מאמר שיטה

מיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה דו-צבעונית להדמיית אינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים

DOI:

10.3791/67020

⸱

27 בספטמבר 2024

 , 
1Neural circuit research group, Korea Brain Research Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר מנגנון לשימוש במיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה כדי להמחיש את האינטראקציה של מיטוכונדריה וליזוזומים המסומנים ב-mEosEM ו-APEX2, בהתאמה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אברונים תאיים, כגון מיטוכונדריה וליזוזומים, מציגים מבנים דינמיים. למרות הרזולוציה הגבוהה יותר של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור לניתוח מבני, מיקרוסקופ אור חיוני להדמיה של אברונים דינמיים על ידי תיוג ספציפי למטרה. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה המשלבת אור מתאם כפול צבע ומיקרוסקופ אלקטרונים (CLEM) כדי לצפות באינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים. במחקר זה, מיטוכונדריה סומנו עם mEosEM (Mito-mEosEM) וליזוזומים עם TMEM192-V5-APEX2. התוצאות המתקבלות מתמונות CLEM מאפשרות לנו לצפות בשינויים באינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים בתנאי עקה חיצוניים. טיפול בבפילומיצין (BFA), המעכב את התפקוד הליזוזומלי, הביא לעלייה במגע בין המיטוכונדריה לליזוזומים, מה שהוביל להיווצרות מיטוכונדריה מקוטעת הכלואה בתוך הליזוזומים. לעומת זאת, טיפול U18666A, המעכב ייצוא כולסטרול מהליזוזומים, גרם לליזוזומים להיות מוקפים במיטוכונדריה, מה שמעיד על צורה מובהקת של אינטראקציה. מחקר זה מציג שיטה יעילה להתבוננות באינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים בתאים קבועים. יתר על כן, הדמיית CLEM עם בדיקות בצבע כפול מציעה כלי רב עוצמה לחקירות עתידיות של דינמיקת אברונים והשלכותיהן על תפקוד התא והפתולוגיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיטוכונדריה וליזוזומים הם האברונים העיקריים הקשורים לממברנה החיוניים לשמירה על הומאוסטזיס תאי. מיטוכונדריה הם אברונים תאיים דינמיים ביותר המווסתים על ידי אירועי ביקוע והיתוך1. באופן כללי, מיטוכונדריה מכונים תחנת הכוח של התא וידועים בתפקידם החשוב בזרחון חמצוני, ייצור ATP ואחסון מטבוליט כגון סידן2. בנוסף לתפקידם בחילוף החומרים האנרגטי, מיטוכונדריה מעורבים במספר תהליכי איתות תאיים אחרים, כולל apoptosis3,4, Calcium Signaling5,6, ומטבוליזם של שומנים7,8. באופן דומה, ליזוזומים הם אברונים תאיים דינמיים ביותר הממלאים תפקידים מרובים כמרכזי מיחזור תאים לשמירה על ניקיון התאים באמצעות פירוק חלבונים, אוטופגיה, אנדוציטוזיס ופגוציטוזיס9. מלבד תפקידם בפירוק, ליזוזומים ממלאים גם תפקידים בפיזיולוגיה התאית כגון חישת חומרים מזינים, הומאוסטזיס10, מטבוליזם של שומנים11, ודה-דיפרנציאציה תאית12.

למרות קיומם של מחקרים רבים על תפקודם של אברונים תאיים בודדים, המחקר האחרון שלנו התמקד בשיח ההדדי הפחות מובן בין מיטוכונדריה לליזוזומים, שהוכח כמשפיע הן על הפיזיולוגיה התאית והן על הפתולוגיה. מגעים בין מיטוכונדריה לליזוזומים נצפו בסוגי תאים שונים, כולל תאים סרטניים, נוירונים ותאים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC)13, והם נצפים בעיקר תחת עקה תאית או במחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת פרקינסון13,14 ו-Charcot-Marie-Tooth disease15. המגע בין מיטוכונדריה לליזוזומים ממלא תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס מטבולי באמצעות חילופי יונים (למשל, Ca2+)16, cholesterol17, ו-iron18 בין שני האברונים. יתר על כן, המגע בין המיטוכונדריה לליזוזומים ממלא תפקיד מכריע בבקרת האיכות של אברונים תאיים. לדוגמה, מיטוכונדריה פגומה יכולה להיות ממוקדת לפירוק באמצעות תהליך של מיטופגיה, שבו הם נבלעים על ידי אוטופאגוזומים ומועברים לליזוזומים לצורך פירוק. כתוצאה מכך, ניתן להקל על הסרת מיטוכונדריה לא מתפקדת לפני שהם גורמים נזק נוסף לתא או למיטוכונדריה רגילה. אינטראקציה זו בין מיטוכונדריה לליזוזומים חיונית לשמירה על הומאוסטזיס תאי ולמניעת הצטברות של אברונים לא מתפקדים. לפיכך, רק מיטוכונדריה פגומה מוסרות באופן סלקטיבי, מה שמאפשר למיטוכונדריה בריאה לתפקד בצורה מיטבית בתוך התא.

