאובידוקט של זרע כוללת לפרוסקופיה. עם זאת, היעילות של טכניקה זו משתנה במידה ניכרת בין פחות מ 20% מעל 80% בשל גורמים שונים כגון האנטומיה של המבנים, סוג הצנתר בשימוש, ואת האתר של שיקוע העובר 4,6,23,24,25,26,27. בעת החזרת 2-4 עוברי חזיר בלסטומר באמצעות לפרוסקופיה דרך אינפונדיבולום ל-6 זריעות, Wieczorek et al.4 לא השיגו הריונות חיוביים לאחר 28-31 ימים לאחר ההליך, ותוצאה זו הייתה קשורה לקשיים בהחדרת הצנתר לאובידוקט, החדרת צנתר רדוד לאובידוקט, והתרחשות של ניקוב אינפונדיבולום עם הצנתר. לכן, השיטה של החזרת עוברים באמצעות laparotomy כדי oviduct של זרע עדיין נראה היעיל ביותר.

הסיכון הניתוחי הכרוך בהליך הלפרטומיה להחזרת עוברים בזרע הוא קטן; עם זאת, חשוב לציין את האפשרות של היפרתרמיה ממאירה במהלך ההרדמה, אשר נראית בדרך כלל בחזירים מסחריים של גזע Landrace וגזע לבן גדול28. במקרה זה, אף אחד מהזימים המנותחים לא הראה סימנים קליניים של היפרתרמיה ממאירה במהלך ההרדמה. קיים גם סיכון לדימום מקומי קל מכלי דם גדולים יותר באזור התת עורי, אשר ניתן לעצור בקלות עם מלקחיים המוסטטיים או תפירה עם תפר נספג. האפשרות של חתך בטעות כל איבר של חלל הבטן, כגון שלפוחית השתן או לולאות מעיים, במהלך החתך עם אזמל בדקירה חתך הרחבה ב linea alba עם מספריים עשוי להתרחש גם. במקרה זה, על המנתח לשים לב היטב במהלך החתך של linea alba ותפירה של שרירי הבטן כדי למנוע חיתוך או שרוך מבנים היסוד.

מיומנותו הידנית של המנתח חיונית למניפולציה נכונה של השחלות וליציאה זהירה, תוך הימנעות מקרע של כלי הדם של פדיקור השחלות. כאשר קיים קושי באיתור השחלה/ות, ניתן להתחיל את ההליך על ידי איתור אחת מקרני הרחם ומעקב אחר הארכתה עד להגעה לקצה קרן הרחם בצומת הרחם-צינורית בסמוך לשחלה. יש להקפיד להימנע הידבקויות בשחלות וברחם עקב מניפולציה מוגזמת של איברים אלה. לחות מבנים אלה עם תמיסת רינגר הנקה או תמיסת מלח ב 39 מעלות צלזיוס במהלך הניתוח יכולה לסייע במניעת היווצרות הידבקות29. מניפולציה של צינור הרחם, במיוחד באזור הפימבריה, צריכה להתבצע בעדינות רבה כדי למנוע מתיחה וקרע. למרות שניתן לבצע החזרת עוברים חד צדדית, רק לאחד מצינורות הרחם, כדי למנוע מניפולציה מוגזמת של הרחם ולהפחית את זמן הניתוח, העברה דו צדדית עשויה להיות בטוחה ומועילה יותר, במיוחד במקרים בהם יש קרע מקרי של אחד מצינורות הרחם או ספקות לגבי תצהיר העובר במיקום הנכון. יתר על כן, העברה דו צדדית מומלצת יותר מכיוון שהיא מקדמת שיעורי הריון גבוהים יותר ומספר החזרזירים שנולדו בהשוואה להעברה חד צדדית16,30. נוכחות של ציסטות קשורה לחזרה סדירה או לא סדירה לייחום, כאשר עד 10% מהנקבות עם ציסטות בשחלות נותרו באנסטרוס. זה קשור לגורמים שונים כגון מתח, שימוש בפרוטוקולים הורמונליים, או תורשה גנטית31,32. במקרה שלנו, ציסטות פוליקולריות התרחשו למרות מעקב אחר המינון וזמן הניהול המומלץ על ידי יצרן ההורמונים לסנכרון חום.

