פרוטוקול זה מתאר מנגנון לשימוש במיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה כדי להמחיש את האינטראקציה של מיטוכונדריה וליזוזומים המסומנים ב-mEosEM ו-APEX2, בהתאמה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה דו-צבעונית להדמיית אינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אברונים תאיים, כגון מיטוכונדריה וליזוזומים, מציגים מבנים דינמיים. למרות הרזולוציה הגבוהה יותר של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור לניתוח מבני, מיקרוסקופ אור חיוני להדמיה של אברונים דינמיים על ידי תיוג ספציפי למטרה. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה המשלבת אור מתאם כפול צבע ומיקרוסקופ אלקטרונים (CLEM) כדי לצפות באינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים. במחקר זה, מיטוכונדריה סומנו עם mEosEM (Mito-mEosEM) וליזוזומים עם TMEM192-V5-APEX2. התוצאות המתקבלות מתמונות CLEM מאפשרות לנו לצפות בשינויים באינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים בתנאי עקה חיצוניים. טיפול בבפילומיצין (BFA), המעכב את התפקוד הליזוזומלי, הביא לעלייה במגע בין המיטוכונדריה לליזוזומים, מה שהוביל להיווצרות מיטוכונדריה מקוטעת הכלואה בתוך הליזוזומים. לעומת זאת, טיפול U18666A, המעכב ייצוא כולסטרול מהליזוזומים, גרם לליזוזומים להיות מוקפים במיטוכונדריה, מה שמעיד על צורה מובהקת של אינטראקציה. מחקר זה מציג שיטה יעילה להתבוננות באינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים בתאים קבועים. יתר על כן, הדמיית CLEM עם בדיקות בצבע כפול מציעה כלי רב עוצמה לחקירות עתידיות של דינמיקת אברונים והשלכותיהן על תפקוד התא והפתולוגיה.
מבוא
מיטוכונדריה וליזוזומים הם האברונים העיקריים הקשורים לממברנה החיוניים לשמירה על הומאוסטזיס תאי. מיטוכונדריה הם אברונים תאיים דינמיים ביותר המווסתים על ידי אירועי ביקוע והיתוך1. באופן כללי, מיטוכונדריה מכונים תחנת הכוח של התא וידועים בתפקידם החשוב בזרחון חמצוני, ייצור ATP ואחסון מטבוליט כגון סידן2. בנוסף לתפקידם בחילוף החומרים האנרגטי, מיטוכונדריה מעורבים במספר תהליכי איתות תאיים אחרים, כולל apoptosis3,4, Calcium Signaling5,6, ומטבוליזם של שומנים7,8....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
זרימת העבודה שלב אחר שלב להכנת דגימה מוצגת באיור 1.
1. תרבית תאים וטרנספקציה
- תרבית תאי HeLa בצפיפות של 1 × 105 תאים בכלי תרבית עם תחתית רשת זכוכית 35 מ"מ המכילים DMEM עם 10% סרום בקר עוברי ו-100 U/mL של פניצילין וסטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס.
- יום לאחר זריעת התאים, יש להעביר את התאים במפגש של 30%-40% עם פלסמידים TMEM192-V5-APEX2 ו-Mito-mEosEM באמצעות מגיב הטרנספקציה בהתאם להוראות היצרן (1 מיקרוגרם כל אחד מ-DNA פלסמיד TMEM192-V5-APEX2 ו-Mito-mEosEM עם 3 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה). לאחר טרנספקציה, טפלו בתאים עם DMSO או U18666A (2 מיקרוגרם/מ"ל), ובאפילומיצין A1 (....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להדמיות את האינטראקציות בין מיטוכונדריה לליזוזומים באמצעות פרוטוקול CLEM דו-צבעי זה, השתמשנו ב-Mito-mEosEM וב-TMEM192-V5-APEX2. תאים מקובעים נסרקו תחילה באמצעות מיקרוסקופ אור, ולאחריו בוצעו דגימה והדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). תוצאות התמונות המתואמות מוצגות ב-איור 3A,B וב-איור 4A. בהתאם לפרוטוקול המתואר לעיל, בדקנו האם ניתן להבחין בשינויים באינטראקציה בין המיטוכונדריה לליזוזומים תחת תנאי עקה חיצונית.
טיפול בתאי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר CLEM בצבע כפול כדי לצפות באינטראקציה של מיטוכונדריה וליזוזומים בתאים קבועים באמצעות תגי mEosEM ו-APEX2 מקודדים גנטית. במהלך העשורים האחרונים, ההתקדמות במיקרוסקופיה שיפרה מאוד את היכולת לצפות בשינויים ברשתות אברונים32,33, וחקר האינטראקציות בין אברונים הפך למעניין יותר ויותר. מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה שימשה לצפייה בשינויים במגעים דינמיים מאוד בין מיטוכונדריה לליזוזומים 34,35,36.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר הבסיסית KBRI באמצעות המכון לחקר המוח של קוריאה במימון משרד המדע והתקשוב (24-BR-01-03). פלסמידים TMEM192-V5-APEX2 סופקו באדיבות על ידי Hyun-Woo Rhee (האוניברסיטה הלאומית של סיאול). נתוני TEM נרכשו במתקני הליבה לחקר המוח ב-KBRI.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>כימיקלים וריאגנטים | |||
| 25% גלוטראלדהיד | אלקטרונים מיקרוסקופיה | 16200 | אדי אלדהיד רעילים ביותר. השתמש רק במכסה אדים. |
| תמיסת מי חמצן 30% | Merck | 107210 | |
| 4% תמיסת פרפורמלדהיד | Biosesang | PC2031-100-00 | אדי לדהיד רעילים ביותר. השתמש רק במכסה אדים. |
| Amplex אדום | ThermoFisher | A12222 | |
| Epon 812 | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 14120 | |
| אתנול | Merck | 100983 | |
| Fugene HD | Promega | E2311 | טרנספקציה פלסמיד |
| גליצין | SIGMA | G8898 | |
| עופרת ציטראט 3% | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 22410 | |
| אוסמיום טטרוקסיד 4% תמיסה מימית | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 16320 | רעיל מאוד. השתמש רק במכסה אדים. |
| אשלגן הקסציאנופרט(II) טריהידרט | SIGMA | P3289 | |
| נתרן קקודילאט טריהידראט | סיגמא-אולדריץ' | C0250-500G | |
| אורניל אצטט | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית | 22400 | |
| UranyLess EM כתם | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי | 22409 | |
| <חזק>פלסמיד בנייה | |||
| Mito-mEosEM | addgene | 132706 | DOI: 10.1016/j.chembiol.2024.02.007 |
| TMEM192-V5-APEX2 | שארמה נ. ואח'. | N/A | DOI: 10.1016/j.chembiol.2024.02.007 |
| Tools | |||
| 0.22 um מסנן מזרק | Sartorius | 16534 | |
| 35 מ"מ צלחת כיסוי מרושתת | מטק | P35G-1.5-14-CGRD | |
| BEEM קפסולות הטמעה | טד פלה | 130 | |
| Formvar נתמך בחריץ יחיד רשת נחושת | טד פלה | 01705 | |
| סכין יהלום | DiATOME | DU4530 | |
| אולטרה-מיקרוטום | Leica | ARTOS 3D | |
| Microscopes | |||
| מיקרוסקופיה קונפוקלית הפוכה | Nikon | A1 Rsi/Ti-E | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים שידור | FEI | Tecnai G2 | |
| תוכנה ו אלגוריתמים | |||
| פיג'י/תמונה J | NIH / קוד | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| ImageJ חבילת תוכנה BigWarp | NIH / קוד | ||
| https://imagej.net/plugins/bigwarp Photozoom Pro 8 | BenVista | https://www.benvista.com/photozoompro תוכנה חלופית שינוי גודל תמונה : https://imageresizer.com/ Gigapixel AI : https://www.topazlabs.com/gigapixel ON1 שינוי גודל : https://www.on1.com/products/resize-ai/ |
מקורות
- Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (4), 204-224 (2020).
- Spinelli, J. B., Haigis, M. C. The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism. Nat Cell Biol. <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
