פיתוח מודל פגיעה מוחית טראומטית קלה לא מסובך ששונה בשיטת ירידה במשקל והוכח על ידי הדמיית תהודה מגנטית

פגיעה מוחית טראומטית קלה (mTBI) נצפית בעיקר אצל ספורטאים העוסקים בספורט מגע, יוצאי צבא ואנשים המעורבים בתאונות דרכים¹. זה מהווה יותר מ-85% מכלל פגיעות הראש המדווחות². האטיולוגיה העצומה של mTBI והשכיחות העולמית הגוברת שלה מדגישים את הכללת mTBI כגורם סיכון סביבתי טנטטיבי למחלה ניוונית מאוחרת³. TBI קלה לא מסובכת מאופיינת בציון תרדמת גלזגו (GCS) של 13-15, ללא חריגות מבניות שנצפו בסריקות טומוגרפיה ממוחשבת (CT) או הדמיית תהודה מגנטית (MRI). תסמינים נפוצים שחווים מטופלים עם mTBI לא מסובך כוללים כאבי ראש, סחרחורת, בחילות או הקאות ועייפות. עם זאת, הערכה אורכית של תוצאות בעקבות mTBI לא מסובך מציבה אתגרים ניכרים בשל שיעור הנשירה הגבוה בחולים⁴.

החששות מ-mTBI חוזרים וגברו, במיוחד בקרב קהילת הספורטאים המקצועיים של ליגת הפוטבול הלאומית (NFL), וכתוצאה מכך העלו את המודעות בקרב^{ספורטאים לא} מקצועיים. ההנחה היא שפגיעות מוחית גדלה לאחר ה-mTBI הראשוני, כאשר עלבונות לאחר מכן עלולים להחמיר את תוצאות הפציעה. ממצאים אחרונים מקבוצת המוח הגדולה ביותר שנתרמה של שחקני כדורגל לא רק קשרו השתתפות קודמת בכדורגל בחומרת אנצפלופתיה טראומטית כרונית (CTE), אלא גם הציעו מתאם בין גורמים שונים הקשורים לכדורגל לבין הסיכון והחומרה של CTE⁶. לפיכך, החשש מהשפעת מספר זעזועי המוח והמשטר החוזר על תוצאות הפציעות הולך וגובר. מחקר פרה-קליני חקר שינויים נוירופתולוגיים, מפל נוירו-דלקתי וליקוי נוירופסיכולוגי לאחר mTBI חוזר על ידי שימוש במודלים שונים של פגיעות ראש סגורות (CHI) 7,8,9,10,11,12,13,14 . עם זאת, חקירת פרמטרי ההשפעה על מודל ה-mTBI הלא מסובך, שעשוי לחקות מקרוב פגיעות ראש חוזרות ונשנות הקשורות לספורט וכתוצאה מכך לפגיעה תפקודית בשלב החריף וניוון מוחי בשלב הכרוני, לא נבדקה היטב.

דימות טנזור דיפוזיה (DTI), טכניקה המעריכה דיפוזיה של מולקולות מים, שימשה בדרך כלל במחקרים שחקרו את ההשפעות של mTBI. אניזוטרופיה חלקית (FA), מדד מפתח הנגזר מ-DTI, מכמת את מידת הקוהרנטיות של דיפוזיביות המים ומספק מידע לגבי הארגון המבני של אקסונים וצרורות סיבי עצב. הפרעה של ערכי FA בחומר הלבן (WM) הוצעה בעקבות mTBI במודלים שונים 8,10,11,15,16,17. בנוסף, דיפוזיות צירית (AD) ודיפוזיות רדיאלית (RD), המצביעות על שלמות אקסונלית ומיאלין, השתנו לאחר mTBI במחקרים פרה-קליניים 10,15,16,18,19,20. עם זאת, פערים בממצאי DTI בין מחקרים קודמים נובעים ככל הנראה משינויים בחומרת mTBI, הבדלים בפרמטרי השפעה, מודלים מגוונים של mTBI ונקודות זמן לא עקביות למעקב לאחר פציעה⁹.

מסמך הפרוטוקול הנוכחי, אם כן, שואף לבסס מודל חיות של mTBI שנועד להעריך את ההשפעות המצטברות של mTBI יחיד וחוזר על עצמו. שילבנו הערכות מקיפות ואורכיות, כולל הערכות של רווחת בעלי חיים, תוצאות התנהגותיות, פרמטרים של DTI ונפח קליפת המוח, כדי ללכוד שינויים דינמיים לאחר פציעה ולחקור את ההשפעות של פרמטרי השפעה שונים. על ידי הדגמת ליקוי תפקודי חריף ושינויים מיקרו-מבניים ארוכי טווח, מודל זה משכפל ביעילות את המאפיינים העיקריים של mTBI לא מסובך שלא טופלו במלואם במחקרים קודמים בבעלי חיים. כאן, סיפקנו פרוטוקול מפורט לפיתוח מודל mTBI לא מסובך באמצעות שיטת ירידה במשקל ראש סגור^{שונה 8,11} וביצוע הערכה אורכית בעקבות mTBI.

המחקר בוצע בהתאם להמלצות הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות למחקר בבעלי חיים (מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה) והנחיות מחקר בבעלי חיים: דיווח בניסויים in vivo. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג צ'יאו טונג. 20 בעלי חיים חולקו באופן אקראי ל-5 קבוצות (n = 4 לקבוצה): (i) פגיעה בודדת בקליפת המוח התחושתית-מוטורית (SMCx/יחיד), (ii) פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של שעה אחת (SMCx/2 פגיעות/1 שעה), (iii) פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של 10 דקות (SMCx/2 פגיעות/10 דקות), (iv) פגיעות כפולות במוח המרכזי עם מרווח של שעה אחת (מרכזי/2 פגיעות/שעה), ו-(5) קבוצת הדמה עם ניתוח בלבד אך ללא השפעה ישירה על הראש, להערכת תוצאות אורך (איור 1). יש לציין כי המרווחים בין הפציעות שנבחרו למחקר זה (מרווחים של שעה לעומת 10 דקות) תוכננו לחקות את ההשפעות התת-מוחיות החוזרות ונשנות 8,10,11,13,21, שיכולות להיות עד אלף פעמים בעונה אחת, שחווים הספורטאים העוסקים בספורט מגע ^22,23.