לדעת כיצד לאתר את האוסטיום של צינור הרחם על ידי פתיחת הפימבריה היא בעלת חשיבות בסיסית לתצהיר נכון של עוברים במיקום המתאים. כדי למנוע טעויות לגבי מיקום שיקוע העוברים, מומלץ לבצע אימון מקדים על מעבר צנתר טומקט מלא בתמיסה (למשל, מים) דרך האוסטיום של צינור הרחם בדגימות של בית מטבחיים. כאשר פיפטה הוא הציג את המיקום הנכון, ניתן לראות עלייה בנפח של צינור הרחם עם הזרקת הפתרון. ראוי לציין כי ככל שכמות הנוזלים המועברת יחד עם העוברים קטנה יותר, כך גדלים הסיכויים להריון33. אם המנתח מתקשה מאוד למצוא את האוסטיום של צינור הרחם, ניתן לעשות כיס על האובידוקט ולהכניס דרכו את הצנתר. למרות שיטה אחרונה זו היא מהירה יותר וכוללת פחות מניפולציה של oviduct, המנתח צריך להימנע כלי דם ולהיות בטוח כי קטטר הוכנס כראוי בתוך לומן של oviduct.

למרות הסיכון של זיהומים לאחר הניתוח מהליך כירורגי זה הוא נמוך, זה יכול להתרחש בשל גורמים כגון רמת הניקיון של האזור שבו בעלי החיים שוכנים, משך ההליך הכירורגי, שמירה על ההלבשה במשך זמן מספיק, ואת המרשם הנכון של תרופות, כגון טיפול אנטיביוטי מונע ואנטי דלקתיות. ההשערה הסבירה ביותר להתרחשות הזיהום שנצפתה באחד הזימים המנותחים קשורה לנפילת החבישה זמן קצר לאחר שהחיה קמה לאחר הרדמה. למרות ניקוי יומי של הפצע הכירורגי של זהב זה בוצע עם גזה ספוגה בתמיסת מלח ויישום מקומי של משחה של פירסון, הליך כזה לא היה מספיק כדי למנוע זיהום עולה, הדורש יישום מים קרים באתר, ניקוז, טיפול אנטיביוטי מערכתי, ועוד 3 ימים של טיפול אנטי דלקתי. גם עם התרחשות של זיהום תת עורי, זה זהב הראה סימני הריון על בדיקה אולטרה סונוגרפית.

לאחר שימוש בחוטי ניילון וסיכות כירורגיות לסגירת העור בניתוחים קודמים, בחרנו להשתמש בדבק אתיל-ציאנואקרילט כדי להפחית את הלחץ בעת הסרת התפרים ולמנוע שאריות חוטים או סיכות. נוכחות של חוטים או סיכות מקדם דלקת מקומית קטנה עם היווצרות pustule. דבק אתיל-ציאנואקרילט כבר שימש בבטחה בהליכים כירורגיים, והוכח כיעיל, לא רעיל וקוטל חיידקים34,35. כל בעלי החיים הראו ריפוי פצעים מעולה, ללא סיבוכים, למעט הזהב, אשר החבישה נפלה זמן קצר לאחר ההליך הכירורגי.

