מאמר שיטה

זרימה צידית פלואורסצנטית Immunoassay מבוסס על נקודות קוונטיות ננו-חרוזים

DOI:

10.3791/67000

⸱

28 ביוני 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Central Laboratory, Shanghai Skin Disease Hospital, School of Medicine, Tongji University, 2Department of Dermatology, Shanghai Skin Disease Hospital, Institute of Dermatology, School of Medicine, Tongji University, 3Department of Pharmacy, Changzheng Hospital, Naval Medical University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להכנת ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB) ולזיהוי סמנים ביולוגיים של מחלות באמצעות רצועות חיסון מבוססות זרימה צידית מבוססות QDNB. ניתן להעריך את תוצאות הבדיקה באופן איכותי תחת תאורת אור UV ולמדוד כמותית באמצעות קורא פס פלואורסצנטי תוך 15 דקות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נקודות קוונטיות, הידועות גם בשם ננו-גבישים מוליכים למחצה, הן תוויות פלואורסצנטיות חדשניות לדימות וחישה ביולוגיים. עם זאת, נוגדנים נקודתיים קוונטיים מצומדים עם ממדים קטנים (~ 10 ננומטר), שהוכנו באמצעות הליכי טיהור מייגעים, מפגינים רגישות מוגבלת בזיהוי סמנים מסוימים של מחלת קורט באמצעות רצועות חיסון זרימה רוחבית. כאן אנו מציגים שיטה להכנת ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB) בשיטת אידוי תחליב חד-שלבית. באמצעות QDNB כפי שהוכן, חיסון זרימה צידית פלואורסצנטית יוצר כדי לזהות סמנים ביולוגיים של מחלות באמצעות חלבון מגיב C (CRP) כדוגמה. שלא כמו ננו-חלקיקים של נקודה קוונטית בודדת, מצומדים של ננו-נוגדנים של נקודה קוונטית רגישים יותר כמו תוויות אימונואסאי בשל הגברת האות על ידי עטיפת מאות נקודות קוונטיות בננו-חרוז פולימרי מרוכב אחד. יתר על כן, הגודל הגדול יותר של QDNBs מאפשר הפרדת צנטריפוגות קלה יותר בעת הצמדת QDNB עם נוגדנים. בדיקת הזרימה הצידית הפלואורסצנטית המבוססת על QDNBs הייתה מפוברקת, וריכוז CRP בדגימה נמדד תוך 15 דקות. ניתן להעריך את תוצאות הבדיקה באופן איכותי תחת תאורת אור UV ולמדוד כמותית באמצעות קורא פלואורסצנטי תוך 15 דקות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רצועות Lateral flow immunoassay (LFIA) משמשות ככלים חיוניים לגילוי מהיר בנקודות טיפול 1,2, במיוחד בבדיקות סקר למחלות במהלך מגיפות. עם זאת, רצועות בדיקת LFIA מסורתיות מבוססות זהב קולואידיות מציגות רגישות זיהוי נמוכה ומספקות רק תוצאות איכותיות3. כדי לשפר את רגישות הזיהוי של LFIA, הופיעו ננו-חלקיקים חדשים שונים, כולל לטקס צבעוני 4,5,ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים 6, מיקרוספרות פלואורסצנטיות 7,8 ונקודות קוונטיות 9,10,11. נקודות קוונטיות (QDs)12,13, הידועות גם כננו-גבישים מוליכים למחצה, מציעות אורכי גל של פליטה מתכווננת, טווח עירור רחב ויעילות הארה גבוהה, מה שהופך אותן לתוויות אידיאליות לדימות ביולוגי.

עם זאת, האות הפלואורסצנטי הנפלט מנקודות קוונטיות בודדות נותר חלש, וכתוצאה מכך רגישות הזיהוי נמוכה יחסית באימונואסות. אנקפסולציה של נקודות קוונטיות רבות בתוך מיקרוספרות יכולה להגביר אותות ולשפר את הרגישות של בדיקות חיסוניות מבוססות נקודות קוונטיות. שיטות שונות, כגון הרכבה עצמית שכבה אחר שכבה 14,15,16,17,18, שיטת הנפיחות19,20, ומיקרספירת סיליקה 21,22,23,24 אנקפסולציה, שימשו כדי לתמצת נקודות קוונטיות בתוך מיקרוספרות. לדוגמה, ניתן להשיג תוויות ננו-ספירה של סיליקה עם פונקציונליות של נקודות קוונטיות על ידי הגדלת עומס QD לכל תגובה חיסונית דחוקה25. מייבש ריסוס המצויד באטומיזר על-קולי שימש גם להכנת ננו-ספירות QD-BSAננומטריות 26. עם זאת, השיטות הנ"ל סובלות מריבוי שלבים מורכבים, מרווה פלואורסצנטית ופרודוקטיביות נמוכה.