מיקרוסקופ אור ואלקטרונים קורלטיבי (CLEM) היא טכניקת הדמיה שזכתה לאחרונה לתשומת לב כשיטת מחקר על ידי שילוב היתרונות של מיקרוסקופ אור (LM) ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM) כדי לספק מידע מבני מפורט בקני מידה שונים. ב-CLEM, דגימה מצולמת תחילה באמצעות LM כדי לזהות אזורי עניין ספציפיים, ולאחר מכן שלבי הכנת דגימת EM כגון קיבוע, התייבשות והטמעה. לאחר מכן אותה דגימה נצפית תחת מיקרוסקופ אלקטרונים. למרות ששיטות CLEM של תאים חיים דווחו לאחרונה19,20,21,22, זה עדיין מאתגר לשלב במדויק תמונות אופטיות של דגימות ביולוגיות דינמיות מאוד עם תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של תאים קבועים למישור אחד. עבור אברונים דינמיים מאוד כמו מיטוכונדריה וליזוזומים, הלוקליזציה המדויקת שלהם יכולה להשתנות כאשר הם נצפים חיים תחת מיקרוסקופ האור, והם ממשיכים לנוע גם בזמן ההשהיה הקצר הנדרש לקיבוע.

לכן, בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בשני תגים מולקולריים שונים שנשארים פעילים גם בתוך פתרונות קיבוע כדי לדמיין את האינטראקציה בין מיטוכונדריה לליזוזומים, הממלאים תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס מטבולי באמצעות חילופי יונים (למשל, Ca2+)16, cholesterol17, ו-iron18 בין האברונים הללו. המבנים TMEM192-V5-APEX2 ו-Mito-mEosEM שימשו לצפייה באינטראקציות של מיטוכונדריה וליזוזומים בתאים מתורבתים הן ברמת EM והן ברמת LM. עבור מיטוכונדריה, תג mEosEM נבחר בשל יכולתו לשמר את אות הקרינה במהלך הכנת דגימת EM בתמיסה מקבעת ו-OsO423. עבור ליזוזומים, תג APEX2, חלבון של כ-28 kDa, שימש לחקר לוקליזציה של חלבון ספציפי הן ברמות EM והן ברמות LM24. בנוכחות מי חמצן, המצע של APEX2, Amplex-Red, יוצר פולימר בלתי מסיס שניתן לצפות בו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית במיקום הממוקד של התג. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב-CLEM בצבע כפול כדי להמחיש את מבנה האינטראקציות בין ליזוזומים למיטוכונדריה בתאים קבועים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה שלב אחר שלב להכנת דגימה מוצגת באיור 1.

1. תרבית תאים וטרנספקציה

  1. תרבית תאי HeLa בצפיפות של 1 × 105 תאים בכלי תרבית עם תחתית רשת זכוכית 35 מ"מ המכילים DMEM עם 10% סרום בקר עוברי ו-100 U/mL של פניצילין וסטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס.
  2. יום לאחר זריעת התאים, יש להעביר את התאים במפגש של 30%-40% עם פלסמידים TMEM192-V5-APEX2 ו-Mito-mEosEM באמצעות מגיב הטרנספקציה בהתאם להוראות היצרן (1 מיקרוגרם כל אחד מ-DNA פלסמיד TMEM192-V5-APEX2 ו-Mito-mEosEM עם 3 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה). לאחר טרנספקציה, טפלו בתאים עם DMSO או U18666A (2 מיקרוגרם/מ"ל), ובאפילומיצין A1 (100 ננומטר) למשך 18 שעות.

2. הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית

  1. לאחר טיפול בתאים בבפילומיצין U18666A למשך 18 שעות, הסר את אמצעי התרבית והוסף מיד 250 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע חמה (30 מעלות צלזיוס-37 מעלות צלזיוס) (2.5% גלוטראלדהיד ו-2% פרפורמלדהיד בתמיסת נתרן קקודילאט 0.1 M [pH 7.0]) על ידי פיפטינג עדין. הסר מיד את הקיבוע, החלף אותו ב -1.5 מ"ל של קיבוע טרי ודגר על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטפו את התאים למשך 3 x 10 דקות ב-1 מ"ל של מאגר נתרן קקודילאט קר כקרח 0.1 M.
    הערה: אדי אלדהיד רעילים. כל הניסויים צריכים להתבצע במכסה אדים מאוורר.
  2. הוסף 1 מ"ל של תמיסת גליצין קרה של 20 מ"מ כדי להרוות את האלדהיד ולדגור על קרח למשך 10 דקות.
  3. הכן תמיסה טרייה המכילה 300 מיקרומטר אמפלקס-אדום על ידי הוספת 10 מ"מ H2O2 לתמיסת קקודילאט של 0.1 M. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת אמפלקס-אדום לצלחת הדגימה ודגירה למשך 5 דקות על קרח.
  4. הסר את תמיסת Amplex-Red ושטוף 3 x 10 דקות עם מאגר נתרן קקודילאט 0.1 M.
  5. לאחר צביעת אמפלקס-אדום, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמות את האזור סביב התאים המעניינים במצב סריקת אריחים בגודל 3 x 3. לכוד גם ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות (DIC) וגם אות פלואורסצנטי כדי לזהות ולתעד את הרשת והאותיות על צלחת הרשת באמצעות מטרה של 40x (או 60x).
    הערה: תמונות סקירה אלה משמשות כמפה לזיהוי תאי יעד ספציפיים בדגימות המשובצות בפלסטיק.
  6. דמיין את תאי המטרה בהגדלה גבוהה באמצעות מטרה של 40x (או 60x) ורכוש תמונת Z-stack.
    הערה: תמונה זו בהגדלה גבוהה מונחת על גבי תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים כדי ליצור תמונה מתאמת.