גילויים

אף אחד מהכותבים לא חושף ניגוד עניינים כלשהו

תודות

ברצוננו להודות לבית החולים הווטרינרי לסוסים ולבית החולים הווטרינרי מעלי גירה של המכללה לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת סאו פאולו (FMVZ / USP), סאו פאולו, ברזיל, FAPESP (מענק 2022/11459-3, קרן המחקר של סאו פאולו), EMS Pharma, CNPq (מענק 405254/2022-9), וחקלאות חזירים Água Branca, איטו, סאו פאולו, ברזיל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.25 מ"ל קשחומר
1 מ"ל מזרקDescarpack341001חומר כירורגי
10 מ"ל מזרקDescarpack324601חומר כירורגי
20 מ"ל מזרקDescarpack324801חומר כירורגי
3 מ"ל מזרקDescarpack324201חומר
מזרק 5 מ"לDescarpack324401חומר כירורגי
60 מ"ל מזרקDescarpack323201חומר כירורגי
צינור אנדוטרכיאלי 9 מ"מRusch112482-000090חומר כירורגי
אליס מלקחייםכירורגי
גנרי Amox LAJA Saú de AnimalMAPA: 8.781/2004תרופה פרמצבטית
מלקחיים Bakhausמכשיר גנרי-כירורגי
צנתר 20GDescarpack362401קטטר לגישה תוך ורידית
CetaminAgener Uniã oרישום MAPA: SP-000292-5.000011 הרדמה
ג'ל קליני מוליךרישום RMCANVISA: 80122200013חומר כירורגי
Dipyrone D-500Zoetisרישום MAPA: SP0000728-46תרופה פרמצבטית
אזמל חד פעמי n. 22WiltexANVISA רישום: 10150470565מכשיר כירורגי
מברשת ספוג סטרילית חד פעמיתRioquimica7.89778E+12אספסיס כירורגי
סריקה קלה: GoIMVESCG01אולטרסאונד
אנדוזים AW פלוסRuhof34514חומר ניקוי למכשירים כירורגיים
פנטניל (פנטנסט)Cristá lia ANVISA רישום: 1029800810159
מפסק גוסטהרדמה מכשיר גנרי-כירורגי
הלסטד-יתוש מלקחיים המוסטטייםגנרי-כירורגי מכשיר
ריפוי - Unguento PearsonPearson SAרישום MAPA: SP0000094-16תרופה פרמצבטית
Rioquimicaרישום ANVISA: 218690015חומר כירורגי
איזופלואורןביוכימיקורישום ANVISA: 100630222
סט טפטוף IV הרדמה מאריךגנרי-נוזליטיפול
IV סט טפטוף מאקרוDescarpack410301טיפול בנוזלים
לקטופור (ceftiofur)Ourofino SAרישום MAPA: SP0000051-50תרופה פרמצבטית
לרינגוסקופ-מכשיר כירורגי
Maxicam 2%Ourofino SAרישום MAPA: SP0000051-69תרופה פרמצבטית
דבק Micropore 5 ס"מ x 10 ס"מ חומר כירורגיגנרי 1530
MidazolamHipolaborרישום ANVISA: 1134301430035