בעבודתנו הקודמת27 דווח על שיטת אידוי תחליב-ממס לעטיפת נקודות קוונטיות בתוך ננו-חרוזים פולימריים. טכניקת הכנה זו פשוטה, שומרת על היעילות הפלואורסצנטית של QDs, מבטיחה יעילות אנקפסולציה גבוהה ומאפשרת ייצור קל להרחבה. מספר קבוצות מחקר פיתחו בהצלחה רצועות LFIA באמצעות QDNB שהוכנו בשיטה זו ליישומים, כולל זיהוי רעלני מזון 28,29,30, זיהוי סמנים ביולוגיים של מחלות זיהומיות 31,32 וניטור סביבתי33.

פרוטוקול זה מציג שלבי הכנה ספציפיים עבור ננו-חרוזי נקודה קוונטית (QDNB), QDNB וצימוד נוגדנים, הכנת FFIA מבוסס QDNB ומדידה של חלבון מגיב C (CRP) בדגימות פלזמה אנושיות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר אושר על ידי מועצת הסקירה המוסדית של בית החולים למחלות עור בשנחאי (מס '2020-15). כל ההליכים הניסיוניים הכוללים דגימות דם אנושיות נערכו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית II. פרטי הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ננו-חרוזי QDs

הערה: עבור סינתזת ננו-חרוזי QD, נעשה שימוש בטכניקת אידוי תחליב-ממס כדי לסנתז ננו-חרוזי QD, עם יחס בין פאזת שמן לשלב מים של 1:5. תחליב המיני נוצר באמצעות אולטרסוניקציה, והננו-חרוזים מתמצקים באמצעות אידוי ממס (כלורופורם). נתרן הידרוקסידי נוצל כדי לזרז את ההידרוליזה של קבוצות אנהידריד על פני השטח של ננו-חרוזים, ולהמיר אותם לקבוצות קרבוקסיל.

  1. הכנת תמיסות פאזת שמן ופזה מימית
    1. הכן 1 מ"ל של שלב שמן: 0.4 מ"ל של פולי (סטירן-co-maleic אנהידריד) תמיסת (PSMA) (50 מ"ג / מ"ל), 0.1 מ"ל של תמיסת QDs (100 מ"ג / מ"ל), מלא כל נפח פחות מ 1 מ"ל עם כלורופורם.
    2. הכן 5 מ"ל של פאזה מימית: תמיסה מימית SDS (0.5 wt %).
  2. הכנת תחליב והתמצקות
    1. מוסיפים 1 מ"ל פאזת שמן ו-5 מ"ל פאזה מימית לבקבוקון (15 מ"ל), ומניחים את הבקבוקון על מערבל מגנטי. הפעל את עוצמת המערבל המגנטי.
    2. לאחר שהשמן והשלבים המימיים מעורבבים לחלוטין, העבירו מיד את הבקבוק לאולטרסוניקציה המתוכנתת (60 שניות, פולס של 3 שניות ואחריו הפסקה של 3 שניות, 50% משרעת) והפעילו את הכוח.
    3. שימו לב לפתרון לאחר ultrasonication. התמיסה הראשונית בצבע ארגמן עברה לשלב אטום שעדיין שומר על גוון אדמדם.
    4. החזירו את הבקבוקון למערבל המגנטי בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב מתמשך למשך הלילה. הכלורופורם התאדה בהדרגה, והתחליב התמצק לננו-חרוזים מרוכבים.
  3. שינוי פני השטח של ננו-חרוזים
    1. הוסף 0.1 מ"ל של 0.1 mM נתרן הידרוקסידי לתרחיף ננו-חרוזים למשך שעה אחת. קבוצות האנהידריד על פני השטח של ננו-חרוזים עוברות הידרוליזה לקבוצות קרבוקסיל.
  4. טיהור ננו-חרוזים
    1. כבו את המערבל המגנטי והעבירו את ננו-חרוזי הננו-חרוזים המוצקים לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינור ב 13523 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולהשליך את supernatant.
    2. הוסף את הנפח הראשוני של מים deionized למשקעים, לכסות את הצינור עם המכסה שלה, לטבול אותו לתוך אמבט מים קולי, ולשמור על טבילה עד המשקע הוא התפזר במלואו.
    3. חזור על שלבים 1.4.1-1.4.2 פעמיים, ולבסוף, העבר את ננו-החרוזים לבקבוק הזכוכית. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.
  5. אפיון ננו-חרוזים
    1. אפיין את הגודל והמורפולוגיה של ננו-חרוזי QDs באמצעות הדמיית מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM)22.
      הערה: ניתן להשיג גדלים שונים של ננו-חרוזים על-ידי שינוי היחס בין תמיסת QDs ותמיסת PSMA. ניתן לקבוע את גודל ננו-חרוזי QDs גם באמצעות פיזור אור דינמי (DLS)27.