1. אינדוקציה של פגיעת ראש סגור (CHI)

הערה: חולדות ספראג-דולי זכרים בוגרים בגילאי 10 עד 12 שבועות ובמשקל של מעל 250 גרם שוכנים במחזור אור/חושך של 12/12 שעות עם גישה חופשית למזון ומים.

1. הניחו את החולדה בתא אינדוקציה קטן והרדימו אותה בתערובת של איזופלורן (5%) ואוויר רפואי (2.5-3 ליטר לדקה). הוציאו את החולדה מהתא עד שהיא לא מגיבה לצביטה בכפה או בזנב.
2. הניחו את החולדה על כרית החימום.
   הערה: הפעל את כרית החימום במהלך הניתוח כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של החולדות.
3. הביאו את החולדה למסגרת סטריאוטקסית ואבטחו אותה בעזרת מוט שיניים. מתן איזופלורן ב-2% באמצעות חרוט האף המחובר עם אוויר רפואי בקצב זרימה של 1.5-2 ליטר לדקה לתחזוקה במהלך הניתוח.
4. מקם את מוטות האוזניים. ודא שהחולדה מרוכזת וסימטרית על המסגרת הסטריאוטקסית.
   הערה: כל ההליכים הכירורגיים צריכים להתבצע בתנאים אספטיים. המכשירים עוקרו לפני הניתוח באמצעות חיטוי קיטור, וקצותיהם עוקרו בנוסף עם מעקר חרוזים במהלך ההליך. כדי למנוע זיהום, הונח וילון כירורגי על החיה. המנתח חבש כובע כדי לכסות את שיערם, מסכה כדי לכסות את פניהם, והיה מצויד בחלוק מעבדה וכפפות כירורגיות במהלך ההליך²⁴.
5. שים את החיישן של אוקסימטר הדופק לכף האחורית של החיה כדי לעקוב אחר קצב הנשימה, קצב הלב, רמת החמצן בדם וטמפרטורת הגוף של החיה.
6. יש להזריק 1 מ"ל/ק"ג משקל גוף של לידוקאין (20 מ"ג/מ"ל) תת עורית לתוך צוואר החולדה כמשכך כאבים.
7. מרחו קרם להסרת שיער על ראש החיה והמתינו 3 דקות. נגב את הקרם עם 70% ספוגיות אלכוהול איזופרופיל.
8. נקו את האזור המגולח מספר פעמים בעזרת צמר גפן סטרילי ספוג ביוד. הסר את שאריות היוד באמצעות צמר גפן ספוג באתנול 70%.
9. צור חתך בקו האמצע באורך של כ-2-2.5 ס"מ בעור המגולח באמצעות להב כירורגי סטרילי כדי לגשת אל פני הגולגולת.
10. הסר את הרקמה על העצם באמצעות כרית כותנה כדי לחשוף את הגולגולת. נקו את משטח הגולגולת באמצעות צמר גפן ספוג במי מלח 0.9%, ולאחר מכן נקו אותו עם כרית כותנה יבשה.
    הערה: כעת ניתן לזהות בקלות את תפרי הגולגולת וגם ברגמה ולמבדה.
11. זהה את הברגמה כנקודת הייחוס כדי לברר עוד יותר את אזור הפגיעה על סמך הקואורדינטה.
    הערה: בפרוטוקול זה, שתי קבוצות של קואורדינטות משמשות לאינדוקציה של CHI: (-2.5, -2.0) (2.5 מ"מ לרוחב 2.0 מ"מ אחורי הברגמה) על גבי קליפת המוח התחושתית-מוטורית (SMCx), כמו גם (0,-3.0) על גבי המוח המרכזי (מרכזי).
12. זהה את הקואורדינטות הנבחרות על פני הגולגולת וצמד קסדת נירוסטה עגולה (קוטר 10 מ"מ ועובי 1 מ"מ) על השטח המיועד באמצעות צמנט דנטלי. הסר את כרית החימום ואת אוקסימטר הדופק.
13. הזיזו את המכשיר הסטריאוטקטי ואת החולדה על שולחן ההרמה (אורך 14 ס"מ, רוחב 8 ס"מ ועומק 6.15 ס"מ) מתחת לפגיעה ב-CHI.
14. הרם את גוף החולדה באמצעות ספוג קצף (19 ס"מ אורך, 10 ס"מ רוחב ו-4 ס"מ עומק, בצפיפות של 18 ק"ג/מ^"ק).
15. הסר את החולדה מסורגי האוזניים של המסגרת הסטריאוטקסית. השאירו את החולדה ללא תנועה על מוט השן המחובר לקונוס האף, והעבירו 2% איזופלורן. ודא שהראש והגוף מיושרים בכיוון הרוסטרלי-זנבי.
16. כוונן את שולחן ההרמה כדי להבטיח שאין רווח בין פגיעת ה-CHI לקסדה. כבה את איזופלורן 5 שניות ממש לפני הפגיעה.
    הערה: כדי לציין את רפלקס היישור עקב פגיעה מוחית, בוצעה הפסקה זמנית של איזופלורן²⁵.
17. זרוק פליז 600 גרם מגובה של 1 מ' דרך צינור נירוסטה (גובה 1 מ' עם קוטר פנימי של 20 מ"מ לפינוי עמוד ממשקולות פליז אל חלד) אל הפגיעה המאובטחת עם קצה עגול המכוון אל קסדת המתכת.
    הערה: בעלי חיים בקבוצת הדמה לא חוו פגיעה, מכיוון שטיפת הפליז שוחררה מבלי ליצור מגע עם הקסדה שעל ראש החולדה.
18. הורד את שולחן ההרמה. הסר את החולדה מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח את החולדה במצב שכיבה על כרית חימום.
19. רשום את זמן רפלקס היישור, שהוא הזמן שבו החיה מנסה לעבור ממצב שכיבה למצב שכיבה^26,27.
    הערה: בעלי החיים שהיו נתונים ל-CHI החוזר ונשנה הורדמו שוב 3 דקות לפני הפגיעה^השנייה . עבור בעלי החיים בקבוצת SMCx/כפול/10 דקות שלא התהפכו בחזרה למצב הנטייה בזמן, הזמן המקביל של רפלקס היישור נרשם כ-420 שניות.
20. לאחר הקלטת רפלקס היישור, יש להרדים את החולדה באיזופלורן שוב באמצעות שלב 1.1.
21. שתק את החולדה עם המסגרת הסטריאוטקסית באמצעות שלב 1.2.
    הערה: לאחר אישור יציבות הקסדה על גבי הגולגולת, חזור שוב על שלבים 1.13-1.17 כדי לבצע את הפגיעה^השנייה .
22. הסר את הקסדה. הסר את כל רקמת החיבור והמלט על גבי הגולגולת.
23. מכסים את הגולגולת במלט הדנטלי ומניחים לה להתייבש. בדוק שהמלט הדנטלי נוקשה וקשה באמצעות גב הפינצטה.
    הערה: המלט הדנטלי הונח על גבי הגולגולת כדי למנוע חפצי רגישות הנגרמים על ידי ממשקי גולגולת-אוויר או גולגולת-דם בין הגולגולת לקרקפת לאחר הניתוח.
24. סגור את החתך באמצעות 4-0 תפרי ניילון כירורגיים עם 4-5 קשרים עצמאיים.
    הערה: אורך הפצע הוא כ-2-2.5 ס"מ. ודא כי לתפרי הניתוח אין פעולה נימית והם עשויים מחומר משי או ניילון. אין לתפור את החתך באמצעות קשר אחד בודד כדי למנוע את פתיחת הפצע על ידי גירוד החיה.
25. מרחו אנטיביוטיקה מקומית (קרם דרמנסט) על מקום הניתוח כדי למנוע זיהומים.
26. יש להזריק 1 מ"ל/ק"ג משקל גוף של קרפרופן (50 מ"ג/מ"ל) תת עורית לתוך הצוואר כמשככי כאבים לאחר הניתוח.
27. הניחו את החולדה בכלוב נקי על כרית חימום עד שהיא חוזרת להכרה. ברגע שהחולדה יושבת זקופה, החזירו אותה לכלוב הביתי.
28. יש לתת דרך הפה 5 מ"ל של אצטמינופן (24 מ"ג/מ"ל) מעורבב ב-200 מ"ל מים לבעל החיים מדי יום כמשכך כאבים במשך 3 ימים רצופים לאחר הניתוח.

2. הדמיית תהודה מגנטית (MRI)

הערה: תמונה משוקללת T2 והדמיית דיפוזיה-טנזור מבוצעות באמצעות מערכת PET/MR 7T עוקבת לפני CHI, כמו גם ב-1 ו-50 יום לאחר הפציעה (איור 1). MRI בסיסי בוצע תוך שבוע לפני הליך CHI. עבור ההערכות ב-1 ו-50 יום לאחר ה-CHI, ההערכות ההתנהגותיות נערכו בבוקר, ולאחר מכן סריקות MRI אחר הצהריים באותו היום.

1. להרדים את החולדה בתא אינדוקציה קטן מלא בתערובת של איזופלורן (5%) ואוויר רפואי (2.5-3 ליטר לדקה).
2. ברגע שהחולדה אינה מגיבה לצביטה בכפה או בזנב, השהה זמנית את ההרדמה בעת העברתה לעריסת החיה במצב נטייה עם הראש תחילה.
3. מקם את החולדה במחזיק הראש המחובר עם חרוט אף, ומספק 2% איזופלורן עם אוויר רפואי בקצב זרימה של 1.5-2 ליטר לדקה לתחזוקה במהלך קליטת התמונה.
4. קבע את הראש בעזרת פיסת סרט קטנה כדי למנוע תנועה במהלך הסריקה.
   הערה: מרחו מעט משחת שיניים על ראש החולדה ביום הראשון לאחר ה-CHI כדי למנוע חפצי רגישות מגנטית עקב הסרת הקרקפת^28,29.
5. הנח כרית לחץ מתחת לבית החזה של החולדה כדי לפקח על הנשימה. הדביקו את תפסי האוקסימטר לגפה האחורית כדי לעקוב אחר קצב הלב.
6. הכנס את הגשושית הרקטלית כדי למדוד את טמפרטורת פי הטבעת. מכסים את החולדה בשמיכת חימום במים חמים במחזור ועטיפת רקמות במהלך הניסוי כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
   הערה: לאורך כל הניסוי, עקוב אחר מצבים פיזיולוגיים, כולל דופק, קצב נשימה וטמפרטורת פי הטבעת. לפני הסריקה, בדוק את כל האותות הפיזיולוגיים של החולדה כדי להבטיח את איכות מוניטור הסימנים החיוניים.
7. השתמש במערכת מיקום הלייזר של סורק PET/MR כדי לסמן את מרכז הראש ליישור מדויק.
8. העבר את החיה לתוך קדח ה-MRI באופן אוטומטי באמצעות מערכת הובלת בעלי חיים ממונעת עד שמרכז הראש מתיישר עם מרכז האיזו של הסורק.
   הערה: מערכת הובלת בעלי חיים ממונעת המשולבת במערכת PET/MR מבטיחה מיקום מדויק של בעלי חיים ומייעלת את זרימת העבודה בעת מעבר בין שיטות הדמיה.
9. השג רצף MRI.
   1. ביצוע לוקליזציה ראשונית והתאמה כוללת.
   2. השתמש בפרוסה הסגיטלית האמצעית ויישר את הפרוסה^ה-8 מהחלק הקדמי עם הפרוסה של הקומיסורה הקדמית.
      הערה: פרוסות העטרה ממוקמות בניצב למישור האופקי המוגדר על ידי הקו המחבר בין הקומיסורה הקדמית לבסיס המוח הקטן, המתאים לזווית של כ-15 מעלות ביחס לציר הארוך של הקורפוס קלוסום. הפרמטרים העיקריים של סריקת T2-RARE עבור הפרוסה הסגיטלית האמצעית הם כדלקמן: זמן חזרה (TR) = 2500 אלפיות השנייה, זמן הד (TE) = 44 אלפיות השנייה, שדה ראייה (FOV) = 3.5 ס"מ, גודל מטריצה = 256 256, עובי פרוסה = 1 מ"מ, מספר פרוסות = 1, גורם RARE = 8, רוחב פס = 75 קילו-הרץ, מספר ממוצעים = 1, זמן הרכישה = 1 דקה 20 שניות.
   3. השתמש ברכישה מהירה עם שיפור הרפיה (RARE) עם דיכוי שומן ורצועת רוויה מתחת למוח כדי לקבל תמונות משוקללות T2 עבור התייחסות אנטומית (איור 2).
      הערה: הפרמטרים העיקריים של סריקת T2-RARE הם כדלקמן: זמן חזרה (TR) = 3600 ms, זמן הד (TE) = 40 ms, שדה ראייה (FOV) = 2 ס"מ, גודל מטריצה = 256 256, עובי פרוסה = 1 מ"מ, מספר פרוסות = 16, גורם RARE = 8, רוחב פס = 75 kHz, מספר ממוצעים = 8, זמן הרכישה = 7 דקות 40 שניות.
   4. השתמש ב-EPI ספין-הד של 4 זריקות כדי לרכוש תמונות טנזור דיפוזיה (איור 2).
      הערה: הפרמטרים העיקריים של סריקת ה-DTI הם כדלקמן: TR = 3000 ms, TE = 28 ms, שדה ראייה (FOV) = 2 ס"מ, גודל מטריצה = 96 96, עובי = 1 מ"מ, מספר פרוסות = 16, משך הדופק (δ) = 5 ms, זמן בין שני הפולסים (Δ) = 15 ms, מספר B0 = 5, מספר כיוונים = 30, ערך b = 1000 s/mm³, רוחב פס = 150 קילו-הרץ, מספר הממוצע = 4, זמן הרכישה = 14 דקות.
   5. סיים את פרוטוקול הסריקה. החלק את עריסת החיה החוצה מהמגנט. הסר את החיה מהעריסה.
   6. העבירו את החולדה לכלוב נקי עם כרית חימום מתחתיה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה. החזירו את החולדה לכלוב הבית שלה ברגע שהיא חוזרת להכרה.
10. עיבוד מקדים של תמונה
    הערה: השתמש בתוכנת MRtrix3, מיפוי פרמטרי סטטיסטי (SPM) וסקריפטים מותאמים אישית של MATLAB לעיבוד וניתוח נתונים.
    1. הפחתת רעש של תמונות DTI באמצעות הפקודה MRtrix3 (dwidenoise)³⁰.
    2. הסר את חפצי הצלצול של גיב מתמונות DTI באמצעות הפקודה MRtrix (mrdegibbs)³⁰.
    3. רשום תמונות DTI לתמונות משוקללות T2 של הנושא היחיד על פני סריקות אורך באמצעות פונקציות SPM (spm_coreg.m ו-spm_powell.m).
    4. בצע הפשטת גולגולת על תמונות משוקללות T2 על ידי עיצוב ידני של אזור המוח פרוסה אחר פרוסה, ולאחר מכן הסרת פיקסלים בעוצמה מתחת לסף המחושב שנקבע על ידי שיטת אוטסו³¹ (סקריפט MATLAB מותאם אישית thr_otsu2.m).
    5. לבצע רישום צולב בין בעלי חיים באותה קבוצת ניסוי באמצעות פונקציות SPM (spm_coreg.m ו-spm_powell.m). החל את מסכת המוח על תמונות ה-DTI המתאימות.
       הערה: הפשטת הגולגולת מתבצעת כדי לקצר את זמן העיבוד של המחשב.
    6. חשב מפות טנזור על סמך DTI (סקריפט MATLAB מותאם אישית, tensormap.m).
    7. חשב מפות FA (סקריפט MATLAB מותאם אישית, calFA.m)
       הערה: כל הסקריפטים המותאמים אישית של MATLAB זמינים דרך מסד הנתונים הבא (https://doi.org/10.57770/9ZESXD).
11. ניתוח תמונה-FA
    1. צייר אזורי עניין (ROIs) בקליפת המוח ובקורפוס קלוסום (CC) עבור שלוש פרוסות התמונה העוקבות מתחת לקואורדינטות של CHI.
       הערה: כל ההחזר על ההשקעה צויר באופן ידני ונבדק ויזואלית לאיתור שגיאות גסות על ידי 2 חוקרים מנוסים עיוורים לקבוצות הניסוי.
    2. חלץ וממוצע את ערך ה-FA מהחזר על ההשקעה.
       הערה: עבור הקורפוס קלוסום מתחת לקליפת המוח, פיקסלים עם ערכים של FA < 0.35 לא נכללו בהחזר ההשקעה שנבחר כדי למנוע השפעות נפח חלקיות. עבור קליפת המוח, כל הפיקסלים עם ערכים של FA < 0.35 בהחזר ההשקעה גויסו לניתוח.
12. ניתוח תמונה - נפח
    1. צייר ידנית החזר ROI המכסים את האזורים בקליפת המוח עבור 11 פרוסות תמונה רצופות ב-Bregma -7 עד +3 מ"מ.
       הערה: כל ההחזר על ההשקעה נלקח באופן ידני על ידי 2 חוקרים מנוסים שהיו עיוורים לקבוצות הניסוי.
    2. סכם את סך הפיקסלים של ההחזר על ההשקעה על פני פרוסות והפוך אותם לנפח על ידי הכפלת עובי הפרוסה (1 מ"מ).
    3. נרמל את עוצמת הקול בקליפת המוח לאחר CHI עם הנפח המתאים לפני CHI של כל חיה.
       הערה: נרמל את הנתונים כדי לבטל הבדלים אינדיבידואליים בנפח המוח בין בעלי חיים לפני ההצגה.

3. הערכת התנהגות

הערה: הניסויים ההתנהגותיים מבוצעים באמצעות מבחן שיווי משקל הליכת אלומה ו-mNSS לפני CHI, כמו גם ב-1 ו-50 יום לאחר CHI (איור 1). כל ההערכה בוצעה על ידי לפחות שני משקיפים כדי להבטיח את הדיוק, העקביות והאובייקטיביות של הנתונים שנאספו.

1. מבחן איזון הליכה בקורה
   1. הפעל את מצלמת הווידיאו והפעל את הטיימר.
   2. הניחו את החולדות בקצה אחד של קורת האיזון (3 ס"מ עומק, 3 ס"מ רוחב, 80 ס"מ אורך ו-60 ס"מ מעל הרצפה).
   3. עצור את הטיימר ברגע שהחולדה משלימה הלוך ושוב, נופלת או קופאת מעל 3 דקות.
      1. במהלך הניסוי, התבונן במצב החיה לצורך ההערכה באמצעות mNSS 11,32,33,34. פעל לפי התקנים הבאים להערכה:
      2. אם החולדה שומרת על שיווי משקל עם יציבה יציבה על הקורה, הקצה ציון 0.
      3. אם החולדה תופסת את צד הקורה, הקצה ציון של 1.
      4. אם החולדה נופלת עם איבר אחד מהקורה, הקצה ציון של 2.
      5. אם החולדה נופלת עם שתי גפיים או מסתובבת על הקורה (>60 שניות), הקצה ציון 3.
      6. אם החולדה מנסה לאזן על הקורה אך נופלת (>40 שניות), הקצה ציון של 4.
      7. אם החולדה מנסה לאזן על הקורה אך נופלת (>20 שניות), הקצה ציון 5.
      8. אם החולדה לא מנסה לאזן או להיתלות על הקורה ונופלת תוך 20 שניות, הקצה ציון של 6.
      9. אם החולדה לא מצליחה להשלים את המשימה, קחו בחשבון שהיא לקחה את הזמן המקסימלי של 3 דקות והקצו לה ציון 6.
   4. קבעו ימי בדיקה בנקודות זמן ספציפיות.
      הערה: אל תכלול חולדות שלא השלימו את הליכת הקורה הלוך ושוב במשך שני ניסויים לפני CHI מהניתוח הבא והערכת התנהגות מעקב.
2. ציון חומרה נוירולוגי שונה (mNSS)
   הערה: הערכת mNSS כוללת בדיקות מוטוריות, בדיקות חושיות, היעדר רפלקס, תנועות חריגות, איזון קרן והליכה על הרצפה ^32,33, שבוצעה במהירות על בסיס יומי.
   1. בצע בדיקות מוטוריות.
      1. הרם את החולדה בבסיס הזנב והתבונן ברפלקסים של הגפיים שלה במשך כ-15 שניות כדי להעריך את הכיפוף וההארכה הנכונים.
      2. אם נצפתה כיפוף רגיל בגפה הקדמית, הקצה ציון 0. אם לא נצפתה כיפוף, הקצה ציון של 1.
      3. אם נצפתה כיפוף רגיל בגפה האחורית, הקצה ציון של 0. אם לא נצפתה כיפוף, הקצה ציון של 1.
      4. אם הראש נע >10° לציר האנכי תוך 30 שניות לאחר הרמת החולדה בזנב, הקצה ציון 0. אם לא, הקצה ציון של 1.
         הערה: מקסימום 3 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   2. בצע בדיקות מיקום גפיים.
      הערה: בדיקת המיקום מבוצעת כדי להעריך את התיאום בין תפקוד חושי (חזותי, מישוש ופרופריוספציה) לבין תפקוד מוטורי.
      1. הורד לאט את החולדה לכיוון פני השולחן. שימו לב אם כפות החולדות הגיעו ונמתחו לעבר פני השטח.
      2. אם החולדות הגיעו לפני השטח עם שתי הגפיים מתוחות וקדימה, הקצה ציון 0. אם יש עיכוב או אין תגובה, הקצה ציון של 1.
      3. הניחו את החולדה על פני השטח ומשכו את הכפה אל קצה השולחן. שים לב אם כפו חוזרת למצב רגיל על פני השולחן.
      4. אם נצפות תגובות מיקום מיידיות ונורמליות, הקצה ציון 0. אם נצפות תגובות מיקום מאוחרות, הקצה ציון של 1. אם אין תגובה, הקצה ציון של 2.
         הערה: מקסימום 3 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   3. התבונן בהיעדר משקף ותנועות חריגות.
      1. שימו לב לנענועי ראש כדי להעריך את רפלקס האפרכסת בעת נגיעה בבשר השמיעה עם קצה הכותנה של צמר גפן.
      2. אם נצפה רפלקס נורמלי, הקצה ציון 0. אם לא נצפה רפלקס, הקצה ציון של 1.
      3. העריכו את נוכחות רפלקס הקרנית על ידי נגיעה בקרנית עם קצה הכותנה של צמר גפן.
      4. אם מתקבלת תגובה נורמלית, הקצה ציון 0. אם לא מתעוררת תגובה למצמוץ, הקצה ציון של 1.
      5. עשו מחיאות כפיים קצרות וחזקות. שימו לב לנוכחות רפלקס הבהלה.
      6. אם נצפה רפלקס, הקצה ציון 0. אם לא נצפה רפלקס, הקצה ציון של 1.
      7. שימו לב אם לחולדה יש התקפים, מיוקלונוס או מיודיסטוניה.
      8. אם אחד מהם מתרחש, הקצה ציון של 1.
         הערה: מקסימום 4 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   4. בצע את בדיקת איזון האלומה, כפי שתואר קודם לכן (שלב 3.1).
      הערה: מקסימום 6 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   5. בצע מבחן הליכה על הרצפה.
      1. הכינו את זירת השטח הפתוח (75 ס"מ אורך, 50 ס"מ רוחב ו-40 ס"מ עומק). ודא שהוא נקי וללא כל רמזי ריח קודמים.
      2. מקמו חולדה במרכז זירת השדה הפתוח והתבוננו כיצד החולדה הולכת בזירה.
      3. אם החולדה מבצעת הליכה רגילה, הקצה ציון 0.
      4. אם החולדה לא יכולה ללכת ישר, הקצה ציון של 1.
      5. אם החולדה נופלת לצד הפרטי לאחר הנחתה על הרצפה, הקצה ציון 3.
         הערה: מקסימום 3 ציונים יוקצו במפגש זה של המבחן.
   6. סכם את כל התוצאות; הציון המקסימלי האפשרי הוא 18.
      הערה: הציון הגבוה יותר מצביע על תוצאה גרועה יותר.

4. אימונוהיסטולוגיה

1. בצע זלוף טרנס-קרדיולוגי³⁵.
   הערה: זלוף טרנס-קרדיולוגי מבוצע לאחר סריקת ה-MRI 50 יום לאחר ה-CHI (איור 1).
   1. הניחו את החולדה בתא אינדוקציה קטן והרדימו אותה עם איזופלורן (5%) עד שהיא לא מגיבה לכפה או לצביטה בזנב.
   2. יש לתת 50 מ"ג/ק"ג משקל גוף של זולטיל (50 מ"ג/מ"ל) ו-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף של קסילזין (רומפון, 23.32 מ"ג/מ"ל) באמצעות הזרקה תוך צפקית להרדמה עמוקה.
   3. הניחו את החולדה במצב שכיבה.
   4. בצע חתך רוחבי באורך של כ-4-5 ס"מ מתחת לבית החזה בעזרת מספריים.
   5. אתר את הסרעפת וחתוך אותה כדי לחשוף את הלב.
   6. השתמש במלקחיים המוסטטיים כדי להדק את עורק הריאה ולאחר מכן בצע חתך באורך של כ-0.5-1 ס"מ בפרוזדור הימני.
   7. חבר את המחט לצינור המחובר למשאבת העירוי.
   8. הכנס את המחט לחדר השמאלי.
   9. שטפו את החיה באמצעות זלוף טרנס-לבבי (40 מ"ל/דקה) עם 500 מ"ל של 0.9% מי מלח עד לניקוי הדם.
   10. לחלחל את החיה באמצעות זלוף טרנס-לבבי (40 מ"ל/דקה) עם 500 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) לקיבוע.
   11. הסר את ראש החולדה, וקלף בזהירות את רקמת המוח מהגולגולת.
   12. שמור את המוח בכ-20 מ"ל של 4% PFA בבקבוק למשך 48 שעות לאחר הקיבוע.
2. בצע עיבוד רקמות וצביעה IHC ^36,37.
   הערה: בצע צביעה אימונוהיסטוכימית על קטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין באמצעות ערכת מערכת הזיהוי המשנית של אימונופרוקסידאז.
   1. השתמש בקטעי רקמה קבועים בפורמלין ובפרפין.
   2. בצע דה-פראפיניזציה וטפל בשקופיות עם 3% H₂O₂ כדי לחסום פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. בצע אחזור אנטיגן באמצעות מאגר ציטראט ב-90 מעלות צלזיוס.
   3. בצע צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות ערכת מערכת הזיהוי המשנית של אימונופרוקסידאז.
      הערה: הליכי הצביעה מתבצעים בהתאם להמלצות היצרן.
   4. השתמש בהמטוקסילין כדי להכתים דגימות.
   5. הרכיבו דגימות עם מגיב נגד דהייה.
   6. השתמש בנוגדנים לחלבון חומצי סיבי (GFAP) נגד גליה לצביעה אימונוהיסטוכימית.
   7. רכשו את התמונות של החזר ROI באמצעות סורק שקופיות מיקרוסקופ אור (איור 6).

5. ניתוח סטטיסטי של התנהגות ותוצאות תדמיתיות

הערה: במחקר הנוכחי בוצע ניתוח סטטיסטי ב-SPSS; עם זאת, ניתן לבצע את הניתוח הסטטיסטי בארגזי כלים סטטיסטיים אחרים.

1. טען את הנתונים בפורמט הרחב בקובץ SPSS *.sav.
2. לבצע ניתוח מדידות חוזרות של שונות (ANOVA) כדי להשוות את תוצאות ההתנהגות (משקל מנורמל, mNSS ומשך הליכת האלומה) והתמונה (ערכי FA בקליפת המוח וב-CC) לאורך זמן בין קבוצות.
   1. לחץ על נתח > מודל ליניארי כללי > מדידות חוזרות.
   2. הקצה שם בתיבה שם גורם בתוך הנושא (למשל, זמן) ושים '3' בתיבה מספר רמות (שלוש רמות עם נקודות זמן שונות למעקב). הקצה שם בתיבה Measure Name (לדוגמה, mNSS) בתיבת הדו-שיח Repeated Measures Define Factor(s).
   3. טען את המשתנים בתוך הנבדק (נתונים שנרכשו בטרום, D1 ו-D50 לאחר CHI) שיש לבדוק וציין את הגורם בין הנבדקים (למשל, קבוצות בעלי חיים עם פרמטרי השפעה שונים) בתיבת הדו-שיח מדידות חוזרות .
   4. בחר בונפרוני כמבחן פוסט הוק עבור גורמי (ים) (למשל, קבוצות בעלי חיים) בתיבת הדו-שיח של השוואות מרובות פוסט-הוק עבור אמצעים נצפים .
      הערה: כדי לתקן השוואות מרובות, השגיאה מסוג I הותאמה באמצעות תיקוני Bonferroni (0.05/3) עבור ההשוואות לאורך זמן. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05 (מותאם SPSS).
3. בצע ניתוח ANOVA חד כיווני כדי להשוות את רפלקס היישור והשינוי בנפח קליפת המוח בין הקבוצות.
   1. לחץ על נתח > השווה אמצעים > ANOVA חד-כיווני.
   2. טען את המשתנים (רפלקס יישור ושינוי נפח קליפת המוח) ברשימה התלויה ואת הקבוצות כגורם בתיבת הדו-שיח ANOVA חד-כיוונית .
   3. בחר Bonferroni כבדיקת פוסט הוק בתיבת הדו-שיח ANOVA חד-כיווני: השוואות מרובות פוסט הוק .
      הערה: כדי לתקן השוואות מרובות, שגיאה מסוג I הותאמה באמצעות תיקוני Bonferroni (0.05/5) עבור ההשוואות בין הקבוצות. מובהקות סטטיסטית הוגדרה כ-p < 0.05 (מותאם SPSS).

איור 2 מציג MRI אורכי מבעל חיים מייצג עם CHI מזויף וחוזר ב-SMCx. לא נמצא שבר משמעותי בגולגולת או חבלה מוחית בתמונות משוקללות T2 ב-1 ו-50 יום לאחר CHI. לא נמצאה בצקת או עיוות משמעותי של זיכרון העבודה במפות FA ב-1 ו-50 יום לאחר CHI. כל בעלי החיים שנחשפו ל-CHI במחקר זה שרדו את כל משך הניסוי של 50 יום, והפגינו תמותה נמוכה (0-5%)7 במודל CHI.

מידת הפגיעה בתודעה מיד לאחר הפגיעה המוחית הוערכה על ידי אובדן רפלקס הנכון, הנטייה הפנימית לתקן את מיקומו בעצמו, של בעלי חיים. בהשוואה ל-CHI דמה ויחיד ב-SMCx, הזמן להחזיר את רפלקס היישור גדל בחיות אחרי CHI חוזר (איור 3A). הרווחה הכללית של בעלי החיים לאחר CHI באה לידי ביטוי בשינוי במשקל הגוף המנורמל וב-mNSS. לא נצפתה ירידה משמעותית במשקל לאחר CHI בקרב הקבוצות (איור 3B). בעוד שציון mNSS גבוה יותר נמצא ביום ה-50 לאחר CHI יחיד, עלייה משמעותית בציון mNSS נצפתה ביום הראשון לאחר CHI חוזר ונשנה ונשמרה גבוהה עד היום ה-50 ללא קשר לחומרת ואתר הפגיעה (איור 3C). ה-mNSS המוגבר המושרה על ידי CHI חוזר ונשנה במוח המרכזי ירד ביום ה-50, נמוך משמעותית מה-CHI המקביל ב-SMCx. שיווי המשקל והתפקוד המוטורי המתואם בחולדות לאחר CHI הוערכו על ידי מבחן הליכת האלומה. עלייה משמעותית במשך ההליכה נצפתה ביום הראשון לאחר CHI חוזר ונשנה ונשמרה גבוהה עד היום ה-50, ללא קשר לחומרת הפגיעה ולאתר הפגיעה (איור 3D). משך הליכת הקרן המוארכת המושרה על ידי CHI חוזר ונשנה במוח המרכזי ירד ביום 50, קצר משמעותית מה-CHI המקביל ב-SMCx.

ירידה משמעותית בנפח קליפת המוח נצפתה ב-50 יום לאחר CHI (איור 4A). נפחי קליפת המוח ביום ה-50 היו 99.63% ±-2.15%, 95.98% ±-1.65%, 92.26% ±-2.22% ו-90.28% ±-1.17% מהנפח הבסיסי, בהתאמה, ב-CHI הדמה ולאחר CHI יחיד וחוזר עם מרווחים של שעה ו-10 דקות ב-SMCx (איור 4B). נפח קליפת המוח ביום ה-50 היה 91.54% ±-1.98% מהנפח הבסיסי לאחר CHI חוזר עם מרווח של שעה במוח המרכזי. בהשוואה לקבוצת הדמה, נצפה אובדן משמעותי בקליפת המוח לאחר CHI. בהשוואה לקבוצת CHI בודדת, נצפה אובדן משמעותי בקליפת המוח לאחר CHI חוזר. ירידה משמעותית בנפח קליפת המוח נצפתה בפרוסות בברגמה -4 עד +0 ובברגמה -5 עד +1 לאחר CHI חוזר במרווחים של שעה ו-10 דקות, בהתאמה (איור 4C). בהשוואה בין חיות CHI עם אתרי פגיעה שונים, נפח קליפת המוח נמצא קטן משמעותית רק בפרוסה בברגמה 0 לאחר CHI במרכז המוח. בעוד שדווח על ניוון משמעותי בקליפת המוחב-11 המחקרים הקודמים ובמחקרים הנוכחיים, תמונות משוקללות T2 עם רזולוציה מרחבית גבוהה, הנרכשות באופן אידיאלי בתלת מימד, מוצעות לניתוח נפחי מדויק. בנוסף, מחקרים עתידיים המיישמים גישת רישום דיפאומורפית מבוססת אטלס38 עשויים לטפל טוב יותר בשינויים המוחיים האזוריים הקשורים לפגיעה מוחית קלה.

ערכי FA קליפת המוח במהלך סריקות MRI אורכיות חושבו כדי להצביע על השינויים המיקרו-מבניים הטנטטיביים לאחר CHI. לאחר CHI בודד ב-SMCx, לא נצפו שינויים משמעותיים ב-FA מתחת לאתר הפגיעה. לאחר CHI חוזר ב-SMCx, נצפתה עלייה משמעותית ב-IPSI-נגעי בקליפת המוח ביום 50 בהשוואה ל-CHI חוזר יום אחד לאחר החזרה עם מרווח של שעה (איור 5A). בנוסף, הפחתה משמעותית של FA בקליפת המוח ה-ipsi-נגעית הודגמה ביום אחד לאחר CHI חוזר במרווח של 10 דקות, שהוא נמוך משמעותית מזה שלאחר CHI בודד וחוזר עם מרווח של שעה. CHI ב-SMCx לא גרם לשינויים משמעותיים ב-FA בקליפת המוח המרכזית (איור 5B). אחרי CHI חוזר ונשנה במוח המרכזי, נצפתה עלייה משמעותית של FA בקליפת המוח מתחת למוח המרכזי בקליפת המוח ביום ה-50 בהשוואה לנקודת ההתחלה וביום הראשון (איור 5B).

לאחר CHI בודד ב-SMCx, לא נצפו שינויים משמעותיים ב-FA ב-CC מתחת ל-SMCx ה-ipsi-נגעי (איור 5A). לאחר CHI חוזר ב-SMCx, נצפתה ירידה משמעותית של FA נגעי ב-CC בקליפת המוח ביום 50 בהשוואה ל-CHI חוזר יום אחד לאחר החזרה במרווח של שעה (איור 5A). ירידה של FA ב-CC הנגעי של ipsi ביום 1 ולאחר מכן התאוששה ביום 50 נצפתה לאחר CHI חוזר עם מרווח של 10 דקות. ב-CC ה-ipsi-נגעי, לאחר CHI חוזר עם מרווח של 10 דקות, הוצג ערך FA נמוך משמעותית ביום הראשון בהשוואה ל-CHI חוזר במרווח של שעה; ערך FA גבוה משמעותית ביום 50 הוצג בהשוואה ל-CHI מזויף, יחיד וחוזר על עצמו במרווח של שעה. לאחר CHI חוזר ונשנה במוח המרכזי, נצפתה עלייה משמעותית של FA ב-CC מתחת ל-ipsi-Lesional SMCx ביום הראשון בהשוואה ל-CHI ב-SMCx וביום ה-50 בהשוואה לקבוצת הדמה (איור 5A).

דלקת עצבית לאחר CHI הוערכה על ידי ביטוי GFAP ביום 50 לאחר הפציעה. התוצאות של צביעה חיסונית הראו שאסטרוציטים הצטברו ב-SMCx ה-ipsilesional אחרי CHI, ללא קשר לחומרה ולמקום הפגיעה (איור 6).

איור 1: סכמטי של תכנון ניסוי. סכימות המציגות את השלבים המרכזיים, כולל השראת פציעת ראש סגורה וציר הזמן המתאים לכל הערכה. סריקות MRI והערכות התנהגותיות לפני CHI נערכו תוך 7 ימים לפני הניתוח. הזמן להחזרת רפלקס היישור הוערך כמידת הפגיעה בתודעה. MRI אורכי ונתוני התנהגות נאספו ב-1 ו-50 יום לאחר CHI. חולדות הוקרבו עם השלמת כל הניסויים, ואחריהם אימונוהיסטולוגיה. קיצור: SMCx/single = פגיעה בודדת בקליפת המוח התחושתית-מוטורית; SMCx/2 פגיעות/1 h = פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של 1 שעות; SMCx/2 פגיעות/10 דקות = פגיעות כפולות ב-SMCx עם מרווח של 10 דקות; מרכז/2 פגיעות/שעה = פגיעות כפולות במוח המרכזי במרווח של שעה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תמונות MR מייצגות לאחר CHI. התמונות המשוקללות T2 (השורה העליונה) ומפות FA (השורה התחתונה) מהחיה הייצוגית לפני ובימים 1 ו-50 לאחר דמה ו-CHI כפול ב-SMCx במרווח של 10 דקות. אין חבלה מוקדית בתמונות משוקללות T2 לאחר CHI ניסיוני. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ליקויים התנהגותיים אחרי CHI עם פרמטרי השפעה שונים. (A) הזמן להחזיר את רפלקס היישור לאחר הפגיעה האחרונה. זמן רפלקס היישור גדל לאחר CHI חוזר ב-SMCx. (B) אין הבדל משמעותי במשקל הגוף המנורמל לאחר CHI (מנורמל לקו הבסיס שלפני CHI) בין הקבוצות. עלייה ב-(C) mNSS ו-(D) משך ההליכה על קרן נצפתה לאחר CHI חוזר. בעוד ש-mNSS ומשך ההליכה על הקרן נותרו גבוהים לאחר CHI ב-SMCx, הם התאוששו לאחר CHI במוח המרכזי ביום ה-50. ANOVA חד כיווני עם מבחן פוסט הוק של Bonferroni לזמן רפלקס התיקון; ANOVA חוזר עם מבחן פוסט הוק של Bonferroni עבור המשקל המנורמל, mNSS ומשך התעוררות האלומה: *, p < .017 בין נקודות זמן; +, עמ' <.05 מול שאם; #, p <.05 לעומת SMCx/יחיד; §, p <.05 לעומת SMCx/2 כניסות/1 שעה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: ניוון קליפת המוח ב-50 יום לאחר CHI עם פרמטרי השפעה שונים. (A) יישור פרוסה על התמונה הסגיטלית האמצעית. הקו הכחול מציין את המישור האופקי המחבר בין הקומיסורה הקדמית לבסיס המוח הקטן; קו הקו המקווקו מראה את הציר הארוך של הקורפוס קלוסום. (B) החזר ROI קליפת המוח להמחשה (אדום) על תמונות משוקללות T2 בפרוסות התמונה המייצגות למדידת נפח קליפת המוח. (C) השינוי בנפח קליפת המוח אחרי CHI יוצג כאחוז מנפח הבסיס בין פרוסות שונות בברגמה -7 עד +3 מ"מ. הודגמה ירידה בנפח קליפת המוח ב-50 יום לאחר CHI ותלויה בפרמטר ההשפעה. הנתונים באים לידי ביטוי כאמצעי ± std. ANOVA חד כיווני עם מבחן פוסט הוק של Bonferroni: +, p < .05 לעומת זיוף; #, p <.05 לעומת SMCx/יחיד; §, עמ' <.05 לעומת SMCx/2 כניסות/1 שעה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: שינויים אורכיים ב-FA לאחר CHI עם פרמטרי השפעה שונים. החזר ROI מפולח אוטומטית הוא קליפת המוח (ירוק) וקורפוס קלוסום (CC) (אדום) עמוק לאתר הפגיעה במוח המרכזי (A) SMCx ו-(B). הכניסה מציגה את תמונת המוח התלת-ממדית עם הפרוסה מתחת לאתר הפגיעה. מעקב אורכי של ערכי FA שנרכשו לפני ו-1 ו-50 יום לאחר CHI הוצגו כממוצע ± std. שינוי ב-FA לאחר CHI חוזר היה בולט ותלוי בפרמטר ההשפעה. ANOVA חוזר עם מבחן פוסט הוק של Bonferroni: *, p < .05 בין נקודות זמן; +, p <.05 לעומת שאם; #, p <.05 לעומת SMCx/יחיד; §, עמ' <.05 לעומת SMCx/2 כניסות/שעה אחת. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: דלקת עצבית הנגרמת על ידי CHI 50 יום לאחר הפציעה בקליפת המוח מתחת לאתר הפגיעה. תמונות מייצגות של קליפת המוח מתחת לאתר הפגיעה עם צביעת GFAP. הצטברות של אסטרוציטים (חיצים) בקליפת המוח נצפתה אחרי CHI. סרגל קנה מידה = 40 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של האיור הזה.

למחברים אין ניגודי אינטרסים פוטנציאליים לחשוף.