סט עירוי IV רב כיווניDescarpack413201טיפול בנוזלים
40 מ"מ x 1.2 מ"מDescarpack353601מחט סטרילית למריחת תרופות וחומרי הרדמה.
מחט 40 מ"מ x 1.6 מ"מWiltexANVISA: 10150470664מחט סטרילית למריחת תרופות וחומרי הרדמה.
מחזיק מחטגנרי-מכשיר כירורגי
ניילון 2 תפר trheadשאלון רפואיN502CTI40חומר כירורגי
עט רגילגנרי-רגיללרישום הערות
תמיסה פיזיולוגית 0.9% 500 מ"ל שקיתJP FarmaMS:1.0491.0070טיפול בנוזלים
חומצה פוליגליקולית 2 חוט תפרAtramatG4099-75Hחומר כירורגי
אשלגן כלוריSamtecANVISA רישום: 1559200010139תרופות פרנטרלי
Descarpack122401ציוד מגן אישי (PPE)
פרופופול (Provive)Uniã o Quí נציץANVISA רישום: 1049714490057
תמיסת הרדמה רינגר לקטט 500 מ"ל שקיתJP FarmaMS:1.0491.0061טיפול בנוזלים
Riohex 0.5% תמיסת אלכוהול קלורקסדיןRioquimica218690356אספסיס כירורגי
Riohex 2% תמיסת קלורקסדין עם חומר פעילי שטחRioquimica218690356אספסיס כירורגי
קרקפת 21 גרםDescarpack421201חומר כירורגי
כיסויי נעלייםאישי גנרי(PPE)
קומפרסים סטרילייםCremerANVISA רישום: 10071150065חומר כירורגי
כרית גזה סטריליתProcitexANVISA רישום: 80245210083חומר כירורגי
וילונות כירורגיים סטריליים 140 ס"מ x 90 ס"מ Venkuri7010003חומר כירורגי
וילונות כירורגיים סטריליים 150 ס"מ x 190 ס"מ PolarFixF00208חומר כירורגי
כפפות כירורגיות סטריליותMucamboCA: 39.317ציוד מגן אישי (PPE)
סטטוסקופציוד כירורגי
כובע כירורגיDescarpack93201ציוד מגן אישי (PPE)
חלוק כירורגיDescarpack231101ציוד מגן אישי (PPE)
מסכה כירורגיתDescarpack110701ציוד מגן אישי (PPE)
מספריים כירורגיים בוטה-קההגנרי-כירורגי
מספריים כירורגיים חדים-חדיםגנרי-מכשירכירורגי
מהדק כירורגיTradevet-חומרכירורגי
Tekbond סופר דבקטק בונד78072720030חומר כירורגי
מדחוםכירורגי
תלת כיווני StopcockSolidor374חומר כירורגי
טרמדול הידרוקלורידAgener Uniã oרישום MAPA: SP-000292-5.000002
חבישת סרט שקוףSkinupperרישום ANVISA: 82307460014חומר כירורגי
דבק עמיד למים 10 ס"מ x 4.5 ס"מ 364828 גנריחומר כירורגי
גנרי-כירורגי כירורגי מכשיר תמיסת מי חמצן מחט רישום עט כפפות נוהל ציוד מגן גנרי-כירורגי ציוד הרדמה