3. הכנה לדוגמא לבלוק EM

  1. לאחר הדמיית LM, הוסף 1 מ"ל של 1% אוסמיום טטרוקסיד מופחת (מוכן על ידי מכיל 3% אשלגן פרוציאניד במאגר קקודילאט 0.3 M בנפח שווה של 2% טטרוקסיד אוסמיום מימי) לקיבוע לאחר הקיבוע ב-4 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן שטוף במשך 3 x 10 דקות במים מזוקקים ב-4 מעלות צלזיוס><. הערה: אדי אוסמיום טטרוקסיד רעילים. יש לבצע את כל הניסויים במכסה אדים מאוורר.
  2. שוטפים 3 x 10 דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מייבשים בסדרת אתנול מדורגת למשך 15 דקות בכל פעם (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% ו-100%) בטמפרטורת החדר.
  3. מערבבים אתנול עם שרף אפוקסי ביחסי נפח של 3:1, 1:1 ו-1:3, ומכינים בסך הכל 300 מיקרוליטר מכל תערובת. שופכים כל שרף אפוקסי לתבשיל, ומאפשרים לו לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן, השתמש בשרף אפוקסי 100% להספגה למשך הלילה.
  4. הכן את קפסולת ההטבעה או צינור ה-PCR על ידי מילויו בשרף אפוקסי טרי, הנח את הצינור או הקפסולה הפוכה על אזור העניין, והכניס לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפילמור.

4. חתך והדמיית TEM

  1. לאחר ששרף האפוקסי התפלמר לחלוטין, הפרד את הזכוכית התחתונה מגוש הפולימר על ידי טבילתה בחנקן נוזלי.
  2. הנח את בלוק הדגימה במחזיק הדגימה של האולטרה-מיקרוטום והנח אותו בבלוק החיתוך. השתמש בסכין גילוח כדי לקצץ את השרף לצורה טרפזית או מלבנית סביב מושא העניין.
  3. הנח את בלוק הדגימה הגזוז במחזיק הדגימה והתאם את להב היהלום. ודא שהקצה המוביל של בלוק הדגימה מקביל לחלוטין לקצה להב היהלום.
  4. בעזרת אולטרה-מיקרוטום, חותכים קטעים דקים במיוחד כ-60-70 ננומטר מהתאים המוטבעים השטוחים. אוספים את החלקים הסדרתיים על רשת חריצים מצופה formvar ומייבשים אותם על פלטה חמה.
  5. הכתים את הקטע בכתם הניגודיות למשך 2 דקות וציטראט עופרת למשך דקה אחת.
  6. הנח את הרשת במחזיק הדגימה TEM לתצפית. זהה את תא המטרה המעניין על סמך תמונת ה-DIC ממיקרוסקופ האור. צלמו את כל אזור התא באמצעות תמונות חופפות באריחים בהגדלה של 1,700x.

5. תפירת תמונה באמצעות imageJ פיג'י.

  1. כדי להתחיל בתפירת תמונה, התחל imageJ Fiji25 ולחץ על קובץ | חדש | TrakEM2 (ריק) | בחר תיקיית אחסון כדי ליצור פרויקט TrakEM226 חדש (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2A1).
  2. פתח את מערך הנתונים של תמונת האריח על ידי גרירה ושחרור של נתוני תמונת האריח הגולמיים לסביבת העבודה (איור 2A2).
  3. לחץ על לחצן העכבר הימני ובחר ישר | מונטאז' של כל התמונות בשכבה זו | אלסטי (התכתבויות בלוק לא ליניאריות) ולאחר מכן לחץ על אישור כדי לקבל את הפרמטרים הנותרים של ערכי ברירת המחדל (<מחלקה חזקה="xfig">איור 2A3).
  4. לחץ על לחצן העכבר הימני ובחר ייצוא | צור תמונה שטוחה כדי ליצור תמונה תפורה, ולאחר מכן לחץ על קובץ | Save As לשמירת התמונה.

6. שינוי גודל תמונת הקרינה

  1. פתחו את התוכנה להגדלת תמונות (ראו טבלת חומרים). לחץ על קובץ | פתח ובחר את תמונת הקרינה.
  2. הזן את הרוחב והגובה כך שיהיו בגודל זהה לתמונת מיקרוסקופ האלקטרונים, ובחר את האלגוריתם שיוחל בשיטת שינוי הגודל (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 2B1).
  3. לחץ על קובץ | שמור בשם כדי לשמור את התמונה שגודלה השתנה.

7. רישום תמונות מבוסס ציון דרך עם התוסף Big Warp

  1. פתח את ImageJ Fiji וגרור ושחרר את המיקרוגרף הקרינה שגודלו השתנה (תמונת FM) ואת מיקרוגרף האלקטרונים התפור (תמונת EM).
  2. לחץ על תוספים | מציג BigData | עטיפה גדולה כדי להתחיל את הרישום, ולאחר מכן לחץ על התפריט הנפתח כדי לבחור את תמונת ה-FM כתמונה הנעה ואת תמונת ה-EM כתמונת היעד (איור 2C1).
    הערה: לכל תמונת FM ו-EM יהיו שלושה חלונות קופצים חדשים (תמונה נעה של BigWrap, תמונה קבועה של BigWrap וציוני דרך) להצגת ציוני דרך.
  3. השווה את תמונות ה-FM וה-EM באמצעות פונקציות כגון זום (גלגל עכבר), סיבוב תמונה (הזזת העכבר תוך כדי לחיצה ממושכת על הכפתור השמאלי) והזזה (הזזת העכבר תוך כדי לחיצה ממושכת על הכפתור הימני), ולאחר מכן לחץ על מקש הרווח במקלדת כדי להפעיל את מצב ציון דרך, ולחץ על לחצן העכבר השמאלי כדי לסמן לפחות שלושה ציוני דרך שזוהו בתמונות FM ו-EM ( איור 2C2, נקודות ורודות וחץ אדום).
  4. לאחר סימון כל ציוני הדרך שזוהו, עבור אל קובץ | ייצוא תמונה נעה | אישור וחלון מוקפץ חדש יופיע עם תמונת ה-FM שהשתנתה (איור 2C3).
    הערה: החלון המוקפץ החדש שנוצר הוא תמונת FM שהשתנתה על בסיס ציון הדרך. סקור את היישור ובצע התאמות, במידת הצורך, על-ידי הוספה או שינוי של ציוני דרך וחישוב מחדש של שינוי הצורה.
  5. לחץ על קובץ | שמירה בשם כדי לשמור את תמונת ה-FM שהשתנתה.

8. שכבת-על של תמונות CLEM

  1. ב-ImageJ, גרור ושחרר את תמונת ה-FM שהשתנתה ואת תמונת ה-EM התפורה.
  2. לחץ על תמונה | סוג | צבע 8 סיביות כדי להגדיר את אותו סוג תמונה הן עבור תמונות LM והן עבור EM (איור 2D1).
    הערה: יש להמיר את תמונת ה- EM פעמיים בסדר הבא: 8 סיביות -> RGB Color -> 8 סיביות צבע.
  3. לחץ על תמונה | צבע >| מיזוג ערוצים כדי לשלב את התמונות לתמונה מורכבת על ידי בחירת תמונות FM ו-EM מהתפריט הנפתח, בהתאמה (איור 2D2).
  4. לחץ על קובץ | Save As לשמירת תמונת CLEM.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לדמיין את האינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים באמצעות פרוטוקול CLEM דו-צבעוני זה, השתמשנו ב-Mito-mEosEM וב-TMEM192-V5-APEX2. תאים קבועים צולמו תחילה באמצעות מיקרוסקופ אור, ולאחר מכן דגימת EM והדמיה. תוצאות התמונות המתואמות מוצגות ב<מחלקה חזקה="xfig">איור 3A,B ו-<מחלקה חזקה="xfig">איור 4A. בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, בדקנו אם אנו יכולים לראות את השינויים באינטראקציה בין מיטוכונדריה לליזוזומים תחת לחץ חיצוני.

טיפול בתאים עם BFA, מעכב V-ATPase ליזוזומלי, מעכב אוטופגיה, וכתוצאה מכך איכות מיטוכונדריאלית מופחתת ואינטראקציות מוגברות בין מיטוכונדריה לליזוזומים27. בתאים שטופלו ב-BFA, ראינו מיטוכונדריה לכודים בתוך ליזוזומים (איור 3B), בהשוואה לתאי ביקורת שטופלו ב-DMSO (איור 3A). למרות שקשה להבחין בין מיטוכונדריה צפופת אלקטרונים מקוטעת ותאים תאיים בתוך ליזוזומים במיקרוגרפים אלקטרוניים בלבד, ניתן להבחין ביניהם בקלות בתמונות מתואמות (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 3B1,B2). מבנה השיבוש המיטוכונדריאלי (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3A1,A2; חץ כחול) שנצפה במיטוכונדריה של תאים שטופלו ב-DMSO אינו קשור לליזוזומים, והמבנה בתמונת הקרינה שנראה כמו ליזוזום שנלכד בתוך מיטוכונדריון גדול הוא מבנה שבו המיטוכונדריון מקיף את הליזוזום (<מחלקה חזקה="xfig">איור 3A2; חץ אדום).

לאחר מכן, בדקנו את ההשפעות של U18666A (2 מיקרוגרם/מ"ל למשך 18 שעות), מעכב ידוע של NPC1 החוסם את תנועת הכולסטרול מהליזוזומים28. תאים שטופלו U18666A הראו אינטראקציה ישירה מוגברת בין מיטוכונדריה לליזוזומים (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 4). בנוסף, המגעים בין מיטוכונדריה לליזוזומים בדגימות שטופלו U18666A היו שונים מאלה בדגימות שטופלו ב-BFA. בתאי HeLa שטופלו ב-BFA, המיטוכונדריון המקוטע נלכד לחלוטין בליזוזום, מורפולוגיה מיטופגית12,29. עם זאת, בקבוצה שטופלה ב-U18666A, חלק מהליזוזומים החיוביים ל-TMEM192 נראים נבלעים על ידי מיטוכונדריון (<מחלקה חזקה="xfig">איור 4D,E)30,31.

figure-results-1
איור 1: סקירה סכמטית של CLEM מבוסס TEM באמצעות בדיקה פלואורסצנטית מתויגת גנטית. (A) תאי HeLa גודלו בכלי תרבית עם תחתית רשת זכוכית של 35 מ"מ. (B) תאים קבועים סומנו עם Amplex-Red על ידי חלבון APEX2. (C) תמונות פלואורסצנטיות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. נעשה שימוש בבמה ממונעת ופונקציית סריקת אריחים כדי ללכוד תמונת סקירה גדולה ותמונה ברזולוציה גבוהה של תא המטרה. התמונה הגדולה משמשת כמפת ניווט לזיהוי מיקום תא המטרה בדגימות משובצות פלסטיק. (ד) המשך עם קיבוע פוסט והטמעת התייבשות. (E) ההטמעה נעשתה באמצעות צינור PCR או קפסולת BEEM מלאה בשרף מעל תא המטרה על הכיסוי. (F) לאחר פילמור שרף, הסרת החלקה הותירה תבנית רשת מוטבעת על המשטח התחתון של הבלוק. (G) תא המטרה זוהה על ידי התבנית המוטבעת על פני השטח של השרף, ותא המטרה נחתך בעובי של כ-60 ננומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום. (H) חתכים טוריים נאספו על רשת חריצי נחושת מצופה פורמבר. (I) הרשתות צולמו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. קיצורים: TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה; CLEM = מיקרוסקופ אור ואלקטרונים קורלטיבי; ROI = אזור עניין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: עיבוד תמונה ויצירת תמונת CLEM באמצעות imageJ פיג'י. (A1) ממשק משתמש גרפי ראשי של פיג'י ו-TrakEM2. (א2) ייבוא מערך הנתונים של תמונת האריחים שנרכש עם TEM בהגדלה של פי 1,700. (א3) יישור ודוגמה לתמונה תפורה בשיטת יישור התמונה של TrakeEM2. (B1-B3) המרת מיקרוגרף אור קטן לתמונות גדולות באיכות גבוהה באמצעות תוכנת הגדלת תמונות. (ג1-ג3) תהליך עבודה לרישום בין תמונות מיקרוסקופ אור ותמונות מיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות תוכנת התוסף Big Wrap. (ד1-ד3) תהליך הכיסוי של תמונת FM שעבר טרנספורמציה ותמונת EM לסינתזה של תמונת מיקרוסקופ מתואמת. קיצורים: TEM = מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה; CLEM = מיקרוסקופ אור ואלקטרונים קורלטיבי; FM = מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: תמונות CLEM של אתרי המגע המיטוכונדריאלי והליזוזומלי שטופלו עם או בלי בפילומיצין A1. תאי HeLa עברו טרנספקט משותף עם Mito-mEosEM (מיטוכונדריה; ירוק) ו-TMEM192-APEX2 (ליזוזומים; אדום) ולאחר מכן נצבעו בצבע אדום-אמפלקס. (A) תאי HeLa לא מטופלים. מידע מולקולרי מהאות הקרינה (פאנל שמאלי) ומידע אולטרה-מבני שהתקבל על ידי TEM (פאנל אמצעי) הונחו על גבי (פאנל ימני) על סמך אות מיטוכונדריאלי ומורפולוגיה. (א1, א2) בתאי HeLa לא מטופלים, הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלית משובשת (חץ כחול), או שהמיטוכונדריה והליזוזומים קרובים מאוד זה לזה (חץ אדום). (B1,B2) בתאי HeLa שטופלו בבפילומיצין A1 במשך 18 שעות, נצפתה מיטופגיה המאופיינת בלכידת מיטוכונדריה לא מתפרקת בליזוזומים (חץ ירוק). פסי קנה מידה = 1 מיקרומטר (A1, A2, B1, B2). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תמונות CLEM של אתרי המגע המיטוכונדריאלי והליזוזומלי שטופלו ב-U18666A (A) תמונות CLEM דו-צבעוניות של תאי HeLa Mito-mEosEM ו-TMEM192-V5-APEX2 (Amplex-Red-labeled) מבוטאות בטיפול U18666A (2 מיקרוגרם/מ"ל למשך 18 שעות). (א1, א2) חיצים אדומים מצביעים על אתרי מגע בין מיטוכונדריה לליזוזומים. פסי קנה מידה = 1 מיקרומטר. (B1-B3,C1-C3) חץ אדום מציין הופעת היתוך בין-אברוני בין מיטוכונדריה לליזוזומים על ידי תמונות סדרתיות. פסי קנה מידה = 500 ננומטר (B1-B3). פסי קנה מידה = 1 מיקרומטר (C1-C3). (D,E) תמונות TEM בהגדלה גבוהה של אתרי ההיתוך בין מיטוכונדריה לליזוזומים. פסאודו-צבעים משמשים להבחנה בין מיטוכונדריון (ירוק) לליזוזום (אדום). פסי קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר CLEM בצבע כפול כדי לצפות באינטראקציה של מיטוכונדריה וליזוזומים בתאים קבועים באמצעות תגי mEosEM ו-APEX2 מקודדים גנטית. במהלך העשורים האחרונים, ההתקדמות במיקרוסקופיה שיפרה מאוד את היכולת לצפות בשינויים ברשתות אברונים32,33, וחקר האינטראקציות בין אברונים הפך למעניין יותר ויותר. מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה שימשה לצפייה בשינויים במגעים דינמיים מאוד בין מיטוכונדריה לליזוזומים 34,35,36. עם זאת, למרות השימוש במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה, קשה להבחין בשינויים בעובי הממברנות המיטוכונדריאליות הפנימיות והחיצוניות (כ-22 ננומטר) וצמתי קריסטה (כ-28 ננומטר)37. למיקרוסקופ אלקטרונים שידור יש יתרון בכך שהוא מסוגל לצפות במבנה של דגימות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה מאוד, אך יש לו את החיסרון שניתן לצפות בתמונות רק בשחור לבן, מה שמקשה על הבחנה בין אברונים בתמונות מורכבות. בפרוטוקול שלנו, השתמשנו בשיטת CLEM המשלבת את היתרונות של אור ומיקרוסקופ אלקטרונים כדי לנטר את האינטראקציה של שני אברונים שונים על ידי צביעתם בצבעים שונים. בפרט, CLEM דו-צבעוני הוא כלי רב ערך לתצפית וניתוח מיטוכונדריה, תהליך הפירוק המיטוכונדריאלי בתוך הליזוזומים, כפי שמוצג באיור 3.

הדמיית תאים חיים מתבצעת בדרך כלל בתנאים פיזיולוגיים, מה שמאפשר לחוקרים לצפות בתהליכים התאיים הדינמיים בזמן אמת. עם זאת, טכניקות מיקרוסקופ אלקטרונים דורשות לעתים קרובות הליכי הכנת דגימה גוזלים זמן, כולל קיבוע וצביעה. עיכוב הזמן בין הדמיית תאים חיים להכנת דגימת מיקרוסקופ אלקטרונים מגביל את הרזולוציה הזמנית של הטכניקה ויכול לגרום לאירועים תאיים דינמיים שעלולים להחמיץ. כדי להתגבר על המגבלה של CLEM של תאים חיים, פיתחנו שיטת CLEM דו-צבעונית שבה בדיקת mEosEM23 והצבע הכימי (Amplex-Red) מוכתמים על ידי אנזים תיוג הקרבה APEX238 מבלי לאבד את אות הקרינה אפילו בסביבות קיבוע קשות. במחקר CLEM קודם של תאים חיים39, נמצאו פערים בין אותות פלואורסצנטיים לתמונות EM עקב בעיות רזולוציה זמנית בדגימת TEM לאחר הדמיית תאים חיים ומגבלות טכניות בהכנת הדגימה. עם זאת, על ידי רכישת תמונות פלואורסצנטיות של תאים קבועים למשך זמן מספיק (הדמיית z-stack של תאים שלמים בהגדלה גבוהה), אנו יכולים לפתור את בעיית הרזולוציה הזמנית ולשפר את המתאם בין תמונות LM ו-EM (איור 3 ואיור 4).

גורם מפתח נוסף לתוצאות CLEM מוצלחות הוא כיצד לרשום במדויק את תמונת ה-LM עם תמונת ה-EM. כדי לעשות זאת, השתמשנו תחילה בשילוב של מצבי דימות DIC ודימות פלואורסצנטי במהלך דימות מיקרוסקופ אור כדי ליצור מפת ניווט סביב תאי המטרה. באמצעות מפת ניווט זו, יכולנו לזהות בקלות את התאים המעניינים באולטרה-מיקרוטום וב-TEM. שנית, על ידי רכישת תמונות אריחי TEM של תאים שלמים בהגדלה גבוהה, הצלחנו להשיג ציוני דרך רבים שיכולים לשמש לרישום תמונה. מניסיוננו, ככל שמספר ציוני הדרך גבוה יותר, כך דיוק היישור של תמונות LM ו-EM בתוסף Big Warp טוב יותר.

במחקר זה, הראינו את תחומי האינטראקציה של ליזוזומים ומיטוכונדריה עם תוצאות CLEM ברזולוציה גבוהה. בנוסף, הגשושית הדו-צבעונית אפשרה הבחנה מדויקת בין מיטוכונדריה לליזוזומים. עם זאת, לשיטה זו יש כמה מגבלות. ראשית, אם זמן התגובה במהלך התיוג הפרוקסימלי של Amplex-Red על ידי האנזים APEX2 ארוך מדי, ה-Amplex-Red יתפזר ויכתים רחב יותר ממיקום חלבון המטרה38. שנית, העובי (נפח ציר z) של האזור בו הליזוזום נבלע במיטוכונדריה הוא קטן למדי, כך שלא ניתן לקבוע את האיחוי של שני ממברנות האברונים בחתך סדרתי בעובי 50 ננומטר. יתר על כן, זהו אתגר משמעותי ליישר במדויק את ציר ה-z של קטע אופטי על ידי מיקרוסקופ אור וחתך מכני על ידי אולטרה-מיקרוטום. כדי להתגבר על מגבלות אלו, ניתן להשתמש ב-CLEM בצבע כפול בשילוב עם אלקטרון-טומוגרפיה קונבנציונלית40 או נפח חתך טורי-CLEM41.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר הבסיסית KBRI באמצעות המכון לחקר המוח של קוריאה במימון משרד המדע והתקשוב (24-BR-01-03). פלסמידים TMEM192-V5-APEX2 סופקו באדיבות על ידי Hyun-Woo Rhee (האוניברסיטה הלאומית של סיאול). נתוני TEM נרכשו במתקני הליבה לחקר המוח ב-KBRI.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>כימיקלים וריאגנטים
25% גלוטראלדהידאלקטרונים מיקרוסקופיה16200אדי אלדהיד רעילים ביותר. השתמש רק במכסה אדים.
תמיסת מי חמצן 30%Merck107210
4% תמיסת פרפורמלדהידBiosesangPC2031-100-00אדי לדהיד רעילים ביותר. השתמש רק במכסה אדים.
Amplex אדוםThermoFisherA12222
Epon 812מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית14120
אתנולMerck100983
Fugene HDPromegaE2311טרנספקציה פלסמיד
גליציןSIGMAG8898
עופרת ציטראט 3%מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית22410
אוסמיום טטרוקסיד 4% תמיסה מימיתמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית16320רעיל מאוד. השתמש רק במכסה אדים.
אשלגן הקסציאנופרט(II) טריהידרט SIGMAP3289
נתרן קקודילאט טריהידראטסיגמא-אולדריץ'C0250-500G
אורניל אצטטאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית22400
UranyLess EM כתםאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי22409
<חזק>פלסמיד בנייה
Mito-mEosEMaddgene132706DOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
TMEM192-V5-APEX2שארמה נ.  ואח'.N/ADOI:  10.1016/j.chembiol.2024.02.007
Tools
0.22 um מסנן מזרקSartorius16534
35 מ"מ צלחת כיסוי מרושתתמטקP35G-1.5-14-CGRD
BEEM קפסולות הטמעהטד פלה130
Formvar נתמך בחריץ יחיד רשת נחושתטד פלה01705
סכין יהלוםDiATOMEDU4530
אולטרה-מיקרוטוםLeicaARTOS 3D
Microscopes
מיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכהNikonA1 Rsi/Ti-E
מיקרוסקופ אלקטרונים שידורFEITecnai G2
תוכנה ו אלגוריתמים
פיג'י/תמונה JNIH / קודhttps://imagej.nih.gov/ij/
ImageJ חבילת תוכנה BigWarpNIH / קוד
https://imagej.net/plugins/bigwarp Photozoom Pro 8 BenVistahttps://www.benvista.com/photozoompro

תוכנה חלופית
שינוי גודל תמונה : https://imageresizer.com/
Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel
ON1 שינוי גודל : https://www.on1.com/products/resize-ai/
מדעית פתוח פתוח

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
  2. Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nat Cell Biol. 20 (7), 745-754 (2018).
  3. Lopez, J., Tait, S. W. G. Mitochondrial apoptosis: Killing cancer using the enemy within. Br J Cancer. 112 (6), 957-962 (2015).
  4. Wang, C., Youle, R. J. The role of mitochondria in apoptosis*. Annu Rev Genet. 43, 95-118 (2009).
  5. Rossi, A., Pizzo, P., Filadi, R. Calcium, mitochondria and cell metabolism: A functional triangle in bioenergetics. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (7), 1068-1078 (2019).
  6. Giorgi, C., Marchi, S., Pinton, P. The machineries, regulation and cellular functions of mitochondrial calcium. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 713-730 (2018).
  7. Talari, N. K., et al. Lipid-droplet associated mitochondria promote fatty-acid oxidation through a distinct bioenergetic pattern in male wistar rats. Nat Commun. 14 (1), 766(2023).
  8. Enkler, L., et al. Arf1 coordinates fatty acid metabolism and mitochondrial homeostasis. Nat Cell Biol. 25 (8), 1157-1172 (2023).
  9. Trivedi, P. C., Bartlett, J. J., Pulinilkunnil, T. Lysosomal biology and function: Modern view of cellular debris bin. Cells. 9 (5), 1131(2020).
  10. Mony, V. K., Benjamin, S., O'Rourke, E. J. A lysosome-centered view of nutrient homeostasis. Autophagy. 12 (4), 619-631 (2016).
  11. Thelen, A. M., Zoncu, R. Emerging roles for the lysosome in lipid metabolism. Trends Cell Biol. 27 (11), 833-850 (2017).
  12. Ma, X., et al. Mitochondria-lysosome-related organelles mediate mitochondrial clearance during cellular dedifferentiation. Cell Rep. 42 (10), 113291(2023).
  13. Kim, S., Wong, Y. C., Gao, F., Krainc, D. Dysregulation of mitochondria-lysosome contacts by gba1 dysfunction in dopaminergic neuronal models of Parkinson's disease. Nat Commun. 12 (1), 1807(2021).
  14. Pickrell, A. M., Youle, R. J. The roles of pink1, parkin, and mitochondrial fidelity in parkinson's disease. Neuron. 85 (2), 257-273 (2015).
  15. Wong, Y. C., Peng, W., Krainc, D. Lysosomal regulation of inter-mitochondrial contact fate and motility in charcot-marie-tooth type 2. Dev Cell. 50 (3), 339-354.e4 (2019).
  16. Peng, W., Wong, Y. C., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial Ca(2+) dynamics via lysosomal trpml1. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19266-19275 (2020).
  17. Juhl, A. D., et al. Quantitative imaging of membrane contact sites for sterol transfer between endo-lysosomes and mitochondria in living cells. Sci Rep. 11 (1), 8927(2021).
  18. Khalil, S., et al. A specialized pathway for erythroid iron delivery through lysosomal trafficking of transferrin receptor 2. Blood Adv. 1 (15), 1181-1194 (2017).
  19. Russell, M. R., et al. 3d correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. J Cell Sci. 130 (1), 278-291 (2017).
  20. Van Rijnsoever, C., Oorschot, V., Klumperman, J. Correlative light-electron microscopy (clem) combining live-cell imaging and immunolabeling of ultrathin cryosections. Nat Methods. 5 (11), 973-980 (2008).
  21. Loginov, S. V., et al. Correlative organelle microscopy: Fluorescence guided volume electron microscopy of intracellular processes. Front Cell Dev Biol. 10, 829545(2022).
  22. De Beer, M., et al. Visualizing biological tissues: A multiscale workflow from live imaging to 3D cryo-CLEM. Microscopy and Microanalysis. 27 (S2), 11-12 (2021).
  23. Fu, Z., et al. Meosem withstands osmium staining and epon embedding for super-resolution clem. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
  24. Lam, S. S., et al. Directed evolution of apex2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Cardona, A., et al. Trakem2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), e38011(2012).
  27. Redmann, M., et al. Inhibition of autophagy with bafilomycin and chloroquine decreases mitochondrial quality and bioenergetic function in primary neurons. Redox Biol. 11, 73-81 (2017).
  28. Lu, F., et al. Identification of npc1 as the target of u18666a, an inhibitor of lysosomal cholesterol export and ebola infection. eLife. 4, e12177(2015).
  29. Jung, M., Choi, H., Mun, J. Y. The autophagy research in electron microscopy. Appl Microsc. 49 (1), 11(2019).
  30. Hao, T., et al. Hypoxia-reprogramed megamitochondrion contacts and engulfs lysosome to mediate mitochondrial self-digestion. Nat Commun. 14 (1), 4105(2023).
  31. Hoglinger, D., et al. Npc1 regulates ER contacts with endocytic organelles to mediate cholesterol egress. Nat Commun. 10 (1), 4276(2019).
  32. Jung, M., Mun, J. Y. Mitochondria and endoplasmic reticulum imaging by correlative light and volume electron microscopy. J Vis Exp. (149), e59750(2019).
  33. Ohta, K., Hirashima, S., Miyazono, Y., Togo, A., Nakamura, K. I. Correlation of organelle dynamics between light microscopic live imaging and electron microscopic 3d architecture using fib-sem. Microscopy (Oxf). 70 (2), 161-170 (2021).
  34. Wang, H., et al. Lysosome-targeted biosensor for the super-resolution imaging of lysosome-mitochondrion interaction. Front Pharmacol. 13, 865173(2022).
  35. Chen, Q., et al. Quantitative analysis of interactive behavior of mitochondria and lysosomes using structured illumination microscopy. bioRxiv. , (2018).
  36. Wong, Y. C., Ysselstein, D., Krainc, D. Mitochondria-lysosome contacts regulate mitochondrial fission via rab7 gtp hydrolysis. Nature. 554 (7692), 382-386 (2018).
  37. Perkins, G., et al. Electron tomography of neuronal mitochondria: Three-dimensional structure and organization of cristae and membrane contacts. J Struc Biol. 119 (3), 260-272 (1997).
  38. Sharma, N., Jung, M., Mishra, P. K., Mun, J. Y., Rhee, H. -W. Flex: Genetically encodable enzymatic fluorescence signal amplification using engineered peroxidase. Cell Chem Biol. 31 (3), 502-513.e506 (2024).
  39. Jung, M., Choi, H., Kim, J., Mun, J. Y. Correlative light and transmission electron microscopy showed details of mitophagy by mitochondria quality control in propionic acid treated sh-sy5y cell. Materials (Basel). 13 (19), (2020).
  40. Mourik, M. J., et al. Methods Cell Biol. Müller-Reichert, T., Verkade, P. 124, Academic Press. 71-92 (2014).
  41. Hegermann, J., et al. Volume-clem: A method for correlative light and electron microscopy in three dimensions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (6), L778-L784 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CLEMHeLa

מאמרים קשורים