2. הכנת מצמידות נוגדנים QDNB

  1. הפעלה של קבוצות קרבוקסיל
    1. הוסף 100 μL של QDNB מוכן (10 מ"ג / מ"ל) ב 200 μL של חיץ פוספט (PB, 20 mM, pH 6.0), ולאחר מכן להוסיף 6 μL של EDC (20 מ"ג / מ"ל).
    2. דוגרים על התערובת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מיקסר סיבובי.
    3. לאחר הדגירה, צנטריפוגו את התערובת ב 13523 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולזרוק את supernatant.
    4. הוסף 100 μL של PB (20 mM, pH 6.0) למשקעים, לכסות את הצינור עם המכסה שלה, לטבול את הצינור לתוך אמבט מים קולי תפעולי עד המשקע הוא התפזר במלואו.
  2. צימוד נוגדנים וננו-חרוזים
    1. יש לפזר נוגדנים של 100 מיקרוגרם ב-200 מיקרוליטר של PB (20 מילימול, pH 6.0) ולהוסיף את תרחיף ה-QDNB המופעל שהתקבל משלב 2.1 לתמיסת הנוגדנים.
    2. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות עם סיבוב רציף. הסר נוגדנים עודפים על ידי צנטריפוגה ב 6010 x גרם במשך 5 דקות (בטמפרטורת החדר), ולאחר מכן בזהירות להשליך את supernatant.
  3. חסימה של ננו-חרוזים
    1. הוסף 200 μL של תמיסת קזאין 1% (במאגר PB של 20 mM, pH 7.4) לשאריות (המתקבלות בשלב 2.2.2), כסה את הצינור במכסה שלו וטבול אותו באמבט המים האולטרסוני התפעולי עד שהשאריות מפוזרות במלואן.
    2. דוגרים על התערובת בטמפרטורת החדר במשך שעתיים עם סיבוב רציף.
      הערה: מטרת שלב זה היא לחסום אתרים שלא הגיבו על פני השטח של QDNB.
  4. אחסון של מצומדים
    1. הוסף 100 μL של תמיסת חומר משמר (20 mM PB buffer, pH 7.4, 1% BSA, 5% trehalose, 6% סוכרוז, 0.1% S9, pH 7.4) לתערובת ואחסן ב 4 ° C לשימוש לאחר מכן.

3. הכנת רצועות immunoassay זרימה לרוחב

הערה: הרצועה האימונוכרומטוגרפית מורכבת מקרום ניטרוצלולוז (NC), כרית דגימה, פד מצומד, פד סופג ולוח פוליוויניל כלוריד (PVC) (איור 1). יש להכין את כל הפתרונות ולהשתמש בהם באופן מיידי. מומלץ להכין רצועות אימונואסאי זרימה לרוחב בחדר נקי עם לחות מבוקרת.

  1. הכנת קרום NC
    1. הכינו תמיסת ציפוי קו בדיקה (T-line) וקו בקרה (C-line): דללו את נוגדן לכידת CRP ואת IgG נגד ארנב עיזים עם PB לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.
    2. הניחו את לוח ה-PVC כראוי, והסירו את נייר המגן הממוקם 25 מ"מ מקצה לוח ה-PVC. יישרו והצמידו את קרום NC לאורך הקצה התחתון של נייר המגן שנותר ללוח ה-PVC.
    3. יש לפזר תמיסות ציפוי T-line ו-C-line על קרום NC בקצב סילון של 1 μL/cm, ולהבטיח שהוא ממוקם במרחק של 20 מ"מ מהקצה העליון, ויוצר קו בדיקה (1 מ"מ רוחב).
    4. מקם את קרום NC בתנאים עם לחות של פחות מ -30% וטווח טמפרטורות של 18-26 ° C לייבוש. זמן הייבוש צריך להיות לפחות 24 שעות.
      הערה: ודא שהקצוות העליונים והתחתונים של קרום NC צמודים לקצוות המתאימים של האזורים הסמוכים. אין לגעת בקרומי NC בידיים. הלחות במהלך שלב זה צריכה להיות נשלטת בטווח של 45% עד 65%. לפני שתמשיך, יש לאזן את תמיסת ציפוי קו T, תמיסת ציפוי קו C וקרום NC לאותה טמפרטורה.
  2. הכנת הפד המצומד
    1. יש לטבול את הפד המצומד בתמיסת הטיפול בפד המצומד (20 mM PB buffer, pH 7.4, 1% BSA).
    2. הכניסו את כרית ההצמדה הספוגה לתנור ייבוש לטיפול ייבוש (בטמפרטורת החדר) למשך הלילה.
    3. הדביקו בעדינות את משטח ההצמדה שהשתנה על לוח ה-PVC.
    4. לדלל את הפתרון המצומד מוכן נוגדנים QDNB עם פתרון משמר (20 mM PB buffer, pH 7.4, 1% BSA, 5% trehalose, 6% סוכרוז, 0.1% S9, pH 7.4).
    5. יש להוציא את תמיסת הנוגדנים המצומדים QDNB על כרית הצמידות בקצב סילון של 1 μL/cm ולייבש את הפד המצומד למשך 24 שעות.
      הערה: יש להתאים את יחס הדילול הספציפי בהתאם ליעד האיתור.
  3. הכנת פנקס מדגם
    1. יש לטבול את כרית הדגימה בתמיסת הטיפול בכרית הדגימה (20 mM PB buffer, pH 7.4, 1% BSA, 5% trehalose, 6% סוכרוז, 0.1% S9, pH 7.4).
    2. הכניסו את כרית הדגימה הספוגה לתנור ייבוש (45°C) וייבשו במשך 24 שעות.
  4. הרכבת הכרטיס וחיתוכו לרצועות
    1. כפי שניתן לראות באיור 1, הניחו ברצף את נייר הספיגה (פד סופג), פד מצומד ומשטח דגימה על לוח PVC עם קרום NC.
    2. חותכים את הכרטיס לרצועות רוחב 3.8 מ"מ.
  5. אריזת הרצועות
    1. עטפו את רצועות הבדיקה בקסטת פלסטיק ואטמו נרתיק רדיד אלומיניום המכיל חומר ייבוש.

4. פעולת בדיקה והערכה איכותית

הערה: פעולות הכוללות דגימות דם אנושיות מומלצות לביצוע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית II. דגימות הפלזמה האנושיות התקבלו ממעבדה קלינית (מנבדקים אנושיים לא מזוהים). בדרך כלל, דם אנושי נאסף באמצעות שפופרת ואקום EDTA, והפלזמה בודדה על פי פרוטוקול סטנדרטי34. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר להפרדת פלזמה. אספו את השכבה העליונה של הפלזמה הצהובה באמצעות פיפטה, ואחסנו את הפלזמה בצינור של 1.5 מ"ל בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

  1. פיפטה 10 μL של דגימת פלזמה או תמיסת כיול לתוך 1 מ"ל של חיץ PBS המכיל 0.1% Tween 20. לאחר מכן, להעביר 100 μL של הדגימה מדולל מוכן על כרית הדגימה של רצועת הבדיקה.
  2. לאחר ריצה של 15 דקות, צפו באותות הפלואורסצנטיים של קו T וקו C תחת חשיפה לאור אולטרה סגול כדי לקבל תוצאות איכותיות.
  3. הכנס את כרטיס הרצועה לקורא בדיקת זרימה צידית פלואורסצנטית כדי לקבל את עוצמות הפלואורסצנטיות לניתוח כמותי.
    הערה: בדוגמה זו, שיטת החיסון של סנדוויץ' משמשת35,36; קו אדום אחד (קו בקרה) מציין תוצאה שלילית, ואילו שני הקווים האדומים (קווי בדיקה ובקרה) מציינים תוצאה חיובית. היעדר קו הבקרה מעיד על כך שהבדיקה שנערכה אינה חוקית.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הליכי הכנת QDNB מודגמים באופן סכמטי באיור 1A. שלב השמן המכיל QDs ופולימר בכלורופורם עורבב עם שלב המים, ומיני תחליב התקבל על ידי סוניקציה. התחליב התמצק על ידי אידוי הדרגתי של כלורופורם. מיקרוגרף אלקטרונים תמסורת (TEM) של QDNB מוצג באיור 2A. ל-QDNBs יש מורפולוגיה כדורית, עם קטרים ממוצעים של 96 ננומטר, שנמדדו מעל 50 QDNB בתמונות TEM. ננו-חלקיקי QD נצפים בבירור בתוך ננו-החרוזים, מה שמצביע על אנקפסולציה מוצלחת. איור 2B ואיור 2D מראים את ספקטרום הפלואורסצנטיות והבליעה של QDNB, בהתאמה.

ה-QDNB והנוגדן צומדו באמצעות כימיה של קרבודימיד, כפי שמוצג באיור 1B. צימוד נוגדני QDNB שימש להכנת FFIA מבוסס QDNB. המבנה של LFIA מומחש באיור 1C. אם האנטיגן CRP קיים בדגימה, מצומד QDNB-anti-CRP מצטבר בקו הבדיקה.

כפי שניתן לראות באיור 3, המדידה מתבצעת על-ידי הוספת 100 μL של דגימה מדוללת לחור הדגימה. לאחר זמן תגובה של 15 דקות, ניתן לקרוא את תוצאות הבדיקה באופן איכותי תחת תאורת אור UV. את התוצאות הכמותיות ניתן לקבל באמצעות קורא רצועות פלואורסצנטיות, וניתן לחשב את ריכוז הדגימה באמצעות משוואת כיול המוטמעת בתוכנת קורא הפסים37,38.

figure-results-1
איור 1: איור של הזרימה הצידית הפלואורסצנטית החיסונית המבוססת על ננו-חרוזים של נקודות קוונטיות. (A) נהלים להכנת QDNB. (B) עקרון צימוד נוגדני QDNB. (C) עקרון LFIA מבוסס QDNB לזיהוי CRP. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: אפיון QDNBs. (A) תמונת TEM של QDNBs. סרגל קנה מידה: 100 ננומטר. (B) ספקטרום פליטה פלואורסצנטי של QDNB. (C) ספקטרום בליעה של QDNB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: הליכים של בדיקה חיסונית של זרימה צידית עבור CRP. (A) איור של האיתור. (B) צילומים של רצועות LFIA מבוססות QDNB המזהות דגימות CRP בטווח של 0-30 מ"ג/ליטר תחת אור UV. (C) קורא פלואורסצנטי לכימות התוצאות. (ד) צילום התוצאות הכמותיות. (E) זיהוי חלבון מגיב C (CRP) באמצעות טרנספורמציה לוגיסטית ואחריה רגרסיה ליניארית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להכנת ננו-כדוריות נקודה קוונטית (QDNB)27 ושימוש ב-QDNB להכנת בדיקות חיסוניות פלואורסצנטיות לזרימה צידית (LFIA). מודגמת מדידה איכותית וכמותית של CRP במדגמים. LFIA מבוסס QDNB זה יכול להיות מיושם גם על סמנים ביולוגיים אחרים של מחלות25,32, רעלני מזון29,30, וירוסים16,27, ועוד.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה הם הכנת צימודים של נוגדנים QDNB ו- QDNB. גודל החלקיקים של QDNB ותכולת ה-QD בננו-חרוזים צריכים להיות ממוטבים כדי לקבל QDNB פלואורסצנטי מאוד עם אותות רקע נמוכים ב-LFIA. לכידה וזיהוי של זוגות נוגדנים הם קריטיים עבור החיסון ויש לבדוק אותם עבור ההתאמות הטובות ביותר מספקים שונים. יש למטב את הצמידות של הנוגדן עם QDNB, כולל יחס נוגדנים/QDNB, pH חוצץ וריאגנטים חוסמים. באופן ספציפי, יש להימנע מצבירה של QDNB ונוגדנים על ידי אופטימיזציה של ה- pH של החיץ, ריכוז המלח וזמן התגובה בהליכי הצמידה.

בהשוואה לשיטות הכנה אחרות עבור ננו-חרוזי נקודה קוונטית, לפרוטוקול זה יש יתרונות של פשטות, תפעול קל ופרודוקטיביות גבוהה. יתר על כן, ננו-חרוזי הפולימר המרוכבים תואמים ביולוגית, בניגוד לננו-חרוזי סיליקה, אשר בדרך כלל דורשים שינוי פני שטח נוסף עם פולימרים. עם זאת, ה-QDNB שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה אינם חד-פיזוריים כמו אלה שהוכנו באמצעות ננו-חרוזים בתבנית פולימר19 או סיליקה21 . גודל החלקיקים של QDNB נע בדרך כלל בין 70 ננומטר ל -200 ננומטר.

רצועות חיסון זרימה צידית מבוססות QDNB (LFIA) מוכנות באופן דומה לרצועות LFIA פלואורסצנטיות אחרות. בשל התפוקה הקוונטית הגבוהה של QDs והגברת האותות של QDNB, LFIA מבוסס QDNB המשתמש בפרוטוקול זה רגיש יותר מאשר LFIA פלואורסצנטי מבוסס אחרים, כגון מיקרוספרות פלואורסצנטיות ומיקרוספרות פלואורסצאין. בנוסף, היציבות של QDNB עדיפה על פלואורסצאין מסורתי, ומספקת ל-FFIA מבוסס QDNB זמן אחסון ארוך יותר.

עם זאת, קדמיום על פני השטח של נקודות קוונטיות נוטה לקלציה עם קבוצות סולפידריל בחלבונים, במיוחד בסביבות מימיות. הימנעות משימוש בריכוזים גבוהים של חלבון היא קריטית ליציבות של FFIA מבוסס QDNB. קדמיום הוא רעיל, והשימוש בו מוגבל במצבים מסוימים, מה שמחייב הכנת נקודות קוונטיות נטולות קדמיום בעלות תפוקה קוונטית גבוהה ויציבות.

לסיכום, ניתנת שיטה רב-תכליתית להכנת ננו-חרוזי נקודה קוונטית בשלב אחד, והיא ניתנת להרחבה לייצור תעשייתי. באמצעות QDNBs שהוכנו, נוצרו רצועות אימונואסאי זרימה צידית פלואורסצנטית לזיהוי איכותי וכמותי של סמנים ביולוגיים של מחלות. ה-QDNB האידיאלי עבור LFIA הוא ננו-חרוז בגודל קטן העטוף במספר רב של QDs ללא מרווה פלואורסצנטית.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פנגפיי ז'אנג הוא מייסד Shanghai Kundao Biotech ויש לו אינטרסים פיננסיים פוטנציאליים עם חברה זו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט ועדת המדע והטכנולוגיה של שנחאי (STCSM) (22S31902000) ותוכנית הדגירה למחקר קליני של בית החולים למחלות עור בשנחאי (NO. lcfy2021-10).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(דימתיל-אמינו)פרופיל)-N'-אתילקרבודימיד הידרוכלורידסיגמא-אולדריץ'03450
נייר ספיגה Kinbio BiotechCH37K
אלבומין סרום בקרSigma-AldrichB2064
CaseinSigma-AldrichC8654
CdSe/ZnS נקודה קוונטיתSuzhou Mesolight Inc.CdSe / ZnS-625
CholoroformSino Pharm10006818
נוגדן CRPHytest Biotech4C28
קורא בדיקת זרימה רוחבית פלואורסצנטיתSuzhou Helmence Precision InstrumentFIC-H1
כרית סיבי זכוכיתKinbio BiotechSB06
עז נגד ארנב IgGSangon BiotechD111018
ממברנת ניטרוצלולוזה קופולימרCN140
פולי (סטירן-מאליק) אנהידריד Sigma-AldrichS458066
Rabbit IgGSangon BiotechD110502
נתרן דודציל סולפטסינו פארם30166428
סודיום הידרוקסידסינו פארם10019718

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. de Puig, H., Bosch, I., Gehrke, L., Hamad-Schifferli, K. Challenges of the nano-bio interface in lateral flow and dipstick immunoassays. Trends Biotechnol. 35 (12), 1169-1180 (2017).
  2. Miller, B. S., et al. Spin-enhanced nanodiamond biosensing for ultrasensitive diagnostics. Nature. 587 (7835), 588-593 (2020).
  3. Gao, Z., et al. Platinum-decorated gold nanoparticles with dual functionalities for ultrasensitive colorimetric in vitro diagnostics. Nano Lett. 17 (9), 5572-5579 (2017).
  4. Fan, L., et al. Deeply-dyed nanobead system for rapid lateral flow assay testing of drugs at point-of-care. Sensors Actuators B Chem. 362, 131829(2022).
  5. Garcia, V. S., Guerrero, S. A., Gugliotta, L. M., Gonzalez, V. D. G. A lateral flow immunoassay based on colored latex particles for detection of canine visceral leishmaniasis. Acta Trop. 212, 105643(2020).
  6. You, M., et al. Household fluorescent lateral flow strip platform for sensitive and quantitative prognosis of heart failure using dual-color upconversion nanoparticles. ACS Nano. 11 (6), 6261-6270 (2017).
  7. Ye, Z., Tan, M., Wang, G., Yuan, J. Novel fluorescent europium chelate-doped silica nanoparticles: preparation, characterization and time-resolved fluorometric application. J Mater Chem. 14 (5), 851(2004).
  8. Xu, Y., Li, Q. Multiple fluorescent labeling of silica nanoparticles with lanthanide chelates for highly sensitive time-resolved immunofluorometric assays. Clin Chem. 53 (8), 1503-1510 (2007).
  9. Zhang, B., et al. Improving detection sensitivity by oriented bioconjugation of antibodies to quantum dots with a flexible spacer arm for immunoassay. RSC Adv. 6 (55), 50119-50127 (2016).
  10. Li, Z., et al. Rapid and sensitive detection of protein biomarker using a portable fluorescence biosensor based on quantum dots and a lateral flow test strip. Anal Chem. 82 (16), 7008-7014 (2010).
  11. Wang, L., et al. Fluorescent strip sensor for rapid determination of toxins. Chem Commun. 47 (5), 1574-1576 (2011).
  12. Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labeling and sensing. Nat Mater. 4 (6), 435-446 (2005).
  13. Smith, A. M., Nie, S. Compact quantum dots for single-molecule imaging. J Vis Exp. (68), e4236(2012).
  14. Wang, C., et al. Layer-by-layer assembly of magnetic-core dual quantum dot-shell nanocomposites for fluorescence lateral flow detection of bacteria. Nanoscale. 12 (2), 795-807 (2020).
  15. Hu, J., Tang, F., Jiang, Y. Z., Liu, C. Rapid screening and quantitative detection of Salmonella using a quantum dot nanobead-based biosensor. Analyst. 145 (6), 2184-2190 (2020).
  16. Wang, W., et al. Introduction of graphene oxide-supported multilayer-quantum dots nanofilm into multiplex lateral flow immunoassay: A rapid and ultrasensitive point-of-care testing technique for multiple respiratory viruses. Nano Res. 16 (2), 3063-3073 (2023).
  17. Wang, C., et al. Colorimetric-fluorescent dual-signal enhancement immunochromatographic assay based on molybdenum disulfide-supported quantum dot nanosheets for the point-of-care testing of monkeypox virus. Chem Eng J. 472, 144889(2023).
  18. Zheng, S., et al. Dual-color MoS2@QD nanosheets mediated dual-mode lateral flow immunoassay for flexible and ultrasensitive detection of multiple drug residues. Sensors Actuators B Chem. 403, 135142(2024).
  19. Wang, G., et al. Efficient incorporation of quantum dots into porous microspheres through a solvent-evaporation approach. Langmuir. 28 (14), 6141-6150 (2012).
  20. Li, H., et al. Fluorescent lateral flow immunoassay for highly sensitive detection of eight anticoagulant rodenticides based on cadmium-free quantum dot-encapsulated nanospheres. Sensors Actuators B Chem. 324, 128771(2020).
  21. Gao, F., et al. Rational design of dendritic mesoporous silica nanoparticles' surface chemistry for quantum dot enrichment and an ultrasensitive lateral flow immunoassay. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (18), 21507-21515 (2021).
  22. Xu, L. D., Zhu, J., Ding, S. N. Immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins using novel red emission-enhanced carbon dot-based silica spheres. Analyst. 146 (16), 5055-5060 (2021).
  23. Tao, S., et al. SARS-Cov-2 Spike-S1 antigen test strip with high sensitivity endowed by high-affinity antibodies and brightly fluorescent QDs/silica nanospheres. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (23), 27612-27623 (2023).
  24. Wang, C., et al. Development of an ultrasensitive fluorescent immunochromatographic assay based on multilayer quantum dot nanobead for simultaneous detection of SARS-CoV-2 antigen and influenza A virus. Sensors Actuators B Chem. 345, 130372(2021).
  25. Chen, L., Chen, C., Li, R., Li, Y., Liu, S. CdTe quantum dot functionalized silica nanosphere labels for ultrasensitive detection of biomarker. Chem Commun. 19, 2670-2672 (2009).
  26. Chu, M., et al. A novel method for preparing quantum dot nanospheres with narrow size distribution. Nanoscale. 2 (4), 542-547 (2010).
  27. Zhang, P., Lu, H., Chen, J., Han, H., Ma, W. Simple and sensitive detection of HBsAg by using a quantum dots nanobeads based dot-blot immunoassay. Theranostics. 4 (3), 307-315 (2014).
  28. Ouyang, S., et al. An on-site, ultra-sensitive, quantitative sensing method for the determination of total aflatoxin in peanut and rice based on quantum dot nanobeads strip. Toxins. 9 (4), 137(2017).
  29. Liu, J., et al. Quantitative ciprofloxacin on-site rapid detections using quantum dot microsphere based immunochromatographic test strips. Food Chem. 335, 127596(2021).
  30. Chen, Y., Fu, Q., Xie, J., Wang, H., Tang, Y. Development of a high sensitivity quantum dot-based fluorescent quenching lateral flow assay for the detection of zearalenone. Anal Bioanal Chem. 411 (10), 2169-2175 (2019).
  31. Zhang, Q., et al. SARS-CoV-2 detection using quantum dot fluorescence immunochromatography combined with isothermal amplification and CRISPR/Cas13a. Biosens Bioelectron. 202, 113978(2022).
  32. Zhong, X., et al. CRISPR-based quantum dot nanobead lateral flow assay for facile detection of varicella-zoster virus. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (10), 3319-3328 (2023).
  33. Liu, Y., Xiao, M., Xu, N., Yang, M., Yi, C. Point-of-need quantitation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a ratiometric fluorescent nanoprobe and a smartphone-based sensing system. Sensors Actuators B Chem. 367, 132083(2022).
  34. McCafferty, C., et al. Blood collection processing and handling for plasma and serum proteomics BT - Serum/plasma proteomics. Methods Mol Biol. 2628, 33-40 (2023).
  35. Zhang, P., et al. Rapid and quantitative detection of C-reactive protein based on quantum dots and immunofiltration assay. Int J Nanomedicine. 10, 6161-6173 (2015).
  36. Hu, J., et al. Sensitive and quantitative detection of C-reaction protein based on immunofluorescent nanospheres coupled with lateral flow test strip. Anal Chem. 88 (12), 6577-6584 (2016).
  37. Fan, L., et al. One-component dual-readout aggregation-induced emission nanobeads for qualitative and quantitative detection of c-reactive protein at the point of care. Anal Chem. 96 (1), 401-408 (2024).
  38. Gui, Y., et al. Colorimetric and reverse fluorescence dual-signal readout immunochromatographic assay for the sensitive determination of sibutramine. ACS Omega. 9 (6), 7075-7084 (2024).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

C

מאמרים קשורים