מקורות

  1. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), 5758(2021).
  2. Xi, J., et al. Genetically engineered pigs for xenotransplantation: Hopes and challenges. Front Cell Dev Biol. 10, 1093534(2023).
  3. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim Sci. 3, 826324(2022).
  4. Wieczorek, J., et al. Laparoscopic embryo transfer in pigs - comparison of different variants and efficiencies of the method. Pol J Vet Sci. 26 (2), 295-306 (2023).
  5. Martinez, E. A., et al. Design, development, and application of a non-surgical deep uterine embryo transfer technique in pigs. Anim Front. 3 (4), 40-47 (2013).
  6. Wieczorek, J., et al. A new concept in minimally invasive embryo transfer. Ann Anim Sci. 20 (4), 1289-1308 (2020).
  7. Brussow, K. P., Torner, H., Kanitz, W., Ratky, J. In vitro technologies related to pig embryo transfer. Reprod Nutr Dev. 40 (5), 469-480 (2000).
  8. Chen, P. R., et al. Production of pigs from porcine embryos generated in vitro. Front Anim. Sci. 3, 826324(2022).
  9. Langendijk, P., vanden Brand, H., Soede, N. M., Kemp, B. Effect of boar contact on follicular development and on estrus expression after weaning in primiparous sows. Theriogenology. 54 (8), 1295-1303 (2000).
  10. Costea, R., Ene, I., Pavel, R. Pig sedation and anesthesia for medical research. Animals. 13, 3807(2023).
  11. Vierstraete, M., Der Vekens, N. V. an, Beckers, R., Renard, Y., Muysoms, F. Descriptive anatomy of the porcine ventral abdominal wall as a basis for training ventral hernia repair techniques. J Abdom Wall Surg. 3, (2024).
  12. Luna, S. P. L., et al. Validation of the UNESP-Botucatu pig composite acute pain scale (UPAPS). PLoS One. 15 (6), e0233552(2020).
  13. Arruda, P. H. E., Gauger, P. Optimizing sample selection, collection, and submission to optimize diagnostic value. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 98-111 (2019).
  14. Althouse, G. C., Kauffold, J., Rossow, S. Diseases of the reproductive system. Diseases of swine. 11th ed. Zimmerman, J. J., Karriker, L. A., Ramirez, A., Schwartz, K. J., Stevenson, G. W., Zhang, J. , Wiley-Blackwell. Hoboken, NJ. 373-392 (2019).
  15. Hao, Y., et al. Porcine skin-derived stem cells can serve as donor cells for nuclear transfer. Cloning Stem Cells. 11 (1), 101-109 (2010).
  16. Rim, C. H., et al. The effect of the number of transferred embryos, the interval between nuclear transfer and embryo transfer, and the transfer pattern on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 143 (1-4), 91-96 (2013).
  17. Choi, K., et al. Production of heterozygous alpha 1,3-galactosyltransferase (GGTA1) knock-out transgenic miniature pigs expressing human CD39. Transgenic Res. 26 (2), 209-224 (2017).
  18. Shim, J., et al. Human immune reactivity of GGTA1/CMAH/A3GALT2 triple knockout Yucatan miniature pigs. Transgenic Res. 30 (5), 619-634 (2021).
  19. Glanzner, W. G., Rissi, V. B., Bordignon, V. Somatic cell nuclear transfer in pigs. Methods Mol Biol. 2647, 197-210 (2023).
  20. Kim, J. H., et al. Analysis of production efficiency of cloned transgenic Yucatan miniature pigs according to recipient breeds with embryo transfer conditions. Theriogenology. 218, 193-199 (2024).
  21. Navarro-Serna, S., Piñeiro-Silva, C., Romar, R., Parrington, J., Gadea, J. Generation of Gene Edited Pigs. , 71-130 (2022).
  22. Geisert, R. D., et al. Rapid conceptus elongation in the pig: An interleukin 1 beta 2 and estrogen-regulated phenomenon. Mol Reprod Dev. 84 (9), 760-774 (2017).
  23. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  24. Hazeleger, W., Kemp, B. Recent developments in pig embryo transfer. Theriogenology. 56 (8), 1321-1331 (2001).
  25. Youngs, C. R. Factors influencing the success of embryo transfer in the pig. Theriogenology. 56 (8), 1311-1320 (2001).
  26. Wieczorek, J., Koseniuk, J., Mandryk, I., Poniedziałek-Kempny, K. Piglets born after intrauterine laparoscopic embryo transfer. Pol J Vet Sci. 18 (2), 425-431 (2015).
  27. Brüssow, K. P., Rátky, J., Antosik, P., Kempisty, B., Jaśkowski, J. M. Embryo transfer in swine - an indispensable key for the application of reproduction techniques. Electron J Pol Agric Univ. 21 (3), (2018).
  28. Cadwallader, J. A., Alley, M. R. Malignant hyperthermia in a crossbred landrace-large white pig. N Z Vet J. 23 (9), 207-211 (1975).
  29. Fatehi Hassanabad, A., et al. Prevention of postoperative adhesions: A comprehensive review of present and emerging strategies. Biomolecules. 11 (7), 1027(2021).
  30. Shi, J., et al. Influence of embryo handling and transfer method on pig cloning efficiency. Anim Reprod Sci. 154, 121-127 (2015).
  31. Castagna, C. D., et al. Ovarian cysts and their consequences on the reproductive performance of swine herds. Anim Reprod Sci. 81 (1-2), 115-123 (2004).
  32. Knox, R. V. Factors influencing follicle development in gilts and sows and management strategies used to regulate growth for control of estrus and ovulation. J Anim Sci. 97 (4), 1433-1445 (2019).
  33. Galvin, J. M., Killian, D. B., Stewart, A. N. V. A procedure for successful nonsurgical embryo transfer in swine. Theriogenology. 41 (6), 1279-1289 (1994).
  34. Lins, R. D. A. U., et al. Use of cyanoacrylate in the coaptation of edges of surgical wounds. An Bras Dermatol. 87 (6), 871-876 (2012).
  35. Horvath-Pereira, B. deO., et al. Case report: An innovative non-invasive technique to manage shell injuries in C. carbonarius. Front Vet Sci. 9, 930419(2022